LABORATORIO 6 SUELOS MICORRIZADOS

Laboratorio No. 6

Biotecnología agrícola

SUELOS MICORRIZADOS Prof. Diana Cárdenas Caro

Luisana Cristina Villamizar Flórez2 Ana María Arismendy Pabón2 Yenny Lorena Patiño Ramírez2

MATERIALES INTRODUCCION Los microorganismos tiene gran potencial para contribuir a la solución de múltiples problemas de la agricultura, dentro de los cuale cualess los los biofe biofert rtil iliz izant antes es con con base base en Micorri Micorrizas zas arbusc arbuscula ulares res (MA) (MA) son una alternativa para la nutrición de las plantas y recu recupe pera raci ción ón de los suel uelos. os. Estas stas asociaciones pueden ser utilizadas en la agricul agricultur turaa en forma forma de biofert biofertili ilizant zantes es tanto en vivero como durante el enraizamiento de vitroplantas, constituyéndose así, en una oportunidad valio valiosa sa para para soluc solucio iona narr probl problem emas as de micro icropr prop opag agac aciión, ón, acl aclimat imatac ació iónn y nut nutrici rición ón de dife difere rent ntes es espe especi cies es de importancia en la agricultura y reduciendo al mismo tiempo, los costosa de prod produc ucci ción ón ya que que requ requie iere renn una una menor apli plicación de ferti rtilizan zantes químicos, aguas de riego y plaguicidas y a su vez, permitiendo establecer sistemas de producción mas eficiente, precoces y productivo, que aumenten la sostenibilidad de los cultivos.

4 bolsas de vivero de 1 Kg,Suelo estéril (750g/bolsa), Cern Cernid idor or o cola colado dor r , Arena (250g/bolsa), Semillas de maíz (3/bolsa), Prop ropágul gulos de micor icorri riza zass (10 (10 mL/b mL/bol olsa sa)), Bala Balanz nza, a, Tami Tamice cess de 72 7200 y 35 3555 um, um, Cent Centrí rífu fuga ga ,Cajas petri, Frasco lavador , Espá Espátu tula la,, Tubos Tubos cent centrí rífug fugaa, Baño maria, Pinzas, Glicerol, azul tripan, HCL, KOH, Sacarosa, peróxido de hidrógeno.-

METODOLOGÍA Prep Prepar arac ació ión n del del Suel Sueloo en bols bolsas as de Vivero Cernir el suelo hasta obtener 7.5 Kg de suelo mullido y mezclar con 2.5 Kg de arena. Llenar 10 bolsas y esterilizar este sustrato en autoclave. Esto con el objeto de reducir la población contaminante del suelo a utilizar,

OBJETIVOS Reconocer la importancia de actividad simbiótica de las micorrizas en la producción vegetal. Desarrollar la metodología para el aislamiento de esporas microarbusculares y la observación de raíces colonizadas. . 1

Practica No. 6 Suelos Micorrizados Biotecnología Agrícola. Estudiantes de Ingeniería Biotecnológica, Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente, Universidad Francisco de Paula Santander. Santander. San José de Cúcuta, II Semestre 2008. 2

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AISLAMIENTO DE ESPORAS Y TINCIÓN DE RAÍCES COLONIZADAS Observación de Esporas.

analizar el crecimiento foliar y radical de las plantas de maíz.

Se pesan 100 gr de suelo y se pasan lavando con el chorro de agua a presión por los tamices de 720 /lm, 355 /lm y 38 /lm (o 45 /lm), colocados en el anterior orden. La fracción colectada en el tamiz de 38 /lm, se vierte con la ayuda de un embudo y un frasco lavador a los tubos cent entríf rífuga uga y se agreg rega agua hasta sta com complet pletar ar las las 2/4 2/4 part partes es,, se agit agitaa la suspensión con una espátula y se aplica al fondo del tubo con una jeringa plástica de 10 cc solución de azúcar hasta completar su volumen. Se centrifuga durante 3 minutos a 3500 r.p.m. Al finalizar la centrifugación, se recoge el sobrenadante en un tamiz de 38 o 45 /lm, lm, se enju enjuag agan an muy bien bien las espo espora rass con con agua agua corr corrie ient ntee y una una vez vez lavadas son colocadas en una caja Petri para su observación.

