i
KATA PENGANTAR
Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat serta karunia-Nya kepada penulis sehingga penulis dapat menyelesaikan dalam menyusun makalah ini yang tepat pada waktunya dengan judul "Flowcytometry".
Kami menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat membangun selalu penulis harapkan demi kesempurnaan makalah ini. Diharapkan makalah ini dapat memberikan informasi dan menambah pengetahuan semua pembaca.
Akhir kata, kami sampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah berperan serta dalam penyusunan makalah ini dari awal sampai akhir. Semoga Allah SWT senantiasa meridhai segala usaha kita. Amin.
Penulis
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR i
DAFTAR ISI ii
BAB 1 PENDAHULUAN 1
1.1 Latar Belakang 1
1.2 Rumusan Masalah 1
1.3 Tujuan 2
BAB 2 PEMBAHASAN 3
2.1 Sejarah perkembangan flowcytometry 3
2.2 Definisi dan prinsip kerja flowcytometry 4
2.3 Kegunaan flowcytometry 6
2.4 Kelebihan & kekurangan 7
2.5 Flowcytometer 7
2.5.1 Sistem fluida 7
2.5.2 Sistem optik 8
2.5.3 Sistem elektronik 9
2.6 Pengaplikasian flowcytometry 10
2.6.1 Aplikasi Flowcytometry dengan Flowcytometer FACS Calibur 10
2.6.2 Aplikasi Flowcytometry untuk Stem Cells Terapi 13
2.6.3 Aplikasi Analisa siklus sel dengan flowcytometry 17
2.6.4 Aplikasi lainnya 21
BAB 3 KESIMPULAN DAN SARAN 23
3.1 Kesimpulan 23
3.2 Saran 23
DAFTAR PUSTAKA iii
BAB 1
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Flowcytometry adalah metode pengukuran (metri) jumlah dan sifat-sifat sel (cyto) yang dibungkus oleh aliran cairan (flow) melalui celah sempit yang ditembus oleh seberkas sinar laser. Setiap sel yang melewati berkas sinar laser menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh instrumen sebagai karakteristik sel bersangkutan. Setiap karakteristik molekul pada permukaan sel maupun yang terdapat di dalam sel dapat diidentifikasi dengan menggunakan satu atau lebih probe. Oleh karena itu, instrumen dapat mengidentifikasi setiap jenis aktivitas sel dan menghitung jumlah masih-masing dalam suatu populasi campuran.
Penggunaan flowcytometry telah berkembang pesat selama 30 tahun terakhir dimulai dari suatu alat tekhnik laboratorium yang rutin digunakan oleh ahli patologi dan ahli imunologi untuk diagnosa dan memonitoring pasien dengan penderita kanker sampai penyakit kelainan atau defisiensi sistem imun (penyakit penurunan daya tahan tubuh). Hingga saat ini flowcytometry menjadi salah satu alat penting dalam perkembangan medis maupun penelitian.
Rumusan Masalah
Apa itu flowcytometry
Bagaimana sejarah perkembangan flowcytometry
Bagaimana prinsip kerja flowcytometry
Apa saja kegunaan flowcytometry
Apa kelebihan dan kekurangan flowcytometry
Apa itu flowcytometer
Apa saja komponen penyusun flowcytometer
Bagaimana pengaplikasian flowcytometry
Tujuan
Dalam penulisan makalah ini diharapkan dapat membantu pembaca lebih memahami mengenai metode dan teknologi di dalam instrumentasi laboratorium klinik. Salah satunya adalah mengenai flowcytometry. Selain itu juga diharapkan pembaca dapat memahami prinsip kerja dari metode tersebut.
BAB 2
PEMBAHASAN
Sejarah perkembangan flowcytometry
Pada 1934, Moldavan pertama kali memperkenalkan alat hitung sel darah otomatik dengan metode flowthrough. Kemudian, pada 1950 dikomersialkan alat dengan metode impedansi, tetapi masih menggunakan pengenceran bahan di luar alat. Sepuluh tahun kemudian, pengenceran tidak dilakukan di luar alat, tapi secara otomatis.
Pada 1953, Crossland and Taylor memperkenalkan teknik penghitungan sel darah, di mana sel dialirkan dalam saluran tunggal, menggunakan bahan cair sebagai laminar sheat flow, dan sel diperiksa dengan metode pendar cahaya.
Pada 1965, diperkenalkan pengukuran sel dengan pendar cahaya yang ditangkap oleh detektor di lebih dari satu sudut dan menggunakan sinar dengan intensitas kuat, yaitu sinar laser. Sinar ini oleh sel itu dapat dipantulkan, dibias, bahkan tembus ke dalam sel, sehingga dapat mendeteksi intrasel.
Nama asli dari teknologi flowcytometry adalah "pulsa cytophotometry" ( Germanwings : Impulszytophotometrie ). Hanya 20 tahun kemudian pada tahun 1988, pada Konferensi Yayasan Rekayasa Amerika di Pensacola, Florida, nama diubah menjadi "flowcytometry" atau "cytometry aliran", sebuah istilah yang dengan cepat menjadi populer.
