La ribonucleótido reductasa (RNR) es una enzima clave que media en la síntesis de desoxirribonucleótidos, los precursores de ADN, para la síntesis de ADN en cada célula viva.Esta enzima convierte ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos, los bloques de construcción para la replicación del ADN, y la reparación. Claramente, las enzimas RNR han contribuido a la aparición de material genético existente en la actualidad, siendo esencial para la evolución de todos los organismos de la Tierra. El control estricto de la actividad RNR y la piscina dNTP tamaños es importante, ya que los desequilibrios de la piscina aumentan las tasas de mutación, anomalías de replicación, y la inestabilidad del genoma. Así, la actividad RNR debe ser finamente regulada alostéricamente y en el nivel transcripcional. En esta revisión se analiza la distribución, la evolución y la regulación genética de RNR bacterianas. Por otra parte, esta enzima puede considerarse un objetivo ideal para los compuestos anti-proliferativos diseñados para inhibir la replicación celular en células eucariotas (células cancerosas), parásitos, virus y bacterias.
introducción Todos los organismos requieren la síntesis de ADN activo antes de la división celular. Un primer requisito para la síntesis de ADN es el suministro equilibrado de las diferentes desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs). La única vía bioquímica para de novo la síntesis de dNTP es la reacción catalizada por la enzimaribonucleótido reductasa (RNR ), que convierte los cuatro ribonucleótidos trifosfatos (PNT) en sus correspondientes dNTPs a través de la reducción del enlace C2 '-OH (véase la Figura 1 ) . FIGURA 1
Figura 1. La reducción de ribonucleótidos a desoxirribonucleótidos por RNR. Tres clases RNR diferentes (I, II, y III) han sido descritos para esta familia de enzimas. RNR es importante para la evolución, ya que esta enzima juega un papel importante durante la transición de un ARN a un mundo de ADN. Enzimas RNR catalizan la reducción de la ribosa C2 '-OH a C2'-H.
Ribonucleótido reductasa (RNR): estructura y mecanismos RNR utiliza química de radicales para catalizar la reducción de cada NTP. Cómo la enzima genera este radical, el tipo de cofactor y el metal se requiere, la estructura tridimensional de este complejo de enzima y la dependencia de oxígeno son todas las características que se consideran en la clasificación de RNR. En la actualidad, tres clases diferentes de RNR se han descrito (I, II, y III), y la clase I se subdivide en Ia, Ib, Ic y (véase la Tabla 1 ). Las tres clases RNR comparten una estructura de proteína tridimensional común en la subunidad catalítica y una estructura de barril α / β altamente conservada en el sitio activo de la enzima.Además, los dos centros alostéricos potenciales (especificidad y actividad) están altamente conservadas entre las diferentes clases RNR, aunque en la clase Ib, y
alguna clase RNR II sitio de actividad alostérico está ausente (revisado en Nordlund y Reichard, 2006 ; Hofer et al. 2012 ).
TABLA 1
Tabla 1. Resumen de las clases de RNR . Reducción de los cuatro nucleótidos diferentes (ATP / CTP / GTP / TTP) se produce en un solo sitio activo en cada cadena de polipéptido, por lo tanto, la regulación estricta de los niveles de dNTP es importante que cada célula que se divide. DNTP niveles desequilibrados podrían conducir a un aumento de las tasas de mutación ( Mathews, 2006 ). Por lo tanto, uno de los aspectos más importantes de la oferta dNTP necesaria para la síntesis y reparación del ADN es la regulación estricta de RNR en diferentes
niveles, incluyendo la regulación alostérica de la actividad enzimática, regulación transcripcional, y proteólisis específicos al ciclo celular en células de mamífero. Actividad RNR se controla en dos niveles diferentes: la especificidad de sustrato, en el que la unión de resultados diferentes nucleótidos en la reducción de cada NTP específico en el sitio activo, y la actividad enzimática, en los que la unión de ATP o dATP activa o inhibe enzimática
respectivamente actividad (Figura 2 ). Extensas revisiones relativas a la regulación alostérica a nivel bioquímico han sido publicados anteriormente ( Reichard, 1997 ; Nordlund y Reichard, 2006 ; Hofer et al, 2012. ; Ahmad y Dealwis, 2013), por lo que esta revisión se centrará en la RNR bacteriana en lugar de la RNR eucariota. FIGURA 2
Figura 2. Regulación alostérica de RNR. Modelo que muestra la regulación alostérica de la clase IA RNR. La unión de ATP en el sitio de especificidad de sustrato activa la enzima, promoviendo la reducción de CDP y UDP a dCDP y dUDP, respectivamente. Una vez formado, dTTP promueve la reducción del PIB a DGDP, que a su vez induce la reducción de la ADP a dADP. Una alta concentración de dATP inhibe la actividad global de esta enzima mediante la unión al sitio alostérico actividad.Símbolos más verdes indican la estimulación de la reducción de RNR, y menos símbolos rojos indican la inhibición.
