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Informe Nº 002 – 2013 / UNDAC / ING - MET
A
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Ing.: PALACIOS ESPIRITU CAYO Docente del curso de ANALISIS QUIMICO INSTRUMENTAL
DE
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ESPINOZA LAVARADO KLEVER BORJA BALDEON VICTOR BONIFACIO GILIAN MIGUEL CHAMORRO DAVILA BRINNER FERNANDES MACURI DAVID HINOSTROSA PABLO JHON
tengo grato dirigirme a usted, para informarle la siguiente trabajo de investigación información colectada y suministrada en el presente trabajo podría ser de utilidad en las posteriores prácticas del curso a seguir con el fin de tener una buena preparación como alumnos cuyo realización se efectuó en GRUPO
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INDICE 1.-introduccion........................................................................................................5 2.-objetivo................................................................................................................6 2.1.-objetivo general.-……………………………………………………………….…….6 2.2.-objetivos específicos………………………………………………………….……..6 3.-marco de referencia…………………………………………………………….…....7 3.1.-la última innovación del líder mundial en AA……………………………..……….7 3.2.-nuevas tecnologías asombrosas de la absorción atómica……………….……..7 3.3.-análisis mediante llama……………………………………………………..……….9 3.4.-análisis mediante horno de grafito………………………………………….…….10 3.5.-horno de plataforma de temperatura
estabilizada (stpf)………………..…..11
4.-horno de grafito................................................................................................12 4.0.-atomización de llama vs horno de grafito………………………………….…….13 4.1.-APLICACIONES ANALÍTICAS……………………………………………………….…..13 4.2.-fortalezas………………………………………………………………………..…..14 4.3.-limitaciones……………………………………………………………………..…...14 4.4.-MODO DE FUNCIONAMIENTO……………………………………………………...…..15 4.5.-descripción general del horno de grafito…………………………………………16 4.6.-secuenciaparaeltratamientodelamuestra………………………………………...16 4.7.-la atomización en flama se caracteriza por:……………………………………..22 4.8.-en horno de grafito se tienen las siguientes características………………...…23 4.9.-la atomización en generador de hidruros se caracteriza por……………….....24
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5.-interferencias....................................................................................................26 5.1.-interferenciasespectrales……………………………………………………..…...27 5.2.-interferencias no espectrales…………………………………………………..….28 5.3.-muestrador automático en horno de grafito…………………………………..…28 6.-técnica de generación de hidruros.-…………………………………………..…....28 6.6.-limitaciones de la técnica.-…………………………………………………...…....29 7.-ejemplo determinación de plomo en la sangre…………………………...…...30 1. objeto y campo de aplicación…………………………………………......…30 4. aparatos y material……………………………………………………………….32
5. toma de muestras……………………………………………………………………32 6. procedimiento de análisis…………………………………………….……….…..32 6.1. Limpieza de material……………………………………………………….…........33 6.2. Preparación de la muestra…………………………………………………..…….34 6.3. Preparación de patrones y curva de calibración…………………………..........35 6.4 determinación……………………………………………………………..…...........35 7. cálculos..............................................................................................................36 8. precisión……………………………………………………………………………....37 8.1. Coeficiente de variación……………………………………………………………37 8.2. Sesgo del método…………………………………………………………..…..…..38 8.3. Límite de detección………………………………………………………….…..…39 8.-glosario…………………………………………………………………………...…..41 9.-conclusiones y recomendaciones.-……………………………………….….....42 10.-bibliografia......................................................................................................43
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1.-INTRODUCCION La tecnología de horno de grafito fue el resultado de la necesidad de contar con una técnica que emplea a volúmenes mínimos de la muestra El presente trabajo es la Espectrometría de absorción atómica de horno de grafito (GFAAS) es también conocido como espectrometría de absorción atómica electro térmica (ETAAS).La técnica se basa en el hecho de que los átomos absorben la luz en las frecuencias o longitudes de onda característica del elemento de interés (de ahí el nombre de la espectrometría de absorción atómica). Dentro de ciertos límites, la cantidad de luz absorbida se puede correlacionar linealmente con la concentración de analito. Los átomos de la mayoría de elementos pueden ser producidos a partir de las muestras mediante la aplicación de altas temperaturas.
En GFAAS, las muestras se depositan en un tubo de
grafito pequeña, que puede ser calentado para vaporizar y atomizar el analito. Con el fin de mantener los estándares de calidad, se realizó la validación de la metodología la cual consistió en establecer los parámetros óptimos de operación del espectrofotómetro de absorción atómica Shimadzu AA 7000 tales como determinación de temperatura óptima para cada metal, parámetros de auto muestre ador, condiciones de respetabilidad y parámetros ópticos; se prepararon una serie de patrones, estándares y muestras de concentraciones conocidas, bajo los lineamientos del Standard methods for the examination of water and wastewater, a dichas soluciones se les realizaron siete ensayos durante siete días diferentes; el grupo de muestras se analizó por duplicado.
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2.-OBJETIVO 2.1.-OBJETIVO GENERALES.Validar los métodos de Espectroscopia de absorción atómica con horno de grafito, en las determinaciones de los metales Cadmio y Plomo en el agua potable y otros casos como la detección del plomo en la sangre mediante los hornos de grafito que en los trabajos realizados a dado mucha ayuda para el desarrollo de la tecnología.
