PRÁCTICA 3: IDENTIFICACIÓN CUALITATIVA DE LÍPIDOS EN UN TEJIDO ANIMAL Jairo Mejia1 (25051801), Paula Ortiz2 (2553910); GRUPO 8 UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE QUÍMICA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA Palabras clave: biomoléculas, soluble, solvente, ácidos grasos, fosfolípidos y colesterol Objetivos generales: Identificar las diferencias existentes entre las moléculas de CHOS, CHON, lípidos y ácidos nucleicos, y observar su comportamiento de solubilidad en solventes orgánicos a una temperatura determinada. Emplear las solubilidades diferenciales y la centrifugación como método para fraccionar ● un tejido animal. Por medio de la observación identificar los componentes lipídicos de la muestra. Analizar la acción de los ácidos en las moléculas de CHOS, CHON, lipidos y acidos ● nucleicos y comprender el fundamento de sus diferencias por medio de la observación de cambios físicos. Objetivos específicos: ●
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Comprender las propiedades de los lípidos, su comportamiento y clasificación estructural, e identificar las diferencias entre estos grupos ( grasas, fosfolípidos, ceras y esteroles) Relacionar el comportamiento de los lípidos según su estructura con la función que desempeña en el organismo.
INTRODUCCIÓN Los lípidos son un grupo heterogéneo de biomoléculas. Se consideran lípidos lípidos moléculas como las grasas y los aceites, los fosfolípidos, los esteroides y los carotenoides, que se diferencian mucho en estructura y función. A causa de su diversidad, el término lípido tiene una definición más operativa que estructural (Mckee et al., 2003). Tienen la propiedad común de ser: 1) relativamente insolubles en agua y 2) solubles en los solventes no polares como el éter, el cloroformo y el benceno (Harper, 2001). Los lípidos pueden clasificarse de muchas formas diferentes. En el cuerpo humano se dividen en cuatro clases diferentes de acuerdo a su estructura: grasas, fosfolípidos, ceras y esteroides como el colesterol. A continuación se considera cada una de estas clases.
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Jairo E. Mejía Benavides, B enavides,
[email protected],
[email protected], UNAL-Bogotá, UNAL-Bogotá, Est. Ing. Agronómica. Paula Andrea Ortiz Rubio, paaortizru@una p
[email protected], l.edu.co, UNAL -Bogotá, Est. Nutrición y dietética.
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Las grasas o ácidos grasos son ácidos monocarboxílicos que contienen típicamente cadenas hidrocarbonadas de longitudes variables (entre 12 y 20 carbonos). Este tipo de lípidos son componentes importantes de varias clases de moléculas lipídicas. Se encuentran principalmente en los triacilgliceroles y varias clases de moléculas lipídicas unidas a las membranas. La mayor parte de los ácidos grasos naturales posee un número par de átomos de carbono que forma una cadena sin ramificar (Mckee et al., 2003). Los fosfolípidos son los primeros y más importantes componentes estructurales de las membranas. Además, varios fosfolípidos son agentes emulsionantes y agentes superficiales activos. (Un agente superficial activo es una sustancia que disminuye la tensión superficial de un líquido, normalmente el agua, de forma que se dispersa por una superficie.) Los fosfolípidos son muy adecuados para estas funciones ya que son moléculas anfipáticas. A pesar de sus diferencias estructurales, todos los fosfolípidos poseen dominios hidrófobos e hidrófilos. El dominio hidrófobo está formado en gran parte por las cadenas hidrocarbonadas de los ácidos grasos; el dominio hidrófilo, que se denomina grupo de cabeza polar, contiene fosfato y otros grupos cargados o polares (Mckee et al., 2003). Las ceras son mezclas