FACULTAD DE CIENCIAS AMBIENTALES ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL
DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN DE TRIGLICERIDOS EN MICROORGANISMOS LENTICOS Huaman Siuce,Mercedes; Ricra Chavez, Ohaira; Quispe Apaza, Nohemi; Valverde Gaspar, Jasmin
LIMA, PERÚ 2017
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INTRODUCCIÓN El término eutrofización, se utiliza para distinguir aquellos lagos en los cuales el nivel nutritivo es particularmente alto (nitratos y fosfatos principalmente) y que se caracterizan por la proliferación de algas, cianobacterias y micrófitos en demasía, siendo una situación irreversible por los nutrientes acumulados (Margalef 1981). Es un proceso que se presenta en los ecosistemas acuáticos lénticos, las plantas que mueren y el aporte de materia orgánica producen mayor cantidad de materia en descomposición sobre las que actúan las bacterias aeróbicas haciendo que disminuya la cantidad de oxígeno disuelto en el agua, desarrollando condiciones hipóxicas o anóxicas, creando medios letales para el desarrollo óptimo de organismos vivos (Abella y Martínez, 2012). Los lípidos son la mayor fuente de energía de los organismos y representan uno de los principales componentes en el peso total de los mismos, esto se debe a los triglicéridos y a los fosfolípidos (Lopez et al 2010). Los procesos de eutrofización pueden ser determinados bioquímicamente, calculando la concentración de triglicéridos presentes en los microorganismos de un medio acuático, utilizando solventes orgánicos adecuados, que permitan desagregar las interacciones hidrófilas y los enlaces entre los lípidos y proteínas de membrana.( Corahua et al 2015) En cuanto a los métodos con determinación del glicerol, el triglicérido es hidrolizado para remover los ácidos grasos y así determinar el glicerol libre, cuya concentración es equivalente a la del triglicérido, para ello se utilizan técnicas químicas y enzimáticas. Las determinaciones enzimáticas se realizan en el glicerol contenido en las moléculas de triglicéridos luego de una hidrólisis química o enzimática (lipasas combinadas con proteasas) para remover ácidos grasos; ésta es una técnica directa, rápida y específica (Naito, 1990) A nivel mundial la eutrofización se ha convertido en una de las principales complicaciones de suma consideración en relación a la calidad del agua, las principales fuentes de contaminación por nutrientes causantes de eutrofización son la escorrentía agrícola y también las provenientes de aguas residuales domésticas (ONU-DAES, 2014). Se ha demostrado que la diversidad de especies disminuye y la flora y fauna cambia, así mismo el nivel de sedimentación aumenta, disminuyendo la durabilidad o provocando la colmatación el Ya que
lago.
la concentración de triglicéridos permite identificar si un medio acuático está en
proceso de eutrofización, lo cual es perjudicial ya que amenaza al ecosistema, el objetivo de este informe es determinar cuantitativamente los triglicéridos presentes en microorganismos de origen lagunar por métodos colorimétricos.
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MATERIALES Y MÉTODOS Materiales
1 Estufa
2 Tubos de Centrifuga Rey Germany de 15 ml
1 Micropipeta de metal 1000µm
Propipetas
1 Gotero de Plástico
Pizeta con agua destilada
1 Tubo Imhoff de 50 ml
1 Soporte de tubo Imhoff
Cuchara-espátula
Pipetas PYREX de 5mL
Beaker PYREX de 200Ml
1 Balde de capacidad 4.5 L
4 pares de guantes quirúrgicos
Muestra de agua de Laguna
Cucharón de muestra
1 Potenciómetro
1 Oxímetro
Reactivos
Cloroformo (4mL)
Reactivo enzimático para trigliceridos
Metanol (4 mL)
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MÉTODO Área de estudio Las recolecciones de muestras del presente estudio han sido tomadas en los distintos puntos de la laguna de los pantanos de villa I. Se tomarán 4 muestras de agua de manera aleatoria, el cual permitio profundizar en el análisis y proporciono mayor control de la muestra a estudiar. Se han determinado puntos diferentes, debido a que el agua se encuentra distribuida en forma variable. La importancia de tomar en distintos puntos se debe a que permita analizar con más precisión. La muestra varia de composición según la localización horizontal y la profundidad (López, 2014).
Preparación de la muestra y cuantificación Para la preparar la muestra, Se extrajo 1, 5 L de agua en cada punto mencionado anteriormente, luego se colocaron en un balde con la ayuda de un cucharon previamente lavados. Las muestras fueron transportadas para el proceso de análisis. Para identificar y analizar la muestra se realizó utilizando el método enzimático. (Velez y Salas, 2017). En el laboratorio se vertió la muestra 1L en el tubo de Imhoff de la muestra, la cual se dejó en reposo 30 minutos, seguidamente se retiró evitando suspender el precipitado hasta dejar 15mL en la base del Imhoff, los cuales fueron depositados en un tubo de centrifuga, posteriormente se pasó a pesar esté, para luego preparar un tubo de igual peso con agua destilada, estos fueron colocados en la centrifugados a 3000RPM durante diez minutos al terminar ello se eliminó el sobredenante. En el tubo del centrifuga el cual contenía el residuo, se le añadió 2mL de agua destilada y se homogenizó, después se le agregó 4mL de metanol y se agito por cinco minutos, después se incorporó 2mL de cloroformo para ser agitada durante dos minutos , asimismo se le echó 2mL de cloroformo, se homogenizo y se dejó en reposo, y se le agregó 2mL de agua destilada, homogenizo y se dejó en reposo; inmediatamente este fue pesado y se realizó la preparación de otro tubo con el mismo peso para ser colocados en la centrifuga a 3000RPM durante quince minutos, luego se retiró un pequeño volumen en un tubo pequeño del cual se extrajó 0.2 mL con ayuda de la micropipeta, el cual fue depositado en otro tubo pequeño que contenía la enzima sintética con 02mg/dL, estos fueron homogenizados, luego se incubo a 37º C por cinco minutos, por último se llevó a medir su absorbancia en el espectrofotómetro a 520nm.
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RESULTADOS DISCUSIÓN
CUESTIONARIO 1. ¿Dónde se encuentra principalmente los triglicéridos en las plantas y animales? Debido a su insolubilidad en medio acuoso, los triglicéridos se transportan en el plasma como integrantes de las lipoproteínas, junto con el colesterol (libre o esterificado).Se encuentran formando parte de las células y tejidos de los animales y vegetales. Los triglicéridos son principal forma de almacenamiento de energía. Los principales depósitos de grasa se encuentran bajo la piel (grasa subcutánea), alrededor de los órganos vitales y en las membranas que rodean a los intestinos. El tejido adiposo, tiene elevado contenido de triglicéridos, que se encuentra por todo el cuerpo, especialmente debajo de la piel, que impide la perdida de calor es decir que en los animales forman la mayor parte del tejido adiposo. En los vegetales son los aceites, en algunos vegetales se acumula en las semillas para darle sustento al embrión cuando empiece su desarrollo, la germinación, por lo que constituyen reserva de energía importante en las frutas y semillas (Billavos, 2001). Las semillas de ciertas plantas como las del girasol y el maní acumulan triglicéridos en organelas llamadas esferosomas, que ocupan el mayor volumen de las células del endospermas o de los cotiledones, cuando estas semillas germinan la grasa se utiliza para crecimiento hasta que la fotosíntesis se establece. Algunos frutos como las aceitunas y lo aguacates contienen triglicéridos, para atraer a los animales y así poder distribuir sus semillas (McKee y McKee, 2003).
2. Explicar la naturaleza antipático de los lípidos Los lípidos conforman una bicapa lipídica que por su naturaleza anfipatica forman una barrera entre dos compartimientos acuosos que delimitan membrana plasmática. Los lípidos de naturaleza antipática, son aquellos lípidos que poseen una cara hidrofilia, es decir afinidad al agua y otra hidrofobica, repelente al agua. La porción hidrofilica de la molécula reside en la cabeza del lípido La característica hidrofílica de la cabeza se debe a que aquí se encuentran moléculas polares, es decir que hay balance desigual de cargas positivas y negativas, lo que permite que reaccionen con el agua formando uniones electrostáticas y puentes de hidrogeno, por otro lado la porción hidrofobica está ubicada en las dos colas de la molécula. Estas poseen moléculas apolares, lo que significa que sus átomos no poseen o poseen poca carga por lo que no pueden interactuar con el agua. Un tipo de lípidos anfipaticos son los fosfolípidos, particularmente lecitina. (Va ́zquez y Va ́zquez, 2014 ), tienen tanto porciones hidrofobicas como hidrofilicas en su molécula. El glicerol junto con el ácido fosfórico y la colina constituyen la cabeza polar de una molécula del fosfolípido, mientras que las cadenas del hidrocarburo del ácido graso representan la cola no polar (Vasudevan, Sreekumri y 5
Vaidyariathan, 2011).
¿Cuál es la relación entre los lípidos y los xenobíticos orgánicos – sintéticos? Los xenobióticos son los productos químicos a los que está expuesto un organismo que son extrínsecos al metabolismo normal de ese organismo. Xenobióticos son utilizados para el control de plagas de insectos en cultivos, casas y jardines, o en el ganado. Las fuentes naturales de xenobióticos incluyen la proliferación de algas, desmineralización, y la solubilización de los sustratos de fondo, erupciones volcánicas, y filtraciones de hidrocarburos a partir de yacimientos de petróleo submarinos. Xenobiticos pueden conducir a lesión hepática después de la biotransformación en metabolitos altamente reactivos electrófilos. (Kretzschmar y Klinger, 1990). Debido a la naturaleza lipófila de estos conjugados, que pueden acumularse en varios órganos del cuerpo y causar manifestaciones tóxicas. (Gas, Bhupendra, Kaphalia y Firoze, 1995) La mayoría de las bioactivaciones son producidas por la enzima de la fase I, aunque algunas de las enzimas de la fase II también pueden bioactivar algunos xenobioticos.esto ocurre de la biotransformacion cuando se prodcuen especies químicas muy reactivas, por lo general a compuestos electrofilicos con gran afinidad por los nucleofilos. Los nucleofilos son el ADN, las proteínas y los lípidos. Por lo que se puede deducir que los lípidos son bioactivaciones de xenobioticos .Las plantas tienen sistemas de desintoxicación versátiles para contrarrestar la fitotoxicidad de la amplia variedad de productos químicos naturales y sintéticos de xenobióticos presentes en el medio ambiente. Un mecanismo de desintoxicación importante es la modificación química de los xenobióticos por enlace covalente a la tripéptido endógeno, glutatión (Coleman, Mechteld y Emyr, 1997).
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BIBLIOGRAFÍA
M´etodos para identificar, diagnosticar y evaluar el grado de eutrofia:
http://www.izt.uam.mx/newpage/contactos/anterior/n78ne/eutrofia2.pdf
CORAHUA (201)
“DETERMINACION DE TRIGLICERIDOS EN MICROORGANISMOS DE ORIGEN LAGUNAR”: http://giocorahua.blogspot.pe/2015/07/ucsur-determinacion-de-trigliceridosen.html Evaluación de un método enzimático para la determinación de triglicéridos: http://www.saber.ula.ve/bitstream/123456789/23887/1/articulo1.pdf
ONU: http://www.un.org/spanish/waterforlifedecade/quality.shtml
Read more: http://www.lenntech.es/eutroficacion-de-las-aguas/efectos-generales-de-laeutrofizacion.htm#ixzz4iT4YC5hR
Abella, J y Martínez, M. 2012. Contribución de un afluente tributario a la eutrofización del lago de tota .Revista Colombiana de Química. 41(2):243- 261. Naito, H. 1990. Triglicéridos. En Kaplan, L.; Pesce, A. Técnicas de laboratorio, fisiopatología - métodos de análisis. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires. pp. 1223 - 235. Margalef, R. (1981). Ecología. Editorial Planeta. Barcelona. 252 pp.
Billavos, E. (2001). FISIOLOGIA DE LOS CULTIVOS VEGETALES. 1st ed. Costa Rica: Universidad de costa rica, p.66. Coleman,J., Mechteld B.K.y Emyr , D. (1997). Detoxification of xenobiotics by plants: chemical modification and vacuolar compartmentation - ScienceDirect . [online] Volumen 2, (4) pp 144-151
GAS, A., Bhupendra, S., Kaphalia., M.Firoze K. (1995) conjugados de ácidos grasos de xenobióticos. ScienceDirect ., [online] Volumen 75(1), pp.páginas 1-17. McKee, T., McKee, J. (2003). Bioqui ́mica. 3ra ed. Madrid [etc.]: McGraw-Hill Interamericana. Va ́zquez, R. y Va ́zquez, R. (2014). Temas selectos de biologi ́a. 1st ed. Mexico: Javier Enrrique Callejas, p.35. 7
Vasudevan, D., Sreekumri, S. y Vaidyariathan, K. (2011). Ejercicios de revision. 6th ed. Mexico- Jalisco: Jaypee Highlights, p.79.
ANEXO
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