2.2.-OBJETIVOS ESPECÍFICOS.Establecer las condiciones instrumentales experimentales para los análisis mediante ensayos previos con muestras patrón. Obtener las soluciones patrón con los rangos de concentración definidos y las muestras naturales y de referencia de acuerdo a la metodología planteada por medio de la técnica de espectrofotometría de absorción atómica con horno de grafito. Determinar las variables del método tales como límite de detección, límite de cuantificación y reproducibilidad para confirmar que el método de ensayo tiene cualidades de desempeño acordes con lo que la aplicación requiere. Documentar el procedimiento para la cuantificación de Cadmio y Plomo por espectrofotometría de absorción atómica por horno de grafito. Este método especifica el procedimiento a seguir y el equipo necesario para la determinación de plomo (Nº CAS 7439-92-1) en sangre por espectrofotometría de absorción atómica, en un intervalo de concentración de 5 a 100 μg de Pb/100 ml de sangre (0,24 a 4,82 μmol/litro) aplicable al seguimiento de poblaciones laborales potencialmente expuestas a plomo metálico y sus compuestos iónicos.
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3.-MARCO DE REFERENCIA.3.1.-LA ÚLTIMA INNOVACIÓN DEL LÍDER MUNDIAL EN AA. PerkinElmer, como líder reconocido de la Absorción Atómica, posee un amplio historial de innovación de productos, y mayor la base instalada de instrumentación de todo el mundo. Ahora el rendimiento de la AA está alcanzando nuevas cotas gracias a la revolucionaria serie PinAAcle. Con un diseño que incorpora diversos avances tecnológicos muy interesantes, la gama PinAAcle ofrece múltiples configuraciones y capacidades que permiten conseguir el nivel de rendimiento que necesita: Diseños sólo de llama, sólo de horno o apilados que incluyen los dos modos para ahorrar espacio. Funciones
de
llama,
horno,
inyección
de
flujo,
horno
FIAS
y
mercurio/hidruro en un único instrumento. Escoja corrección de fondo Zeeman longitudinal o de deuterio. Software WinLab32™ probado que ofrece facilidad de uso y una excepcional
flexibilidad.
Independientemente
del
modelo
que
elija,
descubrirá un sistema intuitivo y de alta eficiencia, capaz de simplificar el recorrido desde la muestra hasta los resultados, incluso con las matrices más difíciles. Obtenga un rendimiento máximo y una productividad sin igual. Pásese a la serie PinAAcle de PerkinElmer.
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3.2.-NUEVAS TECNOLOGÍAS ASOMBROSAS DE LA ABSORCIÓN ATÓMICA. Tanto si necesita las funciones de llama o el rendimiento mejorado del horno, encontrará la solución idónea para sus necesidades en los espectrómetros PinAAcle. La tecnología de vanguardia de fibra óptica crea un sistema óptico totalmente integrado que aumenta el rendimiento óptico para obtener los mejores límites de detección. Este camino óptico de nuevo diseño no sólo utiliza el 100% del haz, sino que también permite al instrumento tener el tamaño más reducido de todos los sistemas de AA de horno de llama/grafito combinados del mercado. El tamaño compacto del PinAAcle también es consecuencia de su exclusivo diseño apilado. En los modelos de horno/llama de modo dual, se coloca un conjunto de quemador de titanio sólido sobre el horno de grafito, y se puede retirar (y volver a colocar) rápida y fácilmente para cambiar la técnica analítica. Cada instrumento también incluye un compartimento versátil de 8 lámparas compatible con las lámparas de cátodo hueco (HLC) Luminay las lámparas de descarga sin electrodo (EDL) patentadas PerkinElmer. Estas últimas ofrecen una mayor sensibilidad y vida útil. El compartimento flexible permite: Configuración automática (con precalentamiento de la lámpara) para permitir una mayor productividad. Supervisión continuada del uso de la lámpara para ofrecer un rendimiento constante y unos resultados fiables.
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3.3.-ANÁLISIS MEDIANTE LLAMA.El modo de llama del PinAAcle presenta un diseño de doble haz verdadero para una rápida puesta en marcha y una estabilidad a largo plazo excepcional sin recalibración. La corrección de fondo de deuterio garantiza la máxima sensibilidad y precisión en un amplio rango de longitud de onda, y el asistente de alineación del quemador ajusta automáticamente la posición del quemador, vertical y horizontalmente. El software WinLab32 también incluye un asistente de optimización del flujo de gas para la medición de elementos específicos con la máxima sensibilidad. La aplicación del instrumento resulta más flexible gracias a varias opciones de nebulizador, disponibles en modelos de acero inoxidable o de alta sensibilidad y resistentes a la corrosión.
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3.4.-ANÁLISIS MEDIANTE HORNO DE GRAFITO Cambiar a modo de horno en el PinAAcle es tan fácil como retirar el conjunto de quemador para así poder acceder al horno. El instrumento, que se puede configurar con corrección de fondo Zeeman longitudinal o de deuterio, permite elegir la técnica que más se ajusta a sus análisis concretos. También le permite analizar desde las matrices de muestras más sencillas hasta las más complejas en el mismo sistema sin comprometer el rendimiento ni la sensibilidad. El diseño de la corrección Zeeman longitudinal patentado de PerkinElmer: Permite el calentamiento transversal del tubo de grafito, reduciendo drásticamente los efectos de matriz. Proporciona el doble de transmisión óptica que otros sistemas Zeeman. Permite alcanzar los mejores límites de detección posibles.
