LAPORAN PRAKTIKUM GENETIKA (BI2105) PCR Tanggal Praktikum : 18 November 2013 Tanggal Pengumpulan : 2 Desember 2013
Disusun oleh : Anisah Firda Rachmani 10612016 Kelompok 12
Asisten : Luthfi Mu’awan Mu’awan 106110
PROGRAM STUDI BIOLOGI SEKOLAH ILMU DAN TEKNOLOGI HAYATI INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2013
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
1.2 Tujuan
1. Menentukan cara penggunaan mikropipet untuk pengambilan larutan encer dan pekat. 2. Menentukan nilai akurasi dan presisi mikropipet. 3. Menentukan kelayakan mikropipet berdasarkan analisis nilai akurasi dan presisi.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Prinsip Kerja Mikropipet
Mikropipet merupakan alat yang memungkinkan pengukuran volume secara akurat dalam satuan µl. Mikropipet sangat peka, mahal, dan penting terutama dalam pengerjaan DNA. Alat ini menggunakan pengisapan yang bisa mengatur berapa volume yang ingin diambil. Prinsip awal pembuatan mikropipet ditemukan oleh Warren Gilson dan Henry Lardy, Professor bidang biochemistry di University of Wisconsin-Madison. Pada awalnya, mereka membuat sebuah mesin untuk mengukur berapa volume oksigen yang dibutuhkan saat pertumbuhan suatu sel. Alat ini bekerja dengan menggerakkan piston untuk menjaga tekanan udara konstan saat oksigen digunakan. Tiga hal terpenting yang diperhatikan saat itu adalah, ukuran kecil piston, akurasi pengukuran dan pengaturan (University of Wisconsin, 2013). Ide awal pengukuran mikropipet adalah saat piston digerakkan, maka dia akan mengeluarkan udara dan selanjutnya menarik cairan masuk saat piston digerakkan kearah berlawanan. Maka, mikropipet berawal dari sebuah alat yang yang dibuat untuk mengukur perubahan kecil jumlah udara menjadi alat yang digunakan untuk memindahkan memindahkan cairan dalam skala yang yang sangat kecil. Sekarang mikropipet sangat melekat dengan bidang ilmu bioteknologi dan menjadi ikon dari biologi molekular (University of Wisconsin. 2013).
2.2 Jenis-jenis Mikropipet
Mikropipet adalah alat untuk memindahkan cairan yang bervolume cukup kecil, biasanya kurang dari 1000 µl. Banyak pilihan kapasitas dalam mikropipet, misalnya mikropipet yang dapat diatur volume pengambilannya ( adjustable volume pipette) pipette) antara 1µl sampai 20 µl, atau mikropipet yang tidak bisa diatur volumenya, hanya tersedia satu pilihan volume ( fixed volume pipette) pipette) misalnya mikropipet 5 µl. dalam penggunaannya, mikropipet memerlukan tip.
Mikropipet berdasarkan volumenya terdiri atas tiga jenis yang umum digunakan yaitu P20, P200, dan P1000. Setiap ukuran yang berbeda dirancang untuk mengukur cairan c airan dalam rentang volume yang berbeda. Mikropipet P20 dapat mengukur volume dalam kisaran 0,02 dan 0,7 ons (0,5 dan 20 mililiter) sedangkan P200 dapat mengukur volume antara 0,7 dan 6,8 ons (20 dan 200 mililiter). P1000 Mikropipet adalah Mikropipet yang tersedia lebih besar dan biasanya digunakan untuk mengukur cairan cai ran dengan volume di kisaran antara 3,4 dan 33,8 ons (100 mililiter dan 1.000) (Clare, ( Clare, 2012). Tabel 2.1 Renang volume beserta tip yang digunakan
Size
Rentang Volume
Warna Tip
Kenaikan terkecil
P20
1-20μl 1-20μl
Kuning
0.02
P200
20-200μl 20- 200μl
Kuning
0.2
P1000
100-1000μl 100- 1000μl
Biru
2
Micropipette
Menurut Cabrillo (2012) Bagian yang paling sulit dari menggunakan micropipette micropipette adalah pengaturan volume dengan benar. Pada setiap micropipette terdapat 3 tempat penyetelan nomor. Namun, angka tersebut mewakili volume yang berbeda untuk P1000, P200, dan P20: Tabel 2.2 Volume pada tiap jenis mikropipet
Nomor st
1 n
2 r
3
P20
P200
P1000
X,000μl
X00μl
X0μl
X00μl
X0μl
Xμl
X0μl
Xμl
0.Xμl