Lueg Luegoo de toma tomarr la mues muestr traa de suel sueloo fres fresco co,, se sele selecc ccio iona nann raíc raíces es qu quee se colocarán en tubos de ensayo. Las raíces seleccionadas al azar, se enjuagan muy bien para retirar las partículas de suelo adhe adheri rida dass a ella ellas. s. De Despu spués és de esto, esto, se agrega KÜH 10% hasta cubrirlas y se llevan van al baño María el cual se ha calentado con anticipación a 60 o 70°C durante 15 minutos. Pasado este tiempo, ser retiran los tubos y se dejan enfriar, se descarta el KOH y se enjuagan 3 veces con agua corriente (si se requiere tonar más claras las raíces después de descartar el KOH y sin enjuagar, se cubren las raíces con peróxido de hidrógeno, se deja reac reacci cion onar ar se desca descart rtaa y enju enjuag agan an las las raíces 3 veces con agua corriente). Posterior a esto se cubren las raíces en HCL HCL 10 10% % y se deja dejann a tem tempera perattura ura ambiente durante 15 minutos; pasado este tiem tiempo po se desc descar arta ta este este reac reacti tivo vo y se cubren las raíces con azul de tripano y se llevan los tubos a baño María durante 15 mino Al finalizar finalizar este tiempo, tiempo, se descarta descarta el azul y sin sacar las raíces de los tubos de ensa ensayyo se cubr cubren en con con agua agua hast hastaa utilizarlas para su análisis correspondiente. Segmentos de raíces ya teñidas de hasta 2 cm de longitud, se distribuyen al azar en una caja Petri y con ayuda de pinzas se colocan paralelamente en un portaobjetos, se les adiciona glicerol y se les coloca una lámi ámina cubr cubreo eobj bjet etos os.. Se real realiiza la observación de las raíces colonizadas en el microscopio

Tinción de raíces colonizadas.

INOC INOCUL ULACI ACIÓN ÓN DE ESPO ESPORAS RAS EN SUELO : Este vial con las esporas de los hongos de los hongos formadores de Micorrizas (HFM) se adiciona en cada bolsa mezclando previamente con el suelo (sólo en dos dos bols bolsas, as, las las otras otras queda quedann como como testig testigos os sin micorri micorrizas zas para realiza realizarr la com compara paraci ción ón). ). Ab Abri rirr un hoy hoyo en este este suelo y poner las tres semillas de maíz y tapa taparr el hoy hoyo. De Debe be fija fijars rsee que que las sem semillas llas no qued queden en más de 2cm 2cm de profundidad Regar frecuente hasta la capacidad de campo, no encharcamiento (saturación del suelo) Después de 2030 días dejar de regar para que se induzca la producción de esporas y además, puede 1


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ANÁL ANÁLISI ISIS S Y PRES PRESEN ENTA TACI CIÓN ÓN DE RESULTADOS

Raíz de la Planta Sin Espora

Raíz de la Planta Con Espora Despu spués de pasad sado el tiempo de la práctica se procedió a la medición de las raíces de cada una de las plantas a las cuales se les aplico el HFM y a las plantas testigo. Los resultados fueron los siguientes:

TESTIGO Raíz (cms) P1: 8 P2: 9 P3:10 P4: 7 P5: 5 Promedio: 7,8

Suelo con Esporas

TRATAMIENTO Raíz (cms) P1: 10 P2: 13 P3: 15 P4: 17 P5: 12 Promedio: 13,4

Teni eniendo endo en cuen cuentta los resu resulltados ados podemos decir que los tratamientos crecieron de forma más eficiente que las plantas testigo, lo que demuestra que las micorrizas son asociaciones benéficas que promueven un mejor desarrollo del área radicular de la planta.

Suelo sin Esporas

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CARACTERISTICAS ESPORAS Y COLONIZADAS

Con el crecimiento eficiente de la raíz, la planta puede realizar una un a mejor absorción de nutrientes que se traduce a un mejor crecimiento.

