Kromatografi dan Aplikasinya pada Bidang Lain Kata Kunci: kromatografi Ditulis oleh Muhammad Amin pada 24-06-2009 a. Pada Bidang Bioteknologi Dalam bidang bioteknologi, kromatografi mempunyai peranan yang sangat besar. Misalnya dalam penentuan, baik kualitatif maupun kuantitatif, senyawa dalam protein. Protein sering dipilih karena ia sering menjadi obyek molekul yang harus di- purified purified (dimurnikan) terutama untuk keperluan dalam bio-farmasi. Kromatografi juga bisa diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin dan molekul penting lainnya.
Dengan data-data yang didapatkan dengan menggunakan kromatografi ini, selanjutnya sebuah produk obat-obatan dapat ditingkatkan mutunya, dapat dipakai sebagai data awal untuk menghasilkan jenis obat baru, atau dapat pula dipakai untuk mengontrol kondisi obat tersebut sehingga bisa bertahan lama. b. Pada Bidang Klinik Dalam bidang clinical (klinik), clinical (klinik), teknik ini sangat bermanfaat terutama dalam menginvestigasi fluida badan seperti air liur. Dari air liur seorang pasien, dokter dapat mengetahui jenis penyakit yang sedang diderita pasien tersebut. Seorang perokok dapat diketahui apakah dia termasuk perokok berat atau ringan hanya dengan mengetahui konsentrasi CN- (sianida) dari sampel air liurnya. Demikian halnya air kencing, darah dan fluida badan lainnya bisa memberikan data yang akurat dan cepat sehingga keberadaan suatu penyakit dalam tubuh manusia dapat dideteksi secara dini dan cepat.
Sekarang ini, deteksi senyawa oksalat dalam air kencing menjadi sangat penting terutama bagi pasien kidney stones (batu ginjal). Banyak metode analisis seperti spektrofotometri, manganometri, atau lainnya, akan tetapi semuanya membutuhkan kerja ekstra dan waktu yang cukup lama untuk mendapatkan hasil analisis dibandingkan dengan teknik kromatografi. Dengan alasan-alasan inilah, kromatografi kemudian menjadi pilihan utama dalam membantu mengatasi permasalahan dalam dunia bioteknologi, farmasi, klinik dan kehidupan manusia secara umum. c. Pada Bidang Forensik Aplikasi kromatografi pada bidang forensik pun sangat membantu, terutama dilihat dari segi keamanan. Masih lekat dalam ingatan kita, sebuah peristiwa Black peristiwa Black September Tragedy mengguncang Amerika pada tanggal 11 September 2001 yang ditandai dengan runtuhnya dua gedung kesayangan pemerintah Amerika Serikat. Demikian halnya di Indonesia yang marak dengan aksi peledakan bom yang terjadi di mana-mana. Perhatian
dunia pun akhirnya mulai beralih dengan adanya peristiwa-peristiwa pengeboman/peledakan tersebut ke bahaya explosive (bahan peledak) dengan peningkatan yang cukup tajam. Kini kromatrografi menjadi hal yang sangat penting dalam menganalisis berbagai bahan bahan kimia yang terkandung dalam bahan peledak. Hal ini didorong karena dengan semakin cepat diketahuinya bahan-bahan dasar apa saja bahan peledak, maka akan makin mempercepat diambilnya tindakan oleh bagian keamanan untuk mengatasi daerah-daerah yang terkena ledakan serta antisipasi meluasnya efek radiasi yang kemungkinan akan mengena tubuh manusia di sekitar lokasi ledakan. Lebih jauh lagi, efek negatifnya terhadap lingkungan juga bisa segera diketahui. Pada dasarnya setiap bahan peledak, baru akan meledak jika terjadi benturan, gesekan, getaran atau adanya perubahan suhu yang meningkat. Dengan terjadinya hal-hal seperti ini, memberikan peluang bahan peledak tersebut berubah manjadi zat lain yang lebih stabil yang diikuti dengan tekanan yang tinggi, yang bisa menghasilkan ledakan dahsyat atau bahkan munculnya percikan api. Ada banyak bahan kimia yang biasa digunakan dalam bahan peledak, baik bahan peledak yang kerkekuatan tinggi maupun rendah, beberapa diantaranya adalah 2,4,6trinitrotoluene (TNT), siklonit (RDX), tetril , pentaeritritol tetranitrat (PETN) dan tetritol serta beberapa anion lain seperti perklorat, k lorat, klorida, nitrat, nitrit, sulfate dan tiosianat. Bisa dikatakan bahwa analisis organic ion (ion organik) dan inorganic ion (ion anorganik) memainkan peranan yang sangat penting pada saat investigasi lokasi ledakan bom berlangsung. Pendeteksian ion-ion anorganik misalnya, setelah pengeboman berlangsung, akan memberikan harapan karena tidak semua material dari bahan peledak tersebut ikut meledak pada saat terjadi ledakan. Bahan-bahan anorganik seperti klorat, klorida, nitrat, nitrit, sulfate, tiosianat, dan perklorat adalah bahan-bahan kimia yang biasa digunakan sebagai oksidator untuk low explosive (bahan peledak berkekuatan rendah). Pada gambar 1A di bawah ini adalah kromatogram dari analisis menggunakan metode kromatografi ion pada sampel standar yang telah diketahui ion-ionnya serta konsentrasi yang terkandung di dalamnya dan gambar 1B adalah kromatogram dari ekstrak serpihan sebuah ledakan bom.
