1 : On détermine les temps de rétention (tr) au cours d'une chromatographie sur Sephadex, des protéines suivantes dont on connaît la masse moléculaire (MM) (Le débit de la colonne est de 5 ml / min) : MM
tr (min)
Aldolase
145000
10,4
Lactate déshydrogénas déshydrogénasee
135000
11,4
Phosphatase alcaline
80000
18,4
Ovalbumine
45000
26,2
Lactoglobuline
37100
28,6
1 - Calculer les volumes d'élution (Ve) correspondants. Porter le log de MM en fonction de Ve - Que remarquez-vous ? 2 - Pour la glucokinase, tr = 21 min. Déterminer sa masse moléculaire à l'aide du graphique précédent. Existe t'il une autre méthode pour déterminer la MM ? Correction
Correction
exercice
1
:
1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie d'exclusion (encore appelée : tamisage moléculaire, gel filtration, perméation de gel). La connaissance du débit de la colonne (5 ml / min) et des différents temps de rétention nous permet de calculer le volume d'élution pour chaque composé (voir tableau), selon la relation : Ve (volume d'élution) = d (débit) x tr (temps de rétention) La représentation graphique du log de la masse moléculaire (log MM) qu'il faut calculer préalablement (voir tableau) en fonction du volume d'élution (Ve) nous donne une droite : MM
Log MM
tr (min)
Ve (ml)
Aldolase
145000
5,16
10,4
52
Lactate déshydrogénase
135000
5,13
11,4
57
Phosphatase alcaline
80000
4,9
18,4
92
Ovalbumine
45000
4,65
26,2
131
Lactoglobuline
37100
4,57
28,6
143
Le
fait
de
visualiser
une
droite
signifie
qu'aucune
protéine
n'est
exclue
du
gel.
2 - La glucokinase, avec un temps de rétention de 21 min, est éluée à un volume d'élution de 5 x 21 = 105 ml. Il suffit de se reporter au graphe pour déterminer un log de MM = 4,82 environ, soit une masse moléculaire de 66070 Da (ou 66070 g/mol ou 66,07 kDa), environ. Ici, on a tracé le logarithme de la masse moléculaire en fonction du volume d'élution : log MM = f (V e). L'autre représentation serait de porter le logarithme de la masse moléculaire en fonction du KAV, le coefficient de partage entre la phase liquide et la phase gel : log MM = f (KAV). KAV = (Ve - Vm) / (Vt - Vm) Mais pour cela, il faudrait connaître le volume mort (Vm) et le volume total de la colonne (Vt). Exercice 2
Exercice 2 : On veut séparer 3 acides-aminés : l'acide L-glutamique, la L-leucine et la L-lysine par chromatographie sur une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-). Les pH isoélectriques de l'acide L-glutamique, de la L-leucine et de la L-lysine sont respectivement : 3,22 ; 5,98 ; 9,74, à 25 °C. On dépose ces 3 acides aminés sur la colonne, à pH 2, puis on élue en amenant progressivement le pH à 7. Question
:
1 - Quels acides aminés sont élués et dans quel ordre ? (On considérera que les interactions acide aminérésine sont uniquement d'ordre électrostatiques). Correction 2
Correction
exercice
2
:
1 - Cet exercice met en jeu une chromatographie échangeuse d'ions. Une résine polystyrénique substituée par des groupements sulfonate (-SO3-) est chargée négativement et est donc une résine échangeuse de cations. Lorsque le pH est supérieur au pHi (pH > pHi), l'acide aminé est chargé négativement (forme anionique). Lorsque le pH est inférieur au pHi (pH < pHi), l'acide aminé est chargé positivement (forme cationique). Le tableau ci-dessous donne les charges des 3 acids aminés, à pH = 2 et à pH = 7. acide aminé :
pHi : charge à pH = 2 : charge à pH = 7 :
Acide L-Glutamique (Glu) 3,22 L-Leucine (Leu) 5,98 L-Lysine (Lys) 9,74