DE RAICES

Las raíces colonizadas colonizadas por micorrizas presentan varios pelos radicales salientes de las raíces primarias, son raíces alargadas; y la raíz primaria se dife difere renc ncia ia bien bien de las las otra otras; s; esta estass raíces tienen mas poder de absorción de nutrientes, ya que con ayuda del hon hongo pueden den penet netrar mas los suelos; el numero el nivel de lignificacion; el numero de cloropl cloroplast astos; os; etc debido debido a la mayor mayor absorci absorción ón de nutrie nutriente ntess las esporas esporas tienen una forma ovalada no son tan pequeñas y se ven coloreadas de negro.

DESCRIBIR LAS ESPORAS OBSERVADAS Y LA COLONI COLONIZAC ZACIÓN IÓN DE LAS RAÍCES RAÍCES EN EL MICROSCOPIO Esporas: Se puede observar la presencia de una espora color negra.

Consultar acerca de las características de los los difer diferen ente te géner géneros os Mico Micorr rriz izas as arbusculares Los Los ho hongo ngoss forma formador dores es de mico micorri rriza zass arbu arbusc scul ular ares es (HFM (HFMA) A) cons consttituy tuyen micor icorri riza zass qu quee col colon oniizan zan el teji ejido intr intrar arra radi dica call de la plan planta ta ho hosp sped eder era, a, do nd e desarrollan estructuras características de la simbiosis (arbúsculos y vesículas), así como micelio extr extrar arrad radic ical al,, el cuál cuál inte intera ract ctúa úa con el ecosist sistem emaa de la rizósfe ósferra y es el encargado de la toma de nutrientes del suelo. Es impo importa rtant ntee tene tenerr en cuent cuentaa que las las micorri micorrizas zas consti constituy tuyen en una asociac asociación ión mult multif ifun unci ciona onall con las las plan planta tas, s, cuy cuyos os beneficios van más allá de los aspectos nutricionales. Los HFMA so n considerados como un recurso biológico multipropósito cuyo manejo, además de los efectos sobre la productividad vegetal,

Raíces colonizadas en el microscopio.

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genera beneficios ambientales al mejorar las condi ndiciones físi físicco-qu -químicas y biológicas del suelo (Guerrero et al., 1996). Los beneficios desde el punto de vista biológico, se derivan de su interacción con con los dive divers rsos os grup grupos os de macro acro y microorganismos de la rizósfera. Tal es el caso de aquellos que están implicados en el reci recicl claj ajee de nutr nutriient entes com como las bacterias fijadoras de nitrógeno y los micr microo oorg rgan anis ismo moss solu solubi bili liza zado dore ress de fosfato (Azcón y Barea, 1996; Kim et al., al.,19 1998 98;; Ho Hodg dge, e, 2002 2002). ). Así Así mismo ismo,, dichos hongos interactúan c on microorganismos implicados en el control biológico de patógenos presentes en el suelo, demostrando que existen diferentes tipos de interacción con HFMA.

especia especiales les que están están involu involucra cradas, das, son todo un universo dispuesto a ser estu estudi diad adoo y apro aprove vech chad adoo de mane manera ra sost ostenible. Teniend endo en cuent enta la importa rtancia cia que ha cobr obrado en la actu actual alid idad ad la util utiliz izaci ación ón de produc producto toss biológicos (controladores biológicos y biofertilizantes) como complementos de las actividad dades agríc rícolas, as, resul sulta fundamental ampliar el conocimiento que se tiene hasta el momento de los efectos de la inoculación con micorriz rizas arbu arbusc scul ular ares es,, haci hacien endo do énfa énfasi siss en la relación de estos con otros micro icroor orga gani nism smos os del del suel sueloo y de la rizósfe rizósfera, ra, en especia especiall con aquello aquelloss que son utiliz utilizado adoss comerc comercial ialmen mente. te. En este este contexto, el objetivo del presente estudio es determinar las posibles interacciones entre HFMA y el controlador biológico