Gambar 1A: Sampel standar yang diketahui anion dan konsentrasinya : (1) Cl-, (2) NO2-, (3) ClO3-, (4) NO3-, (5) SO4-2, (6) SCN- dan (7) ClO4-
Gambar 1 B: Kromatogram dari ekstrak serpihan sebuah ledakan : (1) Cl-, (2) ClO3-, (3) SO4-2 dan (4) puncak yang tidak diketahui 1). Gambar 1 A dan 1B. Perbandingan kromatogram dari sebuah analisis menggunakan teknik kromatografi ion. d. Dalam bidang lingkungan Dalam masalah lingkungan, sebagai konsekuensi majunya peradaban manusia, berarti permasalahan pun semakin “maju”. Salah satu permasalahan serius yang dihadapi oleh negara-negara berkembang dan utamanya negara maju adalah persoalan global warming (pemanasan global). Menurut survei National Institute for Environmental Studies, Japan, tahun 2006 lalu, bahwa masyarakat di Jepang memperkirakan tingkat pemanasan global merupakan masalah lingkungan paling serius dan tingkatannya hampir 7 kali lipat dari satu dekade yang lalu saat polling kali pertama dilakukan pada tahun 19972). Seiring dengan hal itu, permasalahan lingkungan pun semakin meningkat. Disinilah, teknik
kromatografi mengambil peran paling penting dalam environmental analysis (analisis lingkungan) ini. Pada dasarnya permasalahan lingkungan bisa dibagi ke dalam 3 bagian : water hygiene, soil hygiene dan air hygiene. Sebagai contoh, kualitas air (misal : air ledeng, air sungai, air danau, air permukaan) dapat diketahui salah satunya dengan mengetahui jenis anion dan kation yang terkandung dalam sampel air tersebut sekaligus jumlahnya. Apakah mengandung logam-logam berbahaya atau tidak. Demikian halnya pada daerah yang terkena acid rain (hujan asam). Antisipasi dini dapat dilakukan dengan mengetahui secara dini kandungan sulfate ion, SO42- (ion sulfat) dan nitrogen trioxide ion, NO3- (nitrogen trioksida) yang terdapat dalam air hujan tersebut. Terbentuknya hujan asam disebabkan gas sulfur oxide, SOx dengan uap air dan membentuk asam sulfat (H2SO4), demikian pula nitrogen oxide NOx dapat membentuk asam nitrat (HNO3) di udara. Reaksi-rekasi ini mengambil waktu berjam-jam atau bahkan berhari-hari di udara hingga akhirnya jatuh ke bumi dalam bentuk hujan asam. Di beberapa negara maju seperti Jepang, Amerika, Eropa, Kanada, dan beberapa negara lainnya, monitoring udara dan air hujan menjadi sangat penting tidak hanya untuk memperkirakan efek dari polusi itu tapi yang lebih penting lagi adalah memonitor progress (perkembangan) control polusi dari global ecology (ekologi global). Kontrol kondisi air hujan ini menjadi penting karena beberapa efek yang fatal yang mungkin bisa terjadi, di antaranya jatuhnya hujan asam dapat meningkatkan keasaman danau, sungai, bendungan yang pada akhirnya mungin dapat menyebabkan kematian pada kehidupan air. Demikian pula keasaman pada tanah da pat meningkat dan merembes ke air permukaan tanah yaitu sumber air minum sehari-hari. Gambar 2 mengilustrasikan sebuah kromatogram dari analisis air hujan yang dia mbil dari salah satu kota besar di Jepang dalam rangka memonitor kandungan anion sebagai
penyebab utama terjadinya hujan asam.