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3.5.-HORNO DE PLATAFORMA DE TEMPERATURA ESTABILIZADA (STPF) Sólo los sistemas de horno de grafito PerkinElmer utilizan la técnica STPF y garantizan la máxima precisión y exactitud así como los mejores límites de detección. La técnica STPF implica: Plataforma integrada Modificadores de matriz Máxima potencia de calefacción Parada de flujo de gas interno durante la atomización Corrección del desplazamiento de la línea de base Rápido procesamiento de datos mediante el área de picos Corrección de fondo Más de 15.000 usuarios de hornos de grafito PerkinElmerya utilizan la técnica STPF.
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4.-HORNO DE GRAFITO.La tecnología de horno de grafito fue el resultado de la necesidad de contar con una técnica que emplea a volúmenes mínimos de la muestra.
El espectrómetro de absorción atómica con cámara de grafito (GFAAS) permite trabajar con muestras de volumen muy reducido (inferior a 100 μL) o directamente sobre muestras orgánicas líquidas.
Habitualmente se analizan muestras de material biológico de origen clínico (sangre, suero, orina, biopsiashepáticas, etc.).
Por su elevada sensibilidad (nivel es de ppb), la técnica se aplica en la detección de metales en productos de alta pureza, como por ejemplo fármacos, alimentos (peces y carne) y productos industriales, y también en aguas de bebida y de acuíferos (determinación de la presencia de Cu, Cd, Pb, As, Hg, etc.) Un horno de grafito ideal debe cumplir los siguientes requisitos: Una temperatura constante en el tiempo y el espacio durante el intervalo en que los átomos libres se producen La
formación
de
átomos
cuantitativos
independientemente
de
la
composición de la muestra Control por separado de la volatilización y procesos de atomización Alta sensibilidad y buena límites de detección; un mínimo de interferencias espectrales
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ATOMIZACIÓN DE LLAMA VS HORNO DE GRAFITO
4.1.-APLICACIONES ANALÍTICAS.Clínicos y biológicos : sangre, orina, líquido sinovial Las muestras ambientales : aguas naturales, sedimentos, materiales vegetales Materiales industriales: aceros, productos derivados del petróleo
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4.2.-FORTALEZAS Muy buena detección de pequeños tamaños de la muestra Precio Moderado Instrumento muy compacto Pocas interferencias espectrales
4.3.-LIMITACIONES tiempo de análisis más lento Interferencias Químicas Limitaciones Elemento 1-6 elementos por determinación Rango dinámico Limitado
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4.4.-MODO DE FUNCIONAMIENTO La mayoría de GFAAS disponibles en la actualidad están totalmente controlados desde un equipo personal que tiene un software compatible con Windows. Muestras acuosas debe ser acidificada (normalmente con ácido nítrico, HNO
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a un pH de 2,0 o menos. La decoloración en una muestra
puede indicar que los metales están presentes en la muestra Por ejemplo, un color verdoso puede indicar un alto contenido de níquel, o un color azulado puede indicar un alto contenido de cobre. Una buena regla a seguir es analizar clara (relativamente diluida) las primeras muestras, a continuación, analizar de color (relativamente concentrada) muestras.
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4.5.-DESCRIPCIÓN GENERAL DEL HORNO DE GRAFITO. Consiste en un cuerpo de acero con ciertos sensores eléctricos y que acomoda en su parte central una cavidad para que sea colocado un tubo de grafito.
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Este tubo de grafito consiste en un tubo cilíndrico hueco de aproximadamente 4cm de altura y 1cm de diámetro, con un orificio en el centro para poder inyectar la muestra liquida que se desea analizar.
A través del cuerpo del horno de grafito, fluye agua para enfriamiento del sistema cuando así requiera, además de un gas inerte (Argón o Nitrógeno) que sirve como gas de protección del sistema.
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El gas inerte fluye exteriormente al tubo de grafito para evitar la oxidación provocada a altas temperaturas; e interiormente para desalojar los componentes volátiles que se produzcan. El calentamiento del horno y del tubo se hace por medio de una fuente de poder eléctrica controlada por un microprocesador. El microprocesador abre y cierra el gas inerte, sube la temperatura indicada, sostienen la temperatura el tiempo deseado, abre el flujo de agua para enfriamiento del horno después de la secuencia del programa completo, etc.
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4.6.-SECUENCIAPARAELTRATAMIENTODELAMUESTRA.Independientemente del modelo que elija, descubrirá un sistema intuitivo y de alta eficiencia, capaz de simplificar el recorrido desde la muestra hasta los resultados, incluso con las matrices más difíciles.
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PROCESO Evaporación del solvente
DESCRIPCION Evaporar el solvente por medio de la rampa de calentamiento, evitando que arrastre consigo partículas del analito.
Calcinación de la muestra
Eliminar los componentes orgánicos volátiles que la muestra puede contener.
