Kromatografi adalah teknik pemisahan zat untuk analisis dan preparative dengan melarutkan campuran dalam fase gerak (cairan atau gas), yang mengalir melalui fase diam atau stasioner, zat zat yang hendak dipisahkan harus berinteraksi dengan fase stasioner dengan kuat yang berbeda beda , interaksi ini dapat bersifat adsorbs, partisi, pertukaran ion, dan interaksi lainnya. A. KROM KROMAT ATOG OGRA RAFI FI PENU PENUKA KAR R ION ION
Pertuk Pertukaran aran ion adalah adalah salah salah satu satu metode metode yang yang efektif efektif untuk untuk pemisah pemisahan an secara secara kuanti kuantitat tatif. if. Pemisa Pemisahan hanny nyaa berdasa berdasarka rkan n prinsi prinsip p yang yang sama sama sekali sekali berbed berbedaa dan hanya hanya diterapkan pada senyawa yang berion. Dua seri paralel dari prosedur yang ada, terfokus pada pertukaran anion dan kation. stilah penukar ion secara umum diartikan orang sebagai pertukaran dari ion!ion yang bertanda muatan (listrik) sama, antara suatu larutan dan suatu bahan yang padat serta sangat tak dapat larut, dimana larutan itu bersentuhan. "at padat itu (penukaran ion) harus mengandun mengandung g ion!ion ion!ion miliknya miliknya sendiri. sendiri. Dan agar pertukaran pertukaran dapat berlangsung berlangsung dengan dengan cukup cepat dan ekstensif, zat padat itu harus mempunyai struktur molekuler yang terbuka dan permea permeabel bel,, sehing sehingga ga ion!io ion!ion n dan moleku molekul!m l!molek olekul ul pelaru pelarutt dapat dapat berger bergerak ak keluar keluar masuk dengan bebas. Penukar kation terdiri dari suatu anion polimerik polimerik dan kation!kation kation!kation aktif, sementara suatu penukar anion adalah suatu kation polimerik dengan anion!anion aktif.
#esin #esin penu penuka karr kati kation on sebag sebagai ai suatu suatu poli polime merr berb berbob obot ot molek molekul ul tingg tinggi, i, yang yang terangk terangkai ai silang silang yang yang mengan mengandun dung g gugus!g gugus!gugu uguss sulfon sulfonat, at, karbok karboksila silat, t, fenola fenolat, t, dan sebag sebagain ainy ya sebag sebagai ai suat suatu u bagi bagian an inte integr gral al dari dari resin resin itu itu serta serta se$u se$uml mlah ah kati kation on yang ang
ekuivalen. %uatu resin penukar anion adalah suatu polimer yang mengandung gugus!gugus amino (ammonium kuartener) sebagai bagian!bagian integral dari kisi polimer itu dan se$umlah ekuivalen anion!anion seperti ion klorida, hidroksil atau sulfat. %yarat!syarat dasar bagi suatu resin yang berguna adalah& '. #esin #esin itu itu haru haruss cuku cukup p teran terangk gkai ai silan silang, g, sehi sehing ngga ga kete keterl rlaru aruta tann nnya ya yang ang dapa dapatt diabaikan. . #esi #esin n haru haruss cuku cukup p hidr hidrof ofil ilik ik untu untuk k memu memung ngki kink nkan an difu difusi si ion! ion!io ion n mela melalu luii strukturnya dengan la$u yang terukur dan berguna. . #esin #esin harus menggun menggunakan akan cukup cukup banyak banyak gugus gugus penukar penukar ion yang dapat dicapai dicapai,, dan harus stabil dalam hal kimiawinya. *. #esin yang yang sedang sedang mengemban mengembang, g, harus lebih lebih besar besar rapatanny rapatannyaa daripada daripada air.
I. Aksi dari Resin Penukar Ion
#esin penukar kation mengandung kation + kation bebas yang dapat ditukar dengan kation + kation dalam larutan (lar). (#es. )- / (larutan) 0 (#es. )/ - (larutan) 1ika kondisi + kondisi kondisi eksperimen eksperimen adalah sedemikian, sedemikian, sehingga kesetimbangan kesetimbangan telah sama sekali tergeser dari kiri ke kanan, ion / telah lengkap difiksasi (dilekatkan tetap) pada penukaran kation. %atu contoh khas adalah penukaran penukaran ion natrium natrium pada suatu resin sufonat oleh ion kalsium& (#es.%2!)3a /a (lar.)
(#es. %2!)/a 3a (lar.)
#eaksi ini reversibel, dengan mengalirkan suatu larutan yang mengandung ion! ion natrium melalui produk itu, ion!ion kalsium dapat dikeluarkan lagi dari resin, dan bentuk natrium yang semula, teregenerasi (pulih seperti keadaan semula). %ama halnya dengan mengalirkan suatu larutan garam netral melalui bentuk hidrogen suatu resin sulfon sulfonat, at, dihasil dihasilkan kan se$umla se$umlah h asam padana padananny nnyaa yang yang ekuiva ekuivalen len oleh oleh reaksi reaksi khas khas berikut& (#es.%2!)4 3a/l! (lar.)
(#es.%2!)3a 4/l! (lar.)
5kuran resin penukar kation yang asam kuat, seperti resin polistirena sulfonat yang terangkai silang kapasitas tukar boleh dikatakan tak bergantung pada p4 larutan. 5ntuk 5ntuk penuka penukarr kation kation asam lemah, lemah, seperti seperti yang yang mengan mengandun dung g gugus gugus karbok karboksila silat, t, ionisasi timbul samapi tingkat yang berarti hanya dalam larutan basa, yaitu dalam
bentuk garam!garam mereka, maka resin karboksilat hanya mempunyai sangat sedikit aksi dalam larutan dibawah p4 6. Penukaran!penukaran ion karboksilat ini dalam bentuk hidrogennya, akan menyerap basa kuat dari larutan& (#es./22 !)4 3a24! (lar.)
(#es./22 !)3a 42
7etapi hanya memiliki sedikit aksi terhadap, misalnya 3a/l, ter$adi hidrolisis pada bentuk garam dari resin itu sehingga basa tersebut mungkin tak dapat lengkap diserap, bahkan sekalipun terdapat resin dengan berlebihan. #esin penukar kation yang basa kuat, yaitu polistirena terangkai silang yang mengandung gugus ammonium kuartener, sebagian besar akan terionisasi, baik yang dalam bentuk hidroksida maupun yang dalam bentuk garamnya. -eberapa reaksi khas mereka, dapat dinyatakan sebagai& (#es.38e)/l! %2*! (lar.) (#es.38e)/l! 24! (lar.) ! (#es.38e)24! 4 /l (lar.)
(#es.38e)%2*! /l! (lar.) ! (#es.38e)24! /l (lar.) (#es.38e)/l! 42
ktivitas resin!resin ini serupa dengan resin penukar kation sulfonat, dan aksinya sangat tak bergantung pada p4. #esin penukar ion yang basa lemah, hanya mengandung sedikit bentuk hidroksida dalam larutan basa. %ebagai contoh, kesetimbangan dari& (#es.38e ) 42
(#es.34 8e)24!
7erutama adalah ke sebelah kiri, dan resin ini sebagian besar berada dalam bentuk amina. ni dapat $uga dinyatakan dengan kata!kata bahwa dalam larutan basa, basa bebas #es.348e24 sangat sedikit terionisasi. 3amun, dalam larutan yang asam, mereka berperilaku sebagai resin penukar ion basa kuat, yang menghasilkan bentuk garam yang sangat terionisasi& (#es.38e) 4/l! (lar.)
(#es.348e)/l!
8ereka dapat digunakan dalam larutan asam untuk pertukaran anion, sebagai contoh& (#es.348e)/l! 32! (lar.)
(#es.34 8e) 32! /l! (lar.)
#esin yang bersifat basa, dalam bentuk garamnya, mudah diregenerasikan dengan alkali. Keseimbangan pertukaran ion
Proses pertukaran ion yang melibatkan penggantian ion!ion # yang tertukarkan dalam resin, dengan ion!ion yang bermuatan sama - % dari suatu larutan, boleh ditulis& ,#
-%
-# ,%
Proses ini reversibel. %e$auh mana satu ion lebih dipilih untuk diserap, dibandingkan ion lain, memiliki arti penting yang mendasar, yaitu menentukan seberapa mudahnya dua atau lebih zat yang menghasilkan ion!ion dengan muatan serupa dapat dipisahkan dengan cara pertukaran ion dan $uga menentukan seberapa mudahnya ion!ion tersebut dapat selan$utnya dikeluarkan dari resin. 9aktor!faktor yang menetapkan distribusi ion!ion antara suatu larutan, meliputi& '. %ifat ion!ion yang saling bertukaran a.
Pada konsentrasi!konsentrasi rendah dalam larutan air, dan pada suhu biasa, tingkat pertukaran bertambah dengan bertambahnya valensi ion yang bertukar itu, yaitu& 3a:/a:l:7h*.
b.
Pada kondisi yang serupa dan valensi yang konstan, untuk ion!ion univalen (bervalensi ') tingkat pertukaran bertambah dengan berkurangnya ukuran kation terhidrasi& , sementara untuk ion divalen ukuran ion merupakan faktor yang penting, tetapi ketidak lengkapan disosiasi garam!garam logam bivalen (bervalensi ) $ugamemainkanperanan
/d:-e:8n:8g;"n:/u
;3i :/o:/a:%r :Pb:-a. c. Dengan resin penukar anion basa kuat, tingkat pertukaran bagi anion!anion univalent, berbeda!beda menurut ukuran ion terhidrasinya dengan cara yang sama seperti untuk kation. Dalam larutan encer, anion polivalen umumnya lebih dipilih untuk diserap. d. -ila sebuah kation dalam larutan sedang bertukar dengan sebuah ion yang berbeda valensinya, afinitasnya relatif dari ion yang bervalensi lebih tinggi (terhadap resin) bertambah dengan perbandingan lurus dengan bertambahnya keenceran. 1adi, untuk menukar suatu ion bervalensi lebih tinggi yang berada pada suatu penukar ion, dengan suatu ion bervalensi lebih rendah dalam larutan, pertukaran akan lebih baik dengan menaikkan konsentrasi, sedangkan $ika ion bervalensi lebih rendah berada pada penukar ion, dan ion bervalensi lebih tinggi berada dalam larutan, pertukaran akan lebih baik dengan keenceran yang lebih tinggi. . %ifat resin penukar ion
bsorpsi ion!ion akan bergantung pada sifat gugus fungsional dalam resin. Dan $uga bergantung pada dera$at rangkaian silang dengan naiknya dera$at rangkaian silang resin men$adi lebih selektif terhadap ion!ion yang berbeda!beda ukurannya (volume ion dianggap meliputi air hidrasi), dimana ion dengan volume terhidrasi yang lebih kecil, biasanya akan lebih dipilih untuk diserap. Kapasitas pertukaran-ion
Kapasitas pertukaran ion total dari suatu resin bergantung pada $umlah total gugus ugus aktif!ion per satuan bobot bahan itu dan semakin banyak $umlah ion!ion itu, smeakin besarlah kapasitasnya. Kapasitas penukar!ion yang asam lemah dan yang basa lemah, merupakan fungsi dari p4, dimana yang asam lemah mencapai nilai!nilai agak konstan pada p4 di atas sekitar <, sedangkan yang basa lemah pada p4 di bawah sekitar =. II. Prinsip Kromatografi Pertukaran Ion
Kromatografi penukar ion merupakan kromatografi yang berdasarkan penukaran ion!ion secara e>uivalen antara larutan dan gugusan fungsional resin yang mengandung ion!ion yang dapat ditukar (Pud$aatmaka, ??).
1ika suatu campuran dan dua atau lebih dari kation yang berbeda , -, dan sebagainya dialirkan melalui sebuah kolom penukar ion, dan $ika kuantitas!kuantitas ion!ion ini lebih kecil dibanding kapasitas total kolom untuk ion, maka mungkin untuk memperoleh kembali ion!ion terserap itu, sendiri!sendiri dan berturut!turut dengan
menggunakan larutan regenerasi atau elusi yang sesuai. 1ika kation ditahan lebih kuat oleh resin penukar dibandingkan kation -, semua - yang terdapat akan mengalir keluar dari dasar kolom sebelum satupun dibebaskan, asalkan kolom cukup pan$ang dan faktor!faktor eksperimen lainnya menguntungkan bagi pemisahan khusus itu. 7eknik pemisahan ini disebut kromatografi pertukaran ion. 1ika suatu larutan berupa eluan yang sesuai, dialirkan melalui sebuah kolom yang dimuati oleh suatu ion , $alannya reaksi dapat diikuti dengan menganalisis larutan efluen dengan kontinu. 1ika konsentrasi dalam porsi!porsi eluat yang berturutan, dialirkan terhadap volume eluat, akan diperoleh sebuah kurva elusi seperti diperlihatkan pada gambar&
3ampak, bahwa praktis semua terkandung dalam volume cairan tertentu dan $uga bahwa konsentrasi melalui suatu batas maksimum. 1ika kolom pertukaran ion memuat berbagai ion -, / dan sebagainya yang bermuatan serupa, kurva!kurva elusi dapat diperoleh untuk masing!masing ion dengan menggunakan eluan!eluan yang sesuai. 1ika kurva!kurva elusi ini cukup $auh terpisah seperti gambar dibawah, suatu pemisahan kuantitatif dimungkinkan $ika kurva elusi itu saling tindih, hanya akan diperoleh pemisahan yang tak lengkap. dealnya, kurva harus mendekati distribusi @auss (distribusi normal). Penyimpangan yang terlalu besar dari distribusi ini, mungkin menun$ukkan teknik!teknik yang salah dan atau kondisi!kondisi operasi yang salah.
III. Pertukaran-Ion a!am Pe!arut-pe!arut Organik dan Air Organik
Penelitian!penelitian dalam sistem!sistem air telah menetapkan banyak prinsip! prinsip dasar dari pertukaran ion, serta menghasilkan penetapan yang berguna. 3amun, lingkup dari proses pertukaran ion telah diperluas selama sekitar dekade terakhir ini dengan menggunakan baik sistem pelarut organik, maupun sistem campuran pelarut air!organik. Pelarut organik yang umum digunakan adalah senyawa!senyawa okso dari tipe alkohol, keton, dan karboksilat, yang umunya mempunyai tetapan dielektrik di bawah *?. 8aka kation!kation, dan anion!anion tentunya akan berpasangan lebih kuat dalam sistem!sistem pelarut demikian dibandingkan dalam air, dan faktor ini sendiri sa$a dapat diharapkan akan mengubah selektivitas untuk resin. %elain mempengaruhi gaya! gaya yang murni elektrostatik ini, adanya pelarut!pelarut organik dapat meningkatkan kecenderungan suatu kation untuk membentuk kompleks dengan ligan lainnya, $adi memodifikasi perilaku pertukaran ionnya. Dalam pelarut campuran air!organik, besarnya efek!efek demikian $elas bergantung pada proporsi pelarut organik yang ada. %eperti telah ditun$ukkan, resin!resin penukar ion merupakan sistem!sistem osmotik yang mengembang karena pelarut tertarik ke dalam resin. Dimana sistem pelarut campuran digunakan, ter$adi kemungkinan osmosis preferensial (osmosis yang lebih dipilih), dan telah diperlihatkan bahwa fase resin!resin kation yang sangat asam dan fase resin anion yang sangat basa, cenderung untuk secara dominan menyerap air ke dalam struktur resin, sedangkan larutan yang mengambang di antara resin!resin, secara dominan adalah pelarut organik. Afek ini (sorpsi air yang lebih dipilih (preferensial) oleh resin) meningkat dengan menurunnya tetapan dielektrik dari pelarut organik itu.
%uatu akibat yang menarik dari sorpsi selektif ini adalah bahwa kondisi!kondisi untuk kromatografi ( partition chromatography) muncul, yang dapat memperbaiki faktor!faktor pemisahan pertukaran ion yang normal. spek ini telah dimanfaatkan oleh Korkisch untuk pemisahan ion!ion anorganik dengan apa yang disebut B8etode Kombinasi Pertukaran on!Akstraksi pelarutB (/%A ; Combined Ion Exchange-Solvent Extraction).
IV. Resin-resin Penukar-Ion Pem"entuk #epit
%uatu sifat penting dari penukar ion penyempit adalah selektivitas mereka yang lebih besar dibandingkan penukar!ion $enis konvensional. finitas suatu ion logam tertentu terhadap suatu resin!penyempit tertentu, bergantung terutama pada sifat gugus penyepit. Dan perilaku selektif dari resin, terutama didasarkan atas perbedaan! perbedaan dalam kestabilan komplek!komplek logam yang berbentuk pada resin itu pada berbagai kondisi p4. Proses pertukaran ion dalam suatu resin!penyepit biasanya lebih lambat ketimbang dalam penukar $enis biasa, dimana la$u nampaknya dikendalikan oleh mekanisme difusi partikel. 8enurut @regor et al ., sifat!sifat berikut diperlukan untuk suatu zat penyepit, yang akan dimasukkan sebagai gugus fungsional ke dalam suatu resin penukar!ion. '. zat penyepit itu harus, sendirian, atau bersama!sama sebuah zat perangkai!silang, menghasilkan ke dalam suatu gel resin yang cukup stabilC atau ia sanggup dimasukkan ke dalam suatu matriks polimer. . gugus penyepit itu harus memiliki kestabilan kimia yang cukup, sehingga selama sintesis (pembentukan) resin itu, struktur fungsionalnya tak berubah oleh polimerisasi atau reaksi apapun. . struktur ruang (sterik) dari gugus penyepit itu harus kompak, sehingga pembentukan cincin sepit dengan kation, tak akan terintangi oleh matriks resin. *. tata letak gugus!gugus ligan yang spesifik itu harus tetap terpelihara di dalam resin. ni terutama perlu karena zat!zat penyepit yang membentuk komplek yang stabil, biasanya paling sedikit tridentat
Pertimbangan!pertimbangan ini menun$ukkan bahwa banyak zat penyepit tak dapat dimasukkan ke dalam suatu resin, tanpa kehilangan kemampuan!kemampun mereka untuk membentuk kompleks yang selektif. -ahan permulaan untuk sintesis resin penyepit ini adalah stirena!divinilbenzena terklorometilasi yang mengalami reaksi aminasi dan laku diolah dengan asam mono! klorasetat. V. Penukar-Ion $airan
Proses penukaran ion yang melibatkan resin penukar, ter$adi antara fase padat dengan fase cair, sementara dalam hal penukar ion cairan, proses berlangsung antara larutan yang tidak saling tercampurkan. Penukar ion cairan terdiri dari asam dan basa yang berbobot molekul tinggi, yang memiliki kelarutan yang rendah dalam air, tetapi kelarutan yang tinggi dalam pelarut!pelarut yang tidak tercampurkan dengan air. -egitulah, larutan suatu basa yang tidak larut dalam air, dalam pelarut yang tidak tercampurkan dalam air, dapat digunakan sebagai penukar anion. %ama halnya dengan asam yang tidak terlarutkan dalam air, dapat bertindak sebagai penukar kation untuk ion!ion dalam larutan air. Penukar anion yang sekarang tersedia sebagian besar berdasarkan amino alifatik primer, sekunder dan tersier, misalnya penukar ion mberlite .' E3!dodesenil (trialkilmetil)aminaF
dan mberlite . E3!lauril
(trialkilmetil)aminaF, yang
keduanya adalah amin sekunder. /airan penukar anion paling baik digunakan sebagai larutan dan pelarut organik inert seperti benzena, toluena, petroleum eter, sikloheksena, dan sebagainya. Ker$a penukar ion cairan melibatkan perpindahan selektif suatu zat terlarut antara suatu fase air dan suatu fase organik yang tak tercampurkan yang mengandung penukar cairan. -egitulah amina yang berbobot molekul tinggi, dalam larutan asam menghasilkan kation!kation yang mampu membentuk spesi!spesi dengan berbagai anion, yang dapat diekstraksi. 7eknik yang digunakan untuk pemisahan dengan penukar ion cairan identik dengan teknik yang digunakan dalam pemisahan dengan ekstraksi pelarut, $adi penukar!penukar ini memberi banyak sifat!sifat yang menguntungkan baik dari pertukaran ion maupun ekstraksi pelarut. 3amun, ada kesulitan dan kekurangan berkaitan dengan penggunaan mereka, dan ini penting diperhatikan agar dapat menggunakan penukar ion cairan secara efektif.
%.
AP&IKA#I KROMATOGRAFI PENUKAR ION
Kromatografi penukar ion (atau kromatografi ion) adalah sebuah proses yang memberikan pemisahan ion!ion dan molekul polar berdasarkan their charge. Kromatografi ini dapat digunakan untuk hampir semua $enis of charge molecule termasuk protein besar, nukleotida kecil, dan asam amino. arutan yang dimasukkan biasa disebut sampel, dan pemisahan
komponen!komponen secara sendiri!sendiri disebut analit. Kromatografi
penukar ion sering
digunakan dalam pemurnian protein, analisis air, dan kontrol
kualitas. Protein merupakan makromolekul yang tersusun dari building blok asam!asam amino.Dalam setiap molekul dari setiap $enis protein tertentu mempunyai komposisi dan deret asamamino, serta pan$ang rantai polipeptida yang tidak sama. %alah satu tahap yang banyak digunakan untuk pemurnian protein adalah pengendapan protein. Pengendapan ini dapat dilakukan dengan mengubah kekuatan ionic, p4, pnambahan pelarut organik, polimer dan penambahan garam. @aram + garam yang efektif digunakan pada proses pengendapan protein adalah garam yang multi anonik seperti sulfat, fosfat, dansitrat (%copes,'<<*). Pemurnian Protein
Kromatografi pertukaran ion memisahkan protein berdasarkan pada muatan bersih protein dan pada kekuatan relatif dari muatan bersih protein tersebut. Kromatografi pertukaran ion memerlukan fase diam yang biasanya merupakan polimer terhidratasi yang bersifat tidak larut seperti selulosa, dekstran dan agarosa. @ugus penukar ion diimobilisasikan pada matrik. -eberapa gugus penukar anion yaitu aminoetil (A!) kuaternari aminoetil (GA!) dan dietilaminoetil (DAA!), sedangkan gugus penukar kation yaitu sulfopropil (%P!), metil sulfonat dan karboksimetil (/8!). Penukar ion lemah hanya dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang p4 sempit dan kehilangan muatannya pada p4 tertentu, sedangkan penukar ion kuat dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang p4 yang luas. 8isalnya gugus penukar anion lemah DAA! terionisasi sempurna dibawah p4 H.? dan akan kehilangan muatannya pada p4 <.?. @ugus penukar kation lemah /8! akan kehilangan muatannya dibawah p4 *.=. @ugus penukar ion kuat G (penukar anion kuat) dan %P! (penukar kation kuat) dapat mempertahankan kondisi terionisasi pada rentang p4 ' + '?.
Dasar dari kromatografi pertukaran ion adalah ion bermuatan dapat dengan bebas dipertukarkan dengan ion yang memiliki tipe muatan yang sama. Protein yang memiliki muatan negatif dapat dipertukarkan dengan ion klorida. 8ula!mula gugus fungsional matrik yang bermuatan negatif mengikat ion dari bufer (misalnya 3a). Pada saat sampel dimasukkan ke dalam kolom, maka protein yang bermuatan positif akan menggantikan ion 3a sedangkan protein yang bermuatan negatif atau netral tidak akan terikat. Protein yang tidak terikat dibilas dengan menggunakan buffer (biasanya dengan konsentrasi '?!=? m8). Proses selan$utnya adalah melepaskan ikatan protein yang terikat gugus fungsional matrik dengan cara membilas kolom menggunakan bufer yang mengandung 3a/l atau K/l. Pembilasan dilakukan dengan meningkatkan konsentrasi 3a/l atau K/l secara linier atau bertahap sehingga protein yang memiliki ikatan lemah dengan matrik akan lepas terlebih dahulu dan diikuti oleh protein yang memiliki ikatan lebih kuat.
Pemurnian protein dengan kromatrografi pertukaran ion Pemilihan penukar ion tergantung pada muatan protein target. 8uatan bersih protein tergantung pada p4 (protein semakin bermuatan positif dengan menurunkan p4 dan semakin negatif dengan menaikkan p4). Pada saat menentukan p4 untuk kromatografi, maka harus diperhatikan stabilitas protein target pada p4 yang dipilih. pabila protein stabil pada p4 diatas titik isoelektriknya (p) maka digunakan penukar anion (positif), tetapi bila protein stabil pada p4 dibawah p nya maka digunakan penukar kation (negatif). 1ika protein stabil pada rentang ' unit diatas dan dibawah p maka kedua penukar ion dapat digunakan.
8atrik yang mengikat gugus fungsional menentukan sifat aliran, ion yang dapat diikat, stabilitas mekanik dan kimia. da kelompok matrik yang biasanya digunakan, yaitu & '. polistiren, poliakrilik atau polifenolC . selulosaC dan . Dekstran (%ephadeI) atau agarosa (sepharose). 8atrik polistiren dan polifenolik lebih sering digunakan untuk memisahkan molekul!molekul kecil seperti asam!asam amino, peptida kecil, nukleotida, nukleotida siklik, asam!asam organik. 8atrik selulosa biasanya digunakan untuk memisahkan protein (termasuk enzim), polisakarida dan asam nukleat. DAA!selulosa, /8!selulosa dan fosfoselulosa paling sering digunakan. 8atrik polidekstran dan agarosa (misalnya DAA!%ephadeI, /8%ephadeI) digunakan untuk memisahkan protein, hormon, t#3 dan polisakarida. Pada pemurnian Iilanase, matrik selulosa biasanya tidak digunakan karena beberapa Iilanase tertentu memiliki cellulose binding domain (%ubramaniyan J Prema ??) yang akan berinteraksi pada proses elusi normal. Pemilihan penukar ion kuat atau lemah tergantung pada p4 molekul target. 8olekul yang memerlukan p4 sangat rendah atau sangat tinggi untuk dapat erionisasi atau apabila molekul stabil pada p4 ekstrim maka penukar ion kuat harus digunakan. Penukar ion lemah akan memberikan hasil pemisahan yang lebih baik untuk protein!protein yang memiliki muatan bersih yang berdekatan. Keuntungan kromatografi penukar ion diantaranya adalah tidak merusak protein yang dimurnikan dan pada umumnya memiliki kapasitas pengikatan yang tinggi. Kelemahannya adalah protein!protein yang memiliki distribusi gugus bermuatan pada permukaannya atau memiliki p yang sama atau mirip akan sulit dipisahkan dengan cara kromatografi penukar ion. %elain itu larutan enzim hasil kromatografi penukar ion mengandung kadar garam cukup tinggi yang harus dihilangkan untuk proses pemurnian selan$utnya.
Proses penukar ion dapat dipisahkan men$adi * langkah yaitu& 1.
A>uilibrasi
.
plikasi sampel
3.
Alusi
4.
#egenerasi
1.
E'ui!i"rasi
7ahap adalah kesetimbangan terhadap fase stasioner atau fase diam untuk membuat kondisi awal yang diinginkan. Ketika ter$adi kesetimbangan, semua bagian dari gugus muatan pada fase stasioner berikatan dengan counter ion penukar, misalnya on Klorida (/l!) atau %odium (3a). (.
Ap!ikasi #ampe!
7ahap adalah aplikasi sampel dan pencucian. 7u$uan pada tahap ini adalah untuk mengikatkan molekul yang men$adi target dan mencuci semua material yang tidak terikat dengan sampel buffer yang mempunyai p4 dan kekuatan ionik sama, seperti buffer awal agar supaya semua muatan protein berikatan dengan tepat. 3.
E!usi
Dalam tahap ketiga ini adalah elusi, biomolekul dilepaskan dari penukar ion dengan mengubah komposisi buffer, yang umum digunakan adalah peningkatan ionik dengan 3a/l atau gram sederhana lainnya agar supaya ter$adi penurunan ikatan protein.
Deabsorbsi
protein
relatif
terhadap
$umlah
gugus
bermuatan
pada
permukaanya. 4.
Regenerasi
7ahap akhir adalah regenerasi, membuang semua molekul yang masih berikatan, ini untuk memastikan bahwa kapasitas penuh dari fase stasioner untuk dapat digunakan selan$utnya.
Enzim
Anzim adalah protein globular yang umumnya berfungsi sebagai biokatalis pada semua proses kimia dalam makhluk hidup, sehingga disebut life is enzyme. Anzim mampu meningkatkan reaksi kimia tetapi tidak diubah oleh reaksi yang dikatalisnya serta tdak megubah kedudukan normal dari kesetimbangan kimia. Anzim mempunyai daya katalisisspesifik yang lebih besar dari katalisator lainnya. Anzim memegang peranan penting dalam berbagai reaksi di dalam sel. %ebagai protein, enzim diproduksi dan digunakan oleh sel hidup untuk mengkatalisis reaksi antara lain konversi energi dan metabolism pertahanan sel. 5ntuk dapat memahami bagaimana aplikasi kromatografi penukar ion dalam pemurnian protein, maka kami mengambil satu dari sekian banyak penelitian!penelitian yang telah dilakukan mengenai isolasi dan pemurnian protein yaitu salah satunya enzim Iilanase.
plikasi kromatografi penukar ion dalam pemurnian protein ini $uga dapat
dikembangkan dalam bidang industri.
Ap!ikasi Kromatografi Penukar Ion a!am Iso!asi dan Karakterisasi )i!anase dari Bacillus circulans
A. PENA*U&UAN
Perkembangan teknologi industri terus mengalami kema$uan terutama teknologi yang berwawasan lingkungan. %aat ini telah dikembangkan proses bioteknologi dalam industri pulp dan kertas. %alah satu upaya yang sedang dikembangkan adalah penggunaan enzim pada beberapa proses pembuatan pulp dan kertas seperti pada pemasakan (cooking ), reduksi pitch, pemutihan (bleaching ) dan deinking. Pemakaian enzim memiliki banyak keunggulan seperti menghemat energi, mengurangi kebutuhan bahan kimia dan meningkatkan kekuatan pulp dan kertas. %alah satu enzim yang banyak dimanfaatkan dalam industri pulp dan kertas adalah Iilanase. ilanase bisa digunakan untuk menghidrolisis Iilan (hemiselulosa) men$adi gula Iilosa. ilan banyak diperoleh dari limbah pertanian dan industri makanan. Pengembangan proses hidrolisis secara enzimatis merupakan prospek baru untuk penanganan limbah hemiselulosa. Penggunaan enzim Iilanase diharapkan dapat mereduksi penggunaan bahan kimia klorin yang bersifat berbahaya pada bagi lingkungan sehingga dengan menggunakan enzim Iilanase, proses pemutihan men$adi lebih ramah lingkungan. Proses pemutihan adalah proses yang memisahkan serat kertas dari lignin (penyebab kertas berwarna kusam) ,yang selama ini memakai pemutih kimia. ilanase digunakan untuk meningkatkan ekstraksi lignin dan melepaskan kromofor dari pulp dalam tahapan awal pemutihan pulp. 7u$uan utama dari proses pemutihan adalah untuk meningkatkan dera$at putih pulp, sehingga pulp tersebut sesuai untuk dibuat kertas dengan $enis tertentu. Proses pemutihan pulp tidak hanya membuat pulp men$adi lebih putih atau cerah, tetapi $uga membuatnya stabil sehingga tidak menguning atau kehilangan kekuatan dan dera$at putih selama penyimpanan. ilanase yang dibutuhkan dalam proses prapemutihan pulp diharapkan memiliki beberapa karakteristik spesifik seperti tahan suhu tinggi (H?!6? o/), tahan p4 alkali, berupa endoIilanase dan bebas dari aktivitas selulase. ilanase dapat diproduksi oleh beberapa organisme seperti bakteri, alga, $amur, aktinomisetes, ragi, protozoa, gastropoda dan artropoda. -eberapa $enis bakteri dan $amur diketahui mampu menghasilkan Iilanase ekstraseluler yang dapat menghidrolisis hemiselulosa men$adi Iilosa. %elain itu beberapa mikroorganisme yang terdapat pada ruminansia diketahui berpotensial sebagai penghasil Iilanase karena hewan ruminansia tersebut mengkonsumsi hemiselulosa dalam $umlah besar.
@enus Bacillus diketahui sebagai penghasil Iilanase yang aktif pada suhu =? L/ + H? L/, dengan p4 6 ! <, sehingga enzim dari bakteri ini diharapkan dapat diproduksi dan digunakan pada proses awal pemutihan pulp di industri pulp dan kertas. 4asil penelitian terdahulu menun$ukkan Bacillus circulans diketahui mampu menghasilkan Iilanase dengan aktivitas selulase terendah. -erdasarkan hal tersebut, maka perlu dilakukan penelitian mengenai isolasi dan karakterisasi Iilanase dari Bacillus circulans. Diharapkan dengan penelitian ini dapat mengatasi permasalahan ketersediaan enzim yang spesifik dan kendala yang dihadapi dalam aplikasinya di industri pulp dan kertas. Pengembangan produksi dalam skala komersial diharapkan dapat menciptakan kewirausahaan baru dan $uga mendukung perkembangan industri pulp dan kertas yang berwawasan lingkungan. %. %A*AN dan METOA %a+an dan A!at
Peralatan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary shaker , kantung dialisis berbahan dasar selulosa (%@8 /4A8/) dengan ukuran pori yang dapat memisahkan protein minimal ' kDa., refrigerated centrifuge, pengaduk magnetik, kolom kromatografi, avometer, spektrofotometer, waterbath, elektroforesis 8ini Protean I. -akteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah B. circulans yang berasal dari laboratorium 8ikrobiologi, %ekolah lmu dan 7eknologi 4ayati, 7-, -andung. -ahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ammonium sulfat, 3a4/2 , 3a/2, matriks DAA!7oyopearl H=? 8 (7osoh /orp, 7okyo, 1epang), 3a/l, Iilosa, K 9e/3H, Bovine serum albumin (-%, 9raksi M, 8erck), ris base, glisin, 3a24, poliakriamida, gliserol, bromofenol biru, Congo !ed , asam asetat. 8edium Iilan terdiri dari pepton ?,=N, ekstrak ragi ?,=N, K 4P2* ?,'N, 8g%2 *.642 ?,?N, Iilan oat spelt ?,=N (%igma /hemical), p4 medium diatur '?,= dengan 3a /2 'N. Metoda ,. Iso!asi )i!anase
5ntuk mengetahui waktu bakteri menghasilkan Iilanase dan umur inokulum kultur yang digunakan maka dilakukan pembuatan kurva tumbuh dan kurva aktivitas Iilanase dari B. circulans. solat ditumbuhkan pada medium Iilan kemudian diinkubasi selama O? $am. 5ntuk mengetahui pola pertumbuhan dan aktivitas Iilanase, diambil sampel se$umlah m setiap dua $am sekali sampai dengan $am ke!*, kemudian setiap enam $am sekali
sampai $am ke!H?, dan ' $am sekali sampai kultur berumur O? $am. %eluruh sampel yang diperoleh dihitung $umlah koloninya dan aktivitas Iilanasenya. -erdasarkan kurva pertumbuhan dan kurva aktivitas Iilanase yang telah dibuat, dilakukan produksi Iilanase. Kultur B. circulans diinokulasikan ke dalam medium Iilan kemudian diinkubasi pada suhu 6/ dengan pengadukan ?? rpm selama 'O $am. nokulum yang digunakan adalah '?N (vQv). Akstrak kasar enzim diperoleh dengan mensentrifugasi kultur bakteri dengan kecepatan O.??? rpmselama '? menit pada suhu * o/. (. Pemurnian Parsia! )i!anase
%eluruh tahapan pemurnian dilakukan pada suhu * o/ dengan diagram alir seperti dibawah ini&
a. Fraksinasi Bertingkat dan Dialisis
Akstrak kasar enzim Iilanase dari hasil isolasi difraksinasi bertingkat dengan menggunakan garam ammonium sulfat ((34 *)%2*) sehingga diperoleh persen saturasi ?! ?, ?!*?, *?!H?, H?!O?, dan O?!'??. arutan kemudian diaduk dan disentrifugasi dengan kecepatan '.??? rpm selama = menit. Andapan yang diperoleh dilarutkan dalam buffer 3a4/2!3a/2 = m8 p4 <,. 4asil fraksinasi kemudian didialisis dalam *,O buffer 3a4/2!3a/2 selama * $am.
b. Kromatografi Penukar Ion
9iltrat hasil dialisis kemudian dimurnikan lebih lan$ut dengan kromatografi kolom. Kromatografi dilakukan dengan menggunakan bahan pendukung DAA!7oyopearl H=? 8 yang telah disetimbangkan dengan buffer 3a4/2 !3a/2. 9iltrat hasil dialisis kemudian dialirkan ke dalam kolom dan dielusi secara bertahap dengan menggunakan larutan 3a/l (?!*=? m8) dalam buffer 3a4/2 !3a/2 sehingga diperoleh fraksi!fraksi. %etiap fraksi yang diperoleh diu$i aktivitas Iilanase dan kadar proteinnya. 5$i aktivitas Iilanase dan pengukuran protein dilakukan menggunakan metode sebagai berikut& . Ui Akti/itas )i!anase
ktivitas Iilanase diu$i dengan mengukur $umlah gula pereduksi dari substrat Iilan dengan menggunakan metode 9erisianida lkali (Ralker dan 4armon, '<
Kadar protein diukur dengan menggunakan metoda -radford ('<6H) dengan menggunakan bovine serum albumin (-%,9raksi MC 8erck) sebagai standar. 5.
Karakterisasi )i!anase
a. Penentuan pH dan Suu !ptimum
Penentuan p4 optimum dilakukan dengan mengu$i aktivitas Iilanase pada rentang p4 O+'? dengan rentang p4 ?,=. 5ntuk penentuan p4 optimum Iilanase digunakan dua $enis buffer yaitu buffer 7ris!/l untuk p4 O, dan buffer @lisin!3a24 untuk p4 O,=!'?. Penyesuaian p4 enzim dilakukan dengan cara mengencerkan enzim se$umlah '?!'??I pada berbagai p4 sehingga konsentrasi akhir buffer pada reaksi '?? m8. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan mengu$i aktivitas enzim Iilanase pada rentang suhu ?!
b. "nalisis #imogram
%ampel enzim dielektroforesis dengan native gel poliakrilamida '? N selama *!= $am dengan kondisi dingin (*!O o/). 8ula!mula enzim dicampur dengan sampel buffer =I yang mengandung 7ris!/l ',= m8 p4 H,O, gliserol =?N (vQv) dan -romofenol biru ?,?=N. %ampel se$umlah '?!H S dimasukkan ke dalam sumur kemudian dielektroforesis dengan arus sebesar * m pada double strength running buffer (p4 <). @el dielektroforesis pada 8ini Protean iI (-io #ad) dengan tanki elektroforesis vertikal. @el kemudian direndam di dalam buffer @lisin!3a24 '?? m8 p4 O,= dengan substrat Iilan ?,'N pada suhu =? o/ selama ?!? menit. @el kemudian diwarnai menggunakan Congo !ed ?,'N selama '= menit pada suhu ruangan. @el tersebut kemudian dibilas dengan menggunakan larutan 3a/l ' 8 sampai kelebihan warna pada pita hilang. @el lalu dibilas kembali menggunakan asam asetat ?,=N sehingga akan diperoleh zona bening yang menun$ukkan adanya aktivitas enzim Iilanase dengan latar belakang biru gelap. $. PEM%A*A#AN ,. Iso!asi %. 1ir1u!ans
4asil skrining menun$ukkan bahwa isolate -. circulans dapat menghasilkan Iilanase dengan memiliki aktivitas selusase rendah yaitu ?. 5Qm yang lebih rendah $ika dibandingkan dengan isolate -acillus lainnya sehingga sesuai digunakan untuk industry pulp dan kertas. Kondisi fermentasi yang digunakan untuk menghasilkan ilanase adalah suhu 6 o /, p4 medium '?.= dengan pengadukan ?? rpm selama 'O $am dengan $umlah inokulum bakteri yang digunakan adalah '?N (vQv). kurva aktivitas Iilanase yang tertinggi diperoleh pada $am ke 'O dan $am ke H (?.6O 5Qm enzim). -erdasarkan kurva tersebut, maka waktu bakteri yang digunakan untuk percobaan selan$utnya adalah 'O $am karena pada waktu tersebut Iilanase mempunyai aktivitas tertinggi dan memiliki waktu fermentasi yang singkat. Akstrak kasar enzim yang diperoleh dan fermentasi dengan menggunakan '?? m medium adalah '?? m berarti Iilanase yang dihasilkan pada kondisi tersebut dapat mencapai rendemen '??N.
(. Pemurnian parsia! 2i!anase
Pemurnian dilakukan secara parsial karena pada penelitian ini tidak bisa didapat enzim yang benar murni. 7ingkat kemurnian suatu enzim diketahui dari aktifitas enzim tersebut dan berdasarkan kelipatan pemurnian enzim yang diperoleh. /ara mengetahui aktifitas enzim dengan membagi aktifitas enzim hasil pemurnian dengan aktifitas enzim awal ekstrak kasar enzim. Akstrak kasar Iilanase difraksinasi bertingkat sehingga didapat = fraksi. Dengan adanya garam ammonium sulfat pada konsentrasi tertentu berpengaruh terhadap kelarutan suatu protein. 1ika konsentrasi garam tinggi maka kelarutan protein akan menurun sehingga protein akan menurun sehingga protein dapat mengendap dengan sempurna, tetapi $ika konsentrasi garam rendah maka akan ter$adi sebaliknya. 4asil fraksinasi menun$ukkan Iilanase dapat mengendap pada seluruh tingkatan fraksinasi yang digunakan karena pada seluruh fraksi yang diperoleh menun$ukkan adanya aktivitas Iilanase. ilanase mulai dapat mengendap pada konsentrasi garam dengan persen saturasi ? + ?N. Pengendapan protein semakin meningkat dengan peningkatan $umlah garam yang ditambahkan dalam sampel protein yang ditandai dengan meningkatnya $umlah endapan. alu fraksi tersebut didialisis untuk menghilangkan garam ammonium sulfat dan molekul kecil berberat molekul rendah. -erdasarkan hasil u$i aktivitas spesifik, aktivitas Iilanase fraksi dengan saturasi ?+ *?N menun$ukkan peningkatan aktivitas spesifik tertinggi yaitu sebesar =O=.' 5Qmg, maka sampel fraksi ? + *?N digunakan untuk proses pemurnian dengan kolom kromatografi. Anzim hasil fraksinasi ? + *? N yang telah didialisis dialirkan dalam kolom penukar ion lalu dielusi secara bertahap dengan menggunakan 3a/l (? + *=? m8) dalam buffer 3a4/2!3a/2 = m8, p4 <. sehingga diperoleh *? fraksi. Prinsip kolom penukar ion adalah protein dengan ikatan elektrostatis yang lebih rendah dengan matriks akan dielusi terlebih dahulu dan diikuti protein dengan ikatan elektrostatik yang lebih tinggi. 4asil pemisahan protein dengan kolom penukar anion menun$ukkan puncak aktivitas Iilanase tertinggi diperoleh pada fraksi ke '* dengan aktivitas spesifik O?=.*O 5Qmg. 4asil pemurnian enzim Iilanase menggunakan kromatografi penukar anion menun$ukkan peningkatan aktivitas enzim spesifik men$adi O?=.*O 5Qmg dengan tingkat kemurnian *H.O kali dibanding dengan ekstrak kas arnya. . Karakterisasi en3im 2i!anase
Karakterisasi enzim Iilanase dilakukan menggunakan enzim hasil pemurnian parsial dengan parameter p4 dan suhu. 1uga menggunakan zimogram untuk mengetahui keragaman Iilanase dari setiap tahapan pemurnian yang dilakukan. ilanase memiliki aktivitas optimum pada p4 <.= dan suhu 6= o + O?o /. interaksi kimia menyebabkan perubahan konformasi protein yang berpengaruh terhadap stabilitas dan aktivitas protein yang dipengaruhi oleh keadaan lingkungan mikro protein dan distribusi asam amino bermuatan pada permukaan protein. danya modifikasi pada protein tersebut dapat meningkatkan interaksi pada protein tersebut sehingga protein tersebut men$adi lebih rigid dan stabil pada suhu dan p4 tinggi, sehingga enzim tidak terdenaturasi. 0. Keragaman )i!anase
Keragaman Iilanase dapat dianalisis menggunakan metode zimogram. nalisis ini perlu dilakukan untuk mengetahui keragaman Iilanase pada saat tahap pemurnian. Keragaman enzim dapat ter$adi karena adanya isoenzim. soenzim dihasilkan oleh bakteri dengan tu$uan agar bakteri tersebut dapat menghidrolisis substrat Iilane dengan sempurna.
Dari hasil zimogram diatas diketahui bahwa terdapat dua $enis Iilanase, maka kita dapat men$elaskan adanya dua puncak aktivitas saat penentuan suhu optimum. karena memiliki -8 yang berbeda tetapi memiliki titik isoelektrik yang sama. Kedua Iilanase ini kemungkinan adalah isoenzim, karena dilihat dari -8 yang berbeda tetapi memiliki titik isoelektrik yang sama, karena kedunya mengendapa pada fraksi yang sama yaitu fraksi
saturasi ?!*?N. 7itik isoelektrik (7) adalah daerah p4 tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau $umlah muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam medan listrik pada p4 isoelektrik (p), suatu protein sangat mudah diendapakan karena pada saat itu muatan listriknya nol. %ehingga $ika kita hubungkan dengan p4 optimum Iilanase yang telah didapat (p4 <,=), ada kemungkinan bahwa p4 kedua Iilanase B. circulans pada fraksi '* mendekati nilai p, akibatnya kedua protein tersebut dapat mengendap pada fraksi yang sama. 4. Kemungkinan Penggunaan )i!anase di Industri Pu!p dan Kertas
Penggunaan Iilanase dengan karateristik spesifik seperti tahan alkali dan suhu tinggi akan memiliki beberapa keunggulan $ika dilihat dari sisi teknis, ekonomi dan lingkungan. a. "spek $eknis •
1ika kita menggunakan Iilanase yang tahan alkali dan suhu tinggi akan memudahkan penggunaan enzim pada tahapan pra!pemutihan, karena tidak perlu lagi dilakukan proses netralisasi dan pendinginan pulp.
•
Penggunaan Iilanase pada tahap pemutihan dapat meningkatkan fibrilasi pulp dan retensi air, mereduksi waktu penggilingan pulp virgin, meningkatkan dera$at giling dari serat daur ulang, meningkatkan dera$at putih dan menurunkan bilangan kappa.
•
Penggunaan Iilanase $uga dapat meningkatkan kualitas kertas karena Iilanase dapat meningkatkan viskositas pulp, yaitu dengan menurunkan konsumsi senyawa klorin sampai dengan ?N dan dapat diperoleh dera$at putih yang sama dengan kontrol (tanpa menggunakan Iilanase) pada tahapan pemutihan /A4 (chlorinasi, eItraction, dan hipoklorit).
b. "spek Ekonomi •
Anzim merupakan metode alternatif dengan biaya rendah sehingga dapat digunakan untuk mereduksi penggunaan klorin dan bahan bahan kimia pemutihan lainnya. Penggunaan Iilanase pada tahap pra!pemutihan ini dapat mereduksi penggunaan bahan kimia berbahan dasar klorinQ bahan pengoksidasi yang bersifat toksik se$umlah ?!*?N.
•
Digunakannya Iilanase yang sesuai dengan karakteristik untuk proses pra pemutihan maka ketergantungan ketersediaan enzim untuk industri pulp dan kertas dari impor dapat berkurang. %elain itu ter$adinya penurunan aktivitas enzim selama proses penyimpanan dapat dikurangi karena pengadaan enzim yang kontinyu.
c. "spek %ingkungan
7elah kita ketahui bahwa penggunaan Iilanase pada tahap pra!pemutihan pulp dapat mereduksi penggunaan bahan kimia berbahan dasar klorin atau bahan pengoksidasi yang bersifat toksik se$umlah ?!*?N. Dengan menurunnya senyawa klorin yang digunakan pada proses pemutihan maka secara teoritis diharapkan kandungan bahan berbahaya seperti senyara organik terklorinasi (2) dan dioksin pada air limbah industri pulp dan kertas dapat direduksi.
AFTAR PU#TAKA
ehninger,
..,
'<<*,
"asar-dasar
Biokimia,
diter$emahkan
oleh
8aggy
7henawid$aya.Arlangga, 1akarta Pud$aatmaka, 4., ??, #amus #imia, ** + *=, -alai Pustaka, 1akarta #ichana, 3ur, ??, $roduksi dan $rospek En%im &ilanase dalam $engembangan Bioindustri di Indonesia, -alai Penelitian -ioteknologi dan %umberdaya @enetik Pertanian, -ogor %copes, #.K., '<<*, $rotein $urification' $rinciples and $ractice, %pringer Meriag, 3ewTork 7oha, 4.., ??=, "eoxyribo (ucleic )cid ' #eanekaragaman* Ekspresi* !ekayasa + Efek $emanfaatannya, lfabeta, -andung Mogel, '<<*, #imia )nalisis #uantitatif )norganik , ed. *,?!', A@/, 1akarta Ridhyastuti, 3., ??6, $urifikasi dan #arakterisasi &ilanase Ekstraseluler Streptomyces sp. S##I-, )sal Sukabumi, P- Press, -ogor http&QQen.wikibooks.orgQwikiQProteomicsQProteinU%eparationsU! U/hromatographyQonUeIchange
