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LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507
GUÍA 2. RECONOCIMIENTO DE BIOMOLÉCULAS
I. PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
Los seres vivos y todo el material que de ellos se deriva, está formado por diferentes tipos de compuestos que se pueden identificar (cualificar) y cuantificar. Conocer cuáles son esas sustancias, permite generar ideas sobre la posible función, propiedades y usos que estas puedan tener. La identificación cualitativa se realiza por medio de reacciones específicas, cuyo producto es coloreado y de fácil detección.
En esta práctica se pretende contestar las siguientes preguntas: ¿Cuál es la composición mayoritaria en términos de las biomoléculas del material (muestras) a estudiar en esta práctica de laboratorio? ¿Cómo actúan los reactivos (tabla1) que permiten detectar la presencia de biomoléculas en las diferentes muestras? Para esto último usted debe hacer una investigación exhaustiva que le permitirá establecer sus resultados esperados a partir de la naturaleza química del reactivo y del contenido de las diferentes biomoléculas en cada una de las muestras. Así mismo es importante que en este proceso identifique en cada caso cuales son sus patrones de comparación positivos y negativos.
II. FUNDAMENTO TEÓRICO
Todos los organismos vivos están constituidos por compuestos químicos de tamaño y masa muy variables denominadas biomoléculas. Estas sustancias se clasifican en inorgánicas y orgánicas, siendo el agua la sustancia inorgánica más importante para la vida, pues la inmensa mayoría de las reacciones bioquímicas se desarrollan en medio acuoso. Una pequeña fracción en masa corresponde a gases, sales, ácidos y a los iones. Las biomoléculas orgánicas como las proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, están involucradas prácticamente en todos los procesos y propiedades fisicoquímicas de los seres vivos pertenecientes a los diferentes niveles de organización biológica.
Proteínas
Son macromoléculas de elevado peso molecular, caracterizadas por su gran variabilidad estructural y enorme diversidad de funciones biológicas, sin embargo, tienen en común el ser polímeros de α- L –aminoácidos codificados genéticamente y ordenados en secuencias lineales unidas entre sí por enlaces peptídicos. La variedad estructural se debe a las múltiples ordenaciones o secuencias que pueden adoptar los veinte aminoácidos de los cuales están constituidas y que naturalmente se repiten muchas veces dentro de sus estructuras moleculares espaciales. Las proteínas de cada ser vivo, independientemente del dominio biológico al que pertenecen, son específicas, a punto de que una célula típica posee aproximadamente unas tres mil de ellas diferentes. Se ha establecido que las proteínas que desempeñan la misma función presentan ligeras variaciones estructurales (secuencia de aminoácidos) en las distintas especies.
La organización espacial de una proteína se expresa en cuatro niveles, que se denominan la estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria .
Carbohidratos
Son la fuente primaria de energía para los seres vivos, constituidas fundamentalmente por los grupos funcionales hidroxilo y carbonilo. De acuerdo con la naturaleza química, los azúcares más simples, de acuerdo al número de monómeros que los conforman, son los monosacáridos como la glucosa, ribosa y fructosa. De la misma forma, de las combinaciones de dos a diez monosacáridos se forman oligosacáridos como la sacarosa, maltosa, lactosa, entre otros. Los polisacáridos tiene más de diez monosacaridos y pueden ser lineales o ramificados como la celulosa, almidón y el glucógeno. La celulosa es un polímero lineal cuya función es estructural, es el más abundante en las paredes de las células vegetales. El almidón es la molécula de almacenamiento de glucosa (energía) en las plantas y en los animales es el glucógeno. Estos compuestos son polímeros de glucosa que forman cadenas lineales y ramificadas, en el almidón la cadena lineal o amilosa consta de aproximadamente 200 unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos α-1,4 y la ramificada o amilopectina resulta de la unión de glucosas por enlaces α-1,4 y α-1,6. La estructura del glucógeno es similar a la del almidón, pero con mayor cantidad de moléculas de glucosa y más ramificado. La celulosa es un polímero lineal con enlaces β-1,4.
