LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI PEWARNAAN GRAM BAKTERI
Disusun oleh : Kelompok 9
Arini Dyah S.P.D
(1306377316)
Desta Andriyani
(1306377083)
Sekar Pramesti Pramesti Artha (1306397034)
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS INDONESIA 2014
PEWARNAAN GRAM BAKTERI
Hari, tanggal praktikum
: Kamis, 25 September 2014
Waktu
: 10.00 – 12.00
Tempat
: Laboratorium Mikrobiologi lantai 3
Gedung Fakultas Farmasi UI
I. PENDAHULUAN Bakteri sukar sekali dilihat dengan jelas dengan mikroskop cahaya biasa karena bakteri tidak berwarna jika diamati secara sendiri-sendiri. Dalam upaya memahami dan mempelajari struktur, penggolongan sifat, dan morfologi bakteri, dapat dilakukan pewarnaan bakteri. Asam nukleat bakteri mengandung gugus fosfat bermuatan negatif yang dapat mengikat zat warna basa yang bermuatan positif. Zat warna asam tidak dapat mewarnai sel bakteri dan dipergunakan untuk mewarnai latar belakangnya. Zat-zat warna umum dipergunakan untuk mempelajari morfologi bakteri. Zat warna terikat dengan protoplasma bakteri secara kimia dan zat warna yang dipergunakan berbentuk garam. Zat warna bisa mengandung kation pewarna dan anion bukan pewarna, sedangkan zat pewarna asam mengandung kation bukan pewarna dan anion pewarna. Ada 5 macam jenis pewarnaan yang dapat dilakukan, dan pada praktikum kali ini digunakan salah satu cara yaitu Pewarnaan Gram. II. PRINSIP Dalam praktikum pewarnaan bakteri kali ini, digunakan cara Pewarnaan Gram dimana prinsip dari pewarnaan ini yaitu dengan memberikan warna bakteri tersebut dengan 3 zat warna yaitu Zat Karbol Kristal Ungu, Lugol, dan Air Fuchsin.
Setelah pewarnaan tersebut, akan didapatkan 2 kelompok bakteri yaitu bakteri Gram Positif dan Gram Negatif hal itu karena Zat Kristal Karbol Ungu dan larutan Lugol akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna ungu pada bakteri, kemudian setelah dilakukan pencucian dengan
alkohol
96%
barulah
dapat
terlihat
perbedaannya.Bakteri
yang
masih
mempertahankan zat warna ungu merupakan Gram Positif sedangkan yang tidak dapat mempertahankan zat warna ungu disebut Gram Negatif lalu setelah diberi Air Fuchsin, Gram Negatif akan berwarna merah sedangkan Gram Positif akan tetapberwarna biru.
III. TUJUAN Membedakan dan mengidentifikasi bakteri Gram positif dengan bakteri Gram negatif menggunakan metode pewarnaan Gram. IV. ALAT DAN BAHAN A. Alat 1.
Spirtus
4. Kaca objek
2. Korek api
3. Pinset
5. Pensil pewarna
6. Inokulum
7. Bak pewarnaan
8. Mikroskop Cahaya
B. Bahan
2. Biakan bakteri
:
Escherichia coli Staphylococcus Salmonella typhosa Pseudomonas araginosa Bacillus subtilis
3. Zat warna
:
Karbol kristal ungu 0,5 %
Cairan Lugol
Alkohol 96 %
Minyak Immersi
Air Fukhsin 0,5 %
Aquadest
V. PROSEDUR KERJA 1. Nyalakan api dalam Bunsen. Pijar alat-alat yang mau digunakan seperti inokulum, dan bahan seperti tabung reaksi berisi bakteri. 2. Membuat preparat -
Bersihkan objek gelas dengan tissue, kemudian lewatkan di atas api untuk menghilangkan lemak lalu biarkan dingin sebelum dipakai.
-
Buat batas bulatan untuk menempatkan bakteri pada objek gelas menggunakan pensil gelas.
-
Jika kuman yang diperiksa dalam media cair, ambil satu sengkelit letakkan di atas 2
gelas objek gelas, sebarkan seluas 1-2cm atau seluas daerah yang tekah ditandai dalam objek gelas. -
Jika kuman yang diperiksa ditanam pada media padat maka dibuat suspensi kuman dengan satu sengkelit NaCl fisiologis.
-
Biarkan mongering di udara atau dipercepat dengan melewatkan di atas api (difiksasi).
