Relatório 1 (Quantificação)

1. INTR INTRO ODUÇ DUÇÃO Exis Existe tem m vá vári rios os mé méto todo doss pa para ra a qu quan antitififica caçã çãoo da ma mass ssaa de cé célu lula lass e pa para ra a determinação do número de células presentes em uma suspensão. Estes métodos podem ser diretos ou indiretos. Entre os métodos diretos podemos citar: 1.1.Gravimetria: Técnica que efetua a secagem e a pesagem de um determinado volume de suspensão até a obtenção de peso constante. 1.2.Contagem com câmara de Neubauer: Procede-se a contagem de cada célula presente em uma lamínula com o auxílio de um microscópio, e posteriormente, realiza-se uma estimativa do número total de células.

Figura 1 – Câmara de Neubauer

Figura 2 – Esquema da Câmara de Neubauer

Já entre os métodos indiretos: 1.3.Turbidimetria: Este método é uma adaptação da espectrofotometria da química analítica para a utilização na quantificação de células. Ele utiliza os princípios da absorção e da transmissão de luz, para relacionar o valor absorvido com a concentração de células. Neste estudo, fizemos uso da Saccharomyces cerevisiae (Figura 3), que é um fungo eucariote eucariote unicelular muito unicelular muito utilizado na fermentação de pães e de cerveja, cerveja, além de ser usada para a produção de etanol. etanol.

1

Figura 3 - Saccharomyces cerevisiae

Esse fungo é utilizado como fermento biológico, biológico, por liberar dióxido de carbono, carbono, por exemplo, na massa de pão, fazendo-a crescer. No caso das bebidas alcoólicas produzidas pelo processo de fermentação, fermentação, como os vinhos e a cerveja, o Saccharomyces Saccharomyces cerevisiae auxilia na transformação do açúcar em açúcar em álcool etílico. etílico. É um organismo utilizado como modelo no estudo da Bioquímica, Genética e Biologia Celular de Celular de eucariotas, pois é de fácil manutenção em laboratório e não representa risco a quem o esta utilizando.

PRÁTICA 1 – QUANTIFICAÇÃO DA SUSPENSÃO DE LEVEDURA POR GRAVIMETRIA 1. OBJETIVO Utilizar a técnica da gravimetria para determinar a massa de levedura presente em uma suspensão. 2. EQUIPAMEN EQUIPAMENTOS, TOS, MATERIA MATERIAIS IS E REAGEN REAGENTES TES 2.1.Pipeta graduada de 10,0 mL; 2.2. Balança Analítica FA – 2104N da BIOPRECISA; 2.3.Pesa – Filtro de forma baixa; 2.4.Erlenmeyer de 125 mL; 2.5. Estufa Quimis; 2.6. Suspensão de levedura (Saccharomyces Cerevisiae) 2% p/v. 3. METOD ETODOL OLO OGI GIA A 3.1.Pipetou-se 10,0 mL de uma suspensão de levedura para um pesa – filtro de forma baixa, previamente tarado. 3.2.

Em seg seguid uida, a, efe efetuo tuou-s u-see a pe pesag sagem em da suspen suspensão são pip pipetad etada, a, e ano anotou tou-se -se o val valor or encontrado (1ª Pesagem).

3.3.

Levou-se este pesa – filtro para uma estufa, pré-aquecida a 105°C para a secagem da suspensão.

3.4.Após um determinado tempo dentro da estufa, procedeu-se o resfriamento do pesa – filtro em um dessecador. 3.5.

Realizou-se uma nova pesagem (2ª Pesagem).

3.6.