Clase I RNR clase I son las enzimas más conocidos y más estudiados. Estas enzimas comprenden dos subunidades homodiméricas, a saber, R1 (o α) y R2 (o beta). La subunidad α contiene la subunidad catalítica, que contiene el sitio activo, donde se produce la reducción de nucleótidos, y dos sitios alostéricos, que participan en la regulación alostérica de la especificidad de sustrato y la actividad enzimática en general. La subunidad β alberga el metallocofactor esencial para la iniciación de la reducción de nucleótidos. La forma activa de RNR en eucariotas y procariotas comprende dos proteínas (R1 + R2 o α + β) asociada dentro de una formas oligoméricas diméricas u otros, tales como α n β m (donde n puede ser 2, 4 o 6 y m 1, 2, 3 o más). Varias revisiones y estudios han descrito previamente la base estructural para la regulación alostérica y montaje racimo de RNR de clase I ( Ando et al., 2011 ; . Hofer et al, 2012 ; Ahmad y Dealwis de 2013 ; . Tomter et al, 2013 ). RNR de clase I se pueden subdividir en clases enzimas Ia, Ib, Ic y (véase la Tabla 1 ) en función del tipo de centro metálico necesario para generar el radical proteína. Los nrdAB genes codifican enzimas de clase Ia, que requieren un centro de di-hierro (Fe III -O-Fe III ) en la subunidad nrdB (β) para generar el radical tirosilo. Los nrdHIEF genes codifican la clase Ib operón, con NrdE y NRDF que codifica la α y ß subunidades, respectivamente, NrdI que codifica una flavodoxina (Cotruvo y Stubbe, 2008 ; . Roca et al, 2008b ) y NrdH que codifica una proteína glutaredoxina similar (Jordan et al., 1997 ; . Crona et al, 2011 ). NrdI codifica una proteína específica implicada en la biosíntesis y el mantenimiento del centro de metal activo, y NrdH es el donante de electrones específico para el sistema enzimático NrdEF.
Ib RNR Clase protege a un centro de di-manganeso (Mn III -O-Mn III ) para generar el radical tirosil in vivo, aunque esto radical también se pueden generar con un centro-di férrico (Fe III -O-Fe III ) ( Cotruvo y Stubbe, 2010 , 2011 , 2012 ). El NrdE subunidad catalítica también difiere de la de otra clase RNR I porque esta enzima carece de la actividad del sitio en la región N-terminal de la proteína. Por otra parte, los nrdAB genes codifican clase Ic RNR, que se distingue de la clase Ia RNR, como se genera el radical proteína a través de un Mn IV -O-Fe III centro ( Jiang et al, 2007a. , B ; . Dassama et al, 2012 ). Durante la catálisis, el radical se forma en la subunidad β en las tres RNR de clase I y posteriormente transferido a la subunidad grande (α) a través de una vía de transferencia radical de largo alcance, la generación de un radical tiol en el sitio activo de la enzima, donde dos cisteínas son los responsables de la reducción de NTP ( Ekberg et al., 1996 ; Nordlund y Reichard, 2006 ; Cotruvo y Stubbe, 2011 ). Además, todos los RNR clase I requiere la presencia de oxígeno para la generación de un radical en condiciones aerobias.
