Laboratorio de Bioquímica, Bioquímica, No. No. 3, Enero Enero 2013 Prof.: Prof.: Rodrigo Torr Torre e !ae"
Extracción e Identificación de Proteínas David Leonardo Ruiz Rivera 1, Sidne Stefany Rodríguez 1 1
#ni$eridad %ndutria& de !antander.
Realizado 23-30/01/2013; Entregado 06/02/2013; r!"ti"a #o$ 3; %ru&o' (1; Su)gru&o' *lue$
Resumen En e+ta &r!"ti"a +e utiliz el .todo de *iuret y de a)+or"in ultravioleta 20n &ara la "uantifi"a"in de &roteína+ &re+ente+ en la arina ue +e ai+laron de a"uerdo a +u grado de +olu)ilidad en diferente+ +olvente+ "oo #a4l, Et5( y #a5($ ara "ada uno de lo+ .todo+ +e realiz una "urva e+t!ndar &ara deterinar el "ontenido de &roteína+ en lo+ diferente+ etra"to+$
Palabras claves: 4uantifi"a"in de &roteína+, *iuret, a)+or"in ultravioleta$
1. INTROD!!I"N INTROD!!I"N %bsorción en el ltravioleta. La+ &roteína+ &ueden +er etraída+ y "la+ifi"ada+ de a"uerdo a +u +olu)ilidad en diferente+ +olvente+ y +e &ued &ueden en "la+ "la+if ifi" i"ar ar "oo "oo'' al)7 al)7i ina na+, +, glo) glo)ul ulin ina+ a+,, &rol &rola ain ina+ a+ y glut glutel elin ina+ a+$$ E+ta E+ta "la+ifi"a"in +e realiz de)ido a la etra""in de arina en agua, al"ool y en edio+ al"alino+ y &oder "uantifi"ar la "on"entra"in de &roteína u+ando .todo+ e+&e"trofoto.tri"o+$ e+&e"trofoto.tri"o+$
Se ide la a)+or)an"ia a 2<0-20 n originada fundaentalente &or lo+ anillo+ aro!ti"o+ de tri&tfano y tiro+ina$
#. $%R!O TE"RI!O $&todo de 'iuret: Se )a+a en la fora"in de un "o&le8o "oloreado entre el 4u 29 y lo+ gru&o+ gru&o+ #( de lo+ enla"e enla"e++ &e&tídi"o+ en edio )!+i"odando un "olor &ur&7reo ue +e "uantifi"a e+&e"trofoto.tri"aente e+&e"trofoto.tri"aente :0n$ La inten+ inten+ida idad d de "olora "olora"i "in n e+ dire"t dire"tae aente nte &ro&or"ional a la "antidad de &roteína+ enla"e+ &e&tídi"o+ y la rea""in e+ )a+tante e+&e"ífi"a, de anera anera ue &o"a+ &o"a+ +u+tan +u+tan"ia "ia++ inter interfie fieren ren$$ La +en+i)ilidad del .todo e+ uy )a8a y +lo +e re"oienda &ara la "uantifi"a"in de &roteína+ en &re&arado+ uy "on"entrado+$ "on"entrado+$
Ob(etivos
Etraer lo+ ti&o+ de &roteína+ &re+ente+ en la arina de trigo de a"uerdo a +u +olu)ilidad en diferente+ +olvente+$ Deterinar ar "uantitat "uantitativa ivaente ente el "ontenido "ontenido Deterin de &roteína+ ediante lo+ .todo+ derivado+ "olori.tri"o+ "olori.tri"o+ *iuret y de a)+or"in$
2 + ¿ →Complejo →Complejo Cu− proteína proteína ( purpura purpura )
Proteína Proteína +Cu
¿
1
Laboratorio de Bioquímica, No. 3, Enero 2013 Prof.: Rodrigo Torre !ae"
(
#. $ateriales ) $&todos
tu)o+ &ara "entrífuga$ )alone+ aforado+ de 2: L$
