GENOMICA UMANA
BOLI GENOMICE Bolile genomice sunt afecţiuni care rezultă prin rearanjarea ADN din genomul uman, datorită recombinării dintre regiuni distincte omologe, dar nealele (“paraloge”) (Lupski, 1998); aceste rearanjamente determină pierderea sau duplicaţia unei gene (sau unor gene). Bolile genomice sunt deci consecinţa arhitecturii speciale a unor regiuni din cromozom (sau cromozomi), spre deosebire de bolile monogenice convenţionale, produse prin mutaţii specifice într-o genă (datorită erorilor de replicare şi/sau reparare). Rearanjările se produc prin recombinare omologă nealelică între regiuni specifice, de ~10-400 kb, cu secvenţe identice sau asemănătoare. Acestea sunt frecvent duplicaţii segmentare (“dupliconi”), sau secvenţe cu un număr mic de repetiţii identice, localizate preferenţial în anumite segmente ale cromozomilor, frecvent la centromer sau telomere (estimări recente arată că ~5-10% din genomul uman este duplicat). Datorită omologiei lor, secvenţele respective se împerechează greşit şi determină prin recombinare omologă meiotică (intercromozomială) sau mitotică (intracromozomială: schimb între cromatidele surori sau intracromatidiană), rearanjări cromozomiale sau cromatidiene (deleţii, duplicaţii, inversii, disrupţii genice). EXPANSIUNEA INSTABILĂ A REPETIŢIILOR TRINUCLEOTIDICE După anul 1991 s-au descoperit peste 10 boli genetice produse prin mutaţii instabile sau dinamice ale unor repetiţii trinucleotidice; trei dintre acestea sunt relativ frecvente: retardul mintal cu X fragil (FRAXA), distrofia miotonică (sau boala Steinert) şi boala (coreea) Huntington (Tabel 1). Aceste afecţiuni se caracterizează prin expansiunea instabilă a unui segment de ADN ce conţine o repetiţie de trei nucleotide (CAG, CTG, CGG sau GAA), dispuse în tandem (deci adiacente); aceste repetiţii se pot găsi în exoni, la capetele 5’ sau 3’ ale genei, sau în introni. Pe măsură ce gena trece de la o generaţie la alta, numărul de repetiţii trinucleotidice creşte progresiv, suferă o expansiune, şi când depăşeşte un anumit prag critic produce anomalii în expresia genei sau funcţia proteinei codificată de genă. Tabelul 1. Exemple reprezentative de boli prin repetiţii trinucleotidice. Boala
Localizarea genei
Sindromul X fragil (FRAXA) (1:4000) Distrofia miotonică (1:8000) Ataxia Friedreich (1:50.000) Boala Huntingto n (1:12.000)
Xq27.3
19q13.3 9q13 4p16.3
Mod de transmitere DLX (anticipaţie)
Repetiţie
Localizarea repetiției
CGG
AD (anticipaţie) AR AD (anticipaţie)
Efect parental
5’UT
Număr de repetiţii Alela PreMutaţie normală mutaţie completă < 60 60-200 > 200
CTG
3’UT
< 30
50-80
> 80
matern
GAA
Intron 1
< 25
36 -100
> 100
matern
CAG
Regiune codantă
< 36
?
> 35
patern
matern
Genomul uman conţine numeroase secvenţe repetitive care ocupă poziţii cromozomiale fixe (loci) şi a căror complexitate variază de la gene integrale (de exemplu, genele pentru ARN ribozomal) la tracturi formate prin repetarea unuia sau câtorva nucleotide (microsateliţi). Printre cele mai simple şi mai frecvente sunt repetiţiile unor mononucleotide SNP (de la single
nucleotide polymorphism), repetiţiile dinucleotidelor AC, repetiţiile unor trinucleotide sau, mai rar, a unor secvenţe mai lungi, repetate succesiv, în tandem. Funcţiile repetiţiilor simple sunt încă neelucidate dar foarte probabil ele nu sunt “inerte” funcţional; Numărul de repetiţii variază de la un individ la altul, ceea ce face ca secvenţa respectivă să fie polimorfică în populaţie. Aceste secvenţe repetate sunt în general stabile, fiind transmise identic la generaţiile următoare şi putând servi atunci ca marker genetic. În unele cazuri, o repetiţie trinucleotidică moderat amplificată poate produce o boală, dar repetiţia este perfect stabilă şi se transmite fără modificări de mărime în mai multe generaţii. În alte cazuri, numărul de repetiţii trinucleotidice al secvenţei poate să crească în succesiunea generaţiilor, realizând o expansiune progresivă sau bruscă a secvenţei repetate, care este numită instabilă. În aceste cazuri, dacă secvenţa se găseşte în interiorul sau vecinătatea unei gene, se produce o alterare a expresiei genei ce conţine secvenţa şi deci o stare de boală. În afara expansiunii repetiţiilor trinucleotidice instabile există foarte probabil si expansiuni ale altor tipuri de repetiţii. Astfel, o expansiune a unei repetiţii de 12 nucleotide în gena cistatin B produce epilepsia mioclonică progresivă. Modul lor de transmitere a bolilor cauzate de mutaţii dinamice prezintă două caracteristici neobişnuite: există o creştere a riscului de apariţie a bolii sau a severităţii şi precocităţii manifestărilor clinice în succesiunea generaţiilor (anticipaţie); formele cele mai severe se transmit de preferinţă printr-unul din părinţi (“efect parental”). Mecanismul