PRACTICA 2 COLORIMETRIA Y ESPECTROFOTOMETRIA OBJETIVOS 1. Conocer los principios básicos de los métodos para la medida de concentración de las sustancias. 2. Establecer diferencias entre Transmitancia y Absorbancia. 3. Realizar una curva espectral, una curva de calibración y establecer sus diferencias. PREL PRELAB ABOR ORAT ATOR ORIO IO:: Consu Consultltar ar y traer traer al Labor Laborat atori orio o el Espec Espectr tro o de Absorc Absorció ión n de las las diferentes especies de Hemoglobina en la region visible (340-700 nm) Consultar Consultar el mecanismo mecanismo y la técnica para la determinación determinación de hemoglobina hemoglobina en el laboratorio laboratorio clínico. Debe traerse el diagrama de flujo de cada una de las actividades que realizará en la práctica. Traer varias hojas de papel milimetrado, regla e implementos necesarios para realizar sus curvas.
A. COLORIMETRIA Mucho Muchoss experi experime ment ntos os bioqu bioquím ímic icos os incl incluy uyen en la medic medició ión n de un compu compues esto to o grupo grupo de comp compue uest stos os que que hace hacen n part parte e de una una mezc mezcla la.. Una Una de las las técn técnic icas as más más usad usadas as para para determinar la concentración de dichos compuestos es la Colorimetría. El fundamento de la técnica se basa en que si se pasa luz blanca a través de una solución coloreada, algunas longitudes de onda se absorben con preferencia sobre las otras. Figura 2.1 Para el caso de la absorción de radiación visible, muchos iones o moléculas o son coloreados, o pueden reaccionar con una substancia coloreada o pueden formar en algunas de sus reacciones una substancia coloreada. Cada una de estas situaciones presenta la posibilidad de efectuar una determinación analítica cuantitativa. La mayor mayor ventaja de este método consiste en que no es necesario el aislamiento del compuesto y así se pueden determinar los constituyentes de una mezcla compleja tal como la sangre
Luz absorbida por la solución coloreada Luz incidente BlancaRoja
Luz emergente y por consiguiente color de la solución verde
Rojo Amarillo
Amarill o
Azul
Verde
Azu l
.
Figura 2.1 Porqué son coloreadas las soluciones?
PARTES DE UN COLORIMETRO . Figura 2.2
94,50 Filtro Hendidura Fuente de Cubeta ta Dete Detect ctor or HendiduraCube De entrada energía radiante de salida
Pantalla
La luz blanca emitida por una lámpara de tungsteno pasa a través de una rendija (apertura), y luego a través de un lente condensador que vuelve paralelos estos rayos que van a incidir sobre la solución problema (generalmente es coloreada o tiene la capacidad de absorber la luz) la cual se coloca en la celda o cubeta. La cubeta es generalmente de vidrio de paredes paralelas con 1 cm de separación entre ellas en la mayoría de los casos, esta distanciase conoce como paso de luz.. El Filtro puede estar colocado antes o después de la cubeta y su color se selecciona para permitir la transmitancia máxima del color no absorbidodia. El color del filtro debe ser complementario al de la solución que se estudia, por ejemplo, si se quiere examinar una solución de color azul, se selecciona el filtro rojo que es complementario y permite la transmisión máxima del color no absorbido (azul) o dicho de otra forma el filtro rojo no absorbe luz azul permitiendo permitiendo la máxima transmitanci transmitancia a de este último. Los filtros filtros producen bandas angostas de transmisión y por lo tanto luz aproximadamente monocromática . Cada color corresponde a una región del espectro de luz blanca y posee una longitud de onda ( λ) característica que se mide en nanometros (nm) y puede ser seleccionada mediante el uso de los filtros en los colorímetros. colorímetros. La longitud de onda más usada para mediciones mediciones en Bioquímica Bioquímica Clínica es 340 nm que pertenece al rango ultravioleta. A esta longitud de onda las formas reducidas de los cofactores NADH, NADPH tienen valores altos de Absorbancia mientras que sus formas oxidadas oxidadas (NAD, NADP) NADP) no absorben. Una reacción reacción catalizada catalizada por enzimas que
utilicen estas coenzimas puede ser medida fácilmente por la aparición o desaparición de NADH o NADPH. La luz luz lleg llega a a una foto fotocel celda da que que genera genera corri corrient ente e eléct eléctri rica ca en propo proporci rción ón dire direct cta a a la intensidad de la luz incidente, se amplifica la señal y finalmente pasa a un galvanómetro galvanóme tro que proporciona directamente medidas de porcentaje de Transmitancia y Absorbancia.