+ + +
+
Ainsi, à pH = 2, les trois acides aminés sont chargés positivement, et seront retenus lors du passage sur la colonne. A pH = 7, seuls Glu et Leu, chargés négativement, seront élués. Lys reste fixé à la colonne. Glu est élué en premier (pHi = 3,22) puis Leu l'est ensuite (pHi = 5,98). Exercice 3
Exercice 3 : La carboxyméthylcellulose (CM-cellulose) est un support échangeur de cations. Elle est obtenue en substituant la cellulose par des groupements carboxyméthyls (-CH2-COOH). Questions
:
1 - Quelle est la proportion des groupements carboxyméthyls chargés négativement aux pH suivants : 1 ; 4,76 ; 7 et 9 (on considérera que le pKa du groupement carboxyl des radicaux carboxyméthyls est 4,76). 2 - Parmi les protéines suivantes : Ovalbumine (pHi = 4,6), Cytochrome c (pHi = 10,65) et Lysozyme (pHi = 11), quelles sont celles qui sont retenues par la CM-cellulose à pH 7 ? (On considérera que les interactions protéine-CM-cellulose sont uniquement d'ordre électrostatiques). CORRECTION 3
Correction
exercice
3
:
1 - Proportion des groupements carboxyméthyls (pKa = 4,76) chargés négativement aux pH : 1, 4,76, 7 et 9. Le pH est donné par la relation suivante :
À pH = 1 :
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 1,74 10-4.(A), (A)
= 1,74 10-4
= pH - pKa = 1 - 4,76 = -3,76 donc :
est
mis
en
facteur
:
(A)
on en déduit que (A) + 1,74 10-4.(A) = 100 =
100
/(1
+
1,74
10 -4)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,98 % et (B) = 0,02 %
À pH = 4,76 :
= pH - pKa = 4,76 - 4,76 = 0 donc :
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = (A), (A), (A)
est
mis
en
facteur
=1 on en déduit que (A) + (A) = 100
:
(A)
=
100
/(2)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %
À pH = 7 :
= pH - pKa = 7 - 4,76 = 2,24 donc :
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), (A)
est
mis
en
facteur
:
= 173,78 on en déduit que (A) + 173,78(A) = 100 (A)
=
100
/(174,78)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,575 % et (B) = 99,425 %
= pH - pKa = 9 - 4,76 = 4,24 donc :
À pH = 9 :
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 173,78(A), (A)
est
mis
en
facteur
:
= 13378 on en déduit que (A) + 13378(A) = 100 (A)
=
100
/(13379)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 5,73 10-3 % et (B) = 99,994 %
Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements carboxyméthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-CH2-COOH). À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements carboxyméthyls se présenteront
majoritairement
sous
forme
basique
(-CH2-COO-)
2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,425 % sous forme basique, chargée négativement (-CH 2COO-). Protéine :
pHi :
Charge à ph = 7 :
Ovalbumine Cytochrome c Lysozyme
4,6 10,65 11
négative positive positive
Ainsi, seule l'ovalbumine, qui à pH = 7 est chargée négativement, ne sera pas retenue sur la colone. Le cytochrome c et le lysosyme seront retenus. Exercice 4
Exercice 4 : La diéthylaminoéthylcellulose (DEAE-cellulose) est un support échangeur d'anions, obtenu en substituant la cellulose par des groupements diéthylaminoéthyls : CH2-CH3 / -CH2-CH2- NH+ \ CH2-CH3
Questions
:
1 - Quelle est la proportion de radicaux-DEAE chargés positivement aux pH suivants : 2 ; 7 ; 9,4 ; 12 ? (On considérera que le pK de l'amine tertiaire du groupement DEAE est 9,4). 2 - Parmi les protéines suivantes : Sérumalbumine (pHi = 4,9), Uréase (pHi = 5), Chymotrypsinogène (pHi = 9,5), quelles sont celles qui, à pH 7, sont retenues par la DEAE-cellulose ? (On considérera que les interactions protéine-DEAE-cellulose sont uniquement de type électrostatiques). Correction 4
