2014 *
UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA
PROYECTO EFECTOS DEL CLORURO DE ALUMINIO EN LA DIVISIÓN CELULAR EN RAICES DE CEBOLLA Allium cepa L.
Profesor: - Pável Rubio Ramírez Alumna: CITOGENÉTICA CITOGENÉTICA
Maricruz Olano Paitán Jossy Salinas Cornejo Julissa Salirrosas Rodriguez Martín Soto Cárdenas PRÁCTICA - LABORATORIO
16/05/2014
EFECTOS DEL CLORURO DE ALUMINIO EN LA DIVISIÓN CELULAR EN RAICES DE CEBOLLA Allium cepa L. Olano, M.; Salirrosas, J.; Salinas, J. & Soto, M.
RESUMEN Teniendo en cuenta que la toxicidad por aluminio es el efecto más importante en los suelos ácidos y constituye el mayor factor limitante del crecimiento y la producción vegetal, así como también para la salud humana debido al uso que se le ha conferido como antitranspirante, entre otros, se desea realizar una investigación que tiene como objetivo fundamental determinar el efecto del aluminio en los procesos de división celular en las raíces de cebolla ( Allium cepa), así como la relación de éstos con la inhibición del crecimiento radical. Se emplearon diferentes concentraciones de aluminio para imponer la condición de estrés y los efectos perjudiciales en la división celular de los ápices radiculares. Serán sometidos al procesamiento tradicional para microscopía óptica. Las secciones teñidas se observaron al microscopio óptico (Zeiss) con capturas de cámara digital por lo que las dimensiones celulares y fases de división celular se cuantificaron con un mínimo de 100 células por lámina para conseguir datos representativos. Se determinó que el índice mitótico como indicador del proceso de división celular, se pudo apreciar una disminución progresiva del mismo con el aumento en los niveles de aluminio para la variedad de cebolla Allium cepa y también se observó que el índice mitótico es inversamente proporcional a la concentración de AlCl3.
Palabras clave: aluminio, salud, divisiones celulares, cebolla. INTRODUCCIÓN Cuando un bulbo de cebolla (Alliumsp.) se rehidrata se produce una estimulación del crecimiento de las células, lo cual permite la elongación de las raíces de la planta. Sin embargo, cuando la hidratación se lleva a cabo en presencia de sustancias tóxicas, la división celular de los meristemos radiculares puede inhibirse, ya sea retardando el proceso de mitosis o destruyendo las células. Este tipo de alteraciones generalmente impide el crecimiento normal de la raíz, y por tanto su elongación (Fiskesjö 1985, 1993, 1997) Cuando se trabaja con bulbos de diámetro pequeño, las pruebas se realizan en tubos de ensayo de 10 cm de longitud x 1.5 cm de ancho. En el caso de bulbos de mayor diámetro pueden utilizarse tubos o recipientes de mayor volumen, dependiendo del tamaño de los mismos. Es importante destacar que la profundidad de los recipientes debe ser tal que, al término de la prueba, la elongación máxima no alcance el fondo del recipiente (Fiskesjö, 1985).
OBJETIVOS -
Determinar el efecto del cloruro de aluminio (AlCl3) en los procesos de división celular en las raíces de cebolla ( Allium cepa). Comparar el efecto del cloruro de aluminio en las diferentes concentraciones con la inhibición de la división celular y el crecimiento radical.
MATERIALES Y MÉTODOS LUGAR El estudio se realizó en el laboratorio de Citogenética, Departamento de Ciencias Biológicas –Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas, de la Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV).
MATERIAL Vasos descartables (para colocar los bulbos), bisturí y reglilla para hacer mediciones en cm o mm, laminas porta y cubreobjetos, reloj o cronometro y microscopio.
REACTIVOS Se utilizó agua de la llave como medio de crecimiento. El control negativo (agua de llave) y el agua utilizada para preparar las diluciones de los compuestos o las muestras deberán ser los mismos. El control positivo a utilizar fue Cu (II) y el compuesto toxico a estudiar AlCl 3 a distintas concentraciones.
ORGANISMOS DE PRUEBA Para la elaboración de las pruebas se seleccionaron bulbos de Allium sp. (Cebolla amarilla) de 1.5 cm de diámetro, secos y sin formación de hojas o raíz. Éstos fueron obtenidos del mercado local. Previo al montaje de la prueba, los bulbos fueron limpiados eliminando la epidermis seca y removiendo, con un bisturí o instrumento punzante, los restos de tejido y raíces del área radicular (No se deben dañar las raíces primordiales). Con el fin de eliminar los restos de tejido, es conveniente colocar los bulbos en agua destilada por 2 horas y dejar secar. (Ver Figura 1.)
ALMACENAMIENTO DE LOS BULBOS DE CEBOLLA Se recomienda almacenar los bulbos en un lugar donde se puedan garantizar condiciones secas y una temperatura entre 10 y 20 °C.