Principio de la Colorimetría. Cuando se pasa un rayo de luz monocromática de intensidad inicial a través de una solución coloreada en un recipiente transparente parte de la luz es absorbida absorbida por la solución de manera que la intensidad intensidad de la luz transmitida transmitida ( Ι ) es menor que la inicial ( Ι o). Figura 2.3. La relación entre Ι e Ι o depende de la longitud (l) del medio absorbente y de la concentración (C) de la solución absorbente .
Figura 2.3 Absorción de la luz por una solución De cada uno de estos dos factores Longitud y Concentración se deriva la Ley de Lambert y de Beer respectivamente.
Ley de Lambert Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta, esto es: Ι
= Ι o . e-k1 . l
Ley de Beer Cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente aumenta: Ι
= Ι o . e-k 2.c
Dado que las dos características de la solución influyen en la magnitud de la intensidad emergente, surge la ley combinada de Beer Lambert . Ι
= Ι o . e-k 3.c.l
Transmitancia y Absorbancia
La concentración de la sustancia desconocida, puede calcularse en % transmitancia o en unida unidades des de Absorb Absorbanc ancia ia.. El coci cocient ente e de las las dos intens intensid idade ades, s, I/Io I/Io,, se conoce conoce como como TRANSMITANCIA y se expresa como un porcentaje. %T= Ι / Ι o = luz transmitida (solución problema) luz incidente (solución blanco) Expresado en términos de Logaritmos: -Log Ι / Ι o = k.c.l Log Ι o / Ι = k.c.l. = Absorbancia = A k = Constante Constante que depende de la longitud longitud de onda, de la naturaleza naturaleza del espesor.
medio y del
Conociendo %T de una solución coloreada se puede determinar su ABSORBANCIA . T = 100 __ Ι __ Ιo Expresando en Logaritmos: Log % T = Log 100 + Log
Ι
/ Ι o; como A = Log _ Ι o _ y Log 100 = 2 Ι
entonces: Log %T = 2 - A por lo tanto:
A = 2 – Log % T
ABSORBANCIA = EXTINCIÓN = DENSIDAD DENSIDAD ÓPTICA (D.O.) Para buscar la concentración de una sustancia desconocida por colorimetría las lecturas debe deben n hace hacers rse e en %T ya que que la esca escala la de lect lectur ura a es line lineal al porq porque ue est está divi divid dida ida homogénaemente en 100 partes iguales lo que hace su medición más exacta; la escala de Absorbancia o extinción es logarítmica, se extiende de cero a dos con divisiones desiguales haciendo poco exacta la lectura principalmente en los valores altos. Sin embargo, en la práctica debe emplearse valores de Absorbancia, que pueden hallarse hallarse mediante la fórmula o mediante una tabla de conversión para cada valor de transmitancia. Con valores conocidos de A o %T, es posible hallar la concentración de una sustancia desconocida (solución absorbente). La relación entre la concentración y el % T no es lineal, por lo cual se requiere muchos puntos para lograr una medición exacta; en contraposición existe una relación lineal entre la concentración y la Absorbancia. (Figura 2.5.).
Figura 2.5 Relación entre la absorción de la luz y la concentración Por lo tanto con un solo punto dado por el patrón (Estándar de concentración conocida) es posible trazar una curva correcta teniendo en cuenta solo si se ha establecido la relación lineal (o rango lineal) y descartando los rangos de desviación tanto a altas concentraciones como a bajas concentraciones
Limitaciones de la Ley Beer Lambert Para que se cumpla la Ley combinada deben darse las siguientes condiciones: 1.
La luz luz pref preferi eribl blem ement ente e debe debe ser ser monoc monocrom romát ática ica o la la lon longit gitud ud de onda onda debe debe est estar ar ent entre re límites muy estrechos.
2.
La longi longitu tud d de onda onda de la luz luz empl emplead eada a debe debe coin coincid cidir ir con el máxi máximo mo de absor absorció ción n de la solución. Esto permite conseguir la sensibilidad óptima.
3.
No debe debe habe haberr ioni ioniza zaci ción ón,, asoc asocia iaci ción ón,, diso disoci ciac ació ión n o sol solvat vatació ación n del del solu solutto con con respecto a la concentración o el tiempo.
4.