Lípidos
Son biomoléculas orgánicas de naturaleza química diferente, a las mencionadas anteriormente se caracterizan por ser hidrofóbicos, es decir, insolubles en agua pero solubles en solventes orgánicos como el cloroformo, benceno, alcohol, acetona, y otros. Esto último debido a su estructura donde sobresalen los ácidos grasos de cadena larga (saturados o insaturados) y el glicerol. Las grasas insaturadas son líquidas (aceites) y se encuentran abundantemente en los vegetales, mientras que las saturadas (mantecas) son sólidas y están presentes en los tejidos animales. Son fuente de energía, hacen parte de la membrana celular como responsables de la permeabilidad selectiva; algunos lípidos complejos regulan funciones celulares y otros actúan como moléculas de señales químicas. Los lípidos más importantes son las grasas o triglicéridos, los fosfolípidos y los esteroides como el colesterol.
Ácidos nucleicos
Son polímeros de los nucleótidos (base nitrogenada, azúcar de cinco carbonos y grupo fosfato), su función es la de portar la información genética necesaria para que los organismos produzcan todos los factores necesarios para la vida como lo son las proteínas y otros ácidos nucleicos como el ARN. Su nombre se debe a que fueron aislados de los núcleos celulares. Dentro de las células los ácidos nucleicos se encuentran combinados con proteínas básicas denominadas histonas, a estas asociaciones supramoleculares se les denomina nucleoproteínas. Dependiendo del tipo de azúcar (pentosa) que poseen en su estructura los ácidos nucleicos se dividen en dos clases principales, el que tiene ribosa se llama ácido ribonucleico (ARN) y el que tiene desoxirribosa es el ácido desoxirribonucleico (ADN). Estos ácidos nucleicos no solo se encuentran formando el material hereditario en las células procariotas y eucariotas sino también en organelos como los ribosomas, mitocondrias y cloroplastos lo que evidencia la versatilidad evolutiva de estas biomoleculas de acuerdo con su localización y función.
Reconocimiento de biomoléculas
La identificación de las proteínas se hace con el reactivo de Biuret que contiene cobre en solución alcalina, el cobre forma un complejo con los enlaces peptídicos de péptidos y proteínas, de color rosado en los primeros y purpura (morado) en las últimas.
Para reconocimiento de cualquier carbohidrato, oligosacárido, polisacárido o monosacárido se usa la pruba de Molisch, los dos primeros previamente se hidrolizan con ácido sulfúrico concentrado hasta monsacáridos , los cuáles se convierten en derivados del furfural o 5-hidroximetil furfural, que reaccionan con α-naftol formando un producto observable como un anillo de color rosado, violeta o morado.
En cuanto a los lípidos que contienen ácidos grasos en su estructura hay una reacción particular para reconocerlos, la de saponificación, durante esta los compuestos se hidrolizan en un medio básico y se obtienen las sales de los ácidos grasos, es decir jabones, detectables por agitación.
Otros lípidos fundamentales son insaponificables y tienen como núcleo estructural el ciclo pentanoperhidrofenantreno que se identifica con la prueba de Lieberman-Burchard en esta a una solución en cloroformo se le adiciona anhidrido acético y ácido sulfúrico, observando una reacción coloreada que inicia rojo y progresa a verde-azul. Inicialmente los esteroides como el colesterol se convierten a derivados sulfato y acetato que lentamente se someten a sulfonación en diferentes posiciones, para luego eliminar los grupos SO3H, produciendo insaturaciones en forma repetitiva y finalmente polienos y esteroides aromáticos.
El reconocimiento de los ácidos nucleicos puede realizarse con el reactivo de difenilamina, debido a que en condiciones ácidas reaccionan las desoxirribosas de los nucleótidos de purina formando un compuesto de color azul con el ADN.
Tabla 1 Reactivos utilizados para la identificación de diferentes moléculas de importancia biológica
BIOMOLÉCULA
REACTIVO
PROTEÍNAS
Biuret
CARBOHIDRATOS
α-naftol, ácido sulfúrico
ÁCIDOS NUCLEICOS
Difenilamina
LÍPIDOS INSAPONIFICABLES
Cloroformo, anhídrido acético y ácido sulfúrico
LÍPIDOS SAPONIFICABLES
NaOH
III. MATERIALES Y REACTIVOS.
Materiales por grupo:
2 gradillas
24 tubos de ensayo
1 pinza para tubo
3 pipetas graduadas (1, 5 y 10 mL)
1 pipeteador
2 vasos de precipitados (50 mL y 250 mL)
3 goteros
Materiales y reactivos generales (el volumen de los reactivos está calculado para 10 grupos) todos los reactivos con duplicado:
α-naftol (100 ml)
Reactivo de Biuret (100ml)
NaOH 15% (200ml)
Cloroformo (100ml)
Anhídrido acético (100ml)
Ácido sulfúrico concentrado en gotero (50ml) y en frasco sin gotero (50ml).