Metode flowcytometry terus berkembang dengan perkembangan elektrik komputer dan reagen, termasuk digunakannya monoklonal antibodi. Sampai saat ini, pengukuran dengan metode flow cytometrymenggunakan label fluoresensi, selain mengukur jumlah, ukuran sel, juga dapat mendeteksi petanda dinding sel, granula intraselular, struktur intra sitoplasmik, dan inti sel
Definisi dan prinsip kerja flowcytometry
Flowcytometry adalah metode pengukuran (metri) jumlah dan sifat-sifat sel (cyto) yang dibungkus oleh aliran cairan (flow) melalui celah sempit yang ditembus oleh seberkas sinar laser. Setiap sel yang melewati berkas sinar laser menimbulkan sinyal elektronik yang dicatat oleh instrumen sebagai karakteristik sel bersangkutan. Setiap karakteristik molekul pada permukaan sel maupun yang terdapat di dalam sel dapat diidentifikasi dengan menggunakan satu atau lebih probe. Oleh karena itu, instrumen dapat mengidentifikasi setiap jenis aktivitas sel dan menghitung jumlah masih-masing dalam suatu populasi campuran.
Setiap sel yang melewati berkas sinar laser akan menyebabkan sinar laser terpencar (scattered) ke dua arah, yaitu forward scatter (FSC) yang pararel dengan arah sinar dan side scatter (SSC) yang arahnya tegak lurus pada arah sinar laser. Besarnya FSC berbanding lurus dengan atau menggambarkan volume atau ukuran sel. Sel yang mati (walaupun penampakan mikroskopis sebaliknya), terlihat lebih kecil dibanding sel hidup. Sel darah merah juga berbeda dengan sebenarnya, umumnya lebih kecil dari semua sel darah.
Adapun SSC ditentukan oleh morfologi dan emisi sinar fluoresen yang dipancarkan oleh fluorokrom yang digunakan untuk mewarnai sel. Sinyal-sinyal itu dikonversikan menjadi angka digital dan diperlihatkan pada suatu histogram yang dapat dianalisis untuk memperoleh informasi tentang karakteristik sel bersangkutan.
Gambar. Pancaran sinar laser saat sel melewati berkas sinar laser
Untuk identifikasi antigen, dapat digunakan berbagai zat pewarna fluorokrom. Fluorokrom merupakan suatu senyawa fluoresein yang dapat berpendar saat mengalami eksitasi oleh sinar dengan panjang gelombang tertentu. Berikut beberapa fluorokrom yang sering digunakan dalam flow cytometry, yaitu fluorescein isothyocyanate (FITC) yang memancarkan sinar hijau-kuning dengan emisi 519 nm, 4,6-Diamidino 2-Phenylinidole (DAPI) dengan emisi 455 nm, propidium iodide (PI) dengan emisi 617 nm dan phycoeritrin (PE) yang memancarkan sinar merah-orange dengan emisi 578 nm.
Dapat disimpulkan, prinsip kerjanya kurang lebih sepeti ini :
Sejumlah sel disuspensikan ke dalam suatu cairan konduktif.
Sel-sel tersebut diatur sedemikian rupa (diberikan tekanan hydrodynamic focussing) sehingga dapat melewati suatu lorong (apparatus) satu demi satu.
Ketika sel sampai di suatu titik di lorong tersebut, sel akan ditembak dengan sinar laser (Light amplification by stimulating emmision of radiation).
Lalu, hasil tembakan tadi, akan dibaca oleh dua macam detektor.
> detektor yg pertama, letaknya sejajar dengan sumbu X terhadap sumber tembakan. Sinyal yg didapatkan di sini, akan dibaca sebagai gambaran ukuran sel yang ditembak.
> detektor yang kedua, letaknya 90 derajat terhadap sumber tembakan / laser. Sinyal yang didapatkan disini, akan dibaca sebagai gambaran sitosolik yg ada dalam sel (misalnya : granul)
Kegunaan flowcytometry
Flowcytometry merupakan sebuah metode yang secara luas digunakan untuk meneliti ekspresi permukaan sel dan molekul sellular, menggolongkan dan mendeskripsikan tipe sel yang berbeda dalam populasi sel yang heterogen, menaksirkan kemurnian subpopulasi yang terisolasi, dan menganalisis ukuran dan jumlah sel.
Flowcytometry dengan cell sorting (fluorescence activated cell sorter, FACS) memiliki aplikasi dalam sejumlah bidang, termasuk biologi molekuler, patologi, imunologi, biologi tanaman, dan biologi kelautan. Beberapa di antaranya, meliputi:
Analisis dan pemisahan subpopulasi limfosit dengan menggunakan antibodi monoklonal terhadap antigen permukaan yang diberi label dengan zat warna fluorokrom.
Pemisahan limfosit yang memproduksi berbagai kelas imunoglobulin dengan menggunakan antibodimonoklonal terhadap kelas dan subkelas Ig spesifik dan tipe L-chain.
Memisahkan sel hidup dari sel mati.
Analisis kinetik atau siklus sel dan kandungan DNA atau RNA.
Kelebihan & kekurangan
Kelebihan metode ini yaitu, pemeriksaan dilakukan dengan waktu yang relative cepat, menggunakan sampel yang sedikit, memiliki hasil yang lebih akurat karena biasanya sudah melalui quality control. Sedangkan kelemahannya adalah tidak dapat menghitung sel abnormal karena terkadang ada beberapa sel yang tidak terhitung karena sel tersebut memiliki bentuk yang abnormal.