Correction
exercice
4
:
1 - Proportion des groupements diéthylaminoéthyls (DEAE : pKa = 9,4) chargés négativement aux pH : 2, 7, 9,4 et 12. Le pH est donné par la relation suivante :
À pH = 2 :
= 3,98 10-6
= pH - pKa = 2 - 9,4 = -7,4 donc :
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 -6.(A), (A)
est
mis
en
facteur
:
(A)
on en déduit que (A) + 3,98 10-6.(A) = 100 =
100
/(1
+
3,98
10-6)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = environ 100 % et (B) = 0 %
À pH = 7 :
= 3,98 10-3
= pH - pKa = 7 - 9,4 = -2,4 donc :
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 3,98 10 -3.(A), (A)
est
mis
en
facteur
:
(A)
on en déduit que (A) + 3,98 10-3.(A) = 100 =
100
/(1
+
3,98
10-3)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 99,996 % et (B) = 0,004 %
À pH = 9,4 :
= pH - pKa = 9,4 - 9,4 = 0 donc :
Sachant que (A) + (B) (B) = 100 % et que (B) = (A), (A)
est
mis
en
facteur
=1 on en déduit que (A) + (A) = 100
:
(A)
=
100
/(2)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 50 % et (B) = 50 %
= pH - pKa = 12 - 9,4 = 2,6 donc :
À pH = 12 :
Sachant que (A) + (B) = 100 % et que (B) = 398,1(A), (A)
est
mis
en
facteur
:
(A)
= 398,1 on en déduit que (A) + 398,1(A) = 100 =
100
/(1
+
398,1)
On peut ainsi calculer le pourcentage des formes (A) et (B) : (A) = 0,25 % et (B) = 99,75 %
Globalement, on peut donc constater qu'à un pH inférieur au pKa (pH acide), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront majoritairement sous forme acide (-NH+). À l'inverse, à un pH supérieur au pKa (pH basique), les groupements diéthylaminoéthyls se présenteront
majoritairement
sous
forme
basique
(-N)
2 - À pH = 7, on a pu calculer que la résine était à 99,996 % sous forme acide, chargée positivement. Protéine :
pHi :
Charge à ph = 7 :
Sérumalbumine Uréase Chymotrypsinogène
4,9 5 9,5
négative négative positive
Ainsi, à pH = 7 la sérumalbumine et l'uréase sont chargées négativement, et seront donc retenues sur la colone. Le chymotrypsinogène ne sera pas retenus. Exercice 5
Exercice 5 : Le coefficient de partage de l'iode ( I2) entre les deux solvants non-miscibles : tétrachlorométhane et eau, est égal à 100 à 25 °C. À 10 ml de solution aqueuse d'iode à 10 g/l, on ajoute 10 ml de tétrachlorométhane (CCl4). Donnée
: I2 est
plus
soluble
dans
le
tétrachlorométhane
que
dans
l'eau.
Question : Déterminer la concentration en iode dans le tétrachlorométhane et dans l'eau, après agitation et décantation. Correction 5
Correction Coefficient
exercice de
partage
de
l'iode
5 dans
le
tétrachlorométhane
D'après les données de l'exercice, on peut écrire les deux égalités suivantes :
On peut en déduire que :
: et
l'eau.
Concentration
dans
le
tétrachlorométhane
(solvant
organique)
=
9,9
g/l
Concentration dans l'eau (solvant aqueux) = 0,099 g/l Exercice 6
Exercice 6 : On veut déterminer la masse moléculaire (MM) d'une protéine p par chromatographie d'exclusion. La limite d'exclusion du gel se situe entre 40000 et 400000 de MM. L'étalonnage du gel se fait par diverses substances, dont les MM (exprimées en Daltons) et les volumes d'élution (Ve, exprimé en ml) sont indiqués dans le tableau suivant : MM (Da)
Ve (ml)
Dextran
2000000
45
Fibrinogène
340000
60
Catalase
230000
75
Lactoglobuline
19000
132
Questions 1
: - Rappeler
à
quoi
correspond
le
Dalton.
