Indeks polaritas pelarut KLT
Pelarut-pelarut yang biasanya digunakan atau sering dikombinasikan dalam kromatografi lapis tipis adalah n-heksana, eter minyak tanah, karbon tetraklorida, eter, kloroform, etil asetat, asam asetat glasial, aseton, etanol, metanol dan air. Urutan ini berdasarkan bertambahnya sifat kepolaran dari pelarut tersebut. Memilih pelarut pengembang Umumnya fase gerak yang sering digunakan dalam kromatografi lapis tipis adalah berupa campuran dari pelarut organik dengan tujuan untuk memperoleh pemisahan yang lebih baik. Kombinasi pelarut berdasarkan atas kepolaritasannya, sehingga akan diperoleh sistem pengembang yang cocok. Dalam beberapa percobaan pelarut tunggal memberikan hasil yang memuaskan,akan tetapi pada sebagian percobaan pelarut tunggal dapat menggerakkan bercak terlalu jauh sehingga kombinasi pelarut yang mempunyai polaritas berbeda sering dikombinasikan dalam kromatografi lapis tipis (Gritter, 1991
Tinjauan Eluen Untuk KLT
a. Fase Diam Fase diam dalam KLT harus mudah didapat. Keistimewaan KLT adalah lapisan tipis fase diam dan kemampuan pemisahnya. - Silika Gel Pada umumnya sebagai fase diam digunakan silika gel. Untuk penggunaan dalam suatu tipe pemisahan perbedaan tidak hanya pada struktur, tetapi juga pori-porinya dan struktur lubangnya menjadi penting, di samping pemilihan fase gerak. Dalam perdagangan silika gel mempunyai ukuran 10-40µ. Ukuran ini terutama dipengaruhi oleh ukuran porinya yang bervariasi dari 20-50Å. Silika gel berpori 80-150 dinamakan berpori besar. Luas permukaan silika gel bervariasi dari 300-1000m2/g. Silika gel sangan higroskopis. Pada kelembapan relatif 45-75% dapat mengikat air 7-20%. Masalah aktivitasi silika gel tidak begitu mempengaruhi kebanyakan jenis pemisahan, tetapi deaktivitas silika gel merupakan hal yang perlu dipertimbangkan. Beberapa prosedur kromatografi terutama pemisahan yang menggunakan larutan pengembang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12% b/b. Derajat deaktivitasi ditentukan oleh kelembapan relatif kamar dimana pemisahan dilakukan dan lempeng silika gel disimpan. Ada beberapa macam silika gel yang beredar diantaranya: o
Silika gel dengan pengikat. Umumnya sebagai pengikat adalah CaSO4 (515%). Jenis ini dinamakan Silica Gel G. Disamping itu ada juga pati sebagai pengikat dan dikenal sebagai Silica Gel S. Tetapi penggunaan pasti mempunyai kelemahan, terutama jika penentuan lokasi bercak dengan asam sulfat.
o
Silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi. Jenis silika gel ini biasanya berfluoresensi kehijauan jika dilihat pada sinar ultraviolet panjang gelombang pendek. Sebagai indikator biasanya digunakan timah kadmium atau mangan-timah silika aktif. Jenis ini dikenal misalnya Silica Gel GF atau GF254.
o
Silika gel tanpa pengikat. Lapisan ini dibanding dengan yang mengandung CaSO4 menunjukkan lebih stabil. Beberapa produk dinamakan Silica Gel H atau Silica Gel N.
o
Silika gel tanpa pengikat tetapi dengan indikator Fluoresensi.
o
Silika gel untuk keperluan pemisahan prepartif. Untuk keperluan Pemisahan preparatif dapat digunakan Silica Gel PF254 + 366.
Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penyerap fase terbalik dengan cara menbacemnya menggunakan parafin cair. Minyak silikon, atau dengan lemak. Lempeng fase terbalik jenis ini digunakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid. b. Fase Gerak Pemilihan dari fase bergerak tergantung pada faktor-faktor yang sama seperti dalam pemisahan kromatografi kolom serapan. Sebaiknya menggunakan campuran pelarut organik yang mempunyai polaritas serendah mungkin karena mengurangi serapan dari setiap komponen dari campuran pelarut. Jika komonen-komponen yang mempunyai sifat polar yang tinggi (terutama air) dalam campuran cukup akan merubah sistem menjadi sistem partisi. Campuran yang baik memberikan fase-fase bergerak yang mempunyai kekuatan bergerak sedang, tetapi sebaiknya dicegah sejauh mungkin mencampur lebih dari dua komponrn terutama karena campuran yang lebih kompleks cepat mengalami perubahan fase terhadap perubahan suhu. Kemurnian dari pelarut adalah lebih penting dalam KLT daripada bentuk-bentuk kromatografi lain, karena disini digunakan sejumlah materi yang sedikit. Sistem yang paling sederhana adalah dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat dengan mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut ini adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimalkan fase gerak: o
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknik yang sensitif.
o
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
o
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil
eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga RF secara signifikan. o
Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuaran pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing-masing akan meningkatkan elusi solut-solut yang bersifat basa dan asam.
- Pelarut N-heksana n-heksana adalah senyawa dengan rumus kimia C6H14 yang merupakan hidrokarbon yang banyak digunakan sebagai pelarut organik yang memiliki sifat mudah menguap. "n" pada n-heksana mengandung arti normal yang artinya rantai hidrokarbonnya lurus atau linier yang dituliskan CH3-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3. nheksana sering digunakan pada saat penelitian pada proses ekstraksi. Hal ini dikarenakan n-heksana yang merupakan pelarut nonpolar. n-heksana banyak dipilih untuk proses pengekstrakan bahan alam yang akan diambil senyawa nonpolarnya karena n-heksana relatif murah dan relatif aman karena tidak mengiritasi kulit dan tingkat toksisitasnya relatif rendah. Namun, n-heksana akan mudah terbakar (flammable) jika n-heksana diletakkan di dekat api karena titik didih n-heksana yang rendah yaitu 69 °C. Sifat-sifat n-heksana antara lain o
Bobot molekul : 86,18 gr mol−1
o
Wujud : Cairan tidak berwarna
o
Massa jenis : 0,6548 gr/mL
o
Titik leleh : −95 °C, 178 K, -139 °F
o
Titik didih : 69 °C, 342 K, 156 °F
o
Kelarutan dalam air : 13 mg/L pada 20°C
o
Viskositas: 0,294 cP
o
Titik nyala: −23,3 °C
- Etil asetat Etil asetat adalah senyawa organik dengan rumus CH3CH2OC(O)CH3/ CH3COOC2H5. Senyawa ini merupakan ester dari etanol dan asam asetat. Senyawa ini berwujud cairan, tak berwarna tetapi memiliki aroma yang khas. Etil asetat merupakan pelarut polar menengah yang mudah menguap, tidak beracun dan tidak higroskopis. Etil asetat dapat melarutkan air hingga 30% dan larut dalam air hingga kelarutan 8% pada suhu kamar. Kelarutannya meningkat pada suhu yang lebih tinggi, namun senyawa ini tidak stabil dalam air mengandung basa atau asam. Etil asetat dapat dihidrolisis pada keadaan asam atau basa yang menghasilkan asam asetat dan etanol kembali. Katalis yang digunakan adalah asam sulfat (H2SO4), karena berlangsungnya reaksi. Reaksi kebalikan hidrolisis yaitu, esterifikasi ficher. Untuk memperoleh hasil rasio yang tinggi biasanya digunakan asam kuat dengan proposi stoikiometris, misalnya natrium hidroksida. Reaksi ini menghasilkan etanol dan natrium asetat yang tidak dapat di reaksi lagi dengan etanol. Sifat fisika dan kimia etil asetat dapat dilihat pada tabel dibawah ini: o
Berbau Khas
o
Titik didih: 77,1 0C
o
Mudah menguap
o
Densitas: 0,89 gr/cm3
o
Tidak Beracun
o
Berat Molekul: 88,12 gr/mol
o
Tidak Higroskopis
o
Tidak berwarna
Adapun mekanisme dan prinsip penampakan noda pada pegujian Kromatigrafi yaitu : a. Pada UV 254 nm Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel akan tampak berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi
cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. b. Pada UV 366 nm Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak berfluororesensi pada sinar UV 366 nm. c.