Para el caso de Trichoderma sp., se ha dem demostr ostrad adoo que que dife difere rent ntes es espe especi cies es pueden mejorar el desarrollo del sim simbionte micor corríc rícico y que esta sta inte intera racc cció iónn tien tienee infl influe uenc ncia ia sobr sobree el crec creciimien miento to de la plan plantta hosp hosped eder eraa (Calvet et al., 1993; Godeas et al., 1999). Trabajos Trabajos realizados realizados en diversas diversas partes del mundo ndo y con varios modelos, han combinado inóculos de HFMA con cepas de distintas especies de Trichoderma sp. E incl incluso uso con con otro otross micro microor organ ganis ismo moss como como fito fitopa pató tóge genos nos o prom promot otor ores es del crecimiento vegetal (Srinath et al., 2003). La existencia de interacciones semejantes es una muestra más de la complejidad de los los HFMA HFMA,, que que adem además ás de habe habers rsee adaptado a una simbiosis completa con las plantas superiores, parecen interactuar de form formaa perm perman anent entee y mucha muchass veces veces sinergística con la microflora del suelo. Las Las impl implic icaci acione oness evol evolut utiv ivas as de tale taless interacciones y las adaptaciones

Tric Tricho hode derm rmaa harz harzia ianu num, m, así así como como el efecto efecto de dichas dichas interac interaccio ciones nes sobre sobre el crec crecim imie ient ntoo de plan planta tass de Brac Brachi hiar aria ia decumbens, un pasto comúnmente usado en América tropical para el mante ntenimiento nto de ganado para la producción de carne. Dicha planta tiene exig exigen enci ciaa mode modera rada da en el rieg riego, o, sus sus semi semill llas as son fácil fáciles es de mani manipu pula lar, r, su follaje tiene una cobertura mínima (mayor densidad de plantas por unidad de área), tolera podas y es perenne; adic adicio ional nalme ment nte, e, es compat compatib ible le con con un amplio rango de HFMA y desarrolla un sistema radical amplio, características que debe debe tene tenerr un unaa plan plantta para para qu quee sea sea fácilm fácilmente ente micorri micorrizada zada (Ferrer (Ferreraa et al., al., 1993).

Describir las funciones de las micorrizas micorrizas y su efecto en la producción vegetal.

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Se puede ede afirm firmaar que que el pri princi ncipal beneficio que realizan las Micorrizas está rel relacio aciona nado do con con la nutr nutriición ción de las plantas. Este proceso de la nutrición por medio edio de las Mico Micorr rriz izas as est está, pues pues,, extr extrem emad adam amen ente te difu difund ndid idoo entr entree los los vege vegeta tale les, s, tien tienee nota notabl blee impo import rtan anci ciaa porque permite la vida de las plantas en determ determin inad adas as condi condici cione oness y facil facilit itaa la toma de los alimentos por parte de las plantas superiores, en competencia con la infinita y mucho mas adaptable microflora del suelo. Son Son mucho uchoss los bene benefi fici cios os que que nos nos brindan las Micorrizas para la plantas, que que las conv conviiert erten fiel fieles es ali aliadas adas de productores, empresarios, investigadores, cien cientí tífi ficos cos y pob pobla laci ción ón en gene general ral.. A continuación continuación tratamos tratamos de resumir las más importantes:

plantas (dunas de arena, suelos pobres, supe superf rfiicies cies deva devast stad adas as,, etc. etc.). ). Pero Pero tamb tambié iénn en el cult cultiv ivoo de plant plantas as bajo bajo buenas condiciones en comparación con otras, otras, se obtien obtienen en efectos efectos visibl visibles es muy positivos después de una inoculación suplementaria con Micorriza. El desa desarr rrol ollo lo óp ópti tim mo de los los cult cultiv ivos os dema demand ndaa un unaa elev elevad adaa apl aplicaci cación ón de fertilizantes minerales y pesticidas. El uso de dichos insumos químicos implica no solo un costo y requerimientos energéticos elevados, sino que su aporte indiscrim riminad nado pudiera prov rovocar problemas de salinización y cont contam amin inaci ación ón del del manto manto acuíf acuífer ero. o. El empl empleo eo de las las Micor Micorri riza zass signi signifi fica ca un ahorro de insumos y una mejor protección del medio ambiente.

