Informe de práctica de laboratorio sobre el reconocimiento del ADN de las plantas.
informe de lab
DNADescripción completa
Descripción: monografia de adn y arn
Descripción: monografia de adn y arn
adnDescripción completa
Que es adn y arn
Salud con buena alimentaciónDescripción completa
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EL ADN Y ARNDescripción completa
Compilación de datos sobra las últimas investigaciones en torno al ADN y su posible capacidad de teletransportaciónDescripción completa
Duplicación de Proteinas y ADNDescripción completa
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Conceptos de Maitland y Mulligan en Fisioterapia.Descripción completa
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Extracción de ADN en lentejas
Objetivos 1. Indicar Indicar las funciones funciones biológ biológicas icas del del ADN. ADN. 2. Demostrar Demostrar la presenci presenciaa de AN AN en tejidos tejidos biológi biológicos. cos. 3. Expl Explic icar ar los los prin princi cipi pios os físi físico co! !uí uími mico coss en !ue !ue se basa basa la extr extrac acci ción ón " purificación del ADN. #. Indicar Indicar los usos del ADN ADN genómico genómico $umano $umano en el diagnóstic diagnóstico o molecular molecular%% en gen&tica forense e ingeniería gen&tica.
Introducción 'a aplicación de t&cnicas moleculares inicia con la extracción de ADN " la obtenc obtención ión exitos exitosaa de datos datos confia confiable bless " reprod reproduci ucible bless depend depende% e% en gran gran medida% de la extracción de ADN íntegro " puro. 'a extracción consiste en el aislamiento " purificación de mol&culas de ADN " se basa en las características fisico!uímicas de la mol&cula. El ADN est( constituido por dos cadenas de nucleótidos unidas entre sí formando una doble $&lice. 'os grupos fosfato tienen una fuerte tendencia tendencia a repelerse% repelerse% debido a su carga negati)a% lo !ue permite disol)er al ADN en soluciones acuosas " formar una capa $idratante alrededor de la mol&cula. *ero% en presencia de etanol% se rompe la capa $idratante " !uedan expuestos los grupos fosfato. +ajo estas condiciones se fa)orece la unión con cationes como Na, !ue reducen las fuer-as repulsi)as entre las cadenas de nucleótidos " permiten !ue el ADN precipite. A lo largo del tiempo se $an diseado distintos protocolos con la finalidad de obtener una cantidad " calidad de ADN adecuados% así como garanti-ar la eliminación de in$ibidores potenciales !ue dificulten el tratamiento posterior de la mol&cula. En general% los protocolos tradicionales consisten de cinco etapas principales/ $omogenei-ación del tejido% lisis celular% separación de proteínas " lípidos% precipitación precipitación " redisolución redisolución del ADN ADN
E!"#ACCI$N DE ADN
Cuestionario de #evisión %& Describa los 'rinci'ios generales de Extracción de ADN& El ADN se encuentra en el n0cleo celular% mu" replegado " unido a proteínas formando la cromatina. *ara extraerlo es necesario $omogenei-ar el tejido% romper las c&lulas para separar el n0cleo% romper el n0cleo " liberar el ADN% separar las proteínas " precipitarlo para extraerlo de la solución. El ADN aparecer( como un agregado de fibras blan!uecinas !ue se ad$iere.
Fragmentación del tejido
Anlisis
Lisis celular
Purificación del ADN
Purificación
Clarificación
E!"#ACCI$N DE ADN %& Fragmentación del tejido ,-omogeni.ación del tejido/0 'a $omogenei-ación% mec(nica o !uímica% consiste en romper las uniones entre las c&lulas para facilitar la interacción con las soluciones de lisis !ue a"udan a liberar el material gen&tico% es decir no es m(s !ue la disociación de las c&lulas para !ue pierdan contacto entre ellas " así )ol)erse m(s )ulnerables a la lisis celular.
*& Lisis celular0 1otura de las membranas celulares " nucleares para liberar el ADN. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes/ rotura mec(nica 2trituración% lisis $ipotónica% etc.34 tratamiento !uímico 2detergentes% agentes caotrópicos% reducción con tioles3 " digestión en-im(tica 2*roteinasa 5% etc.3.
)& Clarificación0 6eparación de los (cidos nucleicos de los restos celulares. 'a clarificación se puede reali-ar por centrifugación% filtración o por m&todo mixto de en-imas , centrifugación.