de producere a bolii prin expansiuni trinucleotidice Caracteristica definitorie a mutaţiilor dinamice o constituie instabilitatea lor, exprimată cel mai adesea prin creşterea numărului de copii trinucleotidice. Instabilitatea devine manifestă cu ocazia diviziunilor pe care le realizează celula purtătoare, fie în timpul transmiterii de la părinţi la descendenţi (instabilitate intergeneraţională sau “instabilitate meiotică”), fie prin mitoză, producând variaţii de mărime în ţesuturile unui individ afectat (mozaicism somatic sau “instabilitate mitotică”). Instabilitatea se exprimă clinic sub formă de boală când este depăşit un anumit prag critic de repetări. Sub pragul critic variaţiile numărului de repetiţii trinucleotidice generează polimorfisme ADN benigne. O nouă traversare a meiozei, de această dată în gonadele bolnavilor, se soldează – cel mai frecvent – cu expansiuni adiţionale care, în generaţia următoare, vor imprima o simptomatologie mai severă şi vor precipita debutul clinic, la o vârstă mai precoce. Acest fenomen, denumit anticipaţie, caracterizează aproape toate bolile prin repetiţii trinucleotidice descrise până în prezent, dar se manifestă şi în alte afecţiuni cu mecanism patogenic neclar. Intensitatea de manifestare a bolii la descendenţi este proporţională cu dimensiunile secvenţei amplificate şi depinde uneori de sexul părintelui prin care se face transmiterea: în sindromul X fragil şi distrofia miotonică, boala este mai gravă dacă transmiterea se face de către mamă, în timp ce în boala Huntington gravitatea formei clinice este mai mare când boala este transmisă de către tată. Mecanismul acestui “efect parental” este necunoscut. Genele ce conţin expansiuni trinucleotidice instabile se împart în două clase majore: (1) Gene care prezintă expansiuni foarte mari ale unor repetiţii (CGG, CCG, CTG, GAA), localizate în secvenţele necodante ale genei – în promotor, regiunile 5’ şi 3’ transcrise dar netranslate sau în introni. Expansiunea lor masivă blochează transcripţia genei şi produce pierdera funcţiei genei. Alelele normale şi stabile au de obicei 5-50 repetiţii; alelele cu mărime intermediară între 25-200 repetiţii - sunt nepatogene (atenţie: pragul critic este destul de mare) dar foarte instabile. Creşterea treptată a numărului de repetiţii accentuează instabilitatea şi realizează, în apropierea pragului critic, o premutaţie. Purtătorii de premutaţii sunt fenotipic normali dar vor avea descendenţi afectaţi deoarece în celulele lor germinale se produce o expansiune bruscă a premutaţiei care, prin depăşirea pragului critic de repetiţii, devine mutaţie completă.
(2) Gene ce prezintă o expansiune moderată a tripletului CAG (ce codifică glutamina) în secvenţele codante; această expansiune nu modifică transcripţia şi translaţia dar alterează structura şi funcţia proteinei codificate (generând o secvenţă poliglutaminică anormală). Alelele normale şi stabile au 10-30 repetiţii, ele devin (ocazional) patogene la un prag critic foarte îngust şi determină o alterare specifică a anumitor neuroni. Cu cât repetiţia este mai mare cu atât boala debutează la o vârstă mai precoce. Acest mod de acţiune - după cum se vede diferit de primul grup - rămâne enigmatic. Prezenţa unui mecanism unic de mutaţie (sau predominant) face ca identificarea mutaţiei prin analiza ADN să fie cel mai bun mijloc de diagnostic exact a fiecăreia dintre bolile prin expansiunea repetiţiilor trinucleotidice. Boli genetice produse prin mutaţii dinamice In 1991 au apărut primele rapoarte privind implicarea expansiunii unor repetiţii trinucleotidice în etiologia a două boli genetice: repetiţia CGG în cazul sindromului X-fragil şi repetiţia CAG în cazul atrofiei musculare spinobulbare (boala Kennedy). In ambele cazuri s-a constatat că pe măsură ce gena trece de la o generaţie la alta, numărul de repetiţii trinucleotidice creşte progresiv, suferă o expansiune (de aici şi numele de mutaţii dinamice sau instabile), şi când depăşeşte un anumit prag critic produce anomalii în expresia genei sau funcţia proteinei codificată de genă, care determină starea de boală. De asemenea s-a constatat că există o strânsă corelaţie între creşterea numărului acestor repetiţii şi apariţia mai precoce şi severitatea mai mare a manifestărilor clinice. Ulterior s-a dovedit ca acest mecanism al mutaţiilor dinamice este caracteristic şi altor boli genetice, astfel ca în prezent se poate vorbi clar despre o nouă clasă de boli genetice: bolile produse prin mutaţii dinamice, instabile sau prin expansiunea unor repetiţii simple, cel mai frecvent trinucleotide. In prezent lista acestor boli cuprinde cel puţin 15 entităţi clinice distincte (Tabelul 2). Tabelul 2. Boli produse prin mutaţii dinamice Boala Sindromul X fragil Ataxia Friedreich Distrofia miotonică Epilepsia mioclonică Boala Huntington Boala Kennedy – Atrofia musculară spinală şi bulbară Atrofia dentatorubralăpalidoluysiană Ataxia spinocerebelară 1 Ataxia spinocerebelară 2 Boala Machado-Joseph (SCA3) Ataxia spinocerebelară 6 Ataxia spinocerebelară 7