3. Tuang larutan karbol kristal ungu sebanyak ±2 tetes sambil objek gelas digoyang perlahan sampai zat warna menutupi seluruh permukaan bakteri yang akan diuji. Biarkan selama 1-2 menit untuk bakteri gram negatif dan 6-7 menit untuk bakteri gram positif. 4. Cuci dengan air lalu tuangkan cairan Lugol selama 40-60 detik, kemudian dicuci dengan air. 5. Lalu cuci alkohol dengan cara dicelupkan ke dalam bejana yang berisi alkohol 96% goyangkan selama 30 detik sampai zat warna tidak mengalir lagi. 6. Cuci dengan air. 7. Tuangkan air Fukhsin kira-kira 1 tetes sampai menutupi seluruh permukaan bakteri, biarkan selama 1-2 menit, cuci dengan air lalu keringkan dengan tissue selama 30-40 detik sambil ditekan perlahan-lahan sampai semua air terserap. 8. Tetesi minyak immersi sebanyak ± 2 tetes diatas sediaan kemudian amati di bawah mikroskop dengan menggunakan perbesaran awal 100 kali.
VI. HASIL PENGAMATAN Hasil pewarnaan gram pada bakteri Staphylococcus, menunjukkan perubahan warna bakteri menjadi ungu biru, sehingga Staphylococcus digolongkan sebagai bakteri gram positif.
Hasil pewarnaan gram pada bakteri Escherichia coli, menunjukkan perubahan warna bakteri menjadi merah, sehingga Escherichia coli digolongkan sebagai bakteri gram negatif.
Hasil pewarnaan gram pada bakteri Salmonella typhosa, menunjukkan perubahan warna bakteri menjadi merah sehingga Salmonella typhosa digolongkan sebagai bakteri gram negatif.
Hasil pewarnaan gram pada bakteri Streptococcus, menunjukkan perubahan warna bakteri menjadi ungu biru, sehingga Streptococcus digolongkan sebagai bakteri gram positif.
Hasil pewarnaan gram pada bakteri Bacillus subtilis, menunjukkan perubahan warna bakteri menjadi ungu biru. sehingga Bacillus subtilis digolongkan sebagai bakteri gram positif
Hasil pewarnaan gram pada bakteri Pseudomonas araginosa, menunjukkan perubahan warna bakteri menjadi ungu merah, sehingga Pseudomonas araginosa digolongkan sebagai bakteri gram negatif.
VII. PEMBAHASAN
Sumber gambar : http://books.google.co.id/books?id=AIDbNCmkNtgC&pg=PA115&dq=pewarnaan+bakteri&hl=id&sa=X&ei=XQ
Mikroorganisme merupakan makhluk yang berukuran kecil dan hanya dapat dilihat melalui mikroskop. Tidak semua mikroorganisme dapat dilihat melalui mikroskop secara langsung, melainkan ada yang harus diidentifikasi jenisnya dengan pewarnaan, seperti beberapa jenis bakteri. Bakteri adalah salah satu golongan organisme prokariotik (tidak memiliki membran inti). Bakteri dapat diidentifikasi dengan cara pewarnaan, meliputi : 1. Pewarnaan Sederhana 2. Pewarnaan Diferensial 3. Pewarnaan Gram 4. Pewarnaan Negatif 5. Pewarnaan Khusus Pewarnaan yang sering digunakan adalah pewarnaan gram. Berdasarkan pewarnaan gram, bakteri dibagi menjadi dua macam, tergantung dari reaksi dinding sel terhadap tinta
safranin atau kristal violet. Bakteri yang tetap berwarna ungu dengan pewarnaan oleh kristal violet disebut bakteri Gram positif, misalnya Staphylococcus aureus, sedangkan bakteri yang warna ungunya hilang setelah dibilas dengan alkohol, tetapi tetap berwarna merah muda karena menahan warna merah safranin disebut bakteri Gram negatif, misalnya Escherichia coli. Tidak semua bakteri dapat terwarnai oleh pewarnaan Gram, misalnya Mycobacterium spp., karena dinding selnya mengandung banyak lipid, sehingga digunakan pewarnaan tahan asam untuk mengidentifikasi jenis bakteri ini. Pada sel bakteri ini akan berwarna merah muda, tetapi sel jaringannya akan berwarna hijau. Bakteri yang sudah diberi pewarnaan lalu diberi minyak immersi untuk diamati dengan mikroskop cahaya. Bentuk bakteri juga dapat diidentifikasi melalui pewarnaan Gram, misalnya bentuk sferis (kokus), bentuk batang (basilus), bentuk koma (vibrio). (James,Joyce.2006)
Sumber gambar : http://books.google.co.id/books?id=AIDbNCmkNtgC&pg=PA115&dq=pewarnaan+bakteri&hl=id&sa=X&ei=XQ
Jamur dan ragi tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan Gram dan biasanya diidentifikasi dengan pewarnaan jaringan yang terinfeksi untuk melihat struktur tipikal. Kultur murni dapat diwarnai dengan metilen biru untuk menunjukkan struktur reproduksinya. Virus dapat dilakukan dengan pewarnaan imunogenik khusus yang dapat memberi ‘label’ pada virus sehingga adanya virus dapat terdeteksi pada sel. Reagen yang digunakan dalam pewarnaan Gram :
Zat warna utama (C.Gention Violet)
Lugol(zat Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama memperkuat reaksi
Pencuci / peluntur zat warna (alkohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan untuk melunturkan zat warna utama.