Flowcytometer
Flowcytometer merupakan salah satu instrumen yang menggunakan metode flowcytometry. Alat tersebut memiliki kemudahan serta keunggulan dibanding dengan cara konvensional. Selain dapat mengukur berbagai macam karakteristik sel dalam waktu yang cepat secara simultan, teknologi ini juga memiliki ketepatan dan ketelitian yang tinggi.
Flowcytometer pada dasarnya adalah mikroskop yang dilengkapi dengan komponen yang berfungsi untuk melalukan individu sel secara sekuensial melalui berkas cahaya (laser) yang akan dianalisis. Komponen penyusunnya terdiri atas tiga sistem, yaitu fluida, optik, dan elektronik.
Sistem fluida
Gambar. Cara kerja sistem fluida
Sistem fluida mengarahkan sel melalui cahaya (laser) untuk dianalisis, terdiri darisheath fluid dan central channel. Tenaga hidrodinamik mengakibatkan sel satu per satu melewati central channel. Fluida merupakan bagian yang paling sensitif pada flow cytometer. Jika terjadi kesalahan, semuanya akan salah dan fatal. Masalahnya sebagai berikut:
Clogs, celah pada aliran larutan sangat kecil.
Gelembung udara, akan mengganngu aliran dan yang akan diinterpretasikan sebagai sel.
Leaks, kurangnya tekanan udara dalam sistem akan mengganggu aliran selular dan akan memengaruhi hasil.
Errors, yang paling umum memengaruhi fluida adalah:
> Clumps of cells. Hal ini akan "clog" mesin dan berakibat kesulitan utama dan "headaches". Kejadian ini dapat diatasi dengan pre-filtrasi populasi sel tidak lebih besar dari 50 um filter.
> Konsentrasi sel yang tidak sesuai. Semua larutan memiliki proporsi partikel debu yang rendah. Suatu flow rate yang lebih besar sekitar 4.000 sel/sekon meningkatkan resiko pada pengukuran multiple cellsecara simultan.
Sistem optik
Sistem optik terdiri atas laser sebagai sumber cahaya dan mengeksitasi (fluorokrom) sel dalam aliran sampel, serta filter optik untuk mengarahkan sinyal cahaya yang dihasilkan ke detektor yang sesuai. Alasan penggunaan laser, karena kemampuannya untuk difokuskan menjadi berkas cahaya elliptis. Ini terkait dengan komponen-komponen fluida terkait. Laser memancarkan cahaya koheren dan merupakan berkas sangat pararel.
Hal ini memungkinkan dasar pengukuran yang berbasis pada gangguan berkas (beam disturbance) dapat dilakukan (forward scatter, side scatter). Penggunaan berkas terfokus yang elliptis dapat menghasilkan hanya cahaya fluoresensi dari single cell(size dependent) yang dapat diukur setiap saat.
Pengukuran sel pada flow cytometer menggunakan prinsip pendar cahaya (light scattering). Prinsip light scattering adalah metode di mana sel dalam suatu aliran melewati celah di mana berkas cahaya difokuskan ke sel (sensing area). Apabila cahaya tersebut mengenai sel, akan dihamburkan, dipantulkan, atau dibiaskan ke semua arah. Beberapa detektor yang diletakkan pada sudut-sudut tertentu akan menangkap berkas-berkas sinar sesudah melewati sel. satu detektor diletakkan berhadapan dengan sumber sinar (FSC), beberapa diletakkan dengan membentuk sudut (SSC), dan detektor fluoresen. FSC berkorelasi dengan volume atau ukuran sel, sedangkan SSC berhubungan dengan kompleksitas bagian dalam partikel, seperti ukuran nukleus, tipe granula sitoplasma, dan kekasaran membran plasma.
Deteksi sinyal dilaksanakan dengan menggunakan kombinasi photomultiplier (cathode-ray) dan rangkaian elektronika. Sinyal yang dibangkitkan oleh setiap sel pada dasarnya merupakan oscilloscope trace. Dengan melakukan integrasi sinyal ini, akan dihasilkan suatu nilai numerik bagi fluoresensi maupun nilai SSC.
Sistem elektronik
Sistem elektronik berfungsi untuk mendeteksi cahaya dan mengubahnya ke bentuk sinyal digital. Data yang dihasilkan oleh flowcytometer dapat diplot dalam satu dimensi, untuk menghasilkan histogram atau dalam dua dimensi plot titik, atau bahkan dalam tiga dimensi. Plot sering dibuat pada skala logaritmik, karena emisi pewarna fluoresen yang berbeda.
Data akumulasi menggunakan flowcytometer dapat dianalisis menggunakan perangkat lunak komputer, seperti WinMDI Flowjo, FCS Ekspres, VenturiOne, CellQuest Pro, atau Cytospec.
Gambar. Grafik representasi data flowcytometry
Pengaplikasian flowcytometry
Aplikasi Flowcytometry dengan Flowcytometer FACS Calibur
Analisis DNA (Pengukuran kinetik sel )
Pengukuran kinetik pertumbuhan sel diperlukan untuk menentukan prognosis kanker, mengetahui dinamika sel T pada infeksi HIV, dan sebagainya. Kinetik sel dapat dipelajari dengan berbagai cara, salah satunya adalah dengan mengukur indeks proliferasi. Pengukuran indeks proliferasi sel dapat dilakukan dengan menentukan proporsi atau fraksi sel dalam fase-S (yaitu: suatu fraksi dari populasi sel total dalam siklus sel) dan mengukur kandungan DNA.