Trans- Gena mitere LX FMR1 AR FRDA AD AR AD XR
DMPK CSTB HD AR
Localizarea Secventa repetiţiei genei Xq27.3 (CGG)n 9q13(GAA)n q21.1 19q13 (CTG)n 21q22.3 (CCCCGCCCCGCG)n 4p16.3 (CAG)n Xq11-q12 (CAG)n
AD
DRPLA
12p13.31
(CAG)n
3-35
49-88
AD AD AD
ATX1 ATX2 ATX3
6p23 12q24 14q32.1
(CAG)n (CAG)n (CAG)n
6-38 14-31 12-39
39-83 32-77 62-86
AD AD
Repetiţii Repetiţii stabile instabile 6-54 200-1000 ~7-22 200-1700 5-35 ~2-3 ~10-26 9-35
50 - 4000 40-80 36-100 38-62
CACNA1A 19p13 (CAG)n ~4-17 SCA7 3p12(CAG)n 7-35 p21.1 Ataxia spinocerebelară 8 AD SCA8 13q21 (CTG)n 15-21 Ataxia spinocerebelară 10 AD SCA10 22q13 (ATTCT)n ~10-22 Ataxia spinocerebelară 12 AD PPP2R2B 5q31-q33 (CAG)n ~9-18 Ataxia spinocerebelară 17 AD TBP 6q27 (CAG)n 25-42 S-a stabilit prin convenţie (1993) că nomenclatura tripletelor repetitive să se facă în direcţia 5’→3’.
21-30 37-200 100-152 900-4000 55-78 50-55
Mutaţiile dinamice prezintă o serie de proprietăţi comune: -
creştere moderată a numărului repetiţiilor nu se asociază deobicei cu apariţia manifestărilor clinice dar determină o creştere a instabilităţii repetiţiei (premutaţii); mutaţiile complete ce produc boala sunt rezultatul unei modificări (de regulă o creştere peste un anumit prag) a numărului repetiţiilor faţă de numărul iniţial; există o relaţie relativ liniară între numărul copiilor repetiţiei şi severitatea clinică ori vârsta de apariţie a simptomelor (fenomenul de anticipaţie); formele cele mai severe se transmit de preferinţă printr-unul dintre părinţi (“efect parental”);
Exemple ilustrative de boli frecvente produse prin acest mecanism sunt boala Huntington, distrofia miotonică şi sindromul X fragil. BOALA HUNTINGTON Boala (sau coreea) Huntington este o boală neurologică degenerativă, progresivă, caracterizată printr-un sindrom extrapiramidal, însoţit de tulburări psihice care evoluează spre demenţă. Boala se transmite autozomal dominant şi este determinată de mutaţii dinamice ale genei HD pentru huntingtină. Prevalenţa bolii în populaţia europeană este de circa 1 la 20.000 de persoane. Simptomatologie. Boala este caracterizată prin apariţia în a doua jumătate a vieţii a unor tulburări neurologice motorii (coree, distonie), tulburări cognitive şi de personalitate, care evoluează progresiv. In stadiile avansate de boală pacienţii dezvoltă tulburări motorii severe (care îi fac dependenţi), pierdere ponderală, tulburări de somn, incontinenţă şi mutism, iar evoluţia este inexorabilă către decesul prematur (vârsta medie la deces fiind 55 de ani). Genetică. Boala Huntington se transmite autozomal dominant, dar are o penetranţă dependentă de vârstă. Boala este determinată de mutaţii ale genei HD pentru huntingtină, care afectează predominant striatumul şi cortexul şi determină manifestările clinice caracteristice. Mutaţiile care cauzează boala Huntington sunt de regulă expansiuni ale unei repeţii CAG localizată la nivelul exonului 1 al genei HD. Alelele normale ale genei au 10-26 de repetiţii. Alelele cu un număr de 27-35 de repetiţii nu determină manifestări clinice, dar se asociază cu un risc crescut de expansiune până la mutaţii complete în cursul gametogenezei. Alelele mutante ce produc boala au peste 35 de repetiţii; penetranţa unor alele cu 36-41 repetitii este însă redusă. Vârsta pacientului la diagnostic este invers corelată cu numărul repetiţiilor CAG; astfel, formele cu debut adult se asociază cu un număr de 40-55 repetiţii, în timp ce debutul juvenil al bolii este asociat unui număr de peste 60 repetiții CAG; nu există însă corelaţii între numărul repetiţiilor CAG şi alte trăsături ale bolii. Transmiterea mutaţiilor în succesiunea generaţiilor se asociază cu un risc de amplificare a numărului repetiţiilor, ceea ce determină fenomenul de anticipaţie (apariţia mai precoce a bolii în succesiunea generaţiilor). Acest fenomen de amplificare este mult mai frecvent în gametogeneza masculină. Ca urmare, indivizii care moştenesc o alelă mutantă de la tată au un risc mai mare de a dezvolta forme de boală cu debut juvenil (circa 80% dintre cazurile severe având alela mutantă moştenită de la tată). Patogenie. Expansiunea repetiţiei CAG conduce la expansiunea tractului poliglutaminic din structura huntingtinei, ceea ce este echivalentul unei mutaţii cu câştig de funcţie. Huntingtina mutantă pare să fie cauza acumulării unor agregate în citoplasma şi nucleii neuronilor de la nivelul neostriatului, cu modificări consecutive ale nivelului receptorilor exprimaţi la acest nivel şi, în final, moartea neuronală.