Atomización
Una vez que se separa el solvente y los volátiles orgánicos se produce la atomización de los componentes residuales de la muestra. Calcinar y volatilizar el residuo de material que puede existir en la muestra analizada.
Limpieza del tubo
TEMPERATURA La muestra se calienta a una velocidad de 10°C/seg, hasta 120°C. La temperatura es superior a la de ebullición del agua para asegurar que todo el solvente se desprenda de la muestra a atomizar. Una vez alcanzada la temperatura de 600°C se sostiene durante 10 seg para asegurar la perdida de todos los volátiles. Se eleva la temperatura utilizando el máximo de potencia del equipo para alcanzar la temperatura de atomización en el menor tiempo posible. (2200°C) Se incrementa unos 100°C la temperatura (2400°C).
LECTURA DE LA SEÑAL La señal generada es muy rápida y debe ser procesada de tal forma. Los recientes avances en computación y electrónica han permitido que sea posible medir y tener una lectura en una pantalla de: Absorbancia (altura del pico), Absorbancia Segundos (área del pico) o concentración. Gracias a la rapidez del instrumento no hay distorsión de la señal.
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TUBOS DE GRAFITO Nuestro exclusivo grafito de alta densidad usado como materia base garantiza una calidad y una reproducibilidad sin precedentes. Tanto los tubos THGA como los HGA incluyen plataformas integradas para un rendimiento analítico excepcional, y cuentan con un revestimiento pirolítico completo que prolonga su vida útil.
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4.7.-LA ATOMIZACIÓN EN FLAMA SE CARACTERIZA POR: Gran parte de la muestra es desechada La velocidad de formación de átomos a partir de una solución o rocío de partículas no es muy eficiente El tiempo de residencia de los átomos en la flama es mínimo Se requiere de volúmenes de muestra relativamente grandes La población de átomos en la flama es baja comparada con la que se produce en una atomización sin flama Los límites de detección son del orden de ppm
4.8.-EN HORNO DE GRAFITO SE TIENEN LAS SIGUIENTES CARACTERÍSTICAS: Se requiere de cantidades mínimas de muestra La formación de átomos ocurre en segundos y la señal es instantánea pero muy intensa lo que permite mayor sensibilidad. Los límites de detección son de ppb Se pueden cuantificar elementos que por EAA en flama son problemáticos por ejemplo los que forman óxidos refractarios. Las interferencias por señal de fondo son más evidentes por lo que siempre es necesario contar con un corrector de fondo
4.9.-LA ATOMIZACIÓN EN GENERADOR DE HIDRUROS SE CARACTERIZA POR: La formación de átomos ocurre en segundos y la señal es instantánea pero muy intensa lo que permite mayor sensibilidad. Se requiere de volúmenes de muestra relativamente grandes Los límites de detección son del orden de ppb y hasta de ppt Se limita a elementos que forman átomos al agregar un reductor poderoso (mercurio, técnica de vapor en frío), o a los que forman hidruros volátiles que se descomponen fácilmente a la temperatura de la flama.
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5.-INTERFERENCIAS A) FISICAS.Sales, ácidos, sustancias orgánicas cambios en el transporte, temperatura, etc. (mismas propiedades físicas en muestra y patrones)
B) QUIMICAS Aniones que puedan formar sales refractarias con el analito Formación de óxidos, hidróxidos, etctérmicamente estables QUÍMICAS
5.1.-INTERFERENCIASESPECTRALES: Se deben al aislamiento incompleto de la línea emitida o absorbida por el elemento a analizar. Las principales interferencias o curren por: Absorción de radiación por traslapa miento de las líneas atómicas o moleculares emitidas por elementos y sustancias que se encuentran en la matriz, con la línea absorbida o emitida por el elemento a analizar. Dispersión de radiación emitida por la fuente, por partículas sólidas no volátiles formadas por efectos de la matriz. La superposición de líneas de resonancia Al: 308.215 nmV: 308.211 nm Banda de absorción de anchas
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5.2.-INTERFERENCIAS NO ESPECTRALES: Toda señal ajena a la señal del analito y que no tiene como causas la distorsión en la línea absorbida o emitida. La EAA en horno de grafito y generador de hidruros es esencial para determinación de metales a nivel de trazas en: lácteos, frutas y vegetales, aguas potables y residuales, en geoquímica, en metalurgia, etc.
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5.3.-MUESTRADOR AUTOMÁTICO EN HORNO DE GRAFITO Cuando no se tiene el muestreados automático, existe la posibilidad de pérdida de reproducibilidad en los resultados cuando la técnica de inyección de la muestra del analito en el tubo de grafito no se hace con cuidado y la reproducibilidad requerida. Los avances en robótica y microprocesadores han creado sistemas de automuestradores, que se programan de forma automática y repetitiva. Se utiliza un carrusel de 50 o 100 muestras y después, al término de las muestras, se cambia el carrusel si es necesario. Además, en el carrusel se puede cambiar la lámpara y los parámetros del instrumento para analizar la misma muestra por otro elemento diferente.