2 - La protéine p montre, quant à elle, un volume d'élution Ve = 113 ml. Déterminer sa MM. Correction 6
Correction
exercice
6
:
1 - Le Dalton est une unité de masse atomique et correspond à 1,66 . 10-27 kg. La masse moléculaire d'un composé s'exprimera soit en dalton (Da), soit en grammes par mole (g/mol). Noter que l'abréviation de dalton s'écrit avec un Dmajuscule : Da et que le kilodalton s'écrit kDa kDa.. 2 - Afin de déterminer la masse moléculaire (MM) de la protéine p (Ve = 113 ml), il faut au préalable tracer la représentation du log (masse moléculaire) = f(Ve). Le schéma ci-dessous représente le tracé de log (MM) = f(Ve) pour les composés suivants : Dextran, Fibrinogène, Catalase et Lactoglobuline.
Une colonne a été rajoutée dans le tableau pour le calcul du log de la masse moléculaire :
MM (Da)
Ve (ml)
log MM
Dextran
2000000
45
6,3
Fibrinogène
340000
60
5,53
Catalase
230000
75
5,36
Lactoglobuline
19000
132
4,28
Il suffit de reporter sur le tracé : log (MM) = f(Ve), le volume de 113 ml pour en déduire un log MM = 4,93, soit une masse moléculaire de 85114 Da ou 85114 g/mol pour la protéine p. Il
est
très
important
de
noter
que
:
- 45 ml représente le volume mort de la colonne, c'est à dire le volume d'élution des substances exclues (ici, le dextran). -
132
ml
représente
le
volume
d'exclusion
des
protéines
totalement
incluses.
- la droite a été traçée en ne tenant compte que des points correspondants au fibrinogène et à la catalase, car le dextran est un composé totalement exclu, alors que la lactoglobuline est une protéine totalement incluse dans le gel. Ainsi, il aurait été totalement faux de tracer une droite à partir des points correspondant à la catalase et la lactoglobuline (qui sont les protéines dont les volumes d'élution encadrent celui de la protéine p). Exercice 7
Exercice 7 : Une enzyme a été purifiée en trois étapes, en partant de 1000 g d'un extrait brut contenant au total 20000 unités de cette enzyme. Questions
:
1 - Compléter le tableau ci-dessous : protéine (g) :
activité (UE) :
Extrait brut
1000
20000
Chromato. d'exclusion
200
14000
Chromato. d'échange d'ions
15
4500
Chromato. d'affinité
0,5
3500
taux de purification :
rendement :
2 - Quelles conclusions peut on tirer de cette étude ? Correction7
Correction Afin
de
exercice remplir
le
tableau,
7
il
faut
connaître
:
quelques
définitions
:
- L'activité spécifique (AS) représente un nombre d'unités enzymatiques (UE) par gramme de protéines (g) : AS = (UE / g) - Le taux de purification d'une enzyme est le rapport de l'AS mesurée après une étape de purification, sur l'AS mesurée à l'étape précédente : Taux de purification = AS après une étape / AS avant cette même étape - Le rendement correspond à un nombre d'UE mesuré après une étape de purification, sur un nombre d'UE mesuré à l'étape précédente : Rendement = UE après une étape / UE avant cette même étape ét ape Connaissant ces définitions, on peut remplir le tableau. Il faudra rajouter une colonne supplémentaire "AS" qui nous permettra de calculer le taux de purification :
protéine (g) :
activité (UE) :
AS :
taux de purification :
rendement :
Extrait brut
1000
20000
-
-
Chromato. d'exclusion
200
14000
20 70
3,5 fois
70 %
Chromato. d'échange d'ions
15
4500
300
4,28 fois
32 %
Chromato. d'affinité
0,5
3500
7000
23,3 fois
77,7 %
On
pourra
utilement
calculer
:
- Le taux global de purification, qui est égal à l'AS mesurée à la fin de toutes les étapes, divisée par celle de départ. Ici, le taux global de purification est égal à 7000 / 20 = 350. - Le
rendement
global qui
est
égal
à
3500
/
20000
=
17,5
%,
Conclusion : Suite aux différentes étapes de purification, on a pu récupérer 3500 unités, sur les 20000 que l'on avait au départ, soit 17,5 %. L'enzyme a été purifiée 350 fois. Exercice 8
Exercice 8 : Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6. Question
:
1 - Dans quel ordre peut-on prévoir la sortie de ces acides aminés ? Correction 8
Correction
exercice
8
:
Un mélange de trois acides aminés : Asp (pHi = 2,87), Arg (pHi = 10,76) et Leu (pHi = 6), est soumis à une chromatographie sur colonne échangeuse de cations. L'élution est effectuée à l'aide d'un tampon à pH = 6. Question
:
dans
quel
ordre
peut-on
prévoir
la
sortie
de
ces
acides
aminés
?