Una mejor asimilación de los nutrientes en las plantas, que facilita un aumento de laproducción y mayor calidad biológica de ésta. Una mayor tolerancia de las plantas frente a much muchos os fact factor ores es de estr estrés és:: sequ sequía ía,, desequilibrios en el pH, altos contenidos de sales, exceso de viento, entre otros . Esto se debe a que facilita una adecuada evapo evapo-t -tra ransp nspir iraci ación ón de la plan planta ta y un mejor funcionamiento fisiológico de éstas en sentido general. Al esta estarr mejor ejor nut nutrida ridass las plan planta tas, s, promueve en éstas una mayor resistencia frente a organismos patógenos, mejor mejoran ando do su salud salud sin sin aplic aplicac ació iónn de agrotóxicos. agrotóxicos. Es sumamente sumamente importante importante para el crecimiento de las plantas. Ello tiene una mayor significación, en aquellas zona zonass o regi region ones es,, en las las cual cuales es los factores importantes para la producción agríc agrícol ola, a, se encu encuen entr tran an por por debaj debajoo del del estado óptimo para el desarrollo de las

La inoculación de las plantas con hongos mico micorr rriz izóg ógen enos os prov provoc oca, a, de mane manera ra general, un marcado incremento en los procesos de absorción y traslocación de nutrientes como: N, P, K, Ca, Mg, S, Zn, Cu, Mo, Fe, Mn, entre otros. Un aspecto de gran interés en el empleo de las Micorrizas es lo relacionado a la nutrición del Fósforo (P). Éstas desempe desempeñan ñan un importa importante nte pap papel el en la toma del P pres resente nte en los suel uelos principalmente en las zonas tropicales donde las cantidades de P asimilables a las plantas son frecuentemente bajas: Generalmente bajo estas condiciones, en la zona de crecimiento radical ocurre un rápido agotamiento del P, debido al pobre suministro del mismo provocado por la alta capacidad de fijación del elemento en el propio suelo. Los mecanismo smos químicos químicos involucrados involucrados en la absorción de este elemento por el hongo se desco descono nocen cen,, sin sin emba embargo rgo se sabe sabe que

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toma el P en forma de ion ortofosfato y lo transporta a través de las hifas en forma de polifosfato. Se logra una mayor eficiencia en el uso de los fertili fertilizant zantes es fosfóri fosfóricos cos aplica aplicados dos en suelos deficientes y con elevada capa apacidad de fij fijación de fosfa sfatos, predominantes en las zonas tropicales. Adem Ad emás ás del del efec efecto to dire direct ctoo sobr sobree el crecimiento de las plantas, el favore favoreci cimi mient entoo en la absorc absorció iónn del del P, aumenta el crecimiento de las raíces y la fijación biológica de N en plantas, el cual es deficiente en la mayoría de los suelos tropicales. Una mayor resistencia de las plantas a las toxinas. Por su parte, en suelos afectados por los efectos negativos de los metales pesados, se ha comprobado que las plantas micorrizadas poseen mayor

qu quee las las raíce raícess esta estaba bann colo coloni niza zada dass por ho hong ngos os form formad ador ores es de mico micorr rriz izas as;; la coloni colonizaci zación ón de hong hongos os formador formadores es de mico micorr rriz izas as se prod produc ucee medi median ante te un unaa identificación mutua planta-hongo en la rizos rizosfer fera, a, en regio regione ness próxi próxima mass a las las raíc raíces es nutri nutrici cias; as; este este recon reconoci ocimi mien ento to parece mediado por sustancias exudadas por la raíz que provocan el crecimiento del micelio y un biotropismo biotropismo positivo positivo del mismo hacia la raíz. Luego se produce el cont contac acto to inte interc rcel elul ular ar al form formars arsee una estructura llamada _apresorio_. En tercer lugar se producen cambios morfológicos y estr estruc ucttural urales es tant anto en los los teji tejido doss colo coloni niza zados dos po porr el ho hong ngo, o, como como en la orga organi niza zaci ción ón de la pare paredd celu celula larr del del sim simbion bionte te fúngi fúngico co,, y po porr últi último mo se produce una alteración de las actividades enzimáticas, que se coordinan entre los

resiste resistenci ncia, a, gracias gracias a la capaci capacidad dad que obtiene para inmovilizar los metales en la raíz, impidiendo que éstos pasen a la parte aérea de la planta.

