Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión
Facultad De Ingeniería Agrarias Industrias Alimentarias y Ambiental Escuela Profesional De Ingeniería Ambiental
Asignatura: Microbiología Ambiental Docente: Huayna Dueñas Luis Alberto Tema: Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión kirby-bauer o antibiograma). Integrantes:
Pacheco Santillán Derian André Pastor Huamán Cinthya Rosales Bautista Robinson Trujillo rosales Evelin Thalía Zamudio Chávez juan Lupesco Ciclo: VI HUACHO-201
Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma) PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIBIOTICA (METODO DE DISCO DIFUSION KIRBY-BAUER O ANTIBIOGRAMA)
1. OBJETIVOS
Conocer en que se basa la elección de un antimicrobiano para el tratamiento de una infección y los motivos por los que serializan las pruebas de sensibilidad y cuando está indicado hacerlas. Describir los procedimientos por la determinación de la susceptibilidad antimicrobiana mediante el método de discos difusión (kirby - bauer) e interpretación de los resultados. Conocer los principales mecanismos por lo que las bacterias se hacen resistentes a la acción de un antimicrobiano. 2. FUNDAMENTOS
● La actividad antimicrobiana in-vitro determina:
a) La potencia de un agente antimicrobiano en solución. b) Su concentración en los líquidos del cuerpo o en los tejidos. c) La sensibilidad de un microorganismo dado a concentraciones conocidas del medicamento (antimicrobiano). ● Es una prueba in-vitro que se pide cotidianamente al laboratorio, a fin de seleccionar el
antibiótico más en el tratamiento de una infección determinada. ● Consiste en efectuar un cultivo de microorganismo en el medo más apropiado y después
diseminarlo en placa Petri con agar, al que se le colocan los discos de papel de filtro impregnados con solución de antibióticos (método de difusión). pág. 2 Ingeniera Ambiental
Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma)
Métodos de difusión:
Se coloca un disco de papel filtro conteniendo cantidades conocidas del medicamento sobre un medio solido que ha sido sembrado en forma abundante con el microorganismo de prueba.
Después de la incubación se mide el diámetro de la zona clara de inhibición que rodea el disco antibiótico.
El uso de un disco para cada antibiótico estandarizado a una concentración determinada, permite determinar diámetros críticos que delimitan las categorías sensibles, intermedio y resistente (S.I.R) son el resultado de la integración de un conjunto de elementos: la distribución de la CIM (concentración inhibitoria mínima) para diversas poblaciones de sepas sensibles y resistentes, las concentraciones séricas y tisulares de los antibióticos la confrontación de los resultados in-vitro y de los resultados clínicos, así como la variabilidad estadística de los métodos utilizados.
Procedimiento de categorización: Para
los principales antibióticos los valores
críticos de las concentraciones bajas (c) y altas (C) y de sus diámetros correspondientes (d, D), permiten la categorización según los siguientes criterios (Tabla 1): Tabla 1. Categorización Categoría
Concentración inhibitoria Mínima CIM (mg/L)
Diámetro del halo de inhibición, DHI (mm)
S
CIM
DHI > D
R
CIM
DHI < d
I
c < CIM < C
d < DHI
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Por otra parte la lectura interpretativa del antibiograma, fundada en conocimiento de los antibiofenotipos de sensibilidad y resistencia permite recategorizar un resultado inicialmente S en I o R debido al riesgo de fracaso terapéutico. Esta lectura interpretativa requiere la identificación correcta realización del antibiograma.
Se ha señalado la existencia de factores que pueden afectar la actividad antimicrobiana in-vitro, entre ellos están:
El PH del medio de cultivo, siendo que algunos antibióticos son más activos a un PH acido (ej: nitrofurantoina).
Los componentes del medio de cultivo en este caso las proteínas séricas fijan alas penicilinas desde 40% para la meticilina y 98% para la dicloxacilina.
Estabilidad de los medicamentos, así a la temperatura de la incubación varios agentes antimicrobianos pierden su actividad.
Cuanto más grande sea el inoculo bacteriano, más baja será la sensibilidad del microorganismo.
Cuando más tiempo se prolonga la incubación, mayor es la oportunidad que tienen de presentarse las mutantes resistentes, igualmente los microorganismos que crecen rápido y activamente son más sensibles a la acción de los antibacterianos que aquellos que se encuentran en la fase de reposo.
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Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma) 3. MATERIALES
Refrigeradora
I ncubadora microbiológica.
Autoclave
E spectrofotómetro
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Vortex (agitador para tubos de prueba).
Pinza punta plana, estéril.
Pipetas milimétricas de 1ml, 5ml, estériles.
Termómetros
H isopos de algodón, esté riles.
Disco de antibióticos de 6 mm de diámetro
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Regla altimétrica.
Baño maria.
Cloruro de bario (2)
Ácido sulfúrico (2 4)
Suspensión de sulfato de bario (0.5 de la escala de Mac Farland como estándar).
Solución salina o caldo triptacasa soya, estéril.
Placas Petri con Agar mueller Hinton, Agar Mueller Hinton con 5% de sangre de carnero o Haemohhilus test médium (HTM), con 25 ml del medio de cultivo para las placas de 90 mm de diámetro.
Tubo de prueba con caldo tripticasa soya (TSC) sembrado con cepa bacteriana identificada.
4. POCEDIMIENTO
1) Preparación de inoculo (Método de desarrollo previo): a. Seleccionar 4 a 5 colonias bien aisladas, del mismo tipo morfológico de un cultivo en placa. b. Tocar la superficie de cada colonia con un asa de siembra y transferirlo aun tubo que contenga de 4 a 5 ml de caldo apropiado (ejm: Caldo tripticasa soya).
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c. Incubar el caldo a una temperatura entre 35°C a 37°C, hasta que alcance o exceda la turbidez del estándar 0.5 de la escala de Mc Farland (por lo general de 2 a 6 horas). d. Ajustar la turbidez del inoculo con solución salina o caldo apropiado hasta el tubo 0.5 de escala de Mc Farland, por comparación visual con el estándar. Para realizar este paso correctamente usar una luz apropiada y mirar los tubos contra un fondo blanco con líneas negras como contraste. e. La suspensión preparada contendrá aproximadamente 1 a 2×108 UFC/ml de la cepa bacteriana. 2) Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inoculo, sumergir un hisopo estéril en la suspensión, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido para remover el exceso de inoculo.
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3) Inocular la superficie seca de la placa de Mueller Hinton, estriando con el hisopo en 3 direcciones para asegurar una distribución uniforme del inoculo. Antes de colocar los discos de antibióticos dejar secar la placa a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.
4) Colocar los discos de antibióticos individuales o multidisco sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo con la superficie del agar
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5) Distribuir los discos uniformemente, de modo que estén a una distancia mínima de 20 mm uno del otro. No deben de colocarse más de 12 discos en una placa de 150 mm, ni más de 6 en una placa de 100 mm de diámetro interno, para evitar la superposición de las zonas de inhibición. Un disco no debe de ser removido una vez que tomo contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibióticos se difunden rápidamente.
6) Incubar las placas en posición invertida a 35°C por 24 horas según la bacteria investigada. Dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de los discos. 7) Las placas de haemoophilus spp y estreptococos ssp, deben ser incubadas en atmosfera de 5% de 2. 8) Después del tiempo recomendado de incubación, examinar cada placa y medir los diámetros de los halos de inhibición alrededor de cada disco.
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Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma) 5. RESULTADOS LECTURA DE LAS PLACAS E INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
1. Medir los diámetros de la zonas de inhibición completa (donde no crecen los microorganismos “halo claro”, incluyendo el diámetro del disco), usando una regla o
calibrador. Se debe tener iluminada la parte posterior de la placa Petri con una luz reflejada localizada a unos cuantos centímetros sobre un fondo negro. 2. En los medios suplementados con sangre, las zonas son medidas en la parte superior de la superficie del agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de la superficie del agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de la hemolisis sino la de inhibición del crecimiento. 3. El límite del área de inhibición está dado por la inhibición completa del desarrollo tal como se puede apreciar a simple vista. 4. Los diámetros de inhibición son interpretados basándose en las tablas de medidas, conforme a las instrucciones del fabricante. La sensibilidad de la cepa bacteriana será reportada como sensible o susceptible (S), intermedio (I) o resistente (R).
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Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma)
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INTERPRETACION: Luego de hacer las respectivas medidas del diámetro de cada uno
de los antibióticos de los diferentes agares (Escherichia Coli, Staphylococcus Aurius) pasamos a contrastar nuestros resultados versus lo datos que tenemos en las tabla de interpretación de los resultados “Método de difusión en Agar”, ya con esta tabla veremos por el tamaño del diámetro si es sensible (S) intermedia (I) o resistente (R). Dato: sabemos que a mayor diámetro mayor sensibilidad al antibiótico. Sensible (S):
la infección debida al microorganismo aislado puede ser tratada
apropiadamente con el antibiótico a la dosis recomendada, de acuerdo a la gravedad de la infección. Sin embargo, para la prescripción definitiva del medicamento, el veterinario tratante tendrá en cuenta algunos factores tales como biodisponibilidad del antibiótico en el tejido o sistema afectado, presentación del medicamento, edad del paciente, condiciones patológicas subyacentes o fisiológicas, entre otras Intermedia (I): indica
que el antibiótico tiene aplicabilidad clínica en sitios corporales
donde el antibiótico alcance concentraciones terapéuticas adecuadas, como es el caso de !lactámicos y quinolonas en el tracto urinario. En otros casos, puede utilizarse el medicamento con seguridad en dosis elevadas que no alcancen los niveles de toxicidad pero que garanticen actividad terapéutica. Sin embargo, es recomendable evitar el uso de la categoría “intermedia” cuando sea posible. • Resistente (R): la bacteria aislada no es inhibida por el antibiótico a las concentraciones
terapéuticas ideales o la bacteria ha generado mecanismos de resistencia que evaden la actividad del antibiótico, por lo tanto, la eficacia clínica de éste no es confiable.
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Tabla 2: Antibióticos y diámetros críticos para Staphylococcus Aurius Antimicrobiano
Contenido del
Diámetro en mm
disco
R
I
S
Eritromicina
15 ug
_
18
_
Tetraciclina
30 mcg
14
_
_
Gentamicina
10 ug
_
_
17
Amoxicilina/ ácido Clavulanico
20-10 mcg
_
_
22
Vancomicina
30 ug
12
_
_
Penicilina
10 ug
20
_
_
Oxacilina
1 mcg
0
0
_
Tabla 3: Antibióticos y diámetros críticos para Escherichia Co li Antimicrobiano
Contenido del
Diámetro en mm
disco
R
I
S
Amicacina (AK)
30 mcg
_
_
17
Amoxicilina/ ácido Clavulanico
20-10 mcg
0
_
_
Cefotaxima (CTX)
30 ug
0
_
_
Imipenem (IPM)
30 ug
18
_
_
Ciprofloxacina (CIP)
5 mcg
_
_
30
Trimetoprima/ sulfametoxazol
25 ug
_
_
27
30 mcg
_
_
23
(STX) Cloramfenicol (C)
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Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma) 6. COMCLUCIONES
El control de calidad que tiene el método de difusión con disco es muy sencillo y fácil de mantener, debido al monitoreo de los reactivos, los medios de cultivo, así como otros factores externos. Mediante este control de calidad nos damos cuenta si los resultados obtenidos son confiables.
Se concluye que el método de difusión con disco (Kirby-Bauer), es mejor para la prueba de sensibilidad antimicrobiana, es rápido, fácil y sencillo, no se ocupa material caro, ni instrumentos costosos.
La sensibilidad de la bacteria demuestra la utilidad de este antibiótico en el tratamiento de las infecciones.
Este método también cuenta con cepas de control de calidad, que son seleccionadas con base a su susceptibilidad o resistencia a los antimicrobianos y su desempeño confiable para administrar el adecuado tratamiento a dichas enfermedades.
7. CUESTIONARIO a) ¿En que se basa la mayor exactitud del método antibiograma de difusión de Kirby-Bauer?
Para tener una mayor exactitud este método se basa principalmente en los pasos a realiza pero estos debe ser ejecutados correctamente y de esa manera obtendremos un buen resultado de nuestro ensayo.
Estos ensayos son a menudo indicados cuando se piensa que el organismo causante pertenece a una especie capaz de mostrar resistencia a los agentes antimicrobianos más comúnmente usados. pág. 15
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Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma) b) ¿Qué importancia clínica tiene el antibiograma?
El antibiograma ayuda al médico en la elección del antibiótico que hay que prescribir. Permite determinar el antibiótico más eficaz en caso de una infección bacteriana.
c) ¿Qué diferencia existe entre concentración inhibitoria mínima (CIM) y concentración bactericida mínima (CBM)?
La diferencia que existen entre estos dos concentraciones es que la Concentración Inhibidora Mínima (CIM) es la medida de la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico. Es la mínima cantidad de antimicrobiano que es capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones normalizadas.
La Concentración Bactericida Mínima (CBM) es la mínima cantidad de antibiótico capaz de destruir el 99,9% de una muestra inoculada en condiciones estandarizadas.
d) ¿Defina sinergismo y antagonismo antibiótico? Sinergismo: el
sinergismo permite que ambas poclaciones se benificien,
permitiendo combinar sus actividades metabolicas para transformar sustratos que por si solas no pueden utilizar. Antagonismo antibiotico: es
una propiedad de ciertas combinaciones de
antibióticos de ejercer un efecto bactericida inferior al de cada uno de ellos.
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Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma) e) ¿Cuáles son los antibióticos y diámetros críticos para bacterias Gram negativas
A continuación se presentará losantimicrobianos de mayor importancia para el grupo de bacterias Gram negativas. Ampicilina, gentamicina, tobramicina, Amoxicilina Acido clavulánico, Ampicilina Sulbactam, Piperacilina tazobactam, Ticarcilina Acido clavulánico, Cefuroxima, Amikacina,
f) ¿Cuáles son los antibióticos y diámetros críticos para bacterias Gram positivas?
Las PENICILINAS actúan frente a multitud de bacterias gram-positivas.
La ERITROMICINA y fármacos similares (claritromicina, azitromicina, etc) son activos, sobre todo, frente a microorganismos de los llamados ‘gram positivos'
LINCOMICINA Y CLINDAMICINA: Son activos también frente a microorganismos llamados "gram-positivos", pero además pueden con otros microorganismos llamados anaerobios.
g) ¿Defina algunos términos: antibiótico, cepa bacteriana, colonia, disco de sensibilidad, inoculo y medio de cultivo? Antibiótico: molécula
natural (producida por un organismo vivo, hongo o
bacteria), sintética o semisintética, capaz de inducir la muerte o la detención del crecimiento de bacterias, virus u hongos. Hoy en día no se utilizan moléculas de origen natural, por lo cual no se establece más la diferenciación con quimioterápicos.
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Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma) Cepas bacteriana: Es
un conjunto de células homogéneas, o clones, que
deriva de la reproducción de una célula inicial única, seleccionada y aislada. Colonia: Conjunto
de microorganismos visibles macroscópicamente y que se
han desarrollado a partir de una célula o de un progenitor común. Disco de sensibilidad:
Los discos Sensibles se utilizan para pruebas
semicuantitativas de sensibilidad in vitro de patógenos bacterianos comunes de crecimiento rápido y de ciertos patógenos bacterianos exigentes, por medio del procedimiento de prueba de difusión de disco en agar Inoculo: Es
la Cantidad o Número de Gérmenes infectantes que son
introducidos accidental o voluntariamente en los tejidos vivos o en medios de cultivos especiales. Medio de cultivo:
Son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones
adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. En las condiciones de laboratorio para realizar un cultivo, se debe sembrar sobre el medio de cultivo elegido las muestras en las que los microorganismos van a crecer y multiplicarse para dar colonias.
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Prueba de sensibilidad antibiótica (método de disco difusión Kirby-Bauer o antibiograma) 8. BIBLIOGRAFIA
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