clase II RNR Clase II comprenden un polipéptido de cadena única α codificada por un solo nrdJ gen. NrdJ alberga los sitios alostéricos y de centro activo de la enzima. Esta clase RNR utiliza S-adenosylcobalamine (AdoCob) para generar el radical cisteinil que sustituye la clase I pequeña proteína (ß subunidad) ( Tamao y Blakley, 1973 ; Licht et al., 1996 ). Esta reacción enzimática no requiere oxígeno, como esta clase RNR es completamente oxígeno independiente. RNR Clase II albergan un sitio alostérico especificidad, pero carecen de la actividad del sitio alostérico, similar a la clase Ib RNR ( Eliasson et al., 1999 ; . Larsson et al, 2010 ). Una clase excepcional II RNR se ha identificado en P. aeruginosa , y esta enzima se
diferencia de todos los conocidos hasta ahora RNR de clase II, ya que esta enzima se divide y se codifica por dos marcos de lectura abiertos consecutivos, a saber, nrdJa y nrdJb , separados por 16 pb ( Torrents et al., 2005 ).
Clase III RNR Clase III comprenden dos proteínas codificadas por homodiméricas nrdD y nrdG genes. NrdD es la gran subunidad catalítica enzimática, que alberga el sitio activo y los dos sitios de regulación alostérica, determinando respectivamente la especificidad y la actividad de sustrato. Además, la proteína NrdG (conocido como activase) es responsable de generar el radical ( Sun et al., 1993 , 1995 ). RNR Clase III requieren la unión de la S-adenosilmetionina (SAM) a un centro de metal 4Fe-4S situado en la proteína NrdG para la formación de radicales ( Eliasson et al., 1990 ). Esta interacción genera un radical en el dominio C-terminal de la proteína nrdD (glicil extremadamente sensibles al oxígeno Rey y Reichard, 1995). Debido a la alta sensibilidad del radical glicil y el potencial de oxidación centro metálico en presencia de oxígeno, esta clase RNR sólo está activo en condiciones anaerobias. Los experimentos en el Lactococcus lactis clase III RNR han demostrado que nrdD solo cataliza la reducción de los PNT ( Torrents et al., 2001 ). Después de la activación de nrdD, NrdG ya no se requiere y disociado del complejo. Proteína nrdD activado puede catalizar varias rondas de reducción de NTP en presencia de formiato como donante de electrones, con el ATP como el efector alostérico y que requieren Mg 2+ y K + para estimular la reacción ( Torrents et al., 2001 ). Esta reacción enzimática es similar a la de la E. coli sistema de enzima piruvato formato liasa (PFL) ( Kessler y Knappe, 1996 ), en la que PFL es el componente de la subunidad catalítica y PFL-activase inicia el sistema.
Regulación genética Una piscina desequilibrada de dNTPs conduce a un aumento en la tasa de mutación y la pérdida de fidelidad de replicación del ADN ( Wheeler et al., 2005 ; Mathews, 2006 ). Así, la actividad RNR debe ser altamente regulado, ya sea en el nivel de actividad enzimática a través de la
regulación alostérica, como se describe anteriormente, o en el nivel transcripcional. La mayoría de RNR, en ambos microorganismos y células eucariotas, están regulados transcripcionalmente en función del ciclo celular, como la replicación del ADN se produce principalmente durante la división celular, donde se necesita una alta concentración de dNTPs diferentes. En este caso, la regulación transcripcional de RNR en microorganismos, especialmente las eubacterias, se discute. Varios otros estudios han abordado anteriormente regulación de la transcripción eucariótica RNR ( Hakansson et al., 2006 ; Nordlund y Reichard, 2006 ; Thelander, 2007 ). La regulación transcripcional es compleja en los organismos que codifican más de una clase RNR, ya que este proceso es esencial para lograr una coordinación adecuada de la expresión de los diferentes NRDgenes para asegurar la concentración de enzima adecuada y proporcionar niveles de dNTPs equilibradas.Por ejemplo, en Escherichia coli , clase Ia RNR son activas durante el crecimiento en condiciones de laboratorio, mientras que la clase III