Sfat genetic şi diagnostic presimptomatic. Intrucât debutul bolii la vârsta adultă, adeseori către sfârşitul perioadei reproductive, este adeseori probabil ca persoanele purtătoare să fi transmis mutaţia la descendenţi. Riscul de transmitere a unor mutaţii complete este de 50%. In cazul purtătorilor unor premutaţii riscul de expansiune către o mutaţie completă este de circa 3% în cazul meiozei masculine. In prezent sunt disponibile metode de diagnostic prenatal şi presimptomatic bazate pe analiza numărului repetiţiilor CAG de la nivelul exonului 1 al genei pentru huntingtină. Diagnosticul presimptomatic pune însă numeroase probleme etice, având în vedere trauma psihologică pe care o asociază predicţia unei boli pentru care nu există un tratament curativ. DISTROFIA MIOTONICĂ Distrofia miotonică este o afecţiune neuromusculară transmisă autozomal dominant, cu o incidenţă de circa 1 la 8.000 de nou-născuţi, caracterizată prin penetranţă incompletă şi expresivitate variabilă. Simptomatologie. Simptomele apar de regulă la adultul tânăr, primul semn fiind cel mai adesea întârzierea capacităţii de relaxare a mâinii după încleştarea pumnului. Acest semn este denumit miotonie şi este prezent în majoritatea cazurilor simptomatice, fiind urmat de hipotonie şi hipotrofie musculară progresive. Alte manifestări frecvente sunt tulburarile de conducere cardiacă, afectarea musculaturii netede, tulburările mentale, hipersomnia, cataracta oculară şi diabetul insulino-dependent. La bărbaţi se adaugă atrofia testiculară şi calviţia frontală precoce. Există şi forme congenitale care se caracterizează prin severitate crescută (hipotonie musculară, retard mental major, displegie facială, dificultăţi de nutriţie şi tulburări respiratorii) şi mortalitate neonatală de până la 25%. Genetică. Gena responsabilă de boală este gena DMPK, cu localizare cromozomială 19q13.2-q13.3, ce codifică o protein kinază. Distrofia miotonică este inclusă în prezent în categoria bolilor determinate de mutaţii dinamice, afecţiunea fiind asociată cu expansiunea unui triplet CTG în regiunea 3' netranslată a genei. Numărul normal al acestor repetiţii variază între 5 şi 30; formele moderate de boală asociază 50-80 de copii ale tripletului, în timp ce indivizii cu forme severe de boală au peste 2.000 de copii. Amplificarea repetiţiei poate avea loc atât în meioza masculină, cât şi în cea feminină. Cu toate acestea, expansiunile masive, de ordinul a mii de repetiţii, apar numai în gametogeneza feminină. Ca urmare, formele congenitale de boală sunt transmise aproape întotdeauna pe cale maternă. SINDROMUL X FRAGIL Sindromul X fragil, o afecțiune cu transmitere dominantă legată de X, este una dintre cele mai comune forme de retardare mentală ereditară. Fenotipul cognitiv, comportamental și fizic variază dependent de sex, persoanele de sex masculin fiind afectate mai sever din cauza eredității legate de X a mutației ce cauzează sindromul. Sindromul X fragil este cauzat de inactivarea prin mutație a genei FMR1, care se găsește pe cromozomul X. Această mutație afectează modul în care organismul produce anumite proteine necesare pentru desfășurarea normală a proceselor mentale și este asociată cu manifestări cu gravitate variabilă de la caz la caz, printre care s-ar putea număra dificultățile de învățare, cognitive, sau problemele de comportament. Gena FMR1 (Fra X Mental Retardation) este situată pe braţul lung al cromozomului X, în poziţia Xq27.3. FMR1 este exprimată constitutiv în viaţa embrionară; postnatal, gena rămâne intens activă transcripţional în doar câteva organe, cu precădere în uter, testicule şi creier.