complejas de lípidos apolares. Son cubiertas protectoras de las hojas, los tallos y las frutas de los vegetales y la piel de los animales. Los ésteres formados por ácidos grasos de cadena larga y alcoholes de cadena larga son constituyentes destacados de la mayoría de las ceras (Mckee et al., 2003). Los esteroides son derivados complejos de los triterpenos. Se encuentran en todos los eucariotas y en un pequeño número de bacterias. Cada tipo de esteroide está formado por cuatro anillos fusionados. Los esteroides se diferencian entre ellos por la posición de los dobles enlaces carbono-carbono y di versos sustituyentes (p. ej., grupos hidroxilo, carbonilo y alquilo). El colesterol es un ejemplo de esteroide, este se encuentra ampliamente distribuido en todas las células del organismo, pero especialmente en las del tejido nervioso. Es un constituyente de mayor importancia de la membrana celular y de las lipoproteínas plasmáticas. A menudo se encuentra combinado con ácidos grasos como éster de colesterilo, cuando se esterifica el grupo hidroxilo de la posición 3 con un ácido graso de cadena larga, Existe en las grasas animales, pero no en las vegetales (Harper, 2001). En este trabajo se presentan una descripción de los resultados obtenidos en la identificación de lípidos de un tejido animal (hígado de vaca), empleando las solubilidades diferenciales y de la centrifugación como métodos para el fraccionamiento de tejido animal en sus principales constituyentes. CAMBIO EN EL PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: ●
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En la preparación de la muestra, se trabajó con ácido tricloroacético al 5% en lugar de 10%. En la prueba cualitativa de fosfatos, hubo un derrame de la muestra de Lisina, por lo que
trabajamos con 0.5 ml y no con 1.0 ml de la sustancia. De igual forma manejamos las adiciones del ácido molíbdico y ascórbico con la mitad de lo que debíamos, es decir 5 gotas de cada sustancia para que fuese proporcional. DATOS OBTENIDOS Saponificación.
Muestra proveniente del tejido animal. Luego de adicionar, NaOH se forma un anillo rojo de sólidos en la superficie. Al filtrar en el papel quedó adherido un sólido color rojo, el cual deducimos representa los jabones. En el tubo queda una sustancia amarillenta. ❏ Muestra de patrón de lecitina: Al agregar NaOH no hubo mayor cambio, pero al agregar éter, este se separa y queda en la parte superior por diferencia de densidad. Al filtrar en el papel queda un resultante similar a un jabón, este es de color blanco. En el tubo queda una sustancia incolora. ❏
Prueba de fosfatos (reacción de Fiske-Subbarow):
Muestra proveniente del tejido animal: Al agregar ácido molibdico, la solución no tiene cambios físicos, al colocar la sustancia a baño de maría la sustancia no tiene un cambio intenso en color, pues toma un color ligeramente amarillento. ❏
Muestra de patrón de lecitina: Al agregar ácido molibdico la solución toma un color ligeramente azul. Al colocar a baño de maría la coloración de la solución no cambia ni se intensifica. ❏
Prueba de colesterol (prueba de Salkowski):
Muestra proveniente del tejido animal: Al agregar cloroformo la solución presenta dos fases; en la superficie en la superficie una porción de pequeños sólidos blancos y en la parte inferior una coloración amarillenta. ❏
Al agregar ácido sulfúrico la parte inferior toma un color rojizo y la superior sigue igual. Muestra de patrón de lecitina: Al agregar cloroformo, la solución no presenta un cambio físico. Pero al adicionar ácido sulfúrico la solución toma una coloración roja y lentamente se va formando una división, en la parte inferior se ve un color rojo más intenso que en la superior. ❏
RESULTADOS Y CÁLCULOS.