La ley ley sólo se cumpl umple e hast asta cierto rto característico de cada sustancia (Linealidad).
límite
máximo
de
conce ncentraci ración ón,,
B. ESPECTROFOTOMETRIA Un Espectrofotómetro es un colorímetro más sofisticado en el cual la luz monocromática se difracta mediante una rendija o prisma. La banda banda de longit longitude udess de onda onda de la luz luz que pasa a trav través és del filt filtro, ro, en el caso dell colorímetro es muy ancha, por lo cual puede ser difícil distinguir entre dos compuestos que tengan absorción parecida; en este caso, es recomendable usar un Espectrofotómetro ya que permite separar picos de absorción muy juntos debido a la presencia presencia del monocromador. Los Espectrofotómetros son aparatos más sofisticados cuyas 2 ventajas principales son: a)
Abarcan Abarc an todo tod o el espectro espe ctro de luz.
b) Perm Permitite e mayor mayor poder poder de resol resoluc ución ión:: esto esto es medir medir exactame exactament nte e dos comp compues uesto toss que absorben a longitudes de onda muy cercanas.
Espectro de Luz. En la luz blanca existen tres grandes regiones:
Ultravioleta: Comprende longitudes de onda menores de 400 nm Visible: Comprende longitudes de onda de 400 a 700 nm Infrarojo: Comprende longitudes de onda mayores de 700 nm.
DETERMINACIÓN DEL ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE SOLUCIONES COLOREADAS I. CURVA ESPECTRAL A. MATE MATERI RIAL ALES ES -
Solu Soluci ción ón Pat Patrón rón de la sust sustanci ancia a absor absorbe bent nte, e, por por ejemp ejemplo lo:: azul azul de met metilen ileno, o, roj rojo o de metilo, permanganato de potasio o sangre desfibrinada. Agua destilada tubos graduados de 50 y 15 ml. 2 pipetas de 5 ml y 10 ml Espectrofotómetro Papel milimetrado B. MÉTO MÉTODO DOS S
B.1. Preparación Preparación de los estándares: estándares: Se prepararàn 10 estandares estandares de la solución coloreada, coloreada, haciendo diluciones seriadas a la mitad de la siguiente forma:. a. Marcar cada tubo con el número de la dilución b. En cada tubo graduado va a medir exactamente 5 ml de agua destilada c. Al tubo N. 1 le va adicionar 5 ml exactos de la solución marcada como patrón o stardar inicial del compuesto coloreado. d. Agitar el tubo por inversión para mezclar y formar la primera dilución del estándar. e. Prepara Prepararr la segunda segunda diluci dilución ón adiciona adicionando ndo al tubo tubo marcado marcado como como dilució dilución n N.2, 5 ml exactos de la dilución N. 1, como en el caso anterior se agita por inversión del tubo. f. Continuar preparando las diluciones N.3 a N. 10, repitiendo el paso descrito en el ítem anterior, utilizando la dilución inmediatamente anterior. B.2 Curva Espectral a. Prender el espectofotometro 10 min antes de iniciar sus medidas. b. Calibrar el equipo con y sin solución blanco, ajustando 350 nm como longitud de onda. c. Adicionar a la celda 1 ml exacto del estándar N. 4. d. Medir la transmitancia e. Retirar Retirar la celda, variar variar la longitud longitud de onda a 400 nm, calibrar calibrar nuevame nuevamente nte el equipo, equipo, y medir nuevamente la absorbancia de la misma muestra contenida en la celda (dilución N. 4 del estándar). f. Variar la longitud longitud de onda en 50 nm (para este caso 450 nm) y repetir lo descrito descrito en el ítem anterior. g. Seguir variando la longitud de onda cada 50 nm (hasta llegar a700 nm) cada vez repitiendo los pasos descritos anteriormente.
h. Transforme el %T obtenido obtenido en Absorbancia utilizando utilizando las las tablas dadas en el apéndice apéndice 1 ó mediante fórmula (A=2-%T). Tabular sus datos La curva espectral se realiza graficando graficando los valores de Absorbancia Absorbancia de la solución coloreada coloreada (absorbente) en la ordenada, leídos a diferentes longitudes de onda (abcisa): Con los datos datos obte obteni nidos dos trazar trazar en papel papel mili milime metra trado do la curva curva espec espectra tral,l, grafi grafica cando ndo las las longitudes de onda en la abcisa y las absorbancias en la ordenada e informar el rango de longitud de onda óptimo l para la solución coloreada utilizada. Cada sustancia presenta una mayor absorción en una región del espectro (rango de lectura) a una longitud de onda característica. Las curvas curvas espect espectrale raless permite permiten n determi determinar nar la longit longitud ud de onda en la cual la solució solución n presenta la máxima absorción de luz. (Figura 2.6) Por lo tanto, el trazado espectral de una solución nos da información sobre el color y la naturaleza química de la sustancia que la compone.
II. ELABORACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓN Debe conocerse la longitud de onda o el rango óptimo de Absorbancia para la sustancia a analizar (que ha sido hallada mediante una curva espectral). Se prepara una serie de patrones de concentración conocida de la sustancia problema que se va a estudi estudiar. ar. Segui Seguidam damen ente te se prepar prepara a el blanc blanco o adici adiciona onando ndo todos todos los los react reactiv ivos os participantes participantes sin añadirle muestra muestra a analizar, analizar, es decir el blanco corresponde al 100 %T o sea al cero de Absorbancia. De esta forma se hace corrección inmediata de la absorción que puede presentarse por el reactivo y que pudiera aumentar falsamente la concentración de la sustancia a analizar
Figura 2.6. Curva espectral.
Los %T se transforman a Absorbancia (D.O) Se realiza en papel milimetrado una curva resultante de graficar en la abcisa las diferentes conc concen entr trac acio ione ness de los los patr patron ones es proc proces esad ados os y en la orde ordena nada da las abso absorb rban anci cias as correspondientes a cada uno. Si se cumple la ley de Beer Lambert uniendo los puntos se obtendrá una recta, dentro de un rango de absorbancia vs. Concentración. Tambien se determinarán los rangos de desviación. Solo con el rango lineal lineal posible hallar hallar cualquier cualquier concentración concentración desconocida desconocida de la sustancia analizada, si interpolamos sobre la ordenada el dato correspondiente a la Absorbancia del desconocido desconocido en la abcisa. Dado que muchas curvas cumplen las leyes de Beer Lambert por la ley matemática de proporciones, se cumple: Absorbancia 1 ____________ Concentración 1
:
Absorbancia 2 _____________ Concentración 2
Dado que conocemos la concentración del patrón estándar y las absorbancias de ambos caso casos, s, del del patr patrón ón y de la mues muestr tra, a, es posi posibl ble, e, desp despej ejan ando do,, hall hallar ar la conc concen entr trac ació ión n desconocida: _A standard (A St ) = _A muestra (A m) ; C muestra = _A m_ X C St C standard (C St ) En donde: A = Absorbancia C = Concentración
C muestra (C m)
A St
m = Muestra St = Estándar o patrón
Factor =
C St A St RECORDAR QUE ESTA PROPORCION ES VALIDA SOLO SI YA ESTÁ COMPROBADO QUE LAS CURVAS CUMPLEN LAS LEYES DE BEER LAMBERT.
PROCEDIMIENTO a)
Partiendo de las diluciones seriadas de concentración conocida que preparó en el punto anterior, anterior, y habiendo realizado realizado la curva espectral con la que determinó su longitud de onda optima. optima. Ajuste el equipo en esta longitud longitud de onda y calíbrelo utilizando utilizando agua como como blanco de reactivos.
b)
Lea %T de cada una de las concentracionnes de la solución y transforme sus valores de Transmitancia a Absorbancia. Recuerde inciar el proceso utilizando la dilucuón de mejor concentración.
c)
Con los datos obtenidos construya en papel milimetrado la curva de cali calibra braci ción ón graf grafic icand ando o concen concentra traci cione oness en la abci abcisa sa y absor absorban banci cias as en la ordena ordenada. da. Determine el rango lineal y el rango de desviación.
d) Calcul Calcular ar la conce concentr ntració ación n de las muestra muestrass problem problema a mediant mediante e la gráfic gráfica a y mediant mediante e fórmula. f) Con los los datos obtenidos durante la práctica, realice el informe. g) Determine la concentración concentración de sus muestras de análisis análisis realizando realizando incluso las diluciones diluciones que sea necesario. Interpole los datos de absorbancia en su grafica de calibración para obtener los valores de concentración. Reporte sus valores de forma tabulada. Discuta y concluya su informe.
BIBLIOGRAFIA 1. Fischer & Peters; “Compendio de análisis químico cuantitativo”; Nueva Editorial Interamericana, S. A. de C. V.; 1ª edición; 1971; pp. 400 - 450. 2. Gilbert H. Ayres; ”Análisis químico cuantitativo”; Ediciones Ediciones del Castillo, S. S. A.; 1970; pp 459514.