Gambar 2. Pemonitoran kandungan anion dalam sampel air hujan. Sampel A menunjukkan kromatogram untuk standar sampel yang diketahui ion dan konsentrasinya : (1) 0.6 mM Cl- ; (2) 0.2 mM SO42- dan (3) 0.2 mM NO3- . Sampel B menunjukkan kromatogram untuk sampel air hujan e. Aplikasi pada bidang yang lain Sebenarnya masih sangat banyak aplikasi kromatografi dalam bidang-bidang keilmuan lainnya. Beberapa aplikasi tersebut misalnya dalam industri kertas, pertambangan, proses logam, petrokimia, pertanian, kedokteran dan lain-lain. Namun karena keterbatasan ruang, dalam tulisan ini penulis hanya menampilkan beberapa contoh peran serta kromatografi dalam memudahkan dan mempercepat perolehan “target data” dalam beberapa bidang yang tersebut di atas. Referensi
1. http://www.fbi.gov/hq/lab/fsc/backissu/april2001/mmiller.htm 2).http://mdn.mainichi-msn.co.jp/national/news/20070109p2a00m0na026000c.html 3).http://www.tosohbioscience.com/biohome.html 4).http://www.metrohm-peak.com/
5).http://www1.dionex.com/en-us/index.html 6).http://www.krict.re.kr/english/e_equip/e_equ_a00.php
KROMATOGRAFI KERTAS DAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
Pendahuluan
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran didasarkan atas perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase diam (padat atau cair) dan fase gerak (cair atau gas) (Patnaik 2004). Teknik pemisahan ini memanfaatkan interaksi komponen dengan fase diam dan fase gerak serta sifat fisik dan sifat kimia komponen. Berdasarkan fase gerak dan fase diam yang digunakan, kromatografi dibedakan menjadi liquid-solid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud padat dan fase gerak berwujud cair), gas-solid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud padat dan fase gerak berwujud gas), liquidliquid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud cair dan fase gerak berwujud cair), dan gas-liquid chromatography (kromatografi dengan fase diam berwujud padat dan fase gerak berwujud gas) (Harvey 2000). Berdasarkan interaksi komponen dengan fase diam dan fase gerak, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi adsorpsi (kromatografi dengan teknik penyerapan komponen oleh adsorben tertentu), kromatografi partisi (kromatografi dengan partisi terjadi antara fase gerak dan fase diam), kromatografi pertukaran ion (kromatografi yang dapat memisahkan senyawa dengan afinitas ion yang berbeda dengan resin penukar ion), dan kromatografi permeasi atau filtrasi (kromatografi berdasarkan perbedaan bobot molekul) (Skoog et al 2002). Berdasarkan bentuk ruang penyangganya, kromatografi dibedakan menjadi kromatografi planar (kromatografi dengan fase diam terletak pada permukaan datar) yang meliputi kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis serta kromatografi kolom (kromatografi dengan fase diam tertahan pada sebuah kolom) yang meliputi
kromatografi manual,
high
performance
liquid
chromatography,
dan
kromatografi gas (Harvey 2000). Percobaan ini hanya melakukan aplikasi kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Prinsip dari kedua aplikasi tersebut adalah dengan
meneteskan sampel pada kertas di garis startnya berulang-ulang. Setelah kering, kertas dimasukkan dalam pelarut jenuh dan dibiarkan bergerak menuju garis finish. Kromatografi lapis tipis menggunakan lempeng tipis/ plastik yang dilapisi adsorben sebagai penyangga. Kromatografi kertas menggunakan kertas sebagai penyangga (Rouessac 2007). Tujuan Percobaan
Percobaan ini bertujuan melatih penggunaan analisis kualitatif dengan metode kromatografi lapis tipis (Thin Layer Chromatography) pada klorofil daun dan menentukan susunan logam pada uang logam Rp 100 berwarna kuning dan putih. Alat dan Bahan
Alat-alat yang dipakai adalah botol eluen, botol semprot, cawan petri, corong, corong pisah, gelas ukur 50 ml, kaca obyek, kertas saring, kertas kromatografi, lempeng porselin, pipet kapiler, dan tabung reaksi.. Bahan-bahan yang digunakan adalah aseton, NH4OH, Na2SO3 kering, petroleum eter, CuSO4 0,1 M, HCl pekat, NiSO4, klip plastik, dan uang logam Rp 100 warna kuning dan putih. Prosedur Percobaan