Figura 1. Esquema gráfico de los pasos a seguir en la prueba con Allium cepa L . 1) limpieza y pelado de bulbos; 2) ubicación de bulbos en tubos para exposición a las soluciones de ensayo; 3) colocación de tubos en soporte; 4) agregado de soluciones en los tubos durante el ensayo; 5) medición de longitud del haz de raíces al finalizar el tiempo de exposición de los bulbos
PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
Control De Calidad En Las Pruebas Con A.
Cepa
Un elemento importante en la elaboración de las pruebas es el proceso de pelado de los bulbos. Durante este procedimiento debe evitarse el daño del anillo radicular. Igualmente, se debe trabajar con un alto número de réplicas para controlar la variabilidad de las pruebas. Se recomienda utilizar 3 réplicas por concentración. En el caso que exista un bajo desarrollo radicular en más de 2 bulbos del control, se considera que el lote de bulbos tiene problemas, por tanto los resultados no serán válidos.
Preparación De Diluciones Generalmente, se sugiere el empleo de una serie de 3 concentraciones, un control negativo y 1 positivo; este último contiene el compuesto de referencia Cu (II) Para su preparación se emplea el método de dilución en forma secuencial aplicando un factor de 0.2 o 0.3. Cuando se va a llevar a cabo una evaluación exploratoria, puede emplearse una serie de diluciones logarítmicas (por ejemplo: 100; 10; 1; 0.1; 0.01), lo cual permitirá establecer el intervalo de concentración conveniente para la determinación de la Concentración Inhibitoria Media (CI 50)
Desarrollo De La Prueba El ensayo se inicia con el llenado de los tubos con cada una de las diluciones y controles; este llenado debe hacerse hasta el borde del tubo. A continuación se colocan los bulbos limpios sobre la boca del tubo, cuidando que la zona radicular quede inmersa en el líquido (Ver Figura 1) Los tubos se colocan en una gradilla, la cual se localiza sobre una mesa que no presente vibraciones y se mantienen a temperatura ambiente (20 °C) durante un período de 72 horas. Debe evitarse la iluminación directa. Dos veces al día durante el período de prueba, se debe reponer el volumen perdido por evaporación o absorción. Para reponer este volumen se utiliza la muestra o dilución correspondiente. Se recomienda inclinar el bulbo sin sacar las raíces del tubo, adicionando cuidadosamente el volumen con ayuda de una pipeta Pasteur En la tabla 1.0 y en las figuras 1 y 2 se resumen las condiciones de prueba.
Figura 2. Ensayo de toxicidad en Allium cepa L.
Tabla 1.0. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad con Allium cepa L. Tipo de ensayo
Estático
Temperatura
20ºC, ambiente
Cantidad de Luz
Fluorescente, blanco-frío
Iluminación
Indirecta
Recipientes de prueba
Tubos de Ensayo de 10 cm x 1.5 cm diámetro
Número de réplicas
12
Material biológico
Bulbos de aproximadamente 1.5 cm diámetro
Condición de bulbos
Pelar los bulbos y la base, evitar dañar el anillo radicular.
Agua de dilución
Agua de la llave
Número de concentraciones
5
Duración de la prueba
72 horas
Efecto medido
Inhibición de crecimiento de las raíces
Control negativo
Agua de llave
Control positivo
Cobre (II) a partir de una solución CuSO 4
Resultado final
CL50
RESULTADOS
Fig.01. Observación microscópica de la división celular en una concentración de AlCl3 a 1x10-3 M. A. Primera repetición B. Segunda Repetición C. Tercera repetición
Fig.02. Observación microscópica de la división celular en una concentración de AlCl3 a 1x10-6 M. A. Primera repetición B. Segunda Repetición C. Tercera repetición
Fig.03. Observación microscópica de la división celular en una concentración de AlCl3 a 1x10-9 M. A. Primera repetición B. Segunda Repetición C. Tercera repetición
Fig.04. Observación microscópica de la división celular de una muestra positiva (CuII). A. Primera repetición B. Segunda Repetición C. Tercera repetición
Fig.05. Observación microscópica de la división celular en una muestra negativa (agua de llave). A. Primera repetición B. Segunda Repetición C. Tercera repetición
La división celular es un proceso que acompaña al crecimiento en los tejidos meristemáticos. Por este motivo el estudio del efecto del ión Al3+ en la división celular estuvo confinado a la zona de división de la radícula y se evaluó mediante la determinación del índice mitótico (IM), como indicador cuantitativo de este proceso celular.
Los cálculos del índice mitótico se realizaron a través de la ecuación: IM = M x 100/T, donde: IM: Índice Mitótico, M: Células en mitosis (profase, metafase, anafase y telofase) y T: Total de células contadas (Mitosis + Interfase).