6.-TÉCNICA DE GENERACIÓN DE HIDRUROS.Hay algunos elementos que son difíciles de volatilizar con una llama o con un horno. Para estos elementos se utiliza la técnica de generación de vapor, ya sea formado el hidruro metálico del elemento (As, Bi, Sb, Sn, Se y Te) o directamente vapores como en el caso del Hg.
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Esta técnica es 5 o 10 veces más sensible comparada con el horno de grafito, para elementos como Arsénico, Bismuto, Selenio, Teluro y Estaño.
Es posible aislar completamente el elemento o el hidruro del elemento de las sustancias que acompañan la muestra. Esto tiene como consecuencia que casi no se tengan interferencias por efecto de matriz.
Se considera la más reciente de las técnicas de Espectrometría Óptica Atómica. Su uso no ha sido tan difundido, debido fundamentalmente a que es aplicable a pocos elementos, su sensibilidad es equivalente a otras técnicas atómicas o, de ser mayor, su reproducibilidad no es satisfactoria. Por ello, existen pocas compañías que comercializan estos instrumentos
6.1.-COMPARACIÓN EN LOS LIMITES DE DETECCIÓN ENTRE LAS TÉCNICAS DE HORNO DE GRAFITO Y GENERACIÓN DE HIDRUROS Volumen de muestra: Horno de Grafito = 100 μL y Generador de Hidruros = 50 mL.
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Se tiene un recipiente cónico en el fondo, donde se coloca la muestra a analizar. El fondo cónico tiene la finalidad de producir una agitación más intensa y homogénea, y el volumen de muestra es de 10 a 50 mL.
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Con la muestra se agrega HCl 1M para favorecer las condiciones reductoras y es posible agregar unas gotas de Permanganato de Potasio 1M, el cual le da un tinte rosa a la solución de muestra y al ocurrir la reducción completa la solución se dé colorar
por
completo,
lo
cual
garantiza
la
reducción
a
los
hidruros
correspondientes.
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6.6.-LIMITACIONES DE LA TÉCNICA.Está restringida a la cuantificación de elementos que formen hidruros volátiles a temperatura ambiente o que se reduzcan al estado elemental en condiciones apropiadas.
La cantidad de átomos que se pueden formar es mucho más en Generador de Hidruros, lo que indica que tiene menores límites de detección que los correspondientes al Horno de Grafito.
No tiene interferencias por señal de fondo, pues el analito se aísla de la matriz por volatilización.
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7.-EJEMPLO DETERMINACIÓN DE PLOMO EN LA SANGRE 2. OBJETO Y CAMPO DE APLICACIÓN Este método especifica el procedimiento a seguir y el equipo necesario para la determinación de plomo (Nº CAS 7439-92-1) en sangre por espectrofotometría de absorción atómica, en un intervalo de concentración de 5 a 100 μg de Pb/100 ml de sangre (0,24 a 4,82 μmol/litro) aplicable al seguimiento de poblaciones laborales potencialmente expuestas a plomo metálico y sus compuestos iónicos. La interferencia espectral provocada por la absorción inespecífica, que tiene lugar a la longitud de onda de trabajo, hace necesario el uso de un sistema corrector de la radiación de fondo. 3. FUNDAMENTO DEL MÉTODO.Las muestras de sangre se recogen en tubos de polietileno conteniendo EDTA-K2 (sal dipotásica del ácido etilendiaminotetracético) como anticoagulante. La sangre se diluye con un tensoactivo para facilitar su hemólisis. La cuantificación del plomo presente se efectúa por espectrofotometría de absorción atómica a 283,3 nm, utilizando cámara de grafito con plataforma de L'vov y modificación de matriz (9.1), frente a una curva de patrones acuosos. 4. REACTIVOS Durante el análisis, se utilizarán únicamente reactivos "para análisis".
4.1. AGUA DESTILADA O DESIONIZADA El agua será de grado 2 de pureza como mínimo, de acuerdo con ISO 3696 (9.6). El contenido en plomo será menor de 0,01 μg/ml.
3.2. octil-fenoxi-polietoxietanol (tritón x-100) 3.3. Dihidrógeno fosfato (v) de amonio (nh4) h2po4 3.4. Pirrolidinditiocarbamato de amonio (apdc) 3.5. Triclorometano (cloroformo).
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Precaución. Sustancia nociva. Frases (r): 20, frases (s): 2-24/25. Real decreto 2216/1985 (9.5). (2)
3.6. NITRATO DE PLOMO (II) PRECAUCIÓN. SUSTANCIA NOCIVA. Frases (R) 20/22-23; Frases (S): 13-20/21. Real Decreto 2216/1985 (9.5). (2)
3.7. DISOLUCIÓN DE PIRROLIDINDITIOCARBAMATO DE AMONIO DE 10 G/I Se pesa 1 g de APDC (3.4) y se disuelve en agua (3.1) completando hasta 100 ml.
3.8. DISOLUCIÓN DE TRITÓN X-100 AL 0,1% (V/V) Se depositan 0,5 ml de Tritón X-100 (3.2) en un matraz aforado de 500 ml y se completa este volumen con agua (3.1)
3.9. DISOLUCIÓN PATRÓN DE PLOMO DE 1 000 ΜG/ML. Se seca nitrato de plomo (II) a 120°C durante 4 horas y se deja enfriar en desecador. Se pesan 1,598 g y se disuelven en ácido nítrico a 1% (V/V) hasta completar 1 litro de disolución.