+& Purificación0 6eparación del ADN de proteínas solubles% de otros acidos nucleicos no desados% de lípidos% de carbo$idratos% de sales " otros compuestos org(nicos. 'os m&todos empleados para purificar los (cidos nucleicos de extractos celulares suelen ser combinaciones de dos o m(s t&cnicas de las siguientes/ Extracción7precipitación 2Ej. 6alting out " la desproteini-ación con fenol% 8romatografía 2de intercambio iónico% de adsorción selecti)a% de permeación sobre gel3% 8entrifugación " 6eparación por afinidad.
(& Anlisis0 puede ser cualitati)o determinando la calidad del ADN 2electroforesis3 o cuantitati)o para determinar la concentración de ADN 2espectrofotometría 9:3.
E!"#ACCI$N DE ADN
*& Diga usted 'ara 1u2 utili.amos detergentes en el 'rocedimiento&
EL DETERGENTE EN LA EXTRACCIÓN DEL ADN
Cabezas
Colas
Lípidos de la Membrana
Detergente
Agente tenso ati#o& red!e la tensi'nSepara s!per(ial de las membranas Capt!ra los restos de lípidos de las membrana las membranas el!lares del te"ido #i#o ) proteínas $ermite la salida del
E!"#ACCI$N DE ADN
*& Diga usted 'ara 1u2 utili.amos detergentes en el 'rocedimiento&
EL DETERGENTE EN LA EXTRACCIÓN DEL ADN
Cabezas
Colas
Lípidos de la Membrana
Detergente
Agente tenso ati#o& red!e la tensi'nSepara s!per(ial de las membranas Capt!ra los restos de lípidos de las membrana las membranas el!lares del te"ido #i#o ) proteínas $ermite la salida del
E!"#ACCI$N DE ADN
E!"#ACCI$N DE ADN
E!"#ACCI$N DE ADN
)& Diga usted 'ara 1u2 utili.amos alco3ol en el 'rocedimiento&
De"a e%p!estos los gr!pos .os.atos del ADN
E!"#ACCI$N DE ADN
)& Diga usted 'ara 1u2 utili.amos alco3ol en el 'rocedimiento&
De"a e%p!estos los gr!pos .os.atos del ADN
Ne!traliza las argas de la sol!i'n
*ae preipitar el ADN& +ai,ndolo #isible-
Rem!e#e del ADN omponentes omo las onentraiones resid!al
E!"#ACCI$N DE ADN
+& Diga usted 1u2 ti'o de en.imas contienen los suavi.adores de carne 4 el jugo de 'i5a 4 'ara 1u2 lo utili.amos en este 'rocedimiento& Tiene papaína, que es una enzima proteolítica (proteasa), la cual es una proteína especializad
Contiene
A/LANDAD0R DE CARNE Degrada completamente todo tipo de proteínas y las separa del 1!ni'n
E!"#ACCI$N DE ADN
(& Diga usted cuntos usos se les 'uede dar al ADN una ve. extra7do& a c i t 2 n e g n ó i c a i r a v e d s o i d u t s E
d a d i n r e t a P e d s a b e u r P
s e d a d e m r e f n e e d r a l u c e l o 6 o c i t s ó n g a i D
s o d a c i f i d o m e t n e m a c i t 2 n e g s o m s i n a g r O a c i t 2 n e 8 a 7 r e i n e g n I
N D A l e d n ó i c a i c n e u c e 9 s a i r e t c a ; 4 s u r i : e d s a ' e C e d n ó i c c e t e D
s o c i t 2 n e g s o n r o t s a r t e d n ó i c a g i t s e v n I
n e m i r c n u e d a n e c s e a l e d s i s i l n A
e s n e r o F a n i c i d e 6
a c i t 2 n e g a i ' a r e "
e t n a n i b m o c e r a c i t 2 n e g n o c s o c a m r f e d n ó i c a c i r b a F
E!"#ACCI$N DE ADN
<& Diga usted 1u2 relevancia tiene e l ADN en el diagnóstico cl7nico&
EL ADN EN EL DIAGN0STIC0 CL2NIC0
E!"#ACCI$N DE ADN
=& Diga usted cules son las funciones biológicas del ADN&
Codificación de 'rote7nas
Permite la ca'acidad de mutación ,Cambios evolutivos/
Almacena información gen2tica
Funciones ;iológicas del ADN
E!"#ACCI$N DE ADN
=& Diga usted cules son las funciones biológicas del ADN&
Codificación de 'rote7nas
Permite la ca'acidad de mutación ,Cambios evolutivos/
Almacena información gen2tica
Funciones ;iológicas del ADN
9u re'licación asegura la transmisión a las c2lulas 3ijas
Controla la actividad de las c2lulas
E!"#ACCI$N •
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ADN El ADN es mu4 estable 4 sólo se re1uiere mantener las muestras congeladas antes de su extracción& Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis 'ara liberar al ADN del interior celular& Algunos 'a1uetes comerciales de alto rendimiento son0 P>#I8EN? @>IA8EN? 6ILIPO#E? 8EN"#A 4 6o;io&
A#N •
AN total o 6ubcelular citosólico " nuclear *rimero es necesario agregarle una solució
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!ue estabilice al AN lo antes posible 6e minimi-a la acti)idad de ANasa liberadas