Produsul de transcripție al genei FMR1 este proteina FMRP, localizată în citoplasmă. Absenţa FMRP, consecutivă inactivării genei FMR1, determină alterările morfofuncţionale considerate a fi răspunzătoare de imprimarea fenotipului X fragil. În sindromul X fragil, inactivarea genei FMR1 este rezultatul hiper-metilării repetițiilor trinucleotidice CGG, ceea ce se soldează cu sistarea activităţii transcripţionale. S-a stabilit că procesul metilării se inţiază când numărul repetărilor CGG depăşeşte 230. Rata transcrierii alelelor conţinând între 60 şi 230 de repetări nu este modificată. Caracterizate exclusiv prin instabilitate, aceste alele sunt denumite premutaţii. Tranziţia la mutaţia completă (peste 230 de repetări) se produce în cursul ovogenezei. Când numărul repetărilor în exces este de ordinul sutelor, metilarea devine completă, iar nivelul transcripţiei scade la zero. Întrucât expansiunea unităţilor repetitive poate avea loc şi în mitoză, celulele unora dintre bolnavii cu sindrom X fragil – şi anume ale celor care moştenesc mutaţii de dimensiuni mici – diferă între ele în ce priveşte numărul repetărilor, gradul metilării şi, implicit, nivelul expresiei genice. Această situaţie este desemnată prin termenul de mozaic. Incidența și prevalența sindromului X fragil. Datele statistice arată că prevalența sindromului X fragil este de circa 1/3.600 - 1/4.000 la indivizii (persoanele) de sex masculin și respectiv de 1/4.000 - 1/6.000 la cei de sex feminin. Explicația diferențelor existente între cele două sexe din punct de vedere al prevalenței acestui sindrom constă în faptul că în timp ce toți băieții/bărbații cu o mutație deplină (full mutation) a genei FMR1 manifestă simptomele sindromului X fragil, unele dintre fetele/femeile cu mutație FMR1 deplină nu vor manifesta trăsăturile comportamentale, cognitive sau fizice ale sindromului. Conform rezultatelor unui studiu realizat în anul 2012, prevalența premutațiilor genei FMR1 este de 1/151 la persoanele de sex feminin și respectiv de 1/468 la persoanele de sex masculin (https://fragilex.org/fragile-x/ prevalence/). Deși nu există date statistice privind prevalența sindromului X fragil în România, se consideră că aceasta este similară celei globale (1/3.600 în cazul bărbaţilor şi între 1/4.000 1/6.000 în cazul femeilor. Simptomatologia sindromului X fragil. Persoanele cu sindrom X fragil nu au toate aceleași semne și simptome, dar unele pot fi întâlnite în toate cazurile. In general, manifestările sunt mai blânde la femei decât la bărbați. La bărbați, simptomele includ: întârzierea dezvoltării sau dizabilitate intelectuală (în 96% din cazuri); probleme de atenție (84%); anxietate (70%); hiperactivitate (66%); autism (46%); tendința de autorănire / mutilare (41%); agresivitate (38%); atacuri de apoplexie (18%); depresie (12%). La femei, simptomele includ: probleme de atenție (67%); întârzierea dezvoltării sau dizabilitate intelectuală (în 64% din cazuri); anxietate (56%); hiperactivitate (30%); depresie (22%); autism (16%); agresivitate (14%); tendința de autorănire / mutilare (10%); atacuri de apoplexie (7%). Pacienții cu sindrom X fragil prezintă dizabilități intelectuale care pot varia de la minore la severe. De asemenea, sindromul poate afecta capacitatea persoanei de a gândi, de a fi motivată și de a învăța. Mulți dintre bolnavi sunt diagnosticați cu tulburări de atenție, hiperactivitate, anxietate și probleme de procesare a limbajului. Totuși, o persoană cu acest sindrom poate avea mai multe abilități decât sugerează scorul obținut la testul de inteligență. De asemenea, printre problemele mentale s-ar mai putea număra și comportamentele de tip autist. De regulă, sugarii și copiii cu sindrom X fragil nu prezintă caracteristici fizice particulare pentru acest sindrom. Când ajung la pubertate, indivizii afectați vor avea fața îngustă, cap mare, urechi mari, articulații flexibile, platfus, bărbie și frunte proeminente. Aceste semne fizice devin mai evidente o dată cu înaintarea în vârstă. Băieții vor avea testicule mai mari. Fetele vor avea mai puține semne fizice ale bolii, comparativ cu băieții.
Majoritatea copiilor diagnosticați cu sindromul X fragil au unele probleme de comportament, pot experimenta frica sau anxietate în situații noi, pot avea dificultăți în a avea contact vizual cu anumite persoane. Băieții (mai ales) pot înregistra deficit de atenție și agresivitate, iar fetele vor suferi de timiditate accentuată, dar și de tulburări de atenție și hiperactivitate. Cei mai mulți dintre băieții cu sindrom X fragil au tulburări de vorbire și limbaj. Aceștia pot întâmpina dificultăți în a vorbi clar, se vor bâlbâi, sau vor folosi doar anumite părți din cuvinte. De asemenea, nu vor putea diferenția inflexiunile vocale ale unei persoane și nici nu vor putea descifra limbajul corpului. De obicei, fetele nu vor avea probleme grave de vorbire sau limbaj. Unii dintre copiii cu sindrom X fragil vor începe să vorbească mai târziu decât ceilalți copii, iar alții vor folosi doar limbajul non-verbal pe parcursul vieții lor. Mulți dintre copiii cu sindrom X fragil sunt deranjați de anumite senzații, cum ar fi lumina puternică, zgomotele puternice sau modul în care simt anumite haine pe corpul lor. Aceste probleme senzoriale îi pot face să manifeste unele probleme de comportament. Transmiterea ereditară a sindromului X fragil. Modelul transmiterii la descendenţi a alterărilor mutaţionale ale genei FMR1 se particularizează prin câteva trăsături distinctive. Studiile privind segregarea în familii a sindromului X fragil au arătat că bărbaţii aparent sănătoşi, dar care – prin poziţia în pedigree – apar a fi purtători obligaţi, transmit mutaţia moştenită de la mame tuturor fiicelor lor; aproximativ 40% dintre descendenţii de sex masculin ai fiicelor – obligatoriu heterozigote deoarece unul dintre cromozomii X provine de la tată – şi care sunt, de asemenea, clinic normale, prezintă forme uşoare sau medii ale bolii. În generaţia următoare proporţia afectaţilor creşte la 50%, prevalente fiind formele severe. În ce priveşte fraţii bărbaţilor transmiţători, riscul acestora de a fi afectaţi este de numai 9%. Analizele moleculare au relevat că bărbaţii transmiţători, clinic normali, sunt, de fapt, vectorii unor alterări premutaţionale (alele conţinând între 60 şi 230 de repetări CCG). Ei transmit fiicelor un număr de repetări trinucleotidice similar cu cel pe care îl primesc de la mame. Altfel spus, alela premutaţională a genei FMR1 îşi menţine stabilitatea pe întregul parcurs al spermatogenezei. Autismul asociat sindromului X fragil. Sindromul X fragil (sau Martin-Bell) este cea mai frecventă cauză de retard mintal ereditar și principala formă genetică de autism. Pe brațul lung al cromozomului X, la nivelul benzii q27.3, se găsește gena FMR1 (Fragile Mental Retardation 1). In mod normal, în regiunea 5’ netranslată, promotoare, a genei FMR1, există o secvență de maxim 44 repetări CGG; repetarea de un număr mai mare de 200 ori a acestei trinucleotide determină un grad de metilare a porțiunii respective a ADN. Aceasta produce un aspect particular al cromozomului X, cu o mică ruptură la capătul brațului lung (de la care derivă denumirea de cromozom X fragil). Din punct de vedere fenotipic, această mutație are două exprimări clinice: sindromul X fragil și autismul. De la acestea derivă denumirea FRAXA a situsului fragil de pe cromozomul X (Fragile X and Autism). Diagnosticul sindromului X fragil. Analiza citogenetică pentru diagnosticul sindromului X fragil s-a folosit încă din anii 1970, aceasta bazându-se pe cultivarea celulelor într-un mediu deficient în folat și analiza ulterioară a situsurilor fragile (discontinuități de colorare în regiunea repetițiilor trinucleotidice) pe brațul lung al cromozomului X. In timp, această metodă s-a dovedit a avea precizie redusă, deoarece adesea situsul fragil putea fi văzut în mai puțin de 40% din celulele unui individ. Aceasta nu era o problemă mare la bărbați, ci la femeile purtătoare, la care, în general, situsul fragil poate fi văzut doar în 10% din celule, ceea ce face ca adesea mutația să nu poată fi vizualizată. Testele citogenetice nu au fost abandonate nici după descoperirea bazei moleculare a sindromului X fragil (FXS), însă sunt folosite pe o scară mai redusă pentru diagnosticare. De altfel, se afirmă că dintre testele de diagnostic folosite în prezent analiza citogenetică se caracterizează prin cea mai ridicată rată de rezultate false. Au fost raportate cazuri în care anomaliile cromozomiale structurale nu au putut fi confirmate prin diagnosticul molecular, de exemplu pentru mutaţia FRAXA.
Este un fapt binecunoscut că analiza citogenetică nu permite detectarea tuturor femeilor purtătoare, şi nici a tuturor bărbaţilor purtători, deoarece doar o mică proporţie din celulele lor vor exprima fra(X). In schimb, această metodă prezintă avantajul de a face posibilă detectarea altor anomalii cromozomiale, inclusiv a altor situsuri fragile, cu un singur test. Tehnica Southern blotting este în prezent cea mai folosită metodă de laborator pentru diagnosticarea sindromului X fragil (FXS), chiar dacă în ultimul deceniu au fost propuse câteva abordări alternative. Acestea includ PCR cu probe marcate radioactiv sau cu argint, RTPCR (PCR cu transcripţie inversă), MS-PCR (PCR cu sensibilitate la metilare), sau analizele imuno-histochimice. La femei, fragmentele PCR normale cu mărimi similare vor forma o singură bandă, făcând imposibilă diferenţierea unei femei normale homozigote de o purtătoare a mutaţiei FXS. Având în vedere acest inconvenient, a fost elaborată o tehnică PCR alternativă bazată de analiza fluorescenţei, denumită PCR sensibilă la metilare (MS-PCR), care s-a dovedit a fi utilă pentru detectarea femeilor purtătoare, chiar dacă deosebirea între premutaţii şi mutaţiile depline este uneori dificilă. Testarea MS-PCR necesită de 5-6 ori mai puţin ADN recoltat de la pacient decât analiza cu ajutorul tehnicii Southern blot (1 μg faţă de 5-6 μg), iar rezultatul se obţine în mai puţin de 2 zile de lucru comparative cu 1-2 săptămâni în cazul Southern blot. Aceste caracteristici şi capacitatea de a reflecta cu fidelitate mărimea alelelor de mărime normală şi cu premutaţii fac MS-PCR o alternativă atractivă combinaţiei între Southern blot şi PCR utilizate în mod frecvent pentru detectarea alelelor cu mutaţii depline şi a celor de mărime normală în diagnosticul sindromului X fragil. Testarea prenatală pentru sindromul X fragil. Analiza cariotipului în celulele fetale recoltate prin biopsia de vilozități coriale sau amniocenteză a fost metoda standard pentru diagnosticul citogenetic prenatal începând din anii 1970. Deși prezintă un nivel ridicat de încredere, această metodă prezintă o serie de limitări, ce includ: necesitatea culturilor de celule, o durată de timp de 10-14 zile între recoltarea materialului biologic și obținerea rezultatelor, rezoluția limitată, o interpretare bazată pe analiza subiectivă, capacitatea limitată de a detecta delețiile, duplicațiile și alte rearanjări submicroscopice. Această categorie de variante structurale genomice este recunoscută din ce în ce mai mult ca fiind asociată cu circa 17% din cazurile de retard mental sindromic și non-sindromic. Testele ADN care determină mărimea situsului X fragil (numărul de repetiții CGG) sunt considerate în prezent cele mai adecvate teste de diagnostic, având o sensibilitate de 99% și fiind 100% specifice. Aceste teste sunt aplicabile și pentru diagnosticul prenatal, folosind celule din lichidul amniotic (recoltate prin amniocenteză) și din vilozitățile coriale (recoltate prin biopsie). Indiferent de variațiile protocolurilor disponibile, comparativ cu Southern blot, acestea sunt mai ieftine, automatizate și rapide. De asemenea, PCR se poate realiza cu cantități foarte mici de ADN, făcând recoltarea de material biologic pentru extracția de ADN foarte convenabilă pentru orice pacient. Diagnosticul de certitudine se bazează pe evidențierea mutațiilor prin tehnica Southern blot, care evidențiază expansiunea și starea ei metilată sau nemetilată.
BOLILE NEURODEGENERATIVE Bolile neurodegenerative sunt afecţiuni neurologice cronice produse prin pierderea progresivă a neuronilor. În funcţie de regiunea SNC afectată şi de prezenţa unor markeri celulari şi moleculari se deosebesc mai multe tipuri, care au o etiologie multifactorială şi/sau monogenică. Cele mai frecvente afecţiuni sunt boala Alzheimer şi boala Parkinson; alte forme mai rare sunt boala Huntington, ataxiile spinocerebeloase, scleroza laterală amiotrofică, atrofia musculară spinală, etc. BOALA ALZHEIMER Boala Alzheimer (care apare la circa 5% din persoanele peste 65 de ani) se caracterizează prin atrofie corticală (pierderea neuronilor) şi deteriorare intelectuală lentă, dar progresivă (pierderea memoriei, afazie, agnozie, dezorientare temporo-spaţială), până la demenţă. Aceste fenomene se asociază cu o disfuncţie a neurotransmiţătorilor (în special o deficienţă marcată de acetilcolină). Modificările anatomopatologice specifice sunt plăcile senile de amiloid extra-neuronale şi agregatele neurofibrilare. Amiloidul din plăcile senile se formează prin clivarea unei proteine mai mari (precursoare proteina a β-amiloidului - APP). Boala Alzheimer este o afecţiune cu heterogenitate genetică. Circa 6-10% din cazuri debutează precoce, înainte de 65 de