Pereaksi Semprot H2SO4 10% Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 10% adalah berdasarkan kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga panjang gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata. Anisaldehida asam sulfat Larutan A:
0,5 mL anisaldehida dalam 0,5 mL H2SO4 pekat, 9 mL EtOH 95% dan beberapa tetes HOAc.
Semprot dengan larutan A pada pelat
Panaskan sampai 105°C selama 25 menit
Tampak warna merah ungu atau ungu
c. Identifikasi dan Harga Rf Identifikasi dari senyawa-senyawa yang terpisah pada KLT lebih baik dikerjakan dengan pereaksi lokasi kimia dan reaksi-reaksi warna. Sebagian besar teori kromatografi kolom juga dapat diterapkan pada KLT. Konsep ” lempeng teori” lebih sukar
digambarkan disini, tetapi jelaslah bahwa pemisahan itu dilakukan oleh keseimbangan
berturutan cuplika dalam dua fase, satu diantaranya bergerak terhadap yang lainnya. Terjadi proses penyebaran molekul cuplikan karena proses nonideal. Tetapi lazimnya untuk identifikasi menggunakan harga Rf meskipun harga-harga Rf dalam KLT kurang tepat bila dibandingkan pada kertas. Derajat retensi pada klomatografi lempeng biasanya dinyatakan sebagai faktor retensi Rf. Faktor-faktor yang mempengaruhi gerak noda dalam KLT yang juga mempengaruhi harga Rf. - Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan. - Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya. Biasanya aktifitas dicapai dengan
pemanasan dalam oven, hal ini akan mengeringkan molekul-molekul air yang menempati pusat-pusat serapan dari penyerap. Perbedaan penyerap akan memberikan perbedaan yang besar terhadap harga-harga Rf meskipun menggunakan fase bergerak dan solute yang sama, tetapi hasil akan dapat d iulang dengan hasil yang sama, hanya akan diperoleh jika menggunakan penyerap yang sama juga ukuran partikel tetap dan jika pengikat (kalau ada) dicampur hingga homogen. - Tebal dan keratan dari lapisan penyerap. Meskipun dalam praktiknya tebal lapisan
tidak dapat dilihat pengaruhnya, tetapi perlu diusahakan tebal lapisan yang rata. Ketidakrataan akan menyebabkan aliran pelarut menjadi tidak rata pula dalam daerah yang kecil dari plat. - Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase gerak. Kemurnian dari pelarut yang
digunakan sebagai fase gerak dalam KLT adalah sangat penting dan bila campuran pelarut digunakan maka perbandingan yang dipakai harus betul-betul diperhatikan. - Derajat kejenuhan dari uap dalam bajana pengembang yang digunakan. - Teknik percobaan. Arah dalam mana pelarut bergerak diatas plat. (Metode aliran
penaikan yang hanya diperhatikan, karena cara ini yang paling umum meskipun teknik aliran penurunan dan mendatar juga digunakan). - Jumlah cuplikan yang digunakan. Penetesan culikan dalam jumlah yang
berlebihan memberikan tendensi penyebaran noda-noda dengan kemungkonan
terbentuknya ekor dan efek tak keseimbangan lainnya hingga akan mengakibatkan kesalahan-kesalahan pada harga-harga Rf. - Suhu. Pemisahan-pemisahan sebaiknya dikerjakan pada suhu tetap, hal ini
terutama untuk mencegah perubahan-perubahan dalam komposisi pelarut yang disebabkan oleh penguapan atau perubahan-perubahan fase. - Keseimbangan. Ternyata bahwa keseimbangannya dalam lapisan tipis lebih
penting dalam kromatografi kertas, hingga perlu mengusahakan atmosfer dalam bejana tidak jenuh dengan uap pelarut, bila digunakan pelarut campuran, makan akan terjadi pengembangan dengan permukaan pelarut yang terbentuk ceku ng dan fase bergerak lebih cepat pada bagian tepi-tepi daripada dibagian tengah. Keadaan ini harus dicegah.