Difenilamina
Reactivo de difenilamina fresco( preparado al empezar la práctica):1 g de difenilamina en 100 ml de ácido acético glacial y se agregan 2ml de ácido sulfúrico concentrado.
Tabla 2 Soluciones patrón negativos o positivos para esta práctica
PATRONES
Solución de rafinosa 1%
Agua destilada
Caseína al 1% en bicarbonato al 0,9%
Fosfatidilcolina al 1% en cloroformo
Extracto de ácido nucleico( 1/4 de pastilla en 50mL de agua destilada)
Solución de colesterol al 1% en cloroformo
IV. PROCEDIMIENTO
Preparación de extractos (a cargo del auxiliar de laboratorio, no se hace diagrama de flujo de estos procedimientos)
Extracto de papa criolla: macerar cubitos de papa adicionando 8 mL de agua, centrifugar durante 10 minutos y obtener el sobrenadante en un tubo debidamente marcado.
Extracto de harina de trigo: adicionar a 2g de harina de trigo, 100 mL de agua caliente y filtrar con gasa doble. Obtener el filtrado en un vaso debidamente marcado.
Extracto de cebolla cabezona frescas: pelar y cortar en fragmentos pequeños 5 cebollas cabezonas y para cada una: colocarla en el mortero y macerar con 50mL de NaCl al 5%, (mantener a 40 oC), filtrar con gasa o muselina y recojer el filtrado en un vaso de precipitados de 100 mL, adicionar 1ml de SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio), colocar en tubos tapa rosca y mezclar levemente por inversión 10 veces, dejar en reposo por 10 minutos, transcurrido este tiempo, rotar lentamente cada tubo y simultáneamente adicionar por las paredes 3 mL de isopropanol, se debe observar un precipitado blanco, colectarlo con una pipeta pasteur o gotero y separar en un tubo marcado.
Extracto hidrofóbico de hígados de pollo: cortar en trozos pequeños 30g de hígados de pollo con poca sangre, macerar en mortero y adicionar, en varias porciones, ATA en relación 1,5ml/g de tejido(es decir 45 ml en total). Agregar aproximadamente 2,0g de arena lavada, macerar y centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos, desechar el sobrenadante y tomar el residuo, pasar a cápsula de porcelana y adicionar la mezcla de Etanol- Eter-Cloroformo 2:2:1 en 1,5ml/g de tejido( es decir 45 ml en total), luego centrifugue a 2500 rpm por 5 minutos, tomar el sobrenadante evaporarlo hasta la mitad de su volumen original y guardar, este es el extracto a usar.
Identificación de biomoléculas
Para cada prueba de reconocimiento (tabla1) y de acuerdo con su fundamento teórico descrito previamente en está guía, usted debe seleccionar patrones o parámetros de comparación negativos y positivos (tabla 2), los primeros también se llaman blancos y son sustancias en las que se espera un resultado negativo de acuerdo con su naturaleza química, por lo tanto no cambiará el color del reactivo utilizado para la identificación. En los segundos se espera una prueba positiva porque contienen las biomoléculas con los grupos necesarios para que ocurra la reacción con los reactivos de reconocimiento y se observarán productos coloreados o incoloros pero fácilmente detectables por otra propiedad.
Además para cada prueba de identificación también se debe seleccionar 1 muestra o material de prueba de la tabla 3, teniendo en cuenta su composición molecular, elija una muestra de alta concentración de los compuestos de interés y tenga en cuenta la sensibilidad de los reactivos.
Realice con cuidado esta operación de elegir patrones y muestras para una correcta interpretación de los resultados.