enzimas son activas en condiciones anaeróbicas ( Boston y Atlung, 2003 ; Roca et al, 2008a. ) Y la clase Ib RNR son importantes durante el crecimiento en medio deficiente en hierro ( Martin y Imlay, 2011 ) y la formación de biopelículas ( Cendra et al., 2012 ). Sin embargo,Pseudomonas aeruginosa también expresan clase Ia RNR en condiciones de crecimiento de laboratorio (Jordan et al., 1999 ; . Torrents et al, 2006b ) y clase II y III RNR se expresan durante la infección ( Sjöberg y torrentes de 2011 ). Varios factores de transcripción (activadores e inhibidores) se han implicado para la regulación de la expresión de cada clase RNR durante el crecimiento bacteriano bajo ciertas condiciones ambientales. Por ejemplo ICIA, FIS, y DnaA son activadores de la transcripción de E. coli clase Ia
RNR, mientras que H-NS y NrdR actuar como represores de la transcripción ( Torrents et al., 2007 ; . Cendra et al, 2012 , 2013 ).RNR clase Ib se activan transcripcionalmente a través FUR ( Vassinova y Kozyrev, 2000 ; McHugh et al., 2003 ). Por otra parte, la clase III RNR son regulados transcripcionalmente a través de la proteína FNR (Boston y Atlung de 2003 ; Roca et al., 2008a ). En 2007 y 2008, se publicaron exámenes exhaustivos ( Herrick y Sclavi de 2007 ; . Torrents et al, 2008 ), relativa a la regulación transcripcional de ciertas clases de RNR en E. coli y otras bacterias; Sin embargo, en este capítulo, la atención se centrará en el regulador transcripcional descrito recientemente NrdR, implicado en la regulación de las tres clases de RNR.
NrdR-un regulador global de la ribonucleótido reductasa Publicaciones recientes han descrito la regulación transcripcional de diferentes clases RNR; Sin embargo, poco se sabe acerca de cómo la expresión de diferentes RNR podría ser coordinada en los microorganismos que codifican varias clases RNR. Un nuevo factor de transcripción, NrdR, recientemente se ha implicado en la regulación de las tres clases RNR través de la unión de cajas NrdR conservados en las regiones promotoras de casi todos los genes que codifican RNR ( Grinberg et al., 2006 ; Torrents et al., 2007 ; mowa et al., 2009 ; . Panosa et al, 2010 ; Case et al., 2011 ). Todo actualmente conocido codificar eubacterias y NrdR gen excepto que Rickettsia, Helicobacter , y Desulfovibrio . Los resultados obtenidos de un estudio reciente llevado a cabo en la Universidad de Tel Aviv (Israel) indican un papel para NrdR en la regulación de la transcripción de diferentes genes RNR codificados en un solo organismo. Este grupo fue el primero en identificar un marco de lectura abierto en Streptomyces coelicolor , la codificación de NrdR, una proteína que se une a las regiones promotoras de clase Ia y II RNR
( Borovok et al., 2004 ). Posteriormente, un estudio computacional comparando todas las regiones promotoras RNR a nivel genómico reveló una secuencia palindrómica altamente conservado, llamado el NrdR-caja, con la secuencia de consenso acaCwAtATaTwGtg ( Rodionov y Gelfand, 2005 ). Este NrdR caja ya ha sido identificado en los genomas de eubacterias y está ausente en arqueas y eucariotas. Típicamente dos copias de la caja NrdR se detectan sistemáticamente en la región promotora de diferentes NRD genes, con el espaciamiento específico correspondiente a un número entero de giros de la hélice doble de ADN. Actualmente, NrdR ha sido clasificado como un miembro de una familia altamente conservada de proteínas confinadas exclusivamente a procariotas, eubacterias, y algunos arqueas ( Lundin et al., 2009 ).NrdR es una proteína de ácido amino-150-200 albergar dos dominios de la proteína: un dedo de zinc N-terminal como el dominio de unión a ADN y un dominio ATP-cono de C-terminal que une los nucleótidos (Figura 4A ). El N-terminal contiene un motivo de la cinta de zinc para la unión a las regiones reguladoras aguas arriba de los NRD genes (NrdRbox). El dominio ATP es similar al dominio alostérico actividad observado en