3.10. MODIFICADOR DE MATRIZ Se disuelven 5 g de di hidrógeno fosfato (V) de amonio (3.4) en la disolución de Tritón X-100 al 0,1% (V/V) (véase 3.8) hasta completar 500 ml (9.1). Se vierte esta disolución en un embudo de decantación de 1 litro de capacidad, se añade 1 ml de la disolución de APDC de 10 g/l (3.7) y se agita vigorosamente. Se añaden 20 ml de cloroformo y se agita de nuevo para extraer las trazas metálicas que pueda aportar el di hidrógeno fosfato (V) de amonio. Se deja decantar y se elimina la fase orgánica. Esta operación ha de repetirse las veces que sean necesarias para eliminar las trazas de plomo (generalmente 2 o 3). La disolución así preparada se conservará en botella de vidrio o polipropileno para su posterior utilización.
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4. APARATOS Y MATERIAL 4.1. TUBOS DE POLIETILENO Tubos de polietileno de 5 ml, exentos de plomo, conteniendo EDTA-K2 (sal dipotásica de árido etilendiaminotetracético) como anticoagulante.
4.2. CUBILETES DESECHABLES DE POLIESTIRENO Cubiletes desechables de poli estireno, de fondo cónico, de 2 ml de capacidad.
4.3. TUBOS DE GRAFITO PIROLIZADOS Tubos de grafito pirolizados, de 28 mm de longitud y 6 mm de diámetro interno, con plataforma de L'vov (9.1 y 9.2).
4.4. AGITADOR HOMOGENEIZADOR Agitador homogeneizador para las muestras de sangre.
4.5. PIPETAS AUTOMÁTICAS Y DOSIFICADORES Pipetas automáticas y dosificadores que cumplan los requisitos recogidos en ISO 8655 (9.7).
4.6. MATERIAL DE VIDRIO Material de vidrio. De boro silicato 3.3 de acuerdo con ISO 3585 (9.8).
4.7. CÁMARA DE GRAFITO Cámara de grafito capaz de satisfacer el programa de análisis propuesto en 6.4.2.
4.8. ESPECTROFOTÓMETRO DE ABSORCIÓN ATÓMICA Espectrofotómetro de absorción atómica equipado con lámpara de plomo y corrector de absorción inespecífica.
5. TOMA DE MUESTRAS La muestra de sangre venosa extraída con jeringa de polietileno o poliestireno se recoge en tubos de polietileno de 5 ml conteniendo EDTA-K2 como anticoagulante, mezclándola cuidadosamente. Las muestras se conservarán a 4 °C hasta el momento del análisis (véase Tabla 1 del Anexo A).
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6. PROCEDIMIENTO DE ANÁLISIS 6.1. LIMPIEZA DE MATERIAL 6.1.1. Todo el material de vidrio utilizado en el análisis después de su lavado con un detergente, debe mantenerse sumergido varios minutos en ácido nítrico al 50% (V/V) y ser después cuidadosamente enjuagado con agua (3.1). 6.1.2. Los tubos de grafitos nuevos y los usados, tras un período fuera de uso, deben acondicionarse siguiendo las recomendaciones del fabricante. 6.1.3. Las ventanas de cuarzo de la cámara de grafito deben limpiarse periódicamente para eliminar las salpicaduras que sobre ellas se depositan. 6.1.4 Los conos de plástico para los micros pipetas y los cubiletes de poliestireno deben mantenerse en sus bolsas de origen hasta el momento de su uso, para evitar cualquier contaminación.
6.2. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 6.2.1. La sangre se homogeneiza perfectamente en un agitador (4.4) una vez alcanzada la temperatura ambiente. 6.2.2. Se. Pipetean 600 μl del modificador de matriz preparado según 3.10, en un cubilete de fondo cónico (4.2). 6.2.3. Se añaden 50 μl de sangre con pipeta automática y con el mismo cono de plástico utilizado se remueve el contenido del cubilete hasta conseguir una completa homogeneización. La muestra así preparada está lista para su introducción directa en el horno de grafito.
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6.3. PREPARACIÓN DE PATRONES Y CURVA DE CALIBRACIÓN 6.3.1. Disoluciones de trabajo. A partir de la disolución patrón de plomo de 1.000 μg/ml (3.9) y con las diluciones pertinentes se preparan las disoluciones de trabajo de 0,2; 0,4; y 0,8 μl de Pb por ml de agua (3.1) 6.3.2. Se pipetean 600 μl de modificador de matriz (3.10) en los cubiletes de fondo cónico (4.2) en los cuales se van a preparar los patrones. 6.3.3. Se añaden 50 μl de cada una de las disoluciones de trabajo preparadas según 6.3.1 a los cubiletes que contienen modificador de matriz (6.3.2) y se agita el contenido del cubilete tal como se indicó para las muestras. 6.3.4. Blanco de reactivos. Corresponde a la adición de 50 μl de agua destilada (3.1) a 600 μl de modificador de matriz. Su lectura se restará de la obtenida para patrones y muestras antes de construir la curva de calibración. 6.3.5. Curva de calibración. De las lecturas, en área de pico, obtenidas para los patrones
preparados
según
6.3.2
y
que
corresponderán
finalmente
a
concentraciones de 0,2; 0,4; y 0,8 μl Pb/ml de sangre, se resta la lectura, en área de pico también, obtenida para el blanco de reactivos definido según 6.3.4. Se representan los valores corregidos de área de pico frente a sus correspondientes concentraciones, obteniéndose así la curva área de picoconcentración. Las concentraciones propuestas para los patrones son orientativas. Los patrones deben cubrir el intervalo de concentración de las muestras a analizar y a su vez encontrarse dentro de la región lineal de la gráfica de calibración.