Percobaan kromatografi lapis tipis klorofil daun diawali dengan pembuatan ekstrak daun. Daun diiris halus, diambil sebanyak 1 gram, dimasukkan dalam mortar, ditambahkan sedikit pasir kuarsa, dan digerus selama 10 detik. Daun dipindahkan ke dalam tabung reaksi bertutup dan ditambahkan 4 ml aseton, ditutup, dan dikocok selama 10 detik. Campuran dibiarkan selama 10 menit. Ditambhan 6- 7 ml air dan dikocok. Petroleum eter 3 ml ditambahkan, dikocok, dan dipisahkan dengan sentrifus. Lapisan yang berwarna hijau dipipet ke dalam tabung reaksi dan dikeringkan dengan Na2SO4 anhidrat selama 15 menit. Larutan yang telah dikeringkan dituang ke dalam pinggan petri, diuapkan sebentar supaya lebih pekat. Larutan yang telah pekat dituang ke dalam tabung reaksi, lalu ditutup rapat. Larutan tersebut siap untuk dianalisis dengan metode kromatografi. Pada percobaan kali ini, pembuatan lapisan TLC tidak dilakukan karena lapisan TLC sudah tersedia. Selanjutnya pembuatan kromatogram dilakukan dengan eluen (campuran aseton dan PE (1: 9)). Sedikit ekstrak daun diteteskan dengan pipa kapiler di atas lapisan TLC pada jarak 1 cm dari tepi kaca bagian bawah. Pelarut dibiarkan
mengering. Lapisan TLC dimasukkan ke dalam botol yang berisi eluen dengan bagian yang ditetesi berada di bawah. Setelah cairan eluen naik sampai hampir di ujung lapisan TLC, maka lapisan TLC dikeringkan di udara. Komponen warna yang terpisah dicatat. Setelah kering, lapisan TLC dimasukkan dalam alat pemancar ultraviolet untuk membuat komponen pada lapisan TLC menjadi jelas. Komponen yang nampak dihitung nilai Rfnya dengan rumus . Pemisahan susunan logam pada uang logam diawali dengan uang logam dicuci dengan sabun dan disikat, kemudian dibilas dengan akuades. Uang logam tersebut diberi setetes HCl pekat dan ditunggu beberapa menit. Dari tetesan ini, dibuat spot uang logam, spot CuSO4, spot HCl pekat, spot NiSO4, jarak start-front, dan jarak dari tepi kertas bawah pada kertas kromatografi. Kertas digulung dengan klip plastik dan dimasukkan ke dalam toples yang berisi pelarut. Kertas dimasukkan ke dalam botol dengan garis start di bagian bawah. Pelarut dibiarkan naik sampai mendekati garis front. Kertas diangkat dan dikeringkan. Untuk menampakkan warna spot, kertas disemprot dengan NH4OH pekat. Dicatat warna dan jarak spotnya dari garis start. Dihitung nilai Rf masing-masing spot. Pembahasan
Pada percobaan ini, dilakukan analisis terhadap klorofil atau pigmen hijau yang ada pada daun dengan metode kromatografi lapis tipis atau thin layer chromatography (TLC). Selain itu, juga dilakukan analisis terhadap komponen logam yang terkandung dalam uang logam 100 rupiah berwarna kuning dan berwarna putih dengan metode kromatografi kertas. Pada percobaan TLC, daun diiris halus lalu digerus dengan sedikit pasir kuarsa agar mempercepat halusnya daun yang digerus. Daun yang telah halus ditambahkan aseton yang berfungsi untuk mengekstrak klorofil daun karena aseton bersifat nonpolar dan klorofil juga bersifat non polar sehingga dapat terekstrak. Setelah disentrifusa, ekstrak ditambahkan dengan Na2SO4 anhidrat untuk mengikat air yang masih terkandung di dalam ekstrak sehingga ekstrak klorofil murni mudah diambil. Fase diam pada percobaan ini adalah lapisan pelarut yang teradsorbsi pada permukaan adsorben berupa lapisan tipis (thin layer ) dan fase geraknya adalah bagian dari pelarut yang berfungsi menggerakkan eluen berupa aseton dan PE. Volume eluen aseton dan PE digunakan dalam perbandingan yang beragam. Perbandingan volume eluen aseton dan PE yang beragam digunakan untuk menentukan