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de las c&lulas lisadas Extracción con fenol (cido p; #.< *a!uetes comerciales de compaías como =IA>EN% Ambion " NA?or@s
& Diga usted cules son las diferencias en cuanto a la extracción de ADN 4 A#N&
E!"#ACCI$N DE ADN
#EAC"I:O9 E6PLEADO9 EN LA E!"#ACCI$N DE0 •
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ADN "ris ,-idroximetil amonio metano/ como tam'ón biológico estabili.ante del '- de la solución entre =?B 4 ?B ED"A ,cido etilendiamintetrac2tico/ como agente 1uelante? atra'a 6g in3ibiendo las endonucleasas Cloruro de 9odio? a altas concentraciones solubili.a el ADN Cloruro de Potasio? sal e1uilibrante de fuer.as iónicas Acetato de 9odio? sal 1ue 'reci'ita el ADN Acetato de Potasio? sal 1ue 'reci'ita 'rote7nas Fenol? solvente orgnico 1ue denatura 'rote7nas es tóxico Cloroformo? solvente orgnico? 1ue denatura 'rote7nas? remueve l7'idos? solubili.a fenol o lo elimina es tóxico 9D9 ,dodecil sulfato de sodio/? detergente aniónico 1ue solubili.a 'rote7nas 4 membranas es tóxico 9aros4l ,Lauril sarcosina/? detergente aniónico 1ue solubili.a 'rote7nas 4 membranas C"A; ,3exadecil trimetil bromuro de amonio/? detergente catiónico 1ue solubili.a 'olisacridos "ritón !%BB? detergente 1ue solubili.a 'rote7nas 4 membranas ;6erca'toetanol? antioxidante 1ue inactiva 'rote7nas 'or reducción de 'uentes disulfuro D"" ,Ditiot3reitol/? antioxidante 1ue reduce los gru'os sulfuro de las 'rote7nas Octanolilsoamilalco3ol? alco3ol funciona como agente antioxidante 4 disminu4e la
A#N •
9so
de
in$ibidores
de
ANasa
"
denaturantes fuertes de proteínas -CL
8uanidina o "iosanato de 8uanidina con agentes reductores •
Dado !ue las ANasas no )an a ser
•
inacti)adas en su totalidad en el autocla)e% resulta esencial trabajar con material est&ril " de preferencia de un solo uso. Las micro esferas de vidrio% generalmente
•
utili-adas en la extracción para incrementar la lisis celular por acción física Es importante !ue los reacti)os !ue se utilicen en la extracción de AN se mantengan en alícuotas con los )ol0menes mínimos necesarios para cada etapa del proceso " en caso de ser posible se pasen dos )eces por el autocla)e
•
El m2todo utili.ado con ms frecuencia es el de 8IP9 por sus siglas en ingl&s4 (cido iosanato 6ar@os"l
de
>uanidina%
fenol%
El cido "iosanato de 8uanidina
es sumamente fuerte " tiene un alto poder denaturali-ante El fenol% al estar acidificado%
pro)oca !ue el ADN se acumule en la interfase entre la fase acuosa " la del fenol% dejando al AN en la fase acuosa El 9aros4l% por su parte% es un detergente mu" potente !ue a"uda a la lisis celular% pero no reempla-a la ruptura física de las c&lulas !ue generalmente se logra con micro esferas de )idrio agitadas con la a"uda de un )órtex o de un $omogeni-ador celular como +ead+eater
E!"#ACCI$N DE ADN
formación de es'umas e interfases •
• •
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P:P ,'olivinil 'irrolidona/? detergente 1ue elimina com'uestos fenólicos 1ue in3iben la actividad en.imtica Etanol? alco3ol 1ue 'reci'ita los AN Iso'ro'anol? alco3ol 1ue 'reci'ita los AN A#Nasa? en.ima 1ue degrada el A#N
•
El m2todo ;OO6% lle)a a cabo la extracción con el (cido iosanato de >uanidina% separando los (cidos nucleicos con base en su alta afinidad para enla-arse en matrices de sílica% en )e- de utili-ar fenol. Dado !ue este m&todo aisla tanto ADN como AN% resulta esencial utili-ar las nucleasas específicas para ADN !ue lo eliminen de la muestra. Durante su precipitación es com0n utili-ar cloruro de litio B C libre de ANasas. Este m&todo no debe ser utili-ado para AN !ue ser( sometido a transcripción re)ersa
E!"#ACCI$N DE ADN
G& Diga usted cules son las diferencias entre los 'rocedimientos de extracción de
E%traion de ADN 3egetal
E%traion de ADN Animal
El ADN genómico de las plantas es m(s difícil de extraer a causa de la pared celular de la planta% !ue se elimina por $omogenei-ación o mediante la adición de celulasa para degradar la celulosa !ue forma la pared celular.