DISCUSIÓN Y ANÁLISIS DE RESULTADOS: Preparaci ón de la mu estr a
La muestra de lípidos se obtuvieron tras haber agregado a la muestra de tejido animal (hígado de vaca) en primera instancia ácido tricloroacético 10%, este último permite a los carbohidratos se suspende sobre solución, debido a que estos son solubles sobre ATA, y los lípidos por definición son poco solubles en soluciones acuosas de tal forma al pasar por la centrifuga estos se depositan en la base del tubo. En cambio al tomar el residuo que contiene los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos y agregarles la solución de etanol-éter-cloroformo se suspenden los lípidos, mientras que las proteínas y ácidos nucleicos quedan en el residuo. Prueba de saponi ficación
La prueba de saponificación consiste en una hidrólisis alcalina de una preparación lipídica (en este caso con NaOH).Los lípidos derivados de los ácidos grasos dan lugar a sales de ácidos grasos y alcohol (glicerol) como se muestra en la figura 1. La lecitina es un fosfolípido que entra en la clasificación de los glicerofosfolípidos, los cuales a su vez son derivados de los ácidos grasos. Por lo tanto al realizar la hidrólisis por acción de NaOH con la muestra patrón de lecitina resulta positiva la formación de sales de ácido graso, pero en esta caso el resultado es una emulsión: formadas por lípidos no polares en un medio acuoso y se estabilizan por medio de agentes emulsificantes, como lípidos anfipáticos, que forman una capa superficial que separa la masa principal del material no polar de la fase acuosa. La explicación a este proceso es la disociación de las grasas en un medio alcalino. La prueba nos permitió observar el proceso de formación de jabones al realizar la filtración luego de la adición de éter a las muestras. Los jabones que quedaron en el papel de filtro son las sales metálicas de los ácidos grasos que se formaron cuando se produjo la hidrólisis alcalina del diacilglicerol. El proceso anterior finaliza en la separación del glicerol y las sales de ácido graso o jabones, entendiendo la reacción dada así:
Figura 1: reacción de saponificación
Pr ueba de fosfatos (r eacción de Fi ske-Subbarow)
Para la prueba de fosfatos se observaron cambios en la muestra de lecitina como se observa en la figura 2. Este comportamieto se debe a que os fosfolípidos por acción de NaHO se hidrolizan, produciendo fosfatos orgánicos, que con el ácido molibdico dan fosfomolibdatos, y estos por acción de reductores como el ácido 1, 2, 4 – aminonaftolsulfonico o ácido ascórbico, producen complejos de óxidos de molibedeno de color azul. A
B
Figura 3: A) reacción de prueba de fosfatos B) coloración de las muestras utilizadas: derecha filtrado de la muestra de la saponificación de lecitina e izquierda filtrado de la muestra de la saponificación del tejido animal. Pr ueba de colesterol (pr ueba de salkowski)
En cuanto a la determinación de colesterol se obtuvo que al adicionar un volumen de ácido sulfúrico y se mezclan suavemente, se desarrolla un color rojo característico en la capa clorofórmica, ver figura 3. La coloración observada se debe a la acción deshidratarte del ácido sulfúrico, formándose un doble enlace en
posición 3. A
B
Figura 4: A) reacción de Reconocimiento de colesterol B) coloración de las muestras utilizadas: derecha filtrado de la muestra de la saponificación del tejido animal e izquierda muestra de colesterol.
CONCLUSION Como ya sabemos los lípidos son un conjunto de moléculas orgánicas, la mayoría biomoleculas, compuestas principalmente por carbono e hidrogeno y en menor medida por oxígeno, aunque también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno, que tienen como característica principal el ser hidrofóbicas o insolubles en agua y sí en disolventes orgánicos como la bencina, el alcohol, el benceno y el cloroformo. Estos se pueden clasificar de diversas maneras de acuerdo a su estructura y por ende para identificarlos existen diferentes métodos como la saponificación, prueba de fosfatos y colesterol, que se basan en criterios cualitativos.
CUESTIONARIO: ¿Por qué la lecitina forma una emulsión en presencia de agua?
Las emulsiones son partículas de tamaño mucho mayor por lo general, formadas por lípidos no polares en un medio acuoso y se estabilizan por medio de agentes emulsificantes, como lípidos anfipáticos (p. ej., lecitina), que forman una capa superficial que separa la masa principal del material no polar de la fase acuosa, como se muestra en la figura 2 (Harper, 2010).