Tabla.01. Efecto del cloruro de aluminio (AlCl3), a diferentes concentraciones, en la división celular en raíces de Allium cepa [
D.C
]
Interfase Profase Metafase Anafase Telofase suma N° totales de celulas IM
AlCl3 1.10-3 M
AlCl3 1.10-6 M
AlCl3 1.10-9 M
Positivo +
Negativo -
159 30 7 3 1 41 200
137 45 6 7 5 63 200
135 50 4 7 4 65 200
158 25 3 6 8 42 200
118 55 12 8 7 82 200
21
32
33
21
41
DISCUSIONES Y CONCLUSIONES Se observa que la concentración 10-3 de AlCl3 fue la más perjudicial en las células de Allium cepa, el cual presentó una disminución del 40% del índice mitótico, y el cuál se ve que se obtuvo el mismo índice mitótico que el control positivo que se realizó con óxido cúprico. El tratamiento con concentraciones de 10 -3 y 10-6 presentaron un índice mitótico parecido. El tratamiento con concentración de 10 -3 presento mayor cantidad de células en profase e interfase, lo cual indica que hay un mayor desintegración del uso mitótico.
Se concluye que el índice mitótico es inversamente proporcional a la concentración de AlCl3. La división celular no es por sí misma un mecanismo de crecimiento, ya que no conduce necesariamente a un incremento en el tamaño; no obstante es un proceso que acompaña al crecimiento en los tejidos meristemáticos. Por este motivo el estudio del efecto del ión Al3+ en la división celular estuvo confinado a la zona de división de la radícula y se evaluó mediante la determinación del índice mitótico (IM), como indicador cuantitativo de este proceso celular.
Según los resultados realizados en Efectos Del Aluminio En La División Y El Alargamiento celular En Plántulas De Arroz (Oryza Sativa L.), en la revista Scielo, 2012; dice que la evaluación del índice mitótico demostró una afectación importante en este proceso, sobretodo en concentraciones parecidas a nuestro tratamiento, ya que el porciento de células en la fase mitótica disminuyó ante la presencia del ión, este comportamiento sugirió la posibilidad de que el aluminio pudiera afectar algún elemento en la interfase que impidiera la entrada de la célula a la fase mitótica; lo cual se corrobora con nuestro resultado. Por otro lado en un artículo publicado por Teresa Garzón Lopez en “Estudio de la Compartimentación celular en plantas modelo sometidas a estrés por aluminio se observa que también hay una disminución en la tasa de crecimiento en Phaseolus vulgaris como en Zea mays; que también está acorde a nuestro resultado, ya que hay una disminución del índice mitótico. La evaluación del índice mitótico, como indicador de crecimiento, demostró una afectación importante en este proceso, ya que el porciento de células en la fase mitótica disminuyó ante la presencia del ión, sobre todo, en el tratamiento con la concentración 10-3. Este comportamiento sugirió la posibilidad de que el aluminio pudiera afectar algún elemento en la interfase que impidiera la entrada de la célula a la fase mitótica.
BIBLIOGRAFÍA / WEBGRAFÍA -
Ramírez, P. & Mendoza, A. “Ensayo de Toxicidad Aguda con Bulbos de cebolla Allium cepa L. mediante la evaluación de la Inhibición del crecimiento promedio de raíces”. Ensayos toxicológicos para la evaluación de sustancias
químicas en agua y suelo. La experiencia en México. 1º Edición-enero 2008.
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Pereira, L.M.; Tabaldi, L.A.; Gonçalves, J.F.; Jucoski, G.O.; Pauletto, M.M.; Weis, S.N.; Nicoloso, F.T.; Borher, D.; Rocha, J.B.T.; Schetinger, M.R.C. Effect of aluminium on d-aminolevulinic acid dehydratase (ALA-D) and the development of cucumber (Cucumis sativus).Environ. Exp. Bot. 2006, 57,106 – 115.
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Schwarzerová, K.; Zlenkova, S.; Nick, P.; Opatrn, Z. Aluminium induced rapid changes in the microtubular cytoskeleton of tobacco cell lines. Plant and Cell Physiol. 2002,43, 207-216. Liu, Q.; Yang, J.L.; He, L.S.; Li, Y.; Zheng, S.J. Effect of aluminium on cell wall, plasma membrane, antioxidants and root elongation in triticale. Biologia Plantarum. 2008, 52, 87-92. Wang, J.W.; Kao, C.H. Effect of aluminium on endosperm reserve mobilization in germinating rice grains. Biologia Plantarum. 2007, 49, http://scielo.sld.cu/scielo.php?pid=S025859362012000100005&script=sci_artt ext http://cloruro-de-magnesio.net/blog/cloruro-de-aluminio-cuales-son-sus beneficios-para-nuestro-organismo/ http://www.tdx.cat/bitstream/handle/10803/3661/tgl1de1.pdf?sequence=1