simb simbio iont ntes es para para inte integra grarr sus proce proceso soss metabólicos. Se observo en las lecturas realizadas realizadas a las plantas de maíz para la medición de sus raíc raíces es qu quee las las plant plantas as test testig igoo tuvi tuviero eronn much muchaa dife difere renc ncia ia de crec crecim imie ient ntoo en comparación con las plantas a las que se les aplico las esporas; ya que las plantas tratam tratamient ientoo mostra mostraron ron un promedi promedioo de crec crecim imie ient ntoo de l3.4 l3.4 cm y las las plan planta tass testigo mostraron un promedio de 7,8; se noto bastante la diferencia lo cual indica qu quee las las plan planta tass sin sin mico micorr rriz izas as tien tienen en menor crecimiento, menos absorción de nu nuttrien riente tes; s; son son meno menoss resi resist sten enttes a cond condic icio iones nes adve adversa rsass qu quee las las plan planta tass micorrizadas; debido que no poseen los beneficios que brindan la relación simbiótica entre un hongo y la raíz de una planta.

DISCUSIONES En la rea realización de la prá práctica de labo labora rato tori rioo obse observ rvam amos os plan planta tass con con esporas, y otras que servían como testigo a las cuales no se les aplico esporas; las esporas eran los agentes formadores de micorrrizas; se puede notar la diferencia entr entree las las dos dos ya que que la que que cont conten enía ía esporas mostraba mejor apariencia debido a los benefi eficios obt obtenid nidos por las micorrizas. En la tinción de raíces tomadas de la palma africana se observo en el microscopio microscopio la presencia de una espora la cual se veia de color negro; esto indicaba

CONCLUSIONES

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BIBLIOGRAFIA

Se observo que a las plantas a las cuales se les les apli aplico co espo espora rass con con mico micorr rriz izas as mostraron un mejor crecimiento, ya que crec crecie iero ronn más más rápi rápido do que que las las plan planta tass testigo o las que no se les aplico esporas; las raíces presentaban mayor longitud, y el tallo era un poco más grueso; debido a la acci acción ón de las las micor micorriz rizas as las las cual cuales es hacen que la planta pueda aumentar la absorción de agua y sales minerales del suel suelo; o; por al acci acción ón simb simbio ioti tica ca crea creada da entre las raíces de la misma y un hongo.

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ALCALÁ DE MARCANO D., MARC MARCAN ANO O A. J., J., MORAL ORALES ES M. Patogenicida Patogenicidadd de Beauveria Beauveria bassiana bassiana y paecilomyces fumosoroseus sobre adultos del picudo de la batata Cylas formicarius elegantulus Summers (Curculionidae). Venezuela, 1999.

Disponible en: http://209.85.165.104/search? q=cache:bklTL22NRhMJ:www.revfacagr onluz.org.ve/v16_1/v161z005.html+paeci lomyces+fumosoroseus&hl=es&ct=clnk &cd=1&gl=co

En la tinción realizada a las raíces de la planta llevada al laboratoriose observo que eran muy delgadas, delgadas, pequeñas; lo cual indicaba que la planta carecía de hongos forma formador dores es de mico micorri rriza zas; s; debi debido do a su apariencia física. Las Las mico micorri rriza zass propo proporci rciona onann grand grandes es beneficios a la planta como son una mejor asimilació asimilaciónn de los nutrientes nutrientes lo cual que facilita un aumento de la producción y may mayor cali calida dadd biol biológ ógic icaa de ésta ésta,, una una mayor tolerancia de las plantas frente a mucho uchoss fact factor ores es de estr estrés és:: sequí equía, a, desequilibrios en el pH, altos contenidos de sales, exceso de viento, entre otros. Algunos hongos que como Trichoderma sp tien tienen en gran gran capa capaci cida dadd de form formar ar mico micorri rriza zass porqu porquee colo coloni niza zann el teji tejido do intr intrar arra radi dica call de la plan planta ta hosp hosped eder era, a, donde desarrollan es tructuras características de la simbiosis (arbúsculos y vesículas), así como micelio extrar extrarrad radic ical al,, el cuál cuál inte interac ractú túaa con el ecos cosistema de la rizós zósfer fera y es el encargado de la toma de nutrientes del suelo. 1


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