Salah satu metode yang dapat digunakan adalah metode flowcytometry. Prinsip metode ini adalah mengukur emisi fluoresen fluorokrom yang terikat pada DNA dalam sel apabila sel itu dilewatkan berkas sinar dengan panjang gelombang yang sesuai (laser). Zat warna fluorokrom dapat mengikat DNA secara stokiometris.
Pengikatan zat warna fluorokrom pada DNA dapat memberikan informasi tentang kandungan DNA total dan fraksi sel yang berada pada siklus sel secara cepat, akurat, dan praktis. Fluorokrom yang digunakan untuk kuantifikasi DNA adalah propidium iodide (PI) dan ethidium bromida. Interkalasi fluorokrom ini di antara pasangan basa dsDNA atau RNA menghasilkan suatu kompleks dengan fluoresensi efisien yang dapat dideteksi dengan sinar laser dengan kekuatan relatif rendah. Kandungan DNA relatif (status ploidi) dari satu populasi sel dinyatakan dengan indeks DNA dalam fraksi Go/G1 populasi sel bersangkutan dibandingkan terhadap populasi sel kontrol diploidi. Indeks DNA populasi sel normal ploidi adalah 1.0. Sel ganas, walaupun tidak selalu, biasanya menunjukkan kandungan DNA abnormal (aneuploidi) dan pada histogram, populasi abnormal akan menunjukkan puncak ekstra (hiperdiploidi). Fraksi sel yang berada pada fase Go/G1, S dan G2M dapat dihitung dari distribusi DNA.
Analisis DNA (Analisa status ploidi tanaman)
Analisa ploidi tanaman dapat dilakukan dengan menggunakan flowcytometry. Sampel dapat berupa jaringan daun tanaman yang kemudian dilisiskan dalam larutan buffer pelisis dan DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole). Selanjutnya larutan difiltrasi untuk memisahkan debris. Filtrat kemudian dideteksi kandungan DNA-nya dengan flowcytometry. Ploidi dari tanaman ditentukan dengan mengamati peak atau puncak yang ditunjukkan pada layar monitor.
Uji fungsi neutrofil
Uji fungsi neutrofil merupakan parameter penting dalam menganalisis respon imun seluler nonspesifik. Pengujian ini dapat dilakukan dengan cara uji fagositosis partikel bakteri dan uji aktivitasphagocyte respiratory burst menggunakan metode flowcytometry. Prinsip uji fagositosis adalah menganalisis jumlah neutrofil yang mengandung bakteri berlabel yang dibubuhkan.
Pengukuran fungsi fagositosis dan respiratory burst secara simultan dapat dilakukan menggunakan darah yang diinkubasi dengan kumanStafilococcus aureus atau E coli yang telah diberi label fluorescein FITC selama waktu tertentu (biasanya 60 menit) guna menganalisis proporsi sel yang berisi bakteri. Fungsi respiratory burst dievaluasi dengan mengukur banyaknya ethidium bromide (EB) berfluoresensi merah yang dihasilkan oleh oksidasi hidroethidin yang terjadi akibat dibentuknya produk oksidatif oleh PMN atas rangsangan bakteri yang difagositosis. Jadi, yang diukur oleh flowcytometer adalah proporsi sel yang berisi bakteri yang berfluoresensi hijau dan intensitas fluoresensi merah yang dihasilkan EB dalam sel PMN bersangkutan.
Fluorokrom yang dapat digunakan, antara lain propidium iodide yang berfluoresensi merah untuk melabel Stafilococcus dan dihidrorhodamine 123 yang akan berubah menjadi rhodamine 123 yang berfluoresensi hijau setelah dioksidasi.
Monitoring penderita terinfeksi virus HIV (Pengukuran limfosit T)
Monitoring status imunologi pada infeksi HIV bisa dilakukan dengan metode flowcytometry. Pemeriksaan menggunakan flow cytometer yang berbasis flowcytometry merupakan pemeriksaan yang paling baik untuk limfosit T helper/inducer (CD4+) atau limfosit T supressor/cytotoxic (CD8+).
Virus HIV menginfeksi limposit T helper atau melalui antigen CD4+. Limposit yang terinfeksi ini kemudian lisis ketika virion baru dilepaskan atau dipindahkan oleh sistem imun selular. Pada infeksi HIV yang progresif, jumlah CD4+ dan limposit T menurun. Jumlah absolut CD4+ merupakan pengukuran yang penting untuk memprediksi, menentukan derajat, dan monitoring progresivitas serta respons terhadap pengobatan pada infeksi HIV.
Pemeriksaan jumlah virus melengkapi pemeriksaan laboratorium untuk monitoring penyakit. Besarnya berbanding terbalik dengan jumlah CD4+. Jadi, jumlah CD4+ dan jumlah virus secara langsung menunjukkan status imun penderita. Ini berguna untuk menentukan diagnosa, prognosa, dan manajemen pengobatan pada penderita yang terinfeksi HIV.
Nilai normal limfosit T
Dewasa:
- Limfosit T CD4 absolut : lebih besar dari 500/cmm3
- Limfosit T CD4 % : lebih besar dari 25%
Bayi 12 bulan:
- Limfosit T CD4 absolut : lebih besar dari 1.500/cmm3
- Limfosit T CD4 % : lebih besar dari 25%
Anak-anak 1-5 tahun:
- Limfosit T CD4 absolut : lebih besar dari 1.000/cmm3
- Limfosit T CD4 % : lebih besar dari 25%
Aplikasi Flowcytometry untuk Stem Cells Terapi
Stem Cell (juga dikenal dengan istilah sel punca) merupakan sel naif yang dapat membelah diri dan dapat berkembang menjadi berbagai macam sel dalam tubuh manusia, sehingga berpotensi digunakan untuk menggantikan berbagai jaringan tubuh yang rusak.
Stem Cell merupakan sel yang belum terspesialisasi dan memiliki 2 karakteristik, yaitu :
Kemampuan untuk memperbaharui atau meregenerasi dirinya sendiri (self-regenerate/self-renew). Dalam hal iniStem Cell dapat membuat salinan sel yang persis sama dengan dirinya melalui pembelahan sel.
Kemampuan untuk berdirefensiasi menjadi sel lain. Dalam hal ini Stem Cell mampu berkembang menjadi berbagai jenis sel matang, misalnya sel saraf, sel otot jantung, sel otot rangka, sel pankreas, dan lain-lain.
Keuntungan Stem Cell dari darah tali pusat
Mudah diperoleh.
Siap pakai, karena telah melalui tahap pre-screening, testing dan pembekuan.
Cenderung tidak terpapar oleh faktor external.
Cara pengambilan mudah, tidak berisiko atau menyakiti donor.
Risiko GVHD (graft-versus-host-disease) lebih rendah dibandingkan dengan menggunakan stem cell dari sumsum tulang, dan transplantasi tetap dapat dilakukan walaupun HLA matching tidak sempurna atau dengan kata lain toleransi terhadapa ketidaksesuaian HLA matching lebih besar dibandingkan dengan Stem Cell dari sumsum tulang.
Keberhasilan penggunaan Stem Cell darah tali pusar untuk keluarga
Penggunaan Stem Cell darah tali pusar dapat digunakan secara langsung untuk bayi Anda. Kemungkinan kecocokan HLA pada saudara kandung dan orang tua lebih besar dibandingkan dengan kerabat dekat.
Daftar penyakit yang dapat diterapi dengan Stem Cell
Thalassemia
Lymphoma
Systemic lupus
Sickle Cell Anemia
Multiple myeloma
Evan syndrome
Leukemia
Thrombocytopenia
Amegakaryocytosis
Aplastic Anemia
Leukodystrophy
Cerebral palsy
Proses pengambilan Stem Cell dari darah tali pusar
Saat bayi dilahirkan (persalinan normal maupun operasi caesar), darah akan diambil oleh dokter setelah tali pusar di klem dan dipotong, sehingga tidak ada rasa sakit maupun resiko pada ibu dan bayi. Staf ProSTEM yang beroperasi 24 jam siap membawa darah tali pusar ke lab ProSTEM. Darah tali pusat diproses untuk pemisahan Stem Cell yang disimpan pada suhu -196oC dalam cryotank sehingga sel tetap dalam kondisi baik dan stabil hingga saat nanti digunakan.
Parameter keberhasilan terapi dengan Stem Cell
Jumlah Sel
Semakin banyak jumlah sel yang digunakan dalam terapi, maka angka keberhasilan terapi semakin baik
Kecocokan HLA (Human Leukocyte Antigen)
Semakin tinggi kecocokan HLA antara donor dan penerima, maka keberhasilan terapi semakin menjanjikan.
Flow cytometry dapat menganalisis dari beberapa karakteristik sel tunggal. Informasi yang dihasilkan dapat berupa data kuantitatif dan data kualitatif. Selain itu flowcytometry juga mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan mengisolasi stem cell baik untuk penelitian maupun untuk kepentingan klinis. Kelebihan utama dari flowcytometry adalah dengan cepat mampu melakukan pengukuran kuantitatif pada sel tunggal dalam populasi sel heterogen (terdapat banyak jenis sel).
Untuk menganalisis eksprsesi marker penanda permukaan sel, suspensi sel harus diwarnai dengan fluorosen - label antibodi untuk kemudian dianalisis pada flowcytometry[4]. Flowcytometry dapat mengkarakterisasi sel tunggal stem cell dari mesenchymal stem cells (MSC),hematopoietic stem cells, neural stem cells (NSC), very small embryonic-like stem cells (VSEL), dan induced pluripotent stem cell (iPSC)[3]. Dalam kaitannya dengan terapi stem cell, aplikasi penggunaan flowcytometry sangat dibutuhkan mulai dari sebelum transplantasi untuk mengetahui kecocokan antibodi HLA, dan memonitoring antibodi setelah dilakukannya transplantasi[7-10]. Selain itu flowcytometry penting dalam pemeriksaan jumlah CD34+ baik CD34+ dari stem cell sumsum tulang belakang (bone marrow),darah tepi (peripheral blood), maupun darah tali pusat (cord blood).
Pengukuran CD34+ penting dilakukan untuk menentukan waktu yang tepat dilakukannya transplantasi dan untuk mengetahui viabilitas (kemampuan hidup sel) stem cells[5]. Berdasarkan penelitian, jumlah CD34+ mempengaruhi kesuksesan dari transplantasi dan lamanya waktu pemulihan dari hemapoeiteik (proses pembentukan dan perkembangan sel-sel darah)[11] untuk itu aplikasi penggunaan flowcytometry dalam terapi stem cell sangat dibutuhkan.
Dalam meningkatkan kualitas, baik pada pengembangan riset maupun pada akurasi pengukuran CD34+, ProSTEM telah menggunakan alat flowcytometry dimana analisisnya menggunakan platformtunggal sesuai dengan panduan internasional International Society of Hematotherapy and Graft Engineering(ISHAGE).
Aplikasi Analisa siklus sel dengan flowcytometry
Flowcytometry merupakan suatu metode yang diaplikasikan untuk mampu menganalisa berbagai komponen seluler (asam nukleat, lemak, protein dll),organel (lisosom, mitokondria dll), bahkan fungsi ( viabilitas, aktivitas enzimatis dll).Salah satu manfaat dari flowcytometry adalah analisa siklus sel. Analisa siklus sel dengan flowcytometry merupakan hal yang menarik untuk dikaji baik pada penelitian dasar maupun pada ranah biomedik.
Penerapan analisis siklus sel pada berbagai bidang memiliki poteni yang besar untuk terus dikembangkan. Pada bidang farmakologi, flowcytometry menyediakan kesempatan untuk menyelidiki efek terapi obat secara in vitro seperti efikasi dari faktor-faktor anti tumor untuk mengembangkan terapi baru. Pada onkologi, jumlah DNA sel dan distribusinya pada berbagai fase dalam siklus sel dapat dianalisa untuk mendeteksi sel yang patologisuntuk menentukan prognosis maupun untuk monitoring terapi. Analisa siklus sel dengan flowcytometry juga tidak terbatas digunakan pada model eksperimen selain hewan dan famili tumbuhan tingkat tinggi saja, namun juga dapat digunakan untuk meningkatkan pengetahuan pada model eksperimen seperti bakteri, jamur, ataupun alga uniseluler. Untuk aplikasi analisa siklus sel dengan flowcytometry lainnya akan dijelaskan pada pembahasan di bawah ini:
Farmakologi dan toksikologi
Analisa monoparametrik atau multiparametrik dari siklus sel termasuk studi kinetika dapat digunakan untuk mengevaluasi efek obat in vitro. Metode ini juga dapat digunakan untuk mengetahui sitotoksisitas, fase aksi sepesifik, pengaruh pada metaolisme sel atau posisi pada siklus dimana sel tersebut terbunuh oleh karena suatu obat.
Oleh karena manfaat tersebut, metode ini dapat mengkarakterisasi sifat obat dan memberikan prediksi efek obat in vivo dan mengevaluai sensitivitas atau resisitensi untuk dapat menentukan langkah selanjutnya termasuk penggantian terapi.
Patologi tumoral
Diagnosis berdasarkan konten DNA
Berbagai tumor baik ganas maupun lesi prekanker memiliki asosiasi dengan abnormalitas pada jumlah DNA yang didapat dari aberasi kromosomal. Sehingga, dibutuhkan informasi yang dapat didapat dari flowcytometry sehingga nantinya diperoleh informasi berupa indeks DNA. Indeks DNA merupakan rasio antara konten relatif DNA pada sel tumor pada fase G1 dengan sel diploid normal.Ketika sel memiliki abnormalitas konten DNA, indeks DNA akan berbeda dari satu (1) dan disebut populasi aneuploid. Indeks DNA yang dihitung dengan flowcytometry memiliki korelasi yang baik dengan jumlah kromosom terutama pada leukemia dan tumor padat.Populasi aneuploidi merupakan indikator yang baik untuk mengetahui adanya tumor ganas.
Akan tetapi, konten DNA memiliki keterbatasan sebagai metode diagnostik karena resolusi analisis kadangkala tidak cukup untuk menunjukkan populasi yang berbeda sedikit dengan sel diploid seperti pada beberapa jenis leukimia.
Nilai diagnostik berdasarkan aktivitas proliferasi
Repartisi sel pada berbagai fase siklus sel merupakan informasi yang penting olehkarena beberapa tumor memiliki karakter khas berupa proliferasi seluler yang tak terkontrol. Jumlah sel pada fase S, secara langsung yang memiliki hubungan erat dengan proliferasi merupakan hal yang menarik untuk dikaji. Akan tetapi, walaupun pada beberapa jenis tumor berkorelasi dengan tingginya angka proliferasi seperti pada acute myeloblastic leukemias dan limfoma, juga terdapat sel yang sangat rendah tingkat proliferasinya sepertiacute lymphoblastic leukemias dan tumor padat terutama tumor diploid.
Oleh karena itu, proliferasi seluler memiliki keterbatasan sebagai alat diagnostik. Hal ini dapat disebabkan oleh karena perbedaan presentasi sel pada fase S (S%) tergantung pada besarnya tumor atau lokasi pengambilan.
Monitoring obat pada proses terapi
Flowcytometry juga dapat digunakan sebagai alat monitoring terapi dengan menganalisa pada populasi tumor. Metode ini dapat digunakan untuk mengevaluasi efek radioterapi atau kemoterapi Analisa dapat mendeteksi resistensi terhadap regimen terapi yang nantinya dapat menentukan keputusan berikutnya. Pada kasus leukimia dan limfoma, floecytometry dapat menentukan efisiensi terapi. Metode ini juga dapat digunakan untuk mendeteksi sel tumor yang tersisa yang dapat menyebabkan relaps.
Konten DNA dapat dianalisa secara bersamaan dengan indikator tumor untuk mendeteksi adanya modifikasi dari ekspresi yang mungkin menandai adanya transisi dari tingkatan keganasan tumor maupun respon terhadap terapi.
Aplikasi lainnya
Secara aplikasi selain pada terapi kanker dan farmakologi, masih banyak manfaat dari analisa siklus sel dengan flowcytometry. Analisis siklus sel secara luas terbukti mampu mengambil peran luas pada peningkatan pengetahuan dalam berbagai bidang ilmu seperti pada studi sperma dan sel testikular, atau pada interaksi antara virus dan sel. Analisa ini juga terbukti pada beberapa tipe sel lain diluar sel yang lazim dianalisa seperti pada bakteri, jamur, fitoplankton ataupun alga.
Pada studi sel testikular, analisa ini mampu membantu membedakan antara sel haploid, diploid, dan tetraploid berdasarkan jumlah DNAnya. Selain itu, hasil yang lebih akurat mampu didapatkan berkat adanya analisa bivariat pada DNA dan RNA setelah pemberian pewarnaan dengan acridine orange atau setelah inkorporasi dengan BrdUrd. Analisa DNA juga ditujukan untuk mengetahui alterasi sel atau modifikasi pada berbagai subpopulasi setelah terpapar oleh zat kimia tertentu atau terpapar oleh radiasi ionik. Selain itu, terdapat kemungkinan dalam menentukan kualitas dari cairan semen atau untuk membedakan antara sel normal dengan sel tumor testis berdasarkan kondensasi kromatin seluler setelah in situ denaturasi DNA dan pewarnaan dengan acridine orange.
Pada taraf interaksi virus dengan sel, beberapa studi yang fokus pada Simian virus 40 (SV40) mendapatkan bahwa sel yang terinfeksi terinduksi untuk melakukan sintesis DNA yang berkorelasi dengan peningkatan konten DNA.
Analisa multiparametrik pada konten DNA dan antigen T darusel yang terinfeksi SV40 juga telah dilakukan untuk membedakan gen yang diregulasi oleh siklus sel atau yang meregulasi siklus sel.
Selain manfaat yang dapat diamati pada hewan atau pada tumbuhan tingkat tinggi, analisa siklus sel telah terealisasikan untuk diaplikasikan pada bakteri, terutama untuk proses studi efek obat. Analisa ini juga dapat digunakan untuk studi proses evolusi pada populasi jamur, efek stress lingkungan pada spesies fitoplankton ataupun proliferasi dari Euglena gracilis akibat pengaruh vitamin B12.
BAB 3
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Flowcymetry merupakan metode pengukuran jumlah dan sifat-sifat sel yang dibungkus oleh aliran cairan melalui celah sempit yang ditembus oleh seberkas sinar laser. Prinsip kerjanya sejumlah sel disuspensikan ke dalam suatu cairan konduktif, lalu sel-sel tersebut diatur sedemikian rupa seperti diberikan tekanan hydrodynamic focussing, sehingga dapat melewati suatu lorong satu demi satu. Kemudian sel pun akan ditembak dengan sinar laser ketika sel sampai di suatu titik di lorong tersebut, dan hasil tembakan tadi akan lansung dibaca oleh detektor. Flowcymetry juga memiliki manfaat di berbagai bidang, seperti dalam bidang biologi molekuler, patologi, imunologi, biologi tanaman, dan biologi kelautan.
Salah satu instrumen yang menggunakan metode flowcytometry adalah flowcytometer. Flowcytometer memiliki 3 sistem komponen penyusun, yaitu sistem fluida, sistem optik, dan sistem elektronik. Flowcytometry juga dapat diaplikasikan dalam berbagai kasus seperti dalam melakukan stem cells terapi, untuk menganalisa siklus sel, lalu pada alat Flowcytometer FACS Calibur, dan lain-lain.
Saran
Dengan adanya makalah mengenai metode flowcymetry ini diharapkan bisa menambah ilmu bagi masyarakat pada umumnya, dan khususnya dapat lebih dipahami lagi bagi para tenaga ahli laboratorium klinik.
DAFTAR PUSTAKA
Chantal Jayat dan Marie Ratinaud. 1997. Cell cycle analysis by flow cytometry: Principles and applications . Biol Cell (1993) 78, 15-25. [online]
Rafael Nunez. 2001. DNA Measurement and Cell Cycle Analysis by Flow Cytometry. Curr. Issues Mol. Biol. (2001) 3(3): 67-70. [online]. Tersedia :
http://bennyariepradana.blogspot.co.id/2013/06/application-of-cell-cycle-detection-by.html. [Juni 2013]
Jaye DL., Robert AB., Gebel HM., et al. Translational Applications of Flow Cytometry in Clinical Practice. The Journal of Immunology. May 2012 ; 188( 10) : 4715-4719. [online]
Brown M and Carl W. Flow Cytometry: Principles and Clinical Applications in Hematology.Clinical Chemistry. 2000 ; 46 : 8 (B) : 221–1229. [online]
Donnenberg VS., Henning U and Atilla T. Cytometry in Stem Cell Research and Therapy.Cytometry A. 2013 Jan; 83(1): 1–4. [online]
Stem Cell Research. Analysis and Isolation of Stem Cells Using Flow Cytometry. BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company. 2013 BD 23-15275-00. [online]
Meinelt E and Calin Y. 2012. Analyzing Samples for CD34 Enumeration Using the BD Stem Cell Enumeration Kit. 23-14029-00. [online]
Riley RS and Michael I. Principles and Applications of Flow Cytometry. Department of Pathology Medical College of Virginia/VCU Health Systems Virginia Commonwealth University. [online]
Horsburgh T, Martin S, Robson AJ. The application of flow cytometry to histocompatibility testing. Transpl Immunol. 2000 ; 8: 3-15. [online]
Rebibou JM, Chabod J, Bittencourt MC et al. Flow-PRA evaluation for antibody screening in patients awaiting kidney transplantation. Transplant Proc. 2000 ; 32 :2745-6. [online]
Rodriguez PC, Arroyave IH, Mejia G, Garcia LF. Detection of alloantibodies against non-HLA antigens in kidney transplantation by flow cytometry. Clin Transplant. 2000 ; 14 : 472-8. [online]
Tambur AR, Klein T. Flow cytometry application in organ transplantation. Isr Med Assoc J. 2000 ; 2 : 310-5. [online]
Lamb LS. Hematopoietic cellular therapy: Implications for the flow cytometry laboratory. Hematol. Oncol. Clin. North Amer. 2002. [online]. Tersedia :
http://www.prostem.co.id/articles/view/aplikasi-flow-cytometry-untuk-stem-cells-terapi. [5 Juni 2015]
US 3380584 , Mack Fulwyler, "Pemisah Partikel," dikeluarkan 1965/06/01. [online]
Fulwyler, MJ (1965). "Pemisahan Elektronik sel biologis oleh volume." Ilmu 150 (698):. 910-911 PMID 5891056. [online]
DE 1815352 , Wolfgang dan Wolfgang Göhde Dittrich, "Arus-melalui Foto Kamar untuk Monitor untuk Mengukur dan Count Partikel dalam Menengah Dispersi", dikeluarkan 1971/01/14. [online]
Kamentsky, Prosiding "Otomasi Cytologie" Konferensi di Edinburgh, 1970. [online]
http://pingu.salk.edu/flow/fluo.html. [online]
"TSRI cytometry Halaman Perangkat Lunak" . Diakses 2009-09-03 . [online]
"PUCL cytometry Halaman Perangkat Lunak" . Diperoleh 2011/07/07 . [online]
"Penjelasan tujuh belas subset darah manusia perifer B-sel dan Kuantifikasi tanggapan tetanus menggunakan kepadatan berbasis metode untuk identifikasi otomatis populasi sel dalam data flow cytometry Multidimensi" .Diakses 2010-12-14 . [online]
"Imunologi Database dan Analisis Portal" . Diakses 2009-09-03 . [online]
"Arus Analisis multivariat dengan Estimasi Otomatis (FLAME)" . Diakses 2009-09-03. [online]
"flowClust" . Diakses 2009-09-03 . [online]
"FlowCAP - Arus cytometry: Penilaian Kritis Metode Identifikasi Penduduk" . Diakses 2009-09-03 . [online]
"FACS multiset Sistem" (PDF). Becton Dickinson . Diperoleh 2007/02/09 . [online]
Loken MR (1990). Teknik imunofluoresensi di cytometry Arus dan Sortasi (2nd ed.). Wiley. hlm 341-53. [online]
a b c Ornatsky, O.; Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, MA, Tanner, S. (2010). "Sangat multiparametric cytometry analisis oleh massa." Journal of Metode imunologi 361 (1-2): 1-20. DOI : 10.1016/j.jim.2010.07.002 . PMID 20655312 . [online]. Tersedia :
http://www.riset872011.com/2011_07_19_archive.html. [19 Juli 2011]
Anonim. Introduction to Flow Cytometry, diakses dari http://www.abcam.com. [online]
Koeswardani, Boentoro, dan Budiman. 2001. Flow Cytometri dan Aplikasi Alat Hitung Sel Darah Technicon H-1 dan H-3, diakses darihttp://www.tempo.co.id. [online]
Kresno, S. B. 2003. Imunologi: Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Balai Penerbit FKUI: Jakarta. [online]
Ormerod, M. G., 1998. Flow Cytometry: A Practical Approach. Edisi kedua. IRL Press [online]
Http://lemlit.uhamka. ac.id [online]. Tersedia :
http://gubuknoer.blogspot.co.id/2013/09/flow-cytometry.html. [4 September 2013]
Liliyana, Elisa. 2016. "Perbedaan Hasil Pemeriksaan Jumlah Retikulosit Metode Mikroskopis dan Flowcytometry". Skripsi Diploma IV pada FIKK UNIMUS Semarang: tidak diterbitkan.