Zat warna kedua / cat penutup (air fukhsin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol. Identifikasi bakteri dilakukan dengan 4 tahap, yaitu :
1. Pemberian cat warna utama (C.Gention Violet) berwarna ungu. 2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan Lugol 3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam. 4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna air fukhsin
Sumber gambar : http://biobakteri.files.wordpress.com/2009/06/pewarnaan-gram.jpg
Identifikasi bakteri dapat dibedakan menjadi beberapa perbedaan, yaitu : 1. Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam
lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.
Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
Peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Endotoksin
Bakteri Gram negatif
Bakteri Gram- negatif berbentuk batang ( Enterobacteriaceae) Bakteri Gram-negatif berbentuk batang habitat alaminya berada pada sistem usus manusia dan binatang. Keluarga Enterobacteriaceae meliputi banyak jenis ( Escherichia, Shigella, Salmonella,Enterobacter,Klebsiella,Serratia,Proteus,dll). Beberapa organisme, misalnya Escheria coli merupakan flora normal dan menyebabkan penyakit, sedangkan yang lain seperti Salmonella dan Shigella merupakan patogen yang umum bagi manusia.
Pseudomonas, Acinetobacter , dan Bakteri Gram-negatif lain Pseudomonas aeruginosa bersifat invasif dan toksigenik, mengakibatkan infeksi pada pasien dengan penurunan daya tahan tubuh, dan merupakan patogen nosokomial yang penting. Chromobacteria dan Chryseobacteria ditemukan di tanah dan air dan merupakan
bakteri
patogen
yang
oportunistik
bagi
manusia.
Bakteri
lain,
Capnocytophaga, Eikenella corrodens, Kingella, dan Moraxella tumbuh normal pada manusia namun dapat menyebabkan variasi infeksi yang luas.
Vibrio, Campylobacter, Helicobacter , dan Bakteri lain yang berhubungan. Mikroorganisme ini merupakan spesies berbentuk batang gram-negatif yang tersebar luas di alam. Vibro ditemukan di daerah perairan dan permukaan air. Aeromonas banyak ditemukan di air segar dan terkadang pada hewan berdarah dingin. Plesiomonas terdapat pada hewan berdaeah dingin dan panas. Campylobacter ditemukan di banyak spesies hewan, termasuk hewan peliharaan.
Haemophilus, Bordetella, dan Brucella Merupakan kelompok bakteri pleiomorfik kecil, gram-negatif. Haemophilus influenzae tipe b merupakan patogen manusia yang penting.
Yersinia, Francisella dan Pasteurella Merupakan bakteri berbentuk batang pendek Gram-negatif yang pleimorfik. Organisme ini bersifat katalase positif, oksidase, positif, dan merupakan bakteri mikroaerofilik atau anaerob fakultatif.
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.
Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
Tidak peka terhadap streptomisin
Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin
Bakteri Gram-positif
Bakteri gram-positif pembentuk spora : spesies Bacillus dan Clostridium Basil gram-positif pembentuk spora mencakup spesies Bacillus dan Clostridium. Kedua spesies ini ada di mana-mana, membentuk spora sehingga dapat hidup di lingkungan selama bertahun – tahun. Spesies Bacillus bersifat aerob, sedangkan Clostridia bersifat anaerob obligat.