ani, şi sunt familiale; o parte dintre ele sunt determinate de mutaţii (transmise autozomal dominant) în genele APP – de pe cromozomul 21, presenilină 1 (PSEN1) – de pe cromozomul 14 şi presenilină 2 (PSEN2) – de pe cromozomul 1. Majoritatea pacienţilor cu boală Alzheimer sunt însă cazuri sporadice, cu determinism multifactorial; paradoxal, nu s-au identificat mutaţii ale genelor APP, PSEN sau TAU (decât în cazuri rare), deşi mecanismul patogenic pare acelaşi ca şi în formele precoce. În schimb s-a pus în evidenţă un alt factor de risc: APOE 4 – o alelă a genei pentru apolipoproteina E (constituent al LDL); aceasta este prezentă la 50-60% din bolnavi şi dublează riscul purtătorilor de a face boală Alzheimer; printr-un mecanism necunoscut, APOE 4 modifică vârsta de debut cu 5-10 ani mai devreme la heterozigoţi şi 10-20 de ani la homozigoţi. BOALA PARKINSON. Boala Parkinson (care apare la 0,5-1% din persoanele peste 65 de ani) este, ca frecvenţă, a doua boală neurodegenerativă după boala Alzheimer. La scară mondială, boala este diagnosticată la peste 300 000 persoane în fiecare an. În anul 2013, la nivel european existau peste 1.2 milioane de pacienți cu Parkinson; se estimează că numărul acestora se va dubla până în 2030. În România sunt peste 70.000 de bolnavi cu Parkinson, dar se consider că există un număr mult mai mare de pacienți care suferă de această afecțiune, dar care încă nu au fost diagnosticați. Boala Parkinson se caracterizează prin distrugerea progresivă a neuronilor din sistemul extrapiramidal (în special substanţa neagră şi corpii striaţi), asociată cu prezenţa unor depozite de proteine ubicuitinate în citoplasma neuronilor (corpi Lewy) sau prelungirile lor (neurite Lewy) şi depleţie de dopamină. Semnele clinice cardinale ale bolii Parkinson sunt: tremorul de repaus (tremurături lente, caracteristice, ale mâinilor şi capului, persistând în repaus), rigiditatea (creșterea rezistenței la mobilizarea pasivă a mușchilor, mai evidentă la mișcările voluntare ale membrului contralateral) și bradikinezia (încetinirea generală a ritmului activității motrice). La acestea se pot adăuga instabilitatea posturală (tulburări de echilibru și coordonare, care se instalează de regulă tardiv, de obicei după 7-8 ani de evoluție a bolii) și hipertonia extrapiramidală (exagerare permanentă a tonusului muscular, de origine neurologică). În 70% din cazuri, gesturile ritmice incontrolabile ale mâinilor, capului sau picioarelor constituie primul simptom și se manifestă în special în repaus și în perioadele de stres.
Tremorul este diminuat în timpul mișcărilor și dispare în somn, este accentuat de stres și de oboseală. Tremorul devine mai puțin evident pe măsura evoluției bolii. Bradikinezia include și scăderea mișcărilor spontane și scăderea amplitudinii mișcărilor. Bradikinezia este vizibilă prin micrografie (scris de mână mic, ilizibil), hipomimie (diminuarea mișcărilor mimice), clipit rar și hipofonie (voce diminuată). Alte semne sunt: tulburări ale somnului, dificultăți la deglutiție, sialoree (salivație abundentă), hipofonie (voce diminuată, monotonă) și dificultăți la articularea cuvintelor, incontinență urinară și constipație, datorită alterarii funcției intestinului și vezicii, confuzie, pierderea memoriei, tulburări ale mersului, cu pași mici, târșâiți; tendința accentuată spre cădere prin pierderea reflexelor posturale, pierderea balansului brațelor în timpul mersului, hipotensiune ortostatică, dermatită seboreică, modificări ale personalității. Demența survine tardiv în evoluția bolii Parkinson și afectează 15-30% din pacienți. Memoria recentă este afectată. Studiul unor forme familiale cu debut precoce (autozomal dominante) a permis identificarea unor mutaţii în gena sinucleinei, o proteină cu funcţie necunoscută, care se acumulează în corpii Lewy. Alte studii în sindromul parkinsonismului juvenil (autozomal recesiv) au pus în evidenţă mutaţii în gena parkinei (6q25), o proteină (din familia E3 ubicuitin-ligazei) sintetizată în SNC şi implicată în metabolismul sinucleinei. În alte forme familiale rare s-au evidenţiat mutaţii în alte gene (de exemplu, ubicuitin-C-hidrolaza). La circa 5% din cazurile monogenice de boală Parkinson s-au identificat mutaţii în gena parkinei (PRKN). Circa 15% dintre indivizii cu boală Parkinson au (sau au avut) o rudă de gradul I care manifestă (sau a manifestat) această boală. La acești indivizi există mutații ale genelor SNCA (pentru alfa-sinucleină), PRKN (pentru parkină), LRRK2 (pentru kinaza 2 bogată în repetiții ale aminoacidului leucină) PINK1 (kinaza 1 indusă de PTEN), DJ1 și ATP13A2. S-a demonstrat că mutațiile în genele SNCA, LRRK2 și GBA (pentru glucocerebrozidază) sunt factori de risc pentru boala Parkinson sporadică.