Adem(s% los metabolitos presentes en la c&lula )egetal pueden interferir con la extracción de ADN genómico por la contaminación de la muestra de ADN durante el proceso de precipitación.
'os leucocitos de sangre perif&ricos son una fuente principal de ADN genómico en animales% pero la recogida de muestras es difícil "a !ue la sangre debe ser retirada del animal .
'a sangre contiene una serie de compuestos como proteínas% lípidos% glóbulos blancos% glóbulos rojos% pla!uetas " plasma% !ue pueden contaminar la muestra de ADN. El contaminante principal del ADN de animal extraído por muestras de sangre es $emo% el componente no proteíco de la $emoglobina.
ADN animal 4 ADN vegetal&
Diferencias 'as diferencias entre el ADN de las plantas " los animales se encuentran en la secuencia de bases en la $&lice. 'os compuestos !ue se encuentran en las c&lulas )egetales est(n ausentes en las c&lulas animales " las secuencias de bases de ADN reflejan esto% puesto !ue el ADN genómico de la planta es a menudo ma"or !ue el ADN de los animales. Estas
E!"#ACCI$N DE ADN
diferencias afectan los m&todos de extracción% "a !ue impacta en el rendimiento " la pure-a del ADN.
%B& Diga usted 1u2 'rinci'io de extracción se usa 'ara ADN 'lasm7dico& 'as t&cnicas de Cinipreps o mini preparaciones de pl(smidos% permiten la recuperación de pl(smidos de DNA circular sobre el DNA cromosomal. El tratamiento de las c&lulas con una base de p; alto o un detergente interrumpe el apareamiento de las bases nitrogenadas% ocasionando !ue el DNA cromosomal se desnaturalice " se separe. *or el contrario la configuración superenrrollada del pl(smido se mantiene estable.
Existen di)ersos protocolos para reali-ar lisis alcalina pero todos se rigen por los siguientes pasos b(sicos. ♦ ♦
emo)er las c&lulas del medio de culti)o en caldo mediante centrifugación. Descartar el sobrenadante para reducir contaminación mediante fragmentos de la
♦
pared celular del $u&sped. esuspender las c&lulas en un amortiguador !ue contenga ris% EDA " glucosa. 'isar las c&lulas con Na; " 6D6. 9nión de las $ebras de DNA " remoción de contaminación mediante el acetato de
♦
potasio. *recipitación del DNA de plasmido mediante alco$ol etanol o isopropanol " una
♦ ♦
♦ ♦
sal Acetato de amonio% 8loruro de litio% 8loruro de sodio o Acetato de sodio. Enjuague del material gen&tico con Et; al FG. esuspender el material gen&tico.
%%& Ex'li1ue usted 'or 1u2 la concentración de ADN se mide a *
E!"#ACCI$N DE ADN
%*& Indi1ue usted 1u2 ti'o de contaminantes 'odemos encontrar en un extracto de ADN&
Biologic os Quimicos
%)& Ex'li1ue usted 'or 1u2 la medición de una muestra de ADN a *
de las muestras puras es de 2%2 aproximadamente.
'a absorbancia m(xima de las soluciones de ADN " AN corresponde a 2HF nm " la de las soluciones de proteínas% a 2BF nm. Dado !ue las soluciones de ADN " AN absorben parcialmente la lu- a 2BF nm " las !ue contienen proteínas $acen lo propio a 2HF nm% el cociente de los )alores obtenidos a 2HF nm " a 2BF nm A260/A280 proporciona una estimación del grado de pure-a de los (cidos
E!"#ACCI$N DE ADN
nucleicos. 'os cocientes A260/A280 respecti)os del ADN " el AN puros son aproximadamente de 1%B " 2%F. 8on un paso de lu- de 1F mm " una longitud de onda de 2HF nm% una absorbancia A K 1 corresponde aproximadamente a
ser( considerablemente inferior a dic$os )alores " no podr(
determinarse con exactitud la cantidad de (cidos nucleicos.
