PRODUÇÃO DE PIRUVATO E ACETALDEÍDO

Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas Farmacêuticas

PRODUÇÃO DE PIRUVATO E A CETALDEÍDO CETALDEÍDO DURANTE A FERMENTAÇÃO DA GLUCOSE PELA LEVEDURA

I. INTRODUÇÃO

O significado da palavra fermentação sofreu, durante os dois últimos séculos, muitas alterações. Originalmente aplicada ao processo pelo qual o vinho e outras bebidas alcoólicas eram obtidas, significava uma efervescência ou ebulição lenta. Mais tarde, devido às investigações de Gay-Lussac e de outros, a palavra fermentação associou-se ao processo pelo qual o "açúcar" (glucose) era convertida em álcool (etílico) e dióxido de carbono, ou seja o processo que hoje designamos por fermentação alcoólica.

Actualmente, fermentação é um termo bastante geral e implica a degradação anaeróbia de

um substrato. Pode assim ser definida como um processo metabólico

(catabólico) que ocorre na ausência de oxigénio e, no qual, através de uma série de reacções de oxi-redução, hidrólise e outras, os enzimas existentes em determinado organismo/tecido levam a cabo a modificação química de um substrato (metabolito), formando-se outros compostos como produtos finais dessas reacções sequenciais (ou vias), como por exemplo etanol, ácidos carboxílicos, dióxido de carbono, etc. Nos vários organismos, particularmente nos microbianos, existem numerosas vias fermentativas, cada uma delas dando origem a um produto(s) final(is) específico(s). Entre as mais relevantes salientam-se duas vias, ambas tendo o piruvato como metabolito inicial: a fermentação alcoólica em células de levedura e a fermentação láctica (ou homoláctica) no

tecido muscular de animais, originando respectivamente

etanol e e lactato.

Embora o estudo da sequência da via de fermentação alcoólica tenha sido iniciado há cerca de dois séculos com Lavoisier, só em 1951 Embden, Meyerhof e Parnas integram todos os conhecimentos até então adquiridos, propondo um esquema conjunto (Fig. 1) para as transformações sofridas anaerobiamente pela glucose (glicólise) nas leveduras e no músculo.

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Glicogénio Glicogéni o (ou ( ou amido) + - H3P O 4

Fosforilase

1-Fosfato de glucose

D-glucose

Frutose

Hexocinase Fosfatase Hexocinase Fosfatase

6-Fosfato de glucose

6-Fosfato de frutose

1,6-Difosfato de frutose Aldolase

Fosfato de dihidroxicetona dihidroxicetona

Isomerase

3-Fosfato de D-gliceraldeído + - H2

+ - H 3P O 4

1,3-Difosfato 1,3-Difosfato de D-gliceraldeíd H3PO 4

1-Fosfato de D-gliceraldeído D-gliceraldeído

2-Fosfato de D-gliceraldeído + - H 2O

Ácido láctico

Piruvato

Enolase

Fosfato de enolpiruvato

Acetaldeído + CO2 + - H2

Etanol

Figura 1 - Esquema - Esquema proposto por Embden, Meyerhof e Parnas para a glicólise incluindo a fermentação alcoólica e láctica.

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Neste trabalho pretende-se demonstrar a formação de intermediários metabólicos piruvato e acetaldeído - durante a fermentação da glucose pela levedura. Uma vez que tanto o piruvato como o acetaldeído só estão presentes em pequenas quantidades nesta via, dado que se transformam rapidamente no intermediário seguinte, uma maneira de demonstrar a sua existência é impedir a reacção seguinte de prosseguir, levando assim à sua acumulação. Para isso vão ser usadas duas estratégias: 1. Para detectar o piruvato, leva-se a cabo a incubação das células de levedura na presença de glucose sob condições ligeiramente alcalinas, as quais inactivam o enzima piruvato descarboxilase (na nomenclatura dos enzimas: 2-oxoácido carboxilase, E.C. 4.1.1.1.), que catalisa o passo seguinte da via, conduzindo assim à acumulação daquele composto. A sua presença é posteriormente duplamente demonstrada pelas reacções com o nitroprussiato (coloração azul) e com a 2,4-dinitrofenilhidrazina (coloração vermelha). 2. A presença do acetaldeído é posta em evidência mediante a sua reacção com um agente (sulfito de sódio), adicionado à mistura de incubação, dando origem a um composto que já não é metabolizado por não servir de substrato ao enzima álcool desidrogenase. O acetaldeído presente será então identificado através da sua reacção com o nitroprussiato de sódio na presença de piperidina, dando uma característica cor azul.

II. TRABALHO EXPERIMENTAL

A) PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES 1. Na2HPO4 0,5 M 50 ml/turma 2. KH2PO4 0,5 M 50 ml/turma 3. Glucose 100 g/l 150 a 200 ml/turma 4. Ácido tricloroacético (TCA) 100 g/l 50 ml/turma 5. Nitroprussiato de sódio 50 g/l 10 a 20 ml/turma 6. HCl 2 M 50 ml/turma Bioquímica II

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7. Solução saturada de hidrocloreto de 2,4-dinitrofenilhidrazina em HCl 2M 25 ml/turma 8. NaOH 100 g/l 25 ml/turma 9. Usando o fermento de padeiro, faça três suspensões de células de levedura (50 ml/turma) à concentração de 100 g/l: a) uma em Na2HPO4 0,5 M (suspensão ligeiramente alcalina); b) outra em KH2PO4 0,5 M (suspensão ligeiramente ácida) e c) outra em H2O (suspensão neutra).

B) FORMAÇÃO DO PIRUVATO 1. Pipete 5 ml de solução de glucose 100 g/l para cada um de dois tubos de centrífuga (A e B) 2. Adicione 5 ml da suspensão de levedura ligeiramente ácida ao tubo A e 5 ml da suspensão de levedura ligeiramente alcalina ao tubo B. 3. Coloque ambos os tubos ( A e B) num banho termostatizado a 37 ºC durante 1 hora. 4. Após a incubação, adicione 2 ml de ácido tricloroacético (100 g/l) a cada tubo. Agite. 5. Centrifugue durante 10 min. a 2 500 × g. 6. Remova os sobrenadantes para tubos de ensaio (também identificados com A e B)

C) TESTE DO NITROPRUSSIATO PARA O PIRUVATO 1. Retire 3 ml de cada um dos sobrenadantes A e B para outros tubos de ensaio ( A1 e B1)

2. Coloque estes dois tubos num banho de água fervente durante 5 mim. 3. Entretanto, em dois novos tubos de ensaio ( A1 e B1), coloque cerca de 1 cm de sulfato de amónio sólido. 4. Adicione 2 ml de cada um dos sobrenadantes fervidos aos tubos preparados no ponto anterior. 5. Adicione a cada um duas gotas de solução de nitroprussiato de sódio a 50 g/l. 6. Adicione amónia concentrada, deixando cair ao longo das paredes de cada tubo, de modo a formar duas fases. Bioquímica II

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7. Observe e registe o aparecimento (e eventualmente a alteração) de cor no anel de junção das duas fases.

D) TESTE DA DINITROFENILHIDRAZINA PARA O PIRUVATO 1. Retire para dois tubos de ensaio (identificados A2 e B2), 2 ml de cada um dos sobrenadantes obtidos em B.6, ou seja, não fervidos . 2. Adicione a cada um 1 ml de solução saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazina. Agite. ATENÇÃO: TRABALHAR NA HOTTE! Esta solução contém ácido clorídrico.

3. Retire 2 ou 3 gotas de cada tubo para novos tubos de ensaio (também A2 e B2). 4. Adicione 1 ml de NaOH 100 g/l. 5. Dilua com água até cerca de 5 ml. 6. Observe e registe o aparecimento de cor em cada um dos tubos.

E) FORMAÇÃO DE ACETALDEÍDO A P ARTIR DA GLUCOSE 1. Pipete 5 ml de solução de glucose 100 g/l para cada um de dois tubos de centrífuga (C e D). 2. Adicione a ambos, 5 ml da suspensão de levedura em água (suspensão neutra). Agite. 3. Adicione 0,5 g de sulfito de sódio ao tubo D. Agite. 4. Coloque ambos os tubos ( C e D) num banho termostatizado a 37 ºC durante 1 hora. 5. Após a incubação, centrifugue ambos os tubos durante 10 min. a 2 500 × g. 6. Remova os sobrenadantes para tubos de ensaio ( C e D) 7. Em dois novos tubos de ensaio ( C e D), coloque 2 ml de cada um dos sobrenadantes obtidos no ponto anterior. 8. Adicione a cada tubo 0,5 ml de nitroprussiato de sódio a 50 g/l e, TRABALHANDO NA HOTTE, adicione 2 ml de piperidina.

9. Observe e registe o aparecimento de cor em cada um dos tubos.

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III. CONCLUSÕES Interprete o aparecimento de cor nos tubos A1 e B1, A2 e B2, e C e D, explicando esquematicamente as reacções ocorridas.

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EXTRACÇÃO DO GLICOGÉNIO DO FÍGADO. HIDRÓLISE EM MEIO Á CIDO I. INTRODUÇÃO

Os organismos vivos contém frequentemente glúcidos como material de reserva. Estas substâncias são armazenadas na forma de poliósidos como o amido nas plantas e o glicogénio nos animais. As propriedades físicas e químicas de muitos poliósidos são suficientemente diferentes das de outras substâncias naturais, permitindo assim, o seu isolamento. Numa solução de ácido tricloroacético (TCA) muitos compostos de elevada massa molecular, tais como as proteínas e os ácidos nucleicos precipitam, enquanto que o glicogénio se mantém em solução. Por outro lado, os poliósidos são menos solúveis em solução alcoólica do que as "oses" ou outras substâncias solúveis em água, o que permite a sua separação. A hidrólise ácida do glicogénio origina uma série de produtos intermediários com massas moleculares sucessivamente menores, obtendo-se como produto final a glucose. O curso da hidrólise pode assim ser seguida pela determinação do carácter redutor da solução.


A) PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES 10. Solução de TCA a 20 % 11. Solução de glicogénio (4 mg/ml) 12. Solução de HCl 2,5 N 13. Solução de NaOH 1,25 N 14. Solução de 3,5-dinitrosalicilato - dissolver 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicilato em 200 ml de NaOH 2 N, aquecendo e agitando vigorosamente. Dissolver 100 g de tartarato de sódio e potássio tetrahidratado em 500 ml de H2O. Misturam-se as duas soluções e perfaz-se o volume para 1 litro com água destilada. Bioquímica II

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B) EXTRACÇÃO DO GLICOGÉNIO 1. Pese o fígado completo. Pese aproximadamente 15 g de fígado (tome nota do peso rigoroso) e corte-o em pedaços pequenos com uma tesoura. Coloque-os num homogenizador contendo água (1 ml por grama de tecido). Use água destilada gelada de preferência.

2. Homogenize o fígado tendo o cuidado de não deixar elevar muito a temperatura 3. Transfira o homogenizado para um gobelet e aguarde cerca de 5 min. agitando frequentemente com uma vareta de vidro 4. Adicione um volume igual de TCA a 20 % (a solução resultante ficará a 10 %) 5. Transfira o conjunto para um tubo de centrífuga e centrifugue durante cerca de 8 min. 6. Decante o sobrenadante para uma proveta, adicione dois volumes de etanol a pouco e pouco, agitando sempre com a vareta de vidro. 7. Deixe repousar até que se forme um precipitado (se não observar precipitação junte um pouco de cloreto de sódio sólido e aqueça o tubo suavemente colocandoo num gobelet com água quente até se formar um precipitado). 8. Transfira a suspensão para tubos de centrífuga. Equilibre-os e centrifugue o conjunto durante cerca de 5 min. 9. Despreze o líquido sobrenadante e dissolva o precipitado em cerca de 5 ml de água e reprecipite o glicogénio pela adição de 10 ml de etanol 10. Separe de novo o precipitado por centrifugação e lave-o no tubo de centrífuga com 3 ml de éter, agitando o resíduo com uma vareta de vidro. Centrifugue novamente 11. Pese o precipitado Nota: a quantidade de glicogénio existente no fígado depende grandemente do estado nutricional do animal. É possível, portanto, que em certos casos, tais como jejum prolongado, aquela quantidade seja tão pequena que não se chegue a observar precipitado.

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C) HIDRÓLISE DO GLICOGÉNIO 1. Numere 8 tubos de ensaio de 1 a 8 2. Adicione ao tubo nº 1, que servirá de branco, 0,5 ml de água destilada 3. Adicione aos restantes tubos 0,5 ml da solução de glicogénio 4. Junte a cada tubo 0,5 ml de HCl 2,5 N e tome nota da hora a que se verificou a adição 5. Junte imediatamente aos tubos 1 e 2, 1 ml de NaOH 1,25 N e coloque os tubos de 3 a 8 num banho-maria em ebulição 6. Com intervalos de 5 min. retire os tubos 3 a 7 do banho-maria e neutralize o conteúdo de cada um adicionando 1 ml de NaOH 1,25 N 7. Após o tubo nº 8 ter estado no banho-maria 60 min., retire-o e adicione 1 ml de NaOH 1,25 N 8. Junte a todos os 8 tubos, 2 ml da solução de 3,5-dinitrosalicilato e aqueça todos os tubos no banho-maria durante 5 min. 9. Arrefeça os tubos com água fria e junte a cada um 6 ml de água destilada. Agite 10. Leia no espectrofotómetro as absorvências a 540 nm usando como branco o tubo nº 1

III. TRATAMENTO DOS R ESULTADOS Determine a quantidade de glicogénio obtido por grama de fígado total. Ter em conta que o ensaio foi efectuado em apenas 15 g do peso total do fígado. Considere o poder redutor da solução do tubo nº 8 (hidrólise completa) como equivalente a 100 % de conversão do glicogénio em glucose e faça um gráfico das percentagens de hidrólise em função do tempo. Comente os resultados obtidos.

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ISOLAMENTO, PURIFICAÇÃO E C ARACTERIZAÇÃO DO CITOCROMO C DE UMA ESTIRPE DE Saccharomyces cerevisiae

I. INTRODUÇÃO

O último passo do metabolismo aeróbio, a fosforilação oxidativa, permite a síntese de ATP a partir de um gradiente quimiosmótico de protões formados durante a passagem de electrões através da cadeia de transferência de electrões. O citocromo c é o componente mais conhecido desta cadeia e o mais estudado, por diversas razões: •

disponível em grande quantidade e em inúmeras fontes

•

estabilidade e solubilidade em água

•

simplicidade da sua função e da sua estrutura.

O citocromo c mitocondrial dos eucariontes é o membro mais conhecido de uma imensa família de proteínas. Trata-se de uma proteína periférica que se encontra fracamente ligada à membrana interna mitocondrial. Muitos e vários citocromos c já foram isolados de procariontes e muitos mais ficaram provavelmente por descobrir. O citocromo c é uma hemoproteína, ou seja, possui um heme, grupo prostético organometálico constituído por uma estrutura tetrapirrólica com um ião ferro (Fe 2+ ou Fe3+) no seu meio. O citocromo c possui um heme do tipo c, ligado à proteína por ligações covalentes com dois resíduos de cisteína, fig 1. Cys S H3C

CH

Cys

CH 3

S CH

H3C N

CH3

N

Fe3+ N N H3C

CH 3

CH 2

CH 2

CH 2 COO

CH 2 -

COO

-

a)

Figura 1 - Estrutura química do grupo heme c.

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O citocromo c transporta um electrão do complexo III da cadeia respiratória até ao complexo IV: quando o citocromo transporta o electrão tem o ião ferro na forma Fe 2+ que, depois de ter transferido o electrão fica na forma de Fe 3+, pronto para receber outro electrão.


A) PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES 1. Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 2. NaCl 1 M 3. Tris-HCl 1 M, pH 7,6 4. Reagentes para método de Lowry (ver alínea E) 5. NaOH 0,075 M 6. Soluções para electroforese (ver alínea C)

B) PROCEDIMENTO 12. Suspender 1 kg de fermento de padeiro, previamente desfeito no maior número de pedaços possível em 250 ml de acetato de etilo e 500 ml de uma solução de NaCl 1 M, adicionados por esta ordem. Deixar a agitar, no frio, até à manhã seguinte. 13. Retirar a suspensão do agitador e adicionar cerca de 3,5 litros de água destilada. Juntar em seguida 100 ml de resina CMC-32, previamente inchada em água e agitar a mistura durante cerca de 30-45 min. Deixar depositar a resina a qual é em seguida decantada e lavada sucessivamente com Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 até que o sobrenadante fique límpido. Colocar numa coluna de cromatografia (10 cm × 5 cm), previamente montada, a resina preparada anteriormente. Proceder à eluição do citocromo com tampão Tris-HCl 1 M, pH 7,6.

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C) ELECTROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA (SDS) Preparação de soluções 1. Tampão para as amostras (A) - preparar 5 ml Glicerol 0,5 ml; Stock II 1,25 ml; azul de bromofenol 1 mg, SDS a 10% 2 ml, βmercaptoetanol 0,25 ml Stock II - Tris Base 0,5 M (3,03 g); HCl até pH 6.6-6.8. Perfazer volume até 50 ml 2. Tampão para as amostras (B) - preparar 5 ml Glicerol 0,5 ml; Stock II 1,25 ml; azul de bromofenol 1 mg, SDS a 10% 2 ml, 3. Tampão de electroforese Tris-Glicina (10 × conc.) pH 8.3 - preparar 100 ml Tris Base 0,25 M (3,03 g); Glicina 1,92 M (14,41 g); SDS (1 g). Perfazer volume até 100 ml. Diluir de 1:10 antes de usar. 4. Solução corante - preparar 100 ml Coomassie Blue G-250 (40 mg); ácido perclórico a 60% (5,8 ml). ). Perfazer volume até 100 ml Preparação das amostras •

Pipetar para dois eppendorfs 10 µl de amostra (citocromo obtido no ponto B.2). Adicionar 10 µl de tampão A ao eppendorf 1 e 10 µl de tampão B ao eppendorf 2. Preparar as soluções padrão ( eppendorf 3) adicionando a 10 µl de padrão e 10 µl de tampão A. Fazer um spin-down. Ferver durante 2 min. os eppendorfs 1 e 3.

Preparação do gel 1. Remover os Ready Gel da embalagem de acondicionamento. 2. Retirar o pente e lavar os poços com água destilada ou tampão de electroforese. 3. Cortar com o auxílio de uma lâmina a cassete do Ready Gel (em baixo ao longo da linha a ponteado). 4. Puxar a fita existente na parte debaixo da cassete de modo a expor o fim do gel. 5. Colocar a cassete no Electrode Assembly. Encaixar primeiro a parte debaixo do gel nas reentrâncias existentes de cada lado e em baixo do Electrode Assembly. Colocar a cassete de modo que o vidro pequeno fique virado para o interior do Electrode Assembly.

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6. Como se vai correr dois géis não é necessário colocar um vidro do outro lado do Electrode Assembly.

7. Colocar o Electrode Assembly com a cassete do Ready Gel no Clamping Frame. Este dispositivo permite manter o Electrode Assembly com o Ready Gel num sistema fechado. 8. Pressionar o Electrode Assembly para baixo, enquanto fecha os dois clips, situados na parte debaixo do Clamping Frame. Ao conjunto constituído pelo Electrode Assembly

(com os géis colocados) e Clamping Frame designa-se de Inner

Chamber .

9. Colocar o Inner Chamber na tina de electroforese para mini-géis. 10. Encher o Inner Chamber com tampão de electroforese (diluído 10 ×). Verificar se existem fugas. 11. Se não houver fugas colocar entre 200 a 300 ml de tampão de electroforese na tina de electroforese. Caso existam fugas encher a tina de electroforese com o tampão até cima (mais ou menos até ao nível do tampão existente no Inner Chamber ). 12. Verificar se não existem bolhas de ar no fundo do Inner Chamber . A existência de bolhas de ar perturba a migração das proteínas. 13. Aplicar 20 µl de amostra em cada um dos poços com uma pipeta automática. Cada amostra deve ser aplicada devagar, de modo a permitir que a amostra assente no fundo do poço. Ter o cuidado de não tocar com a ponta da pipeta no fundo do poço de modo a evitar que este se rompa. 14. Colocar a tampa da tina de electroforese, tendo o cuidado de colocar as bananas (uma preta e outra vermelha) a condizer com os eléctrodos. 15. Ligar os fios eléctricos da tina à fonte de alimentação, tendo o cuidado de assegurar a polaridade correcta das ligações (banana vermelha no +; banana preta no -). 16. Programar a fonte para 150 mV durante ± 10 min., ou até as amostras já se encontrarem no topo do gel de resolução (o gel de baixo). Aumentar a voltagem para 160 mV e deixar correr até a frente de migração das bandas estar a 5 - 10 mm do fim do gel. 17. Após a corrida do gel, desligar a fonte de alimentação e desligar os fios. 18. Retirar o Inner Chamber e verter o tampão. Desmontar o sistema de modo a remover a cassete do Ready Gel. Bioquímica II

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19. Remover o gel da cassete, separando os dois vidros. É necessário retirar a fita que rodeia a cassete do Ready Gel. 20. Transferir o gel para a solução corante. Deixar a corar num agitador para géis até aparecerem as bandas (entre 30 a 45 min).

D) DETERMINAÇÃO DO ESPECTRO N ATIVO E R EDUZIDO DO CITOCROMO Usando uma cuvette de quartzo, trace o espectro de UV-Vís. (entre 250 e 800 nm) do citocromo (estado nativo). Adicione alguns grãos de ditionito de sódio à cuvette e trace novo espectro (estado reduzido).

E) DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE HEMOS POR MOLÉCULA DE PROTEÍNA A determinação da quantidade total de proteína é feita pelo método de Lowry, enquanto que o conteúdo em hemos é obtido a partir do espectro do derivado piridina hemocromo. Tenha, no entanto, em atenção que o citocromo obtido não se encontra puro pelo que o número de hemos não será proporcional à quantidade de proteína existente na amostra (existem contaminantes/proteínas que não têm hemo). Determinação da quantidade total de proteína

Método de Lowry Reagente A (preparar 100 ml)

Na2CO3 (anidro) a 2 % em NaOH 0.1 M

Reagente B1 (preparar 10 ml)

CuSO4.5H2O a 1 %

Reagente B2 (preparar 10 ml)

Tartarato

de

sódio

e

potássio

tetrahidratado a 1 %. Reagente de Lowry C (preparar 100 ml)

Misturar, agitando, 1 ml de B1, 1 ml de B2 e 100 ml de A

Reagente de Lowry D (preparar 25 ml).

Diluir 2 vezes o reagente de Folin comercial com água destilada

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Construir uma recta padrão para uma solução de citocromo c de coração de cavalo de concentração 0,225 mg/ml, de acordo com os volumes indicados na tabela seguinte: Tubos

1

2

3

4

5

6

Vol (sol. padrão) µl

----

100

200

300

400

500

Vol (água) µl

500

400

300

200

100

----

Vol (sol. C)* ml

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

2,5

Vol (Reagente de Folin) µl

500

500

500

500

500

500

*

Após a adição do reagente C, agitar e esperar 10 min. Adicionar só depois os 0,5 ml de reagente de Folin e ler após 30 min. a absorvência a 500 nm.

Fazer o doseamento da amostra em triplicado (utilizar de preferência diferentes diluições). Determinação do conteúdo em hemos

Efectuar uma diluição do citocromo c purificado, equivalente à da determinação da quantidade total de proteína, numa solução contendo 0,075 M NaOH e 25 % (p/v) de piridina, para um volume final de 1 ml. Reduzir esta solução com ditionito de sódio e ler a absorvência a 550 nm. Determinar o conteúdo em hemos com base no coeficiente de extinção molar para o hemo c: 29.1 mM-1 cm-1.

III. TRATAMENTO DOS R ESULTADOS Apresente os espectros de UV-Vis. traçados entre 250 e 800 nm correspondentes à forma nativa e reduzida do citocromo c. Comente eventuais diferenças. Determine o peso molecular, e o conteúdo hémico deste citocromo e comente. Conclua sobre a possibilidade da existência de formas multiméricas neste citocromo.

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DETERMINAÇÃO DA A CTIVIDADE ENZIMÁTICA DAS TRANSAMINASES NA FRACÇÃO CITOSÓLICA DAS CÉLULAS DO FÍGADO I. INTRODUÇÃO

A disrupção de células (ou seja, a ruptura da membrana celular) pode ser levada a cabo por diferentes métodos: choque osmótico, ultra-sons, uso de detergentes específicos, trituração, etc. (ver Principais Técnicas Usadas na Purificação de Proteínas, notas das aulas práticas de Bioquímica I). Se tais métodos forem aplicados

com os devidos cuidados, os organitos intracelulares ficarão intactos e as várias partículas apresentarão, in vitro, a maior parte das propriedades bioquímicas dos organitos originais da célula intacta (ou seja in vivo). O extracto de células (ou tecido) ficará assim reduzido a uma espessa suspensão de partículas de vários tipos, cada qual com o seu tamanho, carga e densidade. A separação dos vários componentes celulares é possível por centrifugação. É normal usar-se a centrifugação diferencial - permite a separação dos componentes sub-celulares através de centrifugações sucessivas a velocidades crescentes do rotor sendo possível obter quatro fracções: Fracção nuclear - contém essencialmente os núcleos, mas também alguns restos de células que sofreram disrupção parcial, ou que não sofreram disrupção. Os núcleos contêm o material genético, ou seja o DNA, mas também RNA, tanto mensageiro, como ribossomal e de transferência, resultante da actividade de transcrição e que não transitou ainda para o citoplasma. Existem também pequenas moléculas de RNA, constituintes das snRNPs ( smal nuclear r ibonuclear particles). Fracção mitocondrial - contém não só os mitocôndrios, mas também os peroxissomas e lisossomas (se se tratasse de células de plantas superiores, obter-se-iam também os cloroplastos). Fracção microssomal - contém ribossomas e polissomas (ribossomas envolvidos na tradução e que se encontram ligados entre si pelo RNA mensageiro). Também se encontram nesta fracção pequenas vesículas.

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Fracção citosólica - constitui a parte solúvel da célula. Contém as proteínas solúveis, (grande número de enzimas) e outras moléculas de pequenas dimensões. É nesta fracção que se encontram enzimas como as lipases ou as transaminases. Os valores de concentração destas últimas possui grande interesse clínico e a sua presença irá ser detectada neste trabalho. A entrada dos produtos de degradação dos aminoácido no ciclo dos ácidos tricarboxílicos (TCA) pode ocorrer em vários passos do ciclo, sendo um dos modos de entrada o que envolve toda a estrutura carbonada ("esqueleto") do aminoácido. Para tal, os diferentes aminoácido entram nas diferentes vias degradativas (catabólicas) que são específicas de cada tipo de aminoácido. Algumas das transformações das diferentes vias são, porém, comuns a todos os aminoácidos. Entre estas estão as reacções de transaminação, processo pelo qual o grupo amina de um aminoácido dador é transferido para um α-cetoácido aceitador, resultando assim na formação de um novo α-cetoácido (derivado do aminoácido original) e num novo aminoácido (resultante do α-cetoácido original). Os enzimas envolvidos nestas reacções designam-se por transaminases e ocorrem, na sua maioria, no citoplasma.

NH3+ -OOCCH2CH2CHCOO-

O

O +

glutamato

CH3CCOOpir uvato

NH3+

O

-OOCCH CH CHCOO2 2

glutamato

+

-OOCCH CCOO2

Oxaloacetato

Transaminase pir úvica Fosfato de piridoxal

-OOCCH2CH2CCOO -

NH3+ +

CH3CHCOO -

-cetoglutarato

alanina

α

O Tr ansaminase oxaloacét ica OOCCH 2CH2CCOO α-cetoglutarato Fosfato de piridoxal

NH3+ +

-OOCCH CHCOO 2

aspartato

Figura 1 - As reacções de transaminação catalisadas pela GTP e pela GOT.

Entre as várias transaminases que existem, muitas evidenciam uma preferência na utilização de α-cetoglutarato com cetoácido aceitador, originando glutamato, ou viceversa e quase todas usam fosfato de piridoxal como co-enzima. Assim, temos por exemplo (fig. 1) a transaminase pirúvica, ou GPT (glutamato-piruvato transaminase) e a transaminase oxaloacética, ou GOT (glutamato-oxaloacetato transaminase). Ambas são enzimas muito estudados em Bioquímica Clínica, funcionando como indicadores de várias doenças, nomeadamente as de natureza hepática. Bioquímica II

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A) PREPARAÇÃO DE SOLUÇÕES 15. Tampão fosfato 0,1 M pH 7.4 16. Solução de alanina 0,2 M em tampão fosfato 0,1 M pH 7.4 17. Solução de α-cetoglutarato 0,002 M em tampão fosfato 0,1 M pH 7.4 18. HCl 0,1 N 19. NaOH 0,4 N 20. 2,4-dinitrofenilhidrazina 1 mM em HCl 0,1 N 21. Meio de Isolamento - (0,25 M de sacarose e 1 mM de EDTA em HEPES 0,01 M pH 7.4). Dissolver 427,5 g de sacarose, 1,86 g de EDTA (sal dissódico, dihidratado) e 13,0 g de HEPES (sal dissódico) em 4,0 litros de água destilada. Acertar o pH a 7.4 com KOH 0,1 M. Diluir para 5 litros. Guardar a 4 ºC.

B) OBTENÇÃO DA FRACÇÃO CITOSÓLICA 1. Pese 3 g de fígado e corte-o em pequenos pedaços e adicione meio de isolamento gelado (10 ml / 3 g de fígado) 2. Transfira porções desta mistura para um homogeneizador pré-arrefecido. Mantenha o copo do homogeneizador em gelo durante esta operação 3. Coloque a mistura num Erlenmeyer pré-arrefecido e colocado em gelo 4. Transfira o homogeneizado para tubos de centrífuga e centrifugue a 4000 × g durante 10 min. a 4 ºC. O precipitado será a fracção nuclear. Mantenha os tubos em gelo 5. Remova o sobrenadante para outros tubos de centrífuga 6. Centrifugue o sobrenadante a 15 000 × g durante 20 min. a 4 ºC 7. Recolha o sobrenadante

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C) DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE DAS TRANSAMINASES 1. Para cada um de quatro tubos de ensaio (A triplicado e B), pipete 1 ml de solução de alanina 0,2 M e 1 ml de α-cetoglutarato 0,002 M em tampão de fosfato 0,1 M pH 7.4, respectivamente. 2. Adicione aos tubos A 0,5 ml da fracção citosólica obtida na alínea B. 3. Adicione ao tubo B 0,5 ml de água destilada (tubo controlo) 4. Incube os tubos a 37 ºC durante 30 min. 5. Após o período de incubação, adicione a cada tubo 1 ml de solução 1 mM de dinitrofenilhidrazina em HCl 0,1 N. misture e aguarde 20 min. 6. Adicione a cada tubo 10 ml de NaOH 0,4 N. Agitar, deixe repousar durante cerca de 5 min. 7. Leia a absorvência do conteúdo dos tubos A a 540 nm, usando o conteúdo do tubo B como branco.

III. TRATAMENTO DOS R ESULTADOS Usando os valores do Quadro 1, trace a curva que relaciona a absorvência a 540 nm com a actividade enzimática das transaminases. Quadro 1 - Relação entre a absorvência de uma solução a 540 nm e a sua actividade enzimática.

Abs 540 nm

0,025 0,050 0,075 0,100 0,125 0,150 0,175 0,200

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Actividade enzimática

(miliunidades) 2 5 9 12 16 20 24 29

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A partir do valor de absorvência lido para os tubos A, determine, usando a curva traçada no ponto anterior, o valor de actividade enzimática referente às transaminases na fracção citosólica das células de fígado.

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PRODUÇÃO DE PIRUVATO E ACETALDEÍDO

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