A. Reconocimiento de carbohidratos
Numere tres tubos de ensayo, en un tubo adicione 2ml del patrón negativo seleccionado (tabla 2), en otro tubo 2 ml del patrón positivo seleccionado (tabla 2), en el tercero 2 ml de una muestra elegida de la tabla 3. Adicione 2 gotas de reactivo de Molisch y mezcle cuidadosamente. Con los tubos inclinados agregue 1ml de ácido sulfúrico concentrado el cual forma una capa de ácido debajo de la fase acuosa. Observe la coloración del anillo formado en la interfase, use los patrones positivos y negativos como modelo de comparación y registre sus resultados en tablas. Para interpretar sus resultados, en todas las pruebas no olvide tener en cuenta el color inicial de patrón o muestra y el color esperado de la prueba positiva.
B.Reconocimiento de proteínas
Numere tres tubos, en un tubo de ensayo adicione 3ml del patrón negativo seleccionado (tabla 2), en otro tubo de ensayo 3 ml del patrón positivo seleccionado (tabla 2), en el tercero 3 ml de una muestra elegida de la tabla 3. Agregue a todos los tubos 2 ml de reactivo de Biuret, agite, observe lo que sucede y regístrelo en su tabla de datos.
Tabla 3 Composición molecular de las muestras utilizadas en esta práctica
MUESTRAS
COMPOSICIÓN
Harina de trigo (100 g)
Proteína 10,5g. Grasa total 1g. Carbohidratos 76,1g
Extracto de papa criolla (100 g)
Proteína 1,9 g. Lípidos 0,1 g. Carbohidratos 21,6 g
Leche entera (250ml)
Proteína 8g. Grasa total 8 g. Carbohidratos 12 g. Colesterol 12 mg.
Leche descremada (250ml)
Proteína 6g. Grasa total 0,2g. Carbohidratos 11g. Colesterol 0 mg.
Leche deslactosada ( 250ml)
Proteína 8g. Grasa total 4,5g. Carbohidratos 11g. Colesterol 13 mg.
Clara de huevo (100 g)
Proteína 10,9g. Carbohidratos 0,73g. Triglicéridos 0,17g. Agua 88,2g.
Aceite de cocina de soya (100 g)
Grasa saturada 14,9g. Grasa moninsaturada 43,0g. Grasa poliinsaturada 37,6g.
Gelatina sin sabor (100 g)
Proteína 12,7 g.
Hígado de pollo (100 g)
Grasa total 4,7g.Esteroides 492mg. Carbohidratos 1,2g. Proteínas 22,1g.
Yema de huevo (100 g)
Grasa total 30,87g. Esteroides 2,4g. Proteína 16.7g. Carbohidratos 1,78g.
Cebolla cabezona (100 g)
Agua 89,11g. Proteína 1,1g. Carbohidratos 9,34g. Ácidos nucleicos: 0,93%. Triglicéridos 0,1g.
Fuente: Tabla de composición de alimentos Colombianos. Bogotá: Bienestar Familiar, 2005.
C. Reconocimiento de lípidos saponificables
Numere tres tubos de ensayo, en los dos primeros tubos añada 1 mL de cada patrón (positivo y negativo de tabla 2), en el tercero 1ml de una muestra (tabla 3). Agregue 3ml de NaOH al 15% a cada tubo y una perla para ebullición, coloque al baño maría durante 20 minutos y observe con mucha frecuencia (POR SU SEGURIDAD Y LA DEL GRUPO EN LA CABINA DE EXTRACCIÓN), adicione 3ml de agua destilada y agite fuertemente. Observe y compare con los patrones elegidos.
D. Reconocimiento de lípidos insaponificables
Numere tres tubos de ensayo, en un tubo de ensayo adicione 2ml del patrón negativo seleccionado (tabla 2), en otro tubo de ensayo 2 ml del patrón positivo seleccionado (tabla 2), en el tercero 2 ml de una muestra elegida de la tabla 3. Adicione a todos los tubos 3ml de cloroformo y mezcle, luego agregue 1ml de anhídrido acético cuidadosamente por la paredes del tubo y agite, finalmente coloque 3 gotas de ácido sulfúrico también por la paredes y observe la coloración de la interfase al minuto y a los 15 minutos. Compare y registre sus resultados.
E.Reconocimiento de ADN
Numere tres tubos de ensayo, en los dos primeros tubos añada 1 mL de cada patrón (positivo y negativo de tabla 2), en el tercero 1ml de una muestra (tabla 3). A cada tubo adicione 1 ml de agua destilada, suspenda la muestra, agregue 1ml de difenilamina, mezcle bien y caliente al baño maría por 10 minutos, sin dejar que haya ebullición, luego enfrie a baño de hielo, observe durante 10 minutos y registre los resultados en las tablas correspondientes.