Cara pembacaan volume untuk jenis-jenis mikropipet yang berbeda dapat dilihat pada gambar dan penjelasan berikut:
Gambar 2.1 Penunjuk volume mikropipet (Wadsworth, 2011) Pada mikropipet jenis P1000, digit paling atas menunjukkan angka ribuan, bagian tengah menunjukkan angka ratusan, dan bagian bawah menunjukkan angka puluhan. Oleh karena itu, pengaturan volume pada gambar tersebut menunjukkan nilai 220 µl. Pada mikropipet jenis P200, digit paling atas menunjukkan angka ratusan, bagian tengah menunjukkan angka puluhan, dan bagian bawah menunjukkan angka satuan. Oleh karena itu, pengaturan volume pada gambar tersebut menunjukkan nilai 22 µl. Pada mikropipet jenis P20, digit paling atas menunjukkan angka puluhan, bagian tengah menunjukkan angka satuan, dan bagian bawah menunjukkan angka desimal. Oleh karena itu, pengaturan volume pada gambar tersebut menunjukkan nilai 2,2 µl (Wadsworth, 2011). 2.3 Bagian-bagian pada Mikropipet dan Macam Tips
Mikropipet digunakan dalam diagnostik molekuler untuk memindahkan cairan yang bervolume kecil secara akurat dan presisi. Penggunaan mikropipet dengan benar sangat penting dalam memastikan volume cairan yang akan
dipindahkan tersebut akurat dan mencegah terjadinya kerusakan pada bagian bagian tertentu dari mikropipet. Oleh karena itu, mengetahui bagian-bagian dari mikropipet dan memahami fungsinya merupakan suatu hal yang sangat penting (Rhodes, 2012). Adapun bagian-bagian dari mikropipet dapat dilihat pada gambar berikut:
Gambar 2.1 Bagian-bagian mikropipet Eppendorf (Netheler dan Hinz, 2011)
Tombol pengatur pada bagian atas mikropipet merupakan tombol yang berfungsi untuk memasukkan atau mengeluarkan cairan yang akan dipindahkan. Terdapat dua macam stop stop pada tombol pengatur volume ini. Stop Stop pertama digunakan untuk memasukkan volume dari cairan yang diharapkan, sedangkan stop stop kedua digunakan saat mengeluarkan seluruh cairan yang sudah berada di dalam tips (Dean et. al., 2003). Warna dari tombol tersebut menunjukkan jenis mikropipet yang digunakan. Terdapat tiga jenis mikropipet yang biasa digunakan, yaitu P20, P200, dan P1000. Warna putih menunjukkan jenis P20 yang memiliki jangkauan volume ukur 0,5-20 µl, warna kuning menunjukkan jenis je nis P200 dengan
jangkauan volume 20-200 µl, dan warna biru menunjukkan jenis P1000 yang memiliki jangkauan volume ukur 100-1000 µl (Wadsworth, 2011). Cincin pengatur volume merupakan bagian yang dapat diputar untuk mengatur volume yang diinginkan dalam pengambilan cairan yang akan dipindahkan. Tombol untuk melepaskan tips digunakan dengan cara menekan bagian tombol ini ketika sudah selesai menggunakan mikropipet dan akan melepaskan tips yang sudah selesai digunakan. Bagian penunjuk angka volume merupakan nilai volume yang diinginkan saat akan memindahkan cairan (Dean et. al., 2003). Cara pembacaan volume untuk jenis-jenis mikropipet yang berbeda dapat dilihat pada gambar dan penjelasan berikut:
Gambar 2.2 Penunjuk volume mikropipet (Wadsworth, 2011)
Pada mikropipet jenis P1000, digit paling atas menunjukkan angka ribuan, bagian tengah menunjukkan angka ratusan, dan bagian bawah menunjukkan angka puluhan. Oleh karena itu, pengaturan volume pada gambar tersebut menunjukkan nilai 220 µl. Pada mikropipet jenis P200, digit paling atas menunjukkan angka ratusan, bagian tengah menunjukkan angka puluhan, dan bagian bawah menunjukkan angka satuan. Oleh karena itu, pengaturan volume pada gambar tersebut menunjukkan nilai 22 µl. Pada mikropipet jenis P20, digit paling atas menunjukkan angka puluhan, bagian tengah menunjukkan angka
satuan, dan bagian bawah menunjukkan angka desimal. Oleh karena itu, pengaturan volume pada gambar tersebut menunjukkan nilai 2,2 µl (Wadsworth, 2011).