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6.4 DETERMINACIÓN NOTA - MEDIDA DE SEGURIDAD No debe mirarse directamente al tubo de grafito durante el proceso de atomización para evitar posibles lesiones oculares debidas a radiación.
6.4.1 Se introducen 10 μl de patrones y muestras, preparados como se indicó en 6.2 y 6.3, en el horno de grafito con una pipeta automática o bien con un introductor automático si se dispone de él.
6.4.2 El análisis se efectuará con un programa de temperaturas y tiempos (9.4) lo más similar posible al siguiente
ETAPA
1 2 3 4 5 6 7
TEMP(°C) RAMPA(s) ISOTERMA(s)
110 200 800 850 1700 2600 20
10 10 10 5 0 1 1
10 10 10 5 3 3 4
ESPECIFIC ACIONES
secado secado mineralización mineralización (int. flujo) atomización limpieza recuperación
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6.4.3. Se mide el área del pico registrado, durante la etapa de atomización, a 283,3 nm. Es imprescindible utilizar corrección de la absorción no específica. Las determinaciones de muestras y patrones deben efectuarse al menos por duplicado. 6.4.4. El elevado número de variables que intervienen en la determinación y la dificultad en controlarlas todas ellas de forma precisa y continua, hace necesaria la introducción de muestras de sangre de concentración conocida entre las muestras reales. 6.4.5. Es importante en orden a obtener unos resultados reproducibles, asegurarse del buen estado de conservación de los contactores de grafito (cilindros), limpiándolos periódicamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante y cambiándolos cuando su grado de deterioro así lo aconseje.
7. CÁLCULOS
7.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PLOMO EN LA CURVA DE CALIBRACIÓN. La concentración de plomo en sangre de cada muestra, expresada en microgramos por mililitro, se determina directamente por interpolación de la lectura obtenida, restado el blanco 6.3.4, en la curva de calibración.
7.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PLOMO PRESENTE EN LA MUESTRA. Los resultados, expresados en microgramos de plomo por cien mililitros de sangre, se obtienen mediante la siguiente expresión:
C = c x 100 35
Donde C es la concentración de Pb en μg/100 ml de sangreC es la concentración de Pb en μl/ml leída en la curva de calibración.
NOTA.- Si el resultado quiere expresarse en micro moles por litro de sangre μmol/l se divide el resultado calculado en μg Pb/100 ml entre 20,72.
8. PRECISIÓN
8.1. COEFICIENTE DE VARIACIÓN El coeficiente de variación del método calculado a partir de los datos intralaboratorio resultó ser inferior al 3% en el intervalo de concentraciones ensayado (véase Tabla 2 del Anexo A). La repetibilidad (r) y la reproducibilidad (R) han sido evaluadas según la Norma ISO 5725 por medio de una prueba interlaboratorios cuyos resultados se recogen en la Tabla 3 del Anexo A. Los valores de r y R obtenidos en el intervalo de concentraciones ensayado son los siguientes:
Concentración Repetividad μg Pb/100ml
Reproducibilidad
Absoluta relativa
absoluta
relativa
32,32
1,77
5,49
7,93
24,54
58,12
2,92
5,02
8,98
15,45
77,86
4,30
5,53
13,40
17,21
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La relación funcional encontrada entre r y R con la concentración c se ajusta al modelo r(R)= a + bx. La Figura 1 muestra la representación gráfica de las relaciones funcionales encontradas. La diferencia entre dos resultados analíticos obtenidos en condiciones de repetibilidad (ó reproducibilidad) no deberá exceder, con una probabilidad del 95%, los valores de r y R obtenidos en las relaciones funcionales establecidas, para cada concentración.
FIGURA 1
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8.2. SESGO DEL MÉTODO El sesgo del método, evaluado mediante la utilización de Materiales de Referencia Certificados del B.C.R. (Oficina de Referencia de la Comunidad Europea) resultó ser no significativo (p < 0,05) en todo el intervalo de concentraciones ensayado. La Tabla 2 del Anexo A muestra los resultados de esta prueba.
8.3. LÍMITE DE DETECCIÓN El límite de detección calculado para el método, utilizando una muestra real de concentración próxima al blanco, de acuerdo con la definición de la I.U.P.A.C. es de 1,5 μg Pb/100 ml de sangre (n=8; K=3) (9.9 y 9.10). El intervalo de aplicación del método está comprendido entre 5 (K=10) y 100 μg Pb/100 ml de sangre.
GLOSARIO Analito: sustancia contenida en la muestra sometida a análisis.