Estes procedimentos foram realizados em triplicata. 2

4. RESU RESULLTADOS ADOS As massas referentes às pesagens realizadas em cada uma das triplicatas encontramse na tabela a seguir: Tabela 1 – Massas das Pesagens

P2 P3 P4

Tara do Pesa – Filtro 61,9695 g 60,4487g 58,8677 g

1ª Pesagem 71,7435 g 70,3022 g 68,6748 g

2ª Pesagem 62,1448 g 60,6259 g 59,0392 g

4.1.Massa 4.1. Massa inicial: inicial: m0=1ª Pesagem-TaraPesa-Filtro Pesagem-TaraPesa-Filtro m0=71,7435-61,9695=9,7740 g P2: m0=71,7435-61,9695=9,7740 P3: m0=70,3022-60,4487=9,8535 m0=70,3022-60,4487=9,8535 g m0=68,6748-58,8677=9,8071 g P4: m0=68,6748-58,8677=9,8071 4.2. Média da massa inicial: x=i=13xin x=9,7740+9,8535+9,80713=9,81 x=9,7740+9,8535+9,80713=9,8115 15 g 4.3. Massa Seca: m=2ª Pesagem-T Pe sagem-TaraPesa-Filtro araPesa-Filtro m=62,1448-61,9695=0,1753 g P2: m=62,1448-61,9695=0,1753 P3: m=60,6259-60,4487=0,1772 m=60,6259-60,4487=0,1772 g m=59,0392-58,8677=0,1715 g P4: m=59,0392-58,8677=0,1715 4.4. Média da massa seca: x=i=13xin x=0,1753+0,1772+0,17153=0,1747 x=0,1753+0,1772+0,17153=0,1747 g

4.5.Percentual de massa seca: % massa seca=mm0×100 % massa seca= 0,17479,8115×100=1,78 0,17479,8115×100=1,78 %

4.6.Percentual de umidade: % umidade=m0-mm0×100 % umidade= 9,8115-0,17479,8115×100=98,22 %

5. DISCUS DISCUSSÃO SÃO DOS DOS RESUL RESULT TADOS ADOS A amostra utilizada nesta prática foi uma suspensão de levedura, que tende a formar uma deposição no fundo do recipiente ao qual está armazenado, no caso um erlenmeyer. Para diminuir o erro causado por este fato, realizou-se a análise em triplicata, para assim obter-se uma média que foi utilizada nos cálculos de percentual de massa seca e de umidade. Também proced procedeu eu a agi agitaç tação ão da amo amostra stra antes da retirad retiradaa das alíqu alíquota otas, s, para para que houvesse houvesse a ressuspensão da levedura depositada ao fundo. Através dos resultados apresentados acima, podemos perceber que da alíquota de 10,0 mL da amostra que tem massa total de 9,8115 g apenas 0,1747 g são provenientes de leveduras leve duras,, ou de algum outro mate material rial que esteja ali presente, presente, tais como como,, polissacarí polissacarídeos deos e proteínas, o que representa um percentual de 1,78 % de massa seca e de 98,22 % de água presente na suspensão. 3

Este método apresenta algumas limitações que o torna pouco operacional, como por exemplo: O tempo de demora para a obtenção do resultado que corresponde ao tempo de secagem do material na estufa; a incapacidade de diferenciar as células viáveis das células mortas e o fato de quantificar em sua massa seca qualquer outro material que esteja ali presente como citado posteriormente. 6. CONCLUSÃO Em virtude do exposto, podemos concluir que apesar de ser um método de simples realização, ele não fornece resultados com uma grande confiabilidade e tão pouco atende a demand dem andaa de um umaa grande grande ind indúst ústria ria qu quee requer requer result resultado adoss cad cadaa vez ma mais is rápido rápidos, s, porém porém,, dependendo do uso que se dê ele atende com satisfação a uma rotina em laboratório.

PRÁTICA 2 – QUANTIFICAÇÃO DA SUSPENSÃO DE LEVEDURA POR TURBIDIMETRIA 2. OBJETIVO Determ Det erminar inar a mas massa sa de lev levedu edura ra prese presente nte em um umaa suspen suspensão são de con concen centra tração ção desconhecida através da utilização do espectrofotômetro. 3.

EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES 3.1.Pipeta graduada de 2,0 mL; 3.2.Balões volumétricos de 25, 50, 100, 200, 250 e 500 mL; 3.3.Pró-pipete; 3.4.Tubos de ensaio com tampa; 3.5. Espectrofotômetro Unicam 5625 UV/VIS Spectrometer; 3.6. Suspensão de levedura 2% p/v.

4. METOD ETODOL OLO OGI GIA A 4.1. De acordo com a tabela a seguir, com o auxílio de uma pipeta graduada prepararam-se padrões de diferentes concentrações a partir de uma suspensão – mãe de levedura a 2% p/v (base úmida). Tabela 2 – Preparo dos Padrões

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Diluição 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1000

Preparo 1 mL em Balão Volumétrico de 25 mL 1 mL em Balão Volumétrico de 50 mL 1 mL em Balão Volumétrico de 100 mL 1 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 0,5 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 0,25 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 0,5 mL em Balão Volumétrico de 500 mL

Concentração (Base Úmida) 800 ppm 400 ppm 200 ppm 100 ppm 50 ppm 25 ppm 20 ppm

4.2.

Com o auxílio de uma pipeta graduada, diluiu-se a amostra (suspensão de levedura) de concentração desconhecida a 1/250 mL.

4.3.

Após uma intensa homogeneização, transferiu-se cerca de 10 mL de cada uma das solu so luçõ ções es prep prepar arad adas as,, incl inclui uind ndoo a am amos ostr tra, a, pa para ra tubo tuboss de ensa ensaio io co com m tamp tampa, a, previamente identificados. 4

4.4.

Mantendo-se a agitação de cada tubo, procedeu-se a leitura das absorbâncias dos padrões e da amostra no comprimento de onda de 570 nm, com a utilização de água como branco.

5. RESU RESULLTADOS ADOS 5.1.Cálculo da concentração, em ppm, de levedura em base seca: Para realizar estes cálculos, foi utilizado o valor de 0,1747 g referente a massa seca de levedura em 10,0 mL de suspensão. Diluição 1/25: 0,1747 g-10,0 mLx-1,0 mL x=0,1747×1,010,0=0,01747 x=0,1747×1,010,0=0,01747 g=17,5 mg 17,5 mg-25,00 mLy-1000,00 mL y=17,5×1000,0025,00=700,0 y=17,5×1000,0025,00=700,0 ppm

Diluição 1/50: 0,1747 g-10,0 mLx-1,0 mL x=0,1747×1,010,0=0,01747 x=0,1747×1,010,0=0,01747 g=17,5 mg 17,5 mg-50,00 mLy-1000,00 mL y=17,5×1000,0050,00=350,0 y=17,5×1000,0050,00=350,0 ppm




Diluição 1/800: 0,1747 g-10,0 mLx-0,25 mL x=0,1747×0,2510,0=0,0087 x=0,1747×0,2510,0=0,0087 g=4,4 mg 4,4 mg-200,00 mLy-1000,00 mL y=4,4×1000,00200,00=22,0 y=4,4×1000,00200,00=22,0 ppm 5


Resumindo: Tabela 3 – Resumo dos Resultados das Concentrações em Base Seca

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Diluição 1/25 1/50 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1000

Concentração (Base Seca) 700,0 ppm 350,0 ppm 175,0 ppm 87,5 ppm 43,5 ppm 22,0 ppm 17,4 ppm

5.2.Curvas Padrões: Tabela 4 – Dados da Curva Padrão

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Concentra tração (B (Base Se Seca) 700,0 ppm 350,0 ppm 175,0 ppm 87,5 ppm 43,5 ppm 22,0 ppm 17,4 ppm

Absorbância (5 (570 nm nm) 1,268 0,907 0,489 0,297 0,153 0,084 0,069

Gráfico 1 – Curva Padrão de Absorbância contra a Concentração de Levedura: Este gráfico apresenta o padrão com diluição 1/25, colocado somente para estudo.