Si les trois acides aminés ont été retenus sur la colonne, c'est que la charge de la colonne a été réalisée à un pH inférieur au plus petit des pHi, soit un pH inférieur à 2,87, afin que les acides aminés se présentent sous une forme chargée positivement et qu'ils puissent être retenus sar la résine échangeuse de cations, chargée négativement. Acide aminé : Asp Leu Arg
pHi 2,87 6 10,76
Charge à pH < 2,87 + + +
Charge à pH 6 neutre (50%/50%) +
À un pH de 6, Asp est chargé négativement; il est donc élué de la colonne. La leucine est ensuite éluée. L'Arginine, toujours chargée positivement à pH = 6 reste sur la colonne et n'est donc pas éluée. Exercice 9
Exercice 9 : Un mélange d'immunoglobulines G (MM = 160000 Da) et d'albumine sérique bovine (MM = 67000 Da) est déposé sur colonne de séphadex G-100 (limite d'exclusion = 100000 Da). Rappel
:
MM
=
masse
moléculaire.
Question 1 - Tracer un diagramme d'élution vraisemblable (DO en fonction de Ve) en indiquant le volume mort. CORRECTION 9
:
Correction
exercice
9
:
Voici un diagramme d'élution vraisemblable pour une chromatographie d'exclusion séphadex G-100 (limite ( limite d'exclusion = 100000 Da), Da), sur laquelle on aurait déposé un un mélange d'immunoglobulines G (MM (MM = 160000 Da)) Da et d'albumine sérique bovine (MM (MM = 67000 Da). Da). Ici on a représenté la mesure de la densité optique (DO) de l'éluat en fonction du volume d'élution (V e).:
Les IgG présentent une masse moléculaire supérieure à la valeur de la limite d'exclusion de la colonne (100000 Da). Elles seront donc éluées en premier, et donneront la valeur du volume mort de la colonne (Vm = V e IgG) L'albumine de masse moléculaire 67000 g/mol, sera incluse dans le gel et éluée plus tard, avec un Ve albumine qui est égal à V m + Ve' albumine albumine.. EXERCICE 10
Exercice 10 : On veut réaliser la séparation de 5 acides aminés (Glu, Met, Tyr, Lys, Ser). On utilise pour cela 5 g de résine sèche de polystyrène sulfoné que l'on dispose dans une colonne ouverte. La résine est lavée par une solution d'HCl (1 M) en excès. Après ce traitement, la résine est lavée à l'eau distillée. On fait alors passer une solution de NaCl (2 M) en excès. Le filtrat correspondant est recueillit dans sa totalité et est dosé par 11,5 ml de NaOH (1 M).
Questions
:
1 - Commenter les opérations effectuées (écrire sommairement les équations mises en jeu) et en déduire la capacité de rétention de la résine. 2 - Les 5 acides aminés à séparer sont solubilisés dans un tampon à pH = 3,8. A ce pH, quels sont les composés qui seront retenus sur la résine ? 3 - Après avoir chargé la colonne par les 5 acides aminés préalablement solubilisés dans le tampon à pH 3,8, l'élution est réalisée en gradient de pH, en augmentant le pH. Dans quel ordre les acides aminés vont-ils être élués ? On se servira des données ci-après : acide aminé :
Correction 10
pK - COOH
pK - NH2
pK -R
Glu
2,19
9,67
4,25
Met
2,28
9,21
-
Tyr
2,20
9,11
10,07
Lys
2,18
8,95
10,53
Ser
2,21
9,15
-