Blanco: es un sistema físico que no contiene muestra real y por consiguiente no debería contener el analito de interés, pero que debe contener todos los reactivos que se utilizan en el método de análisis, y ser sometida a las mismas condiciones y al mismo procedimiento que las muestras reales y los estándares. En lugar de muestra, el volumen faltante se completara con agua grado reactivo que deberá tener la calidad recomendada por el método respectivo.
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Calibración: Conjunto de operaciones que establecen, bajo condiciones específicas, la relación entre valores indicados por un instrumento o valores representados por una medida material y el correspondiente valor conocido como una medida. Curva de calibración: Representación gráfica de la señal de medición como una función de la cantidad de analito Estandarización: Es un método analítico riguroso que dependiendo de la técnica analítica a la que pertenezca el método, la matriz el analito, la cantidad de parámetros de estandarización, y de la logística empleada para su desarrollo, puede requerir de un tiempo más o menos considerable.
Exactitud: Es la proximidad de concordancia entre un resultado medido y el valor de referencia aceptado.
Matriz de la muestra: Conjunto de todas aquellas especies químicas que acompañan al analito en la muestra.
Medición: Conjunto de operaciones que tienen por objeto determinar un valor de una magnitud.
Método de medición: Secuencia lógica de operaciones, descritas genéricamente, utilizada en el desarrollo de las mediciones.
Muestra: Se refiere a cada sistema físico que sea sometido al procedimiento de análisis siguiendo el método que se está estandarizando, ya sea un blanco, un estándar, una muestra adicionada, o una muestra real propiamente dicha. [4]
Linealidad: define la habilidad del método para obtener resultados de la prueba proporcionales a la concentración del analito. 39
Parámetros de estandarización: Son los resultados finales del proceso, expresados en forma clara y de acuerdo con las convenciones que se utilicen por la literatura especializada en el tema. Patrones: Los patrones, mejor las sustancias químicas patrón son especies químicas fáciles de obtener y purificar, y en particular estables en condiciones adecuadas de almacenamiento. Los patrones primarios son un grupo de sustancias utilizadas como referencia para diferentes análisis, de los cuales existe información general. Procedimiento
de
medición:
Conjunto
de
operaciones,
descritas
específicamente, para realizar mediciones de acuerdo a un método determinado.
Protocolo: Es la descripción especifica de un método, las instrucciones detalladas deben seguirse, sin excepción, si se quiere que los resultados analíticos sean aceptados para un propósito dado, como un análisis.
Recuperación: Es la fracción del analito adicionada a una muestra de prueba previa al análisis que es determinada efectivamente por el método.
Selectividad: Capacidad de un método para determinar exactamente y específicamente el analito de interés en presencia de otros componentes en una matriz de muestra bajo las condiciones de prueba establecidas.
Sensibilidad: El cambio en la repuesta de un instrumento de medición dividido por el correspondiente cambio del estimulo
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CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES.Esta técnica es muy útil, ya que permite utilizar pequeñas cantidades de la muestra para la determinación de trazas de elementos en diferentes tipos de sustancias como en los alimentos, orina, aguas y petróleos. Además tiene bajo costo y tiene pocas interferencias espectrales a la hora del análisis. Se determinaron las condiciones instrumentales experimentales óptimas para la metodología para la determinación de plomo en la sangre por espectroscopia de absorción atómica con horno de grafito. Se validó la metodología para la determinación de Plomo en la sangre empleando la técnica de espectroscopia de absorción atómica con horno de grafito, donde se realizó la medición por duplicado de estándares y muestras con matriz de agua tratada, durante siete días seguidos; con los resultados de éstos se demostró que el método es efectivo para la análisis de Plomo. Las soluciones patrón, las soluciones estándares y la solución blanco de reactivos, se deben preparar a partir de una misma solución madre y emplear la misma agua des ionizada para el aforo de las soluciones con el fin de evitar interferencias en la lectura. La limpieza periódica y mantenimiento al sistema de inyección es importante, por lo tanto se debe realizar ya que el mal estado de éste puede provocar fugas o errores al aspirar el volumen de muestra. Se recomienda utilizar inyección directa de la muestra y el modificador de matriz por el automestreador en lugar de permitir que el equipo los mezcle para su posterior inyección al horno.
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BIBLIOGRAFIA Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Validación de Métodos Analíticos.
–Monografía.
Comisión
de
normas de
buena
fabricación y control de calidad. 2001 LÓPEZ RUIZ, Martha Isabel. “Optimización del sistema de calidad analítica en el laboratorio de análisis de aguas de la Carder”. Manizales, 2003. 278 p. Universidad Nacional de Colombia. Departamento de Ingeniería Química. Métodos analíticos adecuados a su propósito, guía de laboratorio para la validación de métodos y temas relacionados. Segunda edición noviembre de 2005. Eurachem. pág. 48, 51-54, 57,58, 60,61 Protocolo estandarización de métodos analíticos. Bogotá noviembre de 1999 .Gustavo Alfonzo Coy. Instituto de hidrología, meteorología y estudios ambientales (IDEAM). Pág. 9,3. TEMA 1, INTRODUCCION AL ANALISIS QUIMICO. Análisis químico, Grado bioquímica. Curso 2011/12. Pág. 3 la revista de química útil. Mol Labs LTDA. Edición 17
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