V. BIBLIOGRAFÍA
Badui, Salvador. (2010). Química de los Alimentos. 4 ed. México: Pearson Addison –Wesley.
Curtis, Helena y Barnes, Sue. (2008). Biología. 8 ed. Buenos Aires: Médica Panamericana.
Plummer, David T. (1981). Bioquímica práctica. Barcelona: Editorial Mc Graw-Hill Latinoamericana.
PREINFORME / IDENTIFICACIÓN DE BIOMOLÉCULAS
PREINFORME Nombre____________________________ Grupo____
_______________________________________________________________________________________________
Realice todos los numerales del preinforme: título y consulta, fichas técnicas, procedimiento en diagramas de flujo, resultados esperados y bibliografía de acuerdo con las indicaciones de su profesor. Recuerde que solo entregará por escrito el título, las fichas técnicas,diagramas de flujo, resultados esperados y bibliografía. En su quiz de laboratorio(oral o escrito) se le evaluarán sus diagramas de flujo y la consulta.
Consulta
Copie y llene la siguiente tabla para todas las muestras de la tabla 3 con las que va a trabajar. Fíjese en los modelos. En la columna ¨Nombre de las biomoléculas que contiene¨ escriba varios de las más abundantes que se puedan identificar con los reactivos de reconocimiento a usar en esta práctica. En la columna de ¨Tipo de biomolécula¨ sea lo más específico posible, indique si es carbohidrato, lípido, proteína o ácido nucleico, y aclare por ejemplo para los carbohidratos si se clasifican como monosacáridos, disacáridos o polisacáridos, reductores o no, y en los lipidos simples (tipo) o complejos (tipo), saponificables o no. Utilice la información de esta tabla, junto con el fundamento teórico de la guía para plantear sus resultados esperados.
Muestra
Nombre de las biomoléculas que contiene
Tipo de biomolécula
X
Almidón
Carbohidrato, polisacárido
Y
Proteínas
Sacarosa
Carbohidrato, oligosacárido
etc.
2. Fichas técnicas
Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio
Nombre
Fórmula
Aspecto
Peligrosidad*
Primeros auxilios
*Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N).
3. Bibliografía
4.Procedimiento
4.1 Reconocimiento de carbohidratos
Resultado esperado :
__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
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Diagrama de flujo:
4.2. Reconocimiento de proteínas
Resultados esperados:________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________
Diagrama de flujo:
4.3. Reconocimiento de lípidos saponificables
Resultados esperados:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ ______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________Diagrama de flujo:
4.4. Reconocimiento de lípidos insaponificables
Resultados esperados:_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________
Diagrama de flujo:
4.5. Reconocimiento de ADN
Resultados esperados:_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
______________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________
Diagrama de flujo:
INFORME Nombre________________________________________________ / Grupo____
__________________________________________________________________________________
Tablas de resultados con fotos de tubos debidamente marcados
Construya una tabla por cada reactivo de reconocimiento e incluya los patrones (positivo y negativo) y muestra debidamente nombrados y descritos (evite limitarse a escribir tubo 1, tubo 2,etc) y describa en forma organizada las observaciones en cada tubo y si la prueba puede considerarse positiva o negativa.
Discusión de resultados
Para la elaboración del análisis de resultados use toda la información de la guía (fundamento teórico y procedimiento), la consulta y resultados esperados en su preinforme, así como los resultados obtenidos. No olvide que el análisis no se resuelve a manera de cuestionario, explique en forma concreta tanto las pruebas positivas como las negativas y redacte con citas en normas APA.
Para cada prueba explicar en forma concreta:
-El fundamento químico para la identificación de cada biomolécula(reactivo, composición, explicación de reacción, ecuación química de reacción con patrón postivo, prueba positiva, etc).
-La relación con los patrones positivos o negativos usados en la práctica y las observaciones.
-Si hay presencia de carbohidratos, tipos de lípidos, proteína y ácidos nucleicos en cada muestra, de acuerdo con la consulta del preinforme y las tablas de composición molecular de la guía.
- Describir brevemente sus resultados esperados y si lograron o no verificarlos durante la práctica.
3. Bibliografia: redacte la bibliografía con normas APA, que corresponda con las citas usadas en el análisis de resultados.