%+& Diga 'ara 1u2 fines se 'uede utili.ar el ADN genómico 3umano&
%(&
6edicina Forense
;ioinformtica
Ingenier7a gen2tica 4 Criminal7stica Nanotecnolog7a del ADN
Cuando reali.amos una extracción de ADN? a'arte de concentración 4 'ure.a? 1u2 otros 'armetros de calidad de la extracción de ADN se deben investigar
E!"#ACCI$N DE ADN
ureza !antidad !alidad !oncentración
%<& Diga usted 'ara 1ue utili.amos la sal en este 'rocedimiento& 'a sal en disolución act0a disminu"endo la solubilidad de las proteínas% lo !ue $ace !ue precipiten " se separen m(s f(cilmente del ADN% es decir la sal e)ita la unión de las proteínas al ADN.
%= &Para 1u2 se 3ace uso de la licuadora en este 'rocedimiento& 'a licuadora a"uda en la rotura de membranas celulares " cubiertas nucleares% permitiendo la separación del ADN. ompe las c&lulas " expone las paredes celulares " membranas a la acción del detergente.
E!"#ACCI$N DE ADN
#e'orte de Laboratorio $R0CEDIMIENT0S4 6A"E#IALE90 Ar)ejas 7 8 6 +alan-a de 5 compensación Na8l Agua destilada 'icuadora Bea+er colar la sopa resultante +ea@er de 2radillas Ablandador para carne Alco$ol al FG Agregar "g gramo de a-landador, mezclarlo min. Agregar alcool y de$ar reposar "# min. eloj Distri-uir la solución en# tu-os de $a-ón ensayo !on un pinco limpio e/traer el ADN Agregar m& de líquido, esperar "# min. *inc$os de madera para carne
E!"#ACCI$N DE ADN
*ara reali-ar el laboratorio% nos dispusimos a trabajar acti)amente cada uno en un procedimiento inicial diferente% sin embargo a partir del procedimiento de di)idir la solución en tubos de ensa"o% nos reagrupamos en parejas. 8ada pareja era encargada de un tubo de ensa"o% por lo cual a tra)&s de un apo"o mutuo finali-amos el procedimiento exitosamente.
#esultados0
E!"#ACCI$N DE ADN
*ara reali-ar el laboratorio% nos dispusimos a trabajar acti)amente cada uno en un procedimiento inicial diferente% sin embargo a partir del procedimiento de di)idir la solución en tubos de ensa"o% nos reagrupamos en parejas. 8ada pareja era encargada de un tubo de ensa"o% por lo cual a tra)&s de un apo"o mutuo finali-amos el procedimiento exitosamente.
#esultados0
&uego de ciertas di0cultades con los 0ltros, la inno1ación de utilizar papel toalla 2ue la
E!"#ACCI$N DE ADN
*n esta imagen o-ser1amos los cinco tu-os de ensayo, cada uno ya con a-landador d
4inalmente logramos apreciar un poco la precipitación del ADN, a pesar que no se pre
Conclusiones %& 'a extracción de ADN% es un m&todo esencial " multidisciplinario% "a !ue sus aplicaciones abarcan la Cedicina clínica% +iotecnología% Ingeniería >en&tica% Cedicina Morense entre muc$as m(s disciplinas científicas en las cuales se $a abierto campo con los a)ances tecnológicos de la 0ltima d&cada.
*& 'a extracción de AN difiere de la extracción de ADN% "a !ue los reacti)os empleados son diferentes por las características físico!uímicas de las mol&culas% en la extracción de AN el p; debe ser (cido mientras !ue en el de ADN debe ser neutro.
)& Entre los buffer de extracción de ADN tenemos el buffer 8A+% el buffer 8A+ 2x% el buffer 6E. 'os cuales contienen ris;8'% EDA% 8A+% Na8l% bCercaptoetanol entre otros reacti)os.
+& En la extracción de AN se utili-a ma"ormente el m&todo >I*6% por!ue el m&todo +C no es recomendable para AN !ue ser( sometido a la t&cnica de transcripción re)ersa. El reacti)o en com0n de ambos m&todos es el (cido iosanato de >uanidina.
(& 'os par(metros de la calidad de la extracción de (cidos nucleicos inclu"en la concentración% la pure-a% la integridad% el alto rendimiento de la muestra% la exactitud " su fiabilidad para reproducir los datos.