=u)o+ de en+ayo$ i&eta de : L, de 2 L y &era$ E+&e"trofotetro de ultravioleta
4entrífuga$ =ero+tato$ *alanza analíti"a$ (arina$ Solu"in &atrn de &roteína 10 g/L y
Rea"tivo de *iuret
Solu"in de #a4l 1> &/v$ Solu"in de Etanol 4 2(:5( <:>$ Solu"in de #a5( 0,1 #$
mg mL
)(
C 2 =0,2
)
(
∗ 0,1 mL =C 2∗ 5 mL
)
mg mL
=a)la 1$ ?)+or)an"ia &ara lo+ &atrone+ &re&arado+ en el .todo *iuret
Muestr a Blanco 1 2 3 4 5 6 7
1 g/L$
10
Concentració n mg/ml
Absorbanci a
0 0,20 0,60 1,0 1,4 1,8 2,4 3
0,001 0,0: 0,13< 0,20@ 0,23 0,3: 0,21 0,@
En )a+e a e+to+ re+ultado+ +e realiz la "urva de "ali)ra"in "orre+&ondiente a e+te .todo'
ara la realiza"in de la &r!"ti"a +e to 2 g de arina en un tu)o de en+ayo al "ual +e adi"ion 10 L de (25, +e agit durante 10 in y +e introdu8o en la "entrífuga a 3:00 r&$ El +o)renadante +e etra8o; +e re&iti el &ro"e+o "on agua &ara o)tener una "antidad "on+idera)le de +o)renadante y luego +e diluy a 2: L "on agua de+tilada$ E+te etra"to "ontiene la+ ?l)7ina+$ o+teriorente +e "ontinuo "on la etra""in en el &ellet "on otra+ +olu"ione+ de #a4l al 1>, Etanol <:>, y #a5( 0,1 #$ De di"a+ etra""ione+ +e guardo el +o)renadante ue +e e&leo &ara deterinar +u "on"entra"in ediante .todo+ e+&e"trofoto.tri"o+$
%r!fi"o 1$ 4urva de "ali)ra"in del .todo *iuret &ara la "uantifi"a"in de &roteína+$
Curva de calibración para mtodo de Biuret! 0.6 0.5 0.4
Absorbancia
f(x) = 0.17x + 0.03 R² = 0.98
0.3 0.2 0.1
*. Resultados ) Discusión
0
$&todo 'iuret:
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Concentración "mg/m#$
La+ a)+or)an"ia+ de la+ +olu"ione+ &atrone+ e+t!n "on+ignada+ en la ta)la 1, y +e rela"ionan al valor real de "on"entra"in de la+ +olu"ione+ &atrone+ de &roteína ediante la +iguiente e&re+in'
La+ "on"entra"ione+ &ara la+ &roteína+ etraída+ +e deterinan ediante la etra&ola"in en la "urva de "ali)ra"in toando la e"ua"in de la re"ta'
C 1∗V 1=C 2∗V 2
|¿|1,733 C −0.0035
La "on"entra"in del &atrn de &roteína e+ 1 g/L y un voluen final de : L +e tiene ue'
2
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?)+A ?)+or)an"ia
( )
4A 4on"entra"in
1
mg ∗( 0,2 mL ) =C 2∗( 5 mL ) mL
C 2 =0,04
mg mL
=a)la 2 $Balore+ de "on"entra"in de la+ &roteína+ etraída+ &or .todo *iuret$
!oncentra ción
%olven te
&ipo de prote'na
Absorban cia
%,ua Na!l Etanol NaO0
?l)uina+
0,0@
0,0@@
%lo)ulina+
0,1@
0,10<0
rolaina+
0,1
0,23@1
%lutelina+
0,232
0,131
!lculos
(
0,0499
mg mL
)∗(
=a)la $ ?)+or)an"ia &ara lo+ &atrone+ &re&arado+ en el .todo de a)+or"in en C$B
+m,-m/
10 mL)=C 2∗( 25 mL )
mg C 2 =0,0199 mL
$uestra
!oncentración m,-ml
%bsorbancia
'lanco 1 # * 5 2 6 7
0
0,001
0,04
0,036
0,08
0,0::
0,12