2.4 Hal yang Diperhatikan pada Mikropipet
Agar penggunaan mikropipet optimal, ada beberapa hal yang harus diperhatikan seperti : 1.
Konsisten Speed dan kelancaran saat tekan dan lepaskan tombolnya
2.
Konsisten tekanan pada plunger pada pertama
3.
Konsisten dan cukup saat memasukkan tip ke dalam cairan
4.
Posisi tip pada cairan “Posisinya Hampir Vertikal” dari pipet
5.
Menghindari semua gelembung udara
Beberapa hal yang perlu dihindari agar mikropipet tidak rusak dan mengakibatkan tidak akuratnya pengukuran sebagai berikut (Cosee West, 2007) : 1.
Jangan mengatur volume yang akan diambil pada mikropipet melebihi ukuran maksimalnya. Hal ini akan menyebabkan rusaknya roda gigi pada mikropipet.
2.
Jangan
menggunakan
pipet
tanpa
tips
di
ujungnya.
Lupa
menggunakan tips akan merusak piston presisi yang mengukur volume larutan. 3.
Selama ada larutan dalam tips, mikropipet harus selalu berada pada posisi tegak. Karena larutan bisa masuk ke dalam pipet dan merusak perhitungan.
4.
Ketika mengambil larutan, jangan melepas tombol penekan secara tiba-tiba. Gunakan ibu jari untuk mengontrol kecepatan lepasnya tombol penekan. Hal ini akan menyebabkan larutan masuk ke dalam pipet dan merusak piston.
5.
Sebelum memasukkan tips ke dalam larutan, tombol pipet harus ditekan dan jangan menekan melebihi stop pertama karena akan menyebabkan larutan yang diambil tidak akurat.
6.
Ketika memasukkan larutan, jangan melepas tombol penekan secara tiba-tiba tapi secara perlahan. Hal ini akan menyebabkan larutan masuk ke dalam pipet atau volume yang masuk tidak akurat.
2.5 Akurasi dan Presisi
Pengukuran tingkat presisi dan akurasi dari data yang dihasilkan akan memberikan informasi mengenai baik tidaknya hasil pengukuran dari suatu parameter kuantitas. Nilai akurasi menunjukkan kedekatan dari nilai hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya. Syarat menentukan tingkat akurasi adalah diketahuinya nilai sebenarnya dari parameter yang diukur dan kemudian dapat diketahui seberapa besar tingkat akurasinya. Nilai presisi menunjukkan tingkat reliabilitas dari data yang diperoleh. Hal ini dapat dilihat dari standar deviasi (SD) yang diperoleh dari pengukuran. Semakin kecil standar deviasi dan tingkat bias (penyebaran) rendah, akan semakin baik pula nilai presisinya. Jika diinginkan hasil pengukuran yang valid, maka perlu dilakukan pengulangan sebanyak n- kali. Dari data tersebut dapat diperoleh ukuran harga nilai terukur yang merupakan rata-rata dari hasil yang diperoleh dan standar deviasi (Tahir, 2008). Perhitungan nilai akurasi ( systematic error = = E) dan nilai presisi (random (random error = RSD atau CV(%)) dari parameter yang diukur adalah sebagai berikut (Gilson, 2007) :
Gambar 2.2 Perhitungan akurasi
Gambar 2.3 Perhitungan presis
BAB III METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan
Alat dan bahan yang digunakan pada praktikum kali ini adalah, Tabel 3.1 Alat dan bahan
Alat
Bahan
Timbangan analitik
Akuades (berat jenis 1)
Tabung Eppendorf
Gliserol (Berat jenis 1,261)
Tips Microtube 3.2 Cara Kerja
Sebelum melakukan pengerjaan, dilakukan uji kebocoran miikropipet. Pertama, volume mikropipet diatur hingga mencapai volume maksimal. Lalu, tips diisi dengan akuades. Mikropipet didiamkan pada posisi tegak selama 20 detik. Apabila terdapat air menetes, maka terdapat kebocoran. