PRACTICA DE LABORATORIO N°5 “MICROPROPAGACION DE PLANTAS” “ESTABLECIMIENTO DE ROSA Y PIÑA. CULTIVO DE YEMAS Y MERISTEMOS VIA ORGANOGENESIS DIRECTA”
Jasson Javier Sierra Vargas-1610904, Xilena Rodriguez Oyola-1610919, Jefferson Eduardo Contreras-16109 Ingeniería Biotecnológ Biotecnológica ica Biotecnología Biotecnología Vegetal Vegetal Octubre de 2017
INTRODUCCION El cultivo de meristemos apicales es una alternativa de interés para la regeneración in vitro, debido a su menor dependencia del genotipo y a que puede utilizarse material donante de fácil establecimiento como los semilleros. Se inducen procesos de morfogénesis, vía organogénesis indirecta, en meristemos apicales caulinares, en medio basal MS. Los meristemos apicales se obtuvienen realizando cortes en la porción inferior del tallo de las plántulas. En general, se observaron dos tipos de callos: morfogénicos y no morfogénicos, diferentes en su estructura y crecimiento. El cultivo de tejidos ha sido considerado durante mucho tiempo como una mezcla de ciencia y arte. Fue considerada inicialmente como una técnica particularmente difícil de aprender. Sin embargo, estas dificultades de los comienzos están hoy en día prácticamente superadas gracias a factores como la disponibilidad de antibióticos, los medios de composición definida, las instalaciones asépticas (salas de cultivo limpias, cabinas de flujo laminar, incubadores estériles), dispositivos de cultivo (botellas
con tapones filtrantes, placas de Petri ventiladas). En esta práctica se constituyeron cultivos de organogénesis directa, tomando yemas no desarrolladas tanto de tallos de rosa y el meristemos de piña, se llevaron a un proceso de desinfección en tres soluciones, solución jabonosa, hipoclorito de sodio, alcohol , este período de desinfección se llevo a cabo en las diferentes aéreas del laboratorio teniendo en cuenta que comenzamos en la área no estéril hasta llevarlas a cámara de flujo laminar, ya desinfectados los explantes, se procedió a la siembra en cámara de flujo laminar y se llevo a incubación para su crecimiento.
OBJETIVOS
Obtener Habilidades para la extracción y siembra de los meristemos apicales Conocer las etapas de la orsa y piña mediante la siembra de yemas y meristemos con ayuda de la organogensis directa.
MATERIALES Y METODOS
Enjuagar 3 veces con la respectiva agua destilada estéril.
Material Vegetal: Yemas de Rosas pequeño grosor (6/estudiante). Yemas apicales de piña (3/estudiante). Agujas. Escalpelo.
PROCEDIMIENTO PRÁCTICA
DE
LA
Fase de preparación. 1. Se tomaron yemas de rosa, se separaron los segmentos de las yemas axilares, con la ayuda de tijeras o escalpelos.
PASAR AL AREA ESTERIL
PASAR AL FLUJO LAMINAR
Se limpian y rebajan los cogollos de piña con la ayuda de escalpelo y ampolleta.
2. Se procedió a la preparación de las soluciones desinfectantes: (c/u en un frasco de vidrio) Hipoclorito de sodio al 3 % Alcohol 70 % Solución Jabonosa.
5 minutos en solución de alcohol al 70 %. Enjuagar X3 veces en agua destilada estéril. 8 minutos en la solución de hipoclorito de Sodio al 3 %.
Enjuague 3 veces en agua destilada estéril En este paso las yemas quedan desinfectadas y fuera de cualquier patógeno externo que pueda llegar a provocar contaminación en el medio de cultivo.
PROCESO DE PREDESINFECCION Y DESINFECCION PARA YEMAS DE PIÑA
3. Se Lleva a cabo el proceso de desinfección como se describe a continuación:
PROCESO DE PREDESINFECCION Y DESINFECCION PARA YEMAS DE ROSAS. Someter a las yemas separadas a la siguiente cadena de desinfección dada en el laboratorio:
AREA NO ESTERIL
AREA NO ESTERIL
5 minutos en solución jabonosa.
5 minutos en la solución jabonosa Enjuagar 3 veces con agua destilada estéril
PASAR AL AREA ESTERIL
Someter a las yemas separadas a la siguiente secuencia de desinfección:
5 minutos en la solución de alcohol al 70 % Enjuagar 3 veces con agua destilada estéril 6 minutos en la solución de hipoclorito de Sodio al 3 %
PASAR AL FLUJO LAMINAR
y materiales del laboratorio de disección, sobre el papel estéril, la disección de la yema, se corta y implanta en el medio de cultivo.
Enjuague 3 veces con agua destilada estéril En este paso las yemas quedan desinfectadas y fuera de cualquier patógeno externo que pueda llegar a provocar contaminación en el medio de cultivo.
SE SIGEN LAS INSTRUCCIONES ANTEPUESTAS DEL PROFESOR. Cierre el frasco, salga de la cabina y rotule (Nombre, Fecha y Descripción). Ubique en el cuarto decrecimiento con las condiciones adecuadas para el crecimiento y desarrollo del explante.
FASE DE ESTABLECIMIENTO Dentro de la cabina de flujo laminar, se efectúa, con la ayuda de los instrumentos
RESULTADOS Fecha De Siembra: 27/09/17 Fecha De Evaluación: 03/11/17
Método De Regeneración: Organogénesis directa SP: Rosa
No CONTAMINACIÓN FENOLIZACI . ÓN Endógen Exógena 1 2 3 4 5 6 7 8 9
a -
-
-
-
0 0 0 0 0 0 0 0 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
Fecha De Siembra: 27/09/17 Fecha De Evaluación: 10/10/17
1 2 3 4
-
x
x
0 0 0 0
Altura -
OBSERVACIONE Raíces Brot S
-
e -
Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal
Método De Regeneración: Organogénesis directa SP: Rosa
No CONTAMINACIÓN FENOLIZACI . ÓN Endógen Exógena a -
CRECIMIENTO
0 0 0 0
CRECIMIENTO Altura -
OBSERVACIONE Raíces Brot S
-
e -
Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Descarte
5 6 7 8 9
-
-
x
x
0 0 0 0 0
0 0 0 0 0
Fecha De Siembra: 27/09/17 Fecha De Evaluación: 17/10/17
-
-
-
Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Crecimiento Normal Descarte
Método De Regeneración: Organogénesis directa SP: Rosa
No CONTAMINACIÓN FENOLIZACI . ÓN Endógen Exógena
CRECIMIENTO Altura
OBSERVACIONE Raíces Brot S
1 2
a -
-
x -
x -
2 1
2 1
-
-
e -
3 5 6 7
-
-
x -
x -
2 1 2 2
2 1 1 1
-
-
-
8
-
-
-
-
1
1
-
-
-
Fecha De Siembra: 27/09/17 Fecha De Evaluación: 24/10/17
Descarte No hay germinación. Inicio de fenolización. Descarte Crecimiento Normal Crecimiento Normal No hay germinación. Inicio de fenolización. Crecimiento Normal
Método De Regeneración: Organogénesis directa SP: Rosa
No CONTAMINACIÓN FENOLIZACI . ÓN Endógen Exógena
CRECIMIENTO Altura
OBSERVACIONE Raíces Brot S
2 5 6
a -
-
x x x
x x x
2 2 3
2 2 2
-
-
e -
7
-
-
x
x
2
1
-
-
-
Descarte Descarte No hay germinación. Inicio de fenolización. No hay germinación. Inicio de fenolización.
8
-
-
x
-
1
1
Fecha De Siembra: 27/09/17 Fecha De Evaluación: 03/11/17
-
-
son las yemas vegetativas de las plantas. Los frascos que contienen las plantas se ubican en estanterías con luz artificial dentro de la cámara de crecimiento, donde se fija la temperatura en valores que oscilan entre los 21 y 23°C, además de controlar la cantidad de horas de luz, humedad.
CONCLUSIONES.
Se pudo observar que pudo haber un poco de crecimiento pero por la lata contaminación no pudo tener más crecimiento.
CUESTIONARIO 1. ¿Cuáles son las condiciones ambientales que deben ser reguladas para el crecimiento de los explantes sembrados? Detalle en qué condiciones quedaron creciendo los explantes que usted sembró
El explante con más uso para los procesos de propagación in vitro
Crecimiento.
Método De Regeneración: Organogénesis directa SP: Piña.
ANALISIS DE RESULTADOS
Al observar los resultados podemos decir que la practica tuvo un mala asepsia por tanto la mayoría de explantes obtuvieron crecimiento de bacterias y hongos lo cual no se espera, esto se da porque el medio en ms, es un medio rico en nutrientes los cuales ayudan a la propagación de estos si no se tiene una buena asepsia y siembra.
-
Los explantes quedaron en la fase de establecimiento, durante el período de incubación, los cultivos no son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo, segarán creciendo hasta llegar a la fase de aclimatización donde serán expuestos al ambiente externo. 2. ¿Qué tipo de crecimiento debe esperarse de acuerdo al explante usado y a la composición del medio de cultivo? (Señale la composición del medio utilizado). Qué factores podrían afectar ese crecimiento? Explique su respuesta.
Se esperan plantas completas con el tejido caulinar y radicular bien desarrollado.
Composición del medio de rosa MS -100% Vitaminas -1ml/L Myo-inositol -100 mg/L 6Bap -2.5 mg AIA -1,5mg
Temperatura
Concentración de compuestos
Concentración de hormonas
Piña MS 100% Vitaminas 1 ml/L Myo-inositol 100 mg 6 Bap 2.5 mg AIA1.5 mg
Todos estos factores deben estar en un balance adecuado ya que podría afectar la formación y correcto desarrollo de las plántulas.
Los factores que afectan el crecimiento son:
Humedad
Ph
BIBLIOGRAFIA
Leinoso, R (2014), Regeneración in vitro vía organogénesis y aislamiento de protoplastos de gmelina arborea a partir de plantas in vitro. Calderon,Ana. Urrea, Aura. . (2011). Morfogénesis In Vitro A Partir De Yemas Apicales Y Bases De Hojas De Las Especies
ANEXOS
Fig.1. Contaminación y fenolozación grado 3 en rosa.
De Bromelias Aechmea Veitchii Y Racinaea Crispa. Extraído de: http://www.scielo.org.co/pdf/acbi/v33 n94/v33n94a2.pdf
Propagación de Plantas. (2016). Extraído de: https://www.uam.es/docencia/LA vanFis/CI/CharlaCultinvitro0607. pdf
Fig.2. Meristemos de piña en crecimiento observando contaminación.
Fig.3. Crecimiento Y contaminación de rosa.