algunos RNR. El Streptomyces coelicolor proteína NrdR es la mejor caracterizada ( Grinberg y col., 2006 , 2009 ). Los estudios han demostrado que el dominio ATP-cono solo es esencial para la unión de nucleótidos y es importante para la estructura NrdR tridimensional correcta y la unión del ADN a la caja NrdR. Una hipótesis es que NrdR regula RNR transcripción al actuar como regulador de ATP / dATPdependiente que controla el estado oligomérico de NrdR. Por lo tanto, un oligómero nativo NrdR, probable que comprende ocho subunidades, se une ATP o dATP, y el dominio de dedos de chispa es libre de unirse al sitio diana de DNA para reprimir la expresión de genes RNR. Cuando el ADN se replica, los niveles celulares de dNTPs se reducen, NrdR se agota de dATP, y el dominio ATP-cono objeto de un cambio de un estado
oligomérica a una proteína dimérica, la supresión de su actividad de unión a ADN y el aumento de nrd transcripción (Figura 4B ). FIGURA 4
Figura 4. NrdR operón organización y el hipotético mecanismo de regulación de la transcripción por NrdR. (A) Estructura del NrdR operón y dominios de proteínas funcionales para el regulador transcripcional NrdR. (B) mecanismo hipotético para la regulación transcripcional de la nrd génica a través de NrdR. Dependiendo de qué nucleótido es atado y el estado de oligomerización de la NrdR, este factor de transcripción puede modular la expresión de los NRDgenes a través de la unión a la NrdR-box específico. Un estudio reciente informó un mecanismo más complejo de NrdRs de nucleótidos de unión a través de mecanismos alostéricos complejos controlados. Un modelo se ha propuesto, en la que se une selectivamente NrdR trifosfatos de nucleótidos, que se hidrolizan posteriormente para monofosfatos para regular el estado oligomérico NrdR y la unión al ADN ( McKethan y Spiro, 2013 ). Por lo tanto, NrdR podría ser un regulador de la transcripción con el mecanismo de unión a nucleótidos de cooperación y regulada alostéricamente complejo que finamente sintoniza la expresión del gen de la ribonucleótido reductasa en respuesta a los nucleótidos celulares.
Ribonucleótido reductasa como objetivo Biomédica RNR son enzimas esenciales para todos los organismos, ya que estas proteínas proporcionan los dNTPs necesarios para la replicación de los cromosomas y el ADN a reparar el daño. La contribución de RNR a estas reacciones clave hace que esta enzima un blanco perfecto para el diseño
de compuestos que inhiben el crecimiento celular en células con ciclos celulares alterados (células cancerosas) o durante infecciones virales, bacterianas o por protozoos ( Torrents et al., 2008 ) . RNR son enzimas complejas, y varios inhibidores de estas enzimas han sido descritos y clasificados de acuerdo con su modo de acción (Figura 5 ). El primer grupo de inhibidores identificados interactuaba directamente con la subunidad catalítica (R1), alternando la actividad enzimática a través de la unión irreversible al sitio activo de la enzima (análogos de sustrato o inactivadores de grupos sulfhidrilo) o de sitios de unión alostérica. Los inhibidores en el segundo grupo interactúan con la subunidad activador (ß) de clase I RNR, y se han identificado, ya sea como agentes quelantes de hierro el centro dinuclear o eliminadores de radicales. El tercer grupo de inhibidores comprende inhibidores antisentido, que son moléculas de ARN antisentido que se unen a ARNm que codifican los componentes de la enzima. Estos inhibidores antisentido han demostrado resultados prometedores en algunos tipos de cáncer. Por otra parte, existen inhibidores que impiden que la dimerización de los componentes enzimáticos, que son péptidos que imitan la interacción entre la subunidad catalítica y el activador (R1-R2) o las interacciones entre las subunidades catalíticas sí mismos (R1-R1) ( Torrents et al. 2008 ; . Wijerathna et al, 2011 ; Basu y Sinha, 2012 ; . Bhave et al, 2013 ; . Liu et al, 2013 ; . Zhou et al, 2013 ). FIGURA 5