perbandingan volume eluen yang paling baik untuk kromatografi lapis tipis pada klorofil. Pada perbandingan eluen aseton:PE = 1:9, dihasilkan dua spot dengan Rf masing-masing sebesar 0,1852 dan 0,3704. Pada perbandingan eluen aseton:PE = 9:1, dihasilkan satu spot dengan Rf sebesar 0,9390. Dan pada perbandingan eluen aseton:PE = 5:5, dihasilkan dua spot dengan Rf masing-masing sebesar 0,8987 dan 0,9620. Nilai Rf tersebut menunjukkan bahwa pelarut terbaik digunakan pada perbandingan 5:5 karena jumlah spot pemisahan yang banyak dan nilai Rf yang mendekati satu. Hal ini berarti jarak spot dari garis start hampir sama dengan jarak batas eluen dari garis start. Pendeteksian letak spot lebih mudah dilakukan dengan menggunakan penyinaran sinar ultra violet. Terdapat dua penjang gelombang yang digunakan, yaitu 366 nm dan 254 nm. Panjang gelombang efektif yang digunakan kemudian adalah 366 nm karena spot yang terlihat lebih banyak dan jelas. Pada percobaan kromatografi kertas, uang logam warna kuning dan putih dicuci dan disikat, kemudian ditambahkan tetesan HCl pekat sebagai pelarut pemisah komponen uang logam. Selanjutnya spot dari tetesan tersebut dirunning bersama dengan spot HCl pekat, NiSO4, dan CuSO4. Fase diam pada percobaan ini adalah lapisan pelarut yang teradsorbsi pada permukaan kertas berupa kertas kromatografi dan fase geraknya adalah bagian dari pelarut yang berfungsi menggerakkan eluen berupa campuran n-butanol, asam asetat glasial, dan air (untuk uang logam putih) dan campuran n-butanol, etanol, dan amoniak 2M (untuk uang logam kuning). Pada percobaan ini, kromatografi kertas dilakukan secara ascending dimana pelarut yang terdapat di bawah akan bergerak ke atas pada kertas yang tercelup didalamnya. Penjenuhan dengan uap pelarut bertujuan untuk mempercepat terjadinya elusi atau pergerakan komponen-komponen sampel pada media kertas kromatografi. Pada uang logam warna kuning, spot dari uang logam tersebut memiliki Rf sebesar 0,1068 dan spot dari NiSO4 memiliki Rf sebesar 0,1792. Namun, spot dari CuSO4 tidak bermigrasi secara berarti dan spot dari HCl pekat tidak terlihat. Berdasarkan literatur, spot uang logam warna kuning memiliki Rf yang sama dengan spot dari CuSO4 karena uang logam warna kuning tersebut mengandung tembaga (Nurcahyo 2007). Pada uang logam warna putih, tidak terbentuk spot dari uang logam tersebut dan HCl pekat, sedangkan spot dari NiSO4 menunjukkan Rf sebesar 0,1456 dan spot dari CuSO4
menunjukkan Rf sebesar 0,0500. Tidak terbentuknya spot dari uang logam warna putih disebabkan oleh eluen yang digunakan kurang jenuh. Berdasarkan literatur, spot uang logam warna putih tidak memiliki Rf yang sama dengan spot dari CuSO4 dan NiSO4 karena uang logam warna putih tersebut mengandung alumunium (Nurcahyo 2007). Perbedaan antara hasil percobaan dengan literatur menunjukkan masih terdapat kesalahan yang dilakukan dalam percobaan ini, antara lain kertas kromatografi tidak bersih dan dipegang dengan tangan, kesulitan dalam pengukuran jarak saat penyinaran dengan ultra violet, eluen yang digunakan kurang jenuh, dan uang yang digunakan sudah terkontaminasi zat lainnya. Simpulan
Kromatografi lapis tipis dapat digunakan untuk pemisahan komponen klorofil. Data percobaan menunjukkan bahwa perbandingan pelarut aseton:PE yang digunakan adalah 5:5 dengan Rf tertinggi sebesar 0,9620. Panjang gelombang ultra violet yang paling baik digunakan untuk mendeteksi keberadaan spot komponen klorofil adalah 366 nm. Kromatografi kertas digunakan untuk menentukan komponen yang terkandung dalam uang logam warna kuning dan putih. Uang logam warna kuning seharusnya mengandung tembaga dan uang logam warna putih seharusnya mengandung alumunium. Daftar Pustaka
Harvey D. 2000. Modern Analytical Chemistry. New York: McGraw-Hill Comp. Nurcahyo Priyadi. 2007. Nilai Mata Uang Logam. http://priyadi.net/archives/2007/04/27/nilaimata-uang-logam/. (13 Mei 2010) Patnaik Pradyot. 2004. Dean’s Analytical Chemistry Handbook. Second Edition. New York: McGraw-Hill Comp. Rouessac Francis, Annick Rouessac. 2007. Chemical Analysis: Modern Instrumentation Methods and Techniques. Second Edition. West Sussex: John Wiley & Sons, Ltd. Skoog Douglas et al . 2002. Fundamentals of Analytical Chemistry. Eight Edition. Canada: Thomson Learning.