Figura 5: Emulsión de aceite en agua ¿Es el colesterol saponificable? Explique su respuesta
No. La saponificación se basa en la hidrólisis de un diacilglicerol, es decir a partir de ácidos grasos. En la clasificación de lípidos el colesterol se encuentra dentro del grupo de los esteroides, por lo que su estructura es diferente. Los esteroides contienen cuatro anillos fundidos y se identifican por tener un grupo hidroxilo en el carbono 3, es su único componente polar. (Horton, 2008). Además su estructura no presenta grupos éster a comparación de los ácidos grasos (Figura 6). Observando la reacción de saponificación, cuando el NaOH reacciona con el ácido graso, toma el grupo éster del ácido graso y en su lugar deja un hidrógeno. Al no tener grupo éster el colesterol no puede participar en la reacción de saponificación.
Figura 6: Estructura del Colesterol
¿A qué se debe la solubilidad de los lípidos en solventes orgánicos?
Los lípidos tienen gran solubilidad en solventes orgánicos no polares, ya que estos son hidrofóbicos (no polares) o bien son anfipáticos (contienen regiones polares o no polares al mismo tiempo) (Horton, 2008). Los lípidos se describen mejor a través de sus propiedades físicas que en términos estructurales precisos, debido a su baja polaridad (que se debe fundamentalmente a su estructura hidrocarbonada) los lípidos sólo pueden solubilizarse en disolventes que también tengan baja polaridad y la mayoría de solventes orgánicos como el cloroformo, tetracloruro de carbono, éter dietílico y benceno la tienen (Petrucci, 2003). ¿Cómo se puede identificar los ácidos grasos que no se encuentran esterificados?
La cromatografía de gases revolucionó el estudio de los lípidos, haciendo posible determinar la composición completa de los ácidos grasos de un lípido en muy corto tiempo. Para este propósito, los ácidos grasos son convertidos al derivado más simple volátil, usualmente metiléster, aunque otros esteres pueden ser preferidos para diferentes propósitos. La preparación de tales esteres se ha vuelto el tipo de reacción más común entre los analistas de lípidos. Aunque los ácidos grasos pueden estar en la naturaleza en estado libre (no esterificado), en su mayoría se encuentran como ésteres unidos a glicerol, colesterol o alcoholes alifáticos de cadenas largas; en los casos cuando los ácidos grasos están en estado de esteres, se debe trans-esterificar el ácido graso (Montesinos, 2013). ¿Qué tejido vegetal podría utilizar en esta práctica para determinar los lípidos presentes? Explique su respuesta. Indique ¿cuáles son las grasas principales presentes en el tejido vegetal seleccionado?
Los ácidos grasos en las plantas se encuentran distribuidos en todos los órganos ya que son parte estructural de la célula y también se generalmente ácidos carboxílicos de cadena lineal con un número par de átomos de carbono. Las cadenas de carbono pueden ser tan cortos como 12 unidades hasta 20, pero es más frecuente que sean 16 o 18 átomos de carbono. Los aceites son líquidos a temperatura ambiente, principalmente debido a la presencia de enlaces insaturados en sus ácidos grasos componentes; grasas, que tienen una mayor proporción de ácidos grasos saturados, son sólidos a temperatura ambiente. Los principales ácidos grasos en los lípidos de plantas se muestran en la Tabla 1. La composición de ácidos
grasos en los lípidos de la planta varía con la especie. Por ejemplo, el aceite de cacahuete contiene ácido palmítico 9%, ácido oleico 59%, y ácido linoleico 21%, o la semilla de algodón contiene ácido palmítico 20%, ácido oleico 30%, y ácido linoleico 45% (Taiz, 2006).
Tabla 1: Ácidos grasos comunes en los tejidos de plantas superiores
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