Bakteri
Gram-positif
tidak
membentuk
spora
:
spesies
Corynabacterium,
Propionibacterium,Listeria,Erysipelothrix, Actinomycetes Beberapa
anggota
genus
Corynebacterium
dan
kelompok
spesies
Propionibacterium merupakan flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia. Corynebacterium
diphtheriae memproduksi
eksotoksin
yang
sangat
kuat
dan
menyebabkan difteria pada manusia. Listeria monocytogenes dan Erysipelothrix rhusiophathiae ditemukan pada binatang dan kadang menyebabkan penyakit yang berat pada manusia. Golongan Listeria dan Erysipelothrix tumbuh dengan baik di udara,
Staphylococcus Merupakan sel gram-positif berbentuk bulat, biasanya tersusun dalam bentuk bergerombol yang tidak teratur seperti anggur. Beberapa spesies merupakan anggota flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia; yang lain menyebabkan supurasi dan bahkan septikemia fatal. Staphylococcus yang patogen sering menghemolisis darah, mengkoagulasi plasma dan menghasilkan berbagai enzim ekstraseluler dan toksin yang stabil terhadap panas. Stapgylococcus cepat menjadi resisten terhadap beberapa antimikroba. Genus Staphylococcus sedikitnya memiliki 30 spesies. Tigas spesies Staphylococcus yang
berkaitan
dengan
medis
adalah
Staphylococcus
auerus,
Staphylococcus epidermidis dan Staphylococcus saprophyticus. Staphylococcus aureus bersifat koagulase positif, dan merupakan patogen utama pada manusia. Staphylococcus koagulase negatif merupakan flora normal manusia dan kadang – kadang menyebabkan infeksi, misalnya Staphylococcus epidermidis.
Streptococcus Streptococcus merupakan bakteri gram-positif berbentuk bulat yang mempunyai karakteriristik dapat membentuk pasangan atau rainta selama pertumbuhnannya. Bakteri ini beberapa di antaranya merupakan anggota flora normal manusia; sedang Streptococcus yang lain berhubungan dengan penyakit pada manusia. Ada 20 jenis Streptococcus, di antaranya Streptococcus pygones (Group A), Streptococcus agalactiae (Group B) dan jenis Enterococcus (Group D). Mikroorganisme tersebut memiliki berbagai tampilan yang bervariasi dalam hal karakteristik koloni pertumbuhna, pola hemolisis pada meda agar darah, komposisi antigen dalam substansi dinding sel, dan reaksi biokimia. Jenis Streptococcus pneumoniae diklasifikasikan komposisi antigen polisakarida pada kapsul.
VIII. KESIMPULAN Berdasarkan percobaan Pewarnaan Gram yang telah kami lakukan, kami dapat menarik kesimpulan bahwa pada bakteri gram positif ketika dilakukan pewarnaan gram (ditetesi karbol kristal ungu, lugol, dan air fukhsin) akan menunjukkan warna ungu kebiruan karena struktur dinding sel bakteri gram positif mengandung lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga ketika dilakukan pewarnan, zat warna akan terperngkap dalam lapisan tersebut dan sukar dihilangkan ketika dicuci dengan air maupun alkohol, sehingga zat warna dapat mewarnai bakteri jenis ini. Contoh bakteri dalam percobaan kami yang termasuk ke dalam bakteri gram positif adalah Staphylococcus, Streptococcus, dan Bacillus subtilis. Sedangkan bakteri gram negatif ketika dilakukan pewarnaan gram (ditetesi karbol kristal ungu, lugol, dan air fukhsin) akan menunjukkan warna ungu kemerahan karena bakteri tersebut tidak mengandung lapisan peptidoglikan sehinga ketika dlakukan pewarnaan kemudian dicuci dengn air maupun alkohol, zat warna tidak menempel dan akan larut saat dicuci. Contoh bakteri dalam percobaan kami yang termasuk ke dalam bakteri gram negatif adalah Escherichia coli, Pseudomonas araginosa dan Salmonella typhosa.
DAFTAR PUSTAKA 1. Radji, Maksum. 2012. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Depok: Fakultas Farmasi UI 2. Joyce,James.et al.2006. Prinsip – Prinsip Sains untuk Keperawatan.(diterjemahkan oleh: dr. Indah Retno .Jakarta:Erlangga 3. Radji, Maksum. 2013. Buku Ajar MIKROBIOLOGI : Panduan Mahasiswa Farmasi & Kedokteran. Jakarta:EGC 4. http://lib.ui.ac.id/file?file=digital/123049-S09076fk-Pola%20resistensi-Literatur.pdf