0,103
0,16
0,116
0,2
0,1:
0,24
0,11
0,3
0,21:
En )a+e a e+to+ re+ultado+ +e realiz la "urva de "ali)ra"in "orre+&ondiente a e+te .todo' =a)la 3$ 4antidad de &roteína en 2: l de +olu"in Concentraci !oncentración ón (rote'na "mg/ml$ m, en #2 ml
%lbuminas 3lobulinas Prolaminas 3lutelinas
0,0@@
0,01@@
0,10<1
0,02
0,23@1
0,0@:6
0,131
0,0:2<
%r!fi"o 2$ 4urva de "ali)ra"in del .todo CB &ara la "uantifi"a"in de &roteína+$
Curva de calibración para la absorción )!*! 0.25 f(x) = 0.72x + 0 R² = 0.99
0.2 0.15
$&todo de absorción en .4:
Absorbancia
La+ re+&e"tiva+ a)+or)an"ia+ de la+ +olu"ione+ &atrone+ +on o)+ervada+ en la ta)la , y la+ "uale+ +e rela"ionan al valor real de "on"entra"in de la+ +olu"ione+ &atrone+ de &roteína ediante la +iguiente e&re+in' C 1∗V 1=C 2∗V 2
0.1 0.05 0 0
0.1
0.2
0.3
Concentración "mg/m#$
La "on"entra"in del &atrn de &roteína e+ 1 g/L y un voluen final de : L +e tiene ue' 3
0.4
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La+ "on"entra"ione+ &ara la+ &roteína+ etraída+ +e deterinan ediante la etra&ola"in en la "urva de "ali)ra"in toando la e"ua"in de la re"ta'
?l)uina+
0,20
0,21
%lo)ulina+
0,1@:
0,263
rolaina+
0,202
0,2<3
%lutelina+
0,1<
0,2:2
0,2:2
0,101
Se o)+erv ue la+ &roteína+ en +olu"in &re+entan "a)io+ de +olu)ilidad en fun"in del &(, la fuerza ini"a y la+ &ro&iedade+ diel."tri"a+ del di+olvente y a+í o)tener fra""ione+ &rotei"a+ "oo al)uina+, glo)ulina+, &rolaina+ y glutelina+$
Absor !oncentración bancia
%,ua Na!l Etanol NaO0
%lutelina+
5. !ON!9IONE9
=a)la :$ Balore+ de "on"entra"in de la+ &roteína+ etraída+ &ipo de prote'na
0,10@
Seg7n la+ "on"entra"ione+ o)tenida+ en a)a+ etra""ione+, +e o)+erv ue la+ fra""ione+ &rotei"a+ o)tenida+ &or el .todo de CB vi+i)le e+ ayor de)ido a una e8or etra""in$
4A 4on"entra"in
%olven te
0,2<3
5. %N8I9I9 DE RE9T%DO9
|¿|0,7 219 C − 0,0048
?)+A ?)+or)an"ia
rolaina+
+m,-m/
C+ando el .todo de *iuret y de a)+or"in +e logr "uantifi"ar la+ fra""ione+ &rotei"a+ o)tenida+ &or +olu)ilidad$
4!l"ulo+
2. 'I'IO3R%;%
(
0,281
)
mg ∗( 10 mL ) =C 2∗( 25 mL) mL
C 2 =0,112
Leninger, ?l)ert$, #el+on, David L$, 4o, i"ael $,1@@3 rin"i&io+ de *iouíi"a$ Segunda Edi"in, Edi"ione+ 5ega, *ar"elona, E+&aa$
mg mL
4a&)ell, ary F$ y Garrell SaHn 5$, 200 *iouíi"a$ 4uarta Edi"in, =o+on Editore+, ei"o$
=a)la 6$ 4antidad de &roteína en 2: l de +olu"in Concentra !oncentració n ción (rote'na "mg/ml$
m, en #2 ml
?l)uina+
0,21
0,112
%lo)ulina+
0,263
0,10:
.todo de "uantifi"a"in de &roteína+ tt&'//HHH$u"o$e+/organiza/de&artaento+/)ioui i"a-)iol-ol/&df+/2<>20>43>@=5D5S >20?R?>20L?>204C?#=IGI4?4I >43>@3#>20DE>22R5=E >43>D#?S$&df