Aplicando-se as fórmulas do Coeficiente Angular Angular e do Coeficiente Linear, pode-se verificar que estes valores para o gráfico 1, são: Coef. Ang.= 0,001798744 Coef. Linear = 0,108147607 Gráfico 2 – Curva Padrão de Absorbância contra a Concentração de Levedura: Gráfico utilizado para a quantificação, pois não apresenta o padrão com diluição 1/25. 1/2 5.

Aplicando-se as mesmas fórmulas do Coeficiente Angular Angular e do Coeficiente Linear, pode-se verificar que estes valores para o gráfico 2, são: Coef. Ang.= 0,002498479 Coef. Linear = 0,043592901 5.3.

Concentração de levedura na Amostra: A absorbância absorbância da amostra foi 0,222. 6

yA=aε×b×xC 0,222=0,002498479×C+0,043592901 C=71,41 ppm

6. DISCUS DISCUSSÃO SÃO DOS DOS RESUL RESULT TADOS ADOS Com a utilização dos resultados obtidos na prática apresentada anteriormente, pode-se calcular a concentração de levedura em base seca e assim construir uma curva padrão que atendesse ao objetivo desta prática. Através da equação da reta desta curva, chegamos ao resultado da concentração de levedura que foi de 71,41 ppm, um valor que, como o esperado, sem encontra dentro da curva, o que nos permite ter uma maior confiança nesse valor encontrado. Foram colocados acima dois gráficos, um contendo um ponto que representa uma diluição de 1/25 (Gráfico 1) e outro que efetivamente foi utilizado nos cálculos que não apre ap rese sent ntaa es este te po pont ntoo (Grá (Gráfifico co 2). 2). Este Estess gráf gráfic icos os fora foram m co colo loca cado doss pa para ra real realiz izar ar um umaa comparação e exemplificar uma das limitações deste método, que é a falta de linearidade que ocorre em soluções pouco diluídas, devido a um desvio que ocorre na Lei de Beer. Em soluções muito concentradas passam a ocorrer aglutinações entre as células, isto acaba alterando a absortividade e conseqüentemente, aumentando o valor da absorbância lida, levand lev andoo est estee val valor or para para a parte parte do gráfic gráficoo que não corres correspon ponde de à fai faixa xa linear linear do me mesm smo, o, causando assim erros grosseiros na leitura e nos cálculos. Este método possui algumas limitações, como, não ser muito eficiente para soluções muito concentradas, como foi explicado acima, e não conseguir distinguir células viáveis de células células não-viáveis não-viáveis e tão pouco de outros materiais materiais que possam possam estar presentes presentes junto das células. 7. CONCLUSÃO Podemos concluir que este método de quantificação é de grande rapidez e de fácil utilização, pois não requer nada além de simples diluições para a preparação dos padrões e da amostra, e de um espectrofotômetro. É um método que apresenta resultados satisfatórios, mesmo com as suas limitações.

PRÁTICA 3 – CONTAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURA EM CÂMARA DE NEUBAUER 8. OBJETIVO Através Através de um instrumen instrumento to cha chamado mado Câmara de Neubauer Neubauer,, proceder proceder à conta contagem gem e realizar uma estimativa do número de células presentes na suspensão. 9. EQUIPAMEN EQUIPAMENTOS, TOS, MATERIA MATERIAIS IS E REAGEN REAGENTES TES 9.1.Câmara de Neubauer; 9.2.Microscópio; 9.3.Pipeta de 1,0 mL; 9.4. Balão Volumétrico Volumétrico de 250,00 mL; 9.5. Suspensão de Levedura 5% p/v. 10.METODOLOGIA 10.1.Pipetou-se 1,0 mL de uma suspensão de levedura previamente preparada, para um balão volumétrico de 250,00 mL, completando o seu volume com água destilada até o traço de aferição. 7

10.2.Transferiram-se

algumas gotas desta solução para uma Câmara de Neubauer.

10.3.Colocou-se a Câmara de Neubauer em um microscópio e com a utilização do mesmo, procedeu-se a contagem do número de células presentes na suspensão. 11. RESULTADOS RESULTADOS 11.1.Quantidade de células encontradas nas quadrículas: Quadrícula A1: 33, 33, 34 →x=33+33+343=33,33 Quadrícula A5: 24, 24, 24 →x=24+24+243=24 Quadrícula C3: 26, 22, 22 →x=26+22+223=23,33 Quadrícula D4: 18, 18, 18 →x=18+18+183=18 Quadrícula E1: 27, 27 →x=27+272=27 11.2.Estimativa do número de células de levedura: nº de células/mL=x×25×FD×104 •

• • •

Onde: x é a o somatório do número de células contadas dividas pelo número de quadrados contados (i=15xin); 25 é o número total de quadrados no centro da câmara; FD é o fator de diluição usado na preparação da amostra; 104 é o fator de conversão de cm3 para mL.

nº de células/mL=33,33+24+23,33+18+2 células/mL=33,33+24+23,33+18+275×25×250×104 75×25×250×104 nº decélulasmL=1,57×109células/mL

12.DISCUSSÃO 12. DISCUSSÃO DOS RESULT RESULTADOS Através do método da contagem com o uso da câmara de Neubauer, determinou-se a presença de 1,57x109 células por mL de suspensão. Para padronizar esta contagem utilizou-se da regra do “L”, que convenciona a contagem das células que estão sob a linha tripla, como na forma de um L, assim quando as células estão naquela região pertencem ao quadrado a que se está contando e quando as células estão sob o L invertido (outro lado do quadrado) pertence ao quadrado subseqüente. Devi De vido do à fa falta lta de ag agita itaçã çãoo em um eq equi uipa pame ment ntoo es espe pecí cífifico co,, po pode de-s -see pe perc rceb eber er a formação de grumos, ou seja, aglutinações entre as células de leveduras, causando assim alguns equívocos na contagem de quadrículas. Este fato pode ser encarado como uma das limitações deste método. Como nos outros métodos, as limitações de não distinguir células viáveis de células não-viáve não-viáveis is e de outros mate materiais riais que possam possam estar presentes presentes junto das células tam também bém se aplicam neste método. Porém o problema das células viáveis e das não-viáveis pode ser resolvido com a adição de azul de metileno. Esta técnica consiste em se misturar partes iguais da suspensão de levedura (amostra), adequadamente diluída, e da solução corante (azul de metileno). As células com alta atividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas (mortas) ficaram coloridas de azul (Figura 3).

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Figura 4 – Determinação da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno.

13.CONCLUSÃO A partir do que foi apresentado acima, concluímos que este método apresenta ótimos resultados na determinação do número de células, porém, apresenta um grau de dificuldade mais elevado que os métodos anteriores, devido ao uso do microscópio e da dificuldade de contagem das células. 14.REFERÊNCIAS CONTAGEM DE CÉLULAS EM CÂMARA DE NEUBAUER. Disponível em: . .pdf>. Acessado em: 26/03/2009 às 14h23min. MÉTODOS DE ANÁLISES E MONITORAMENTO MICROBIOLÓGICO EM LABORATÓRIO DE DESTILARI DESTILARIA. A. UNIVERSIDA UNIVERSIDADE DE FEDERAL FEDERAL DE SÃO CARLOS. CARLOS. AUTORA: AUTORA: SANDRA SANDRA REGINA REGINA CECCATO CECCATO ANTONINI. Disponível em: . nitoramento_microbiologic o.pdf>. Acessado em: 26/03/2009 às 15h07min. A. OLIVEIRA LIMA, J. BENJAMIM SOARES, J. B. GRECO, J. GALIZZI, J. ROMEU CANÇADO. MÉTODOS DE LABORATÓRIO LABORATÓRIO APLICADOS À CLÍNICA. 5ª Ed. – 1977. Editora Guanabara Koogan.

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Relatório 1 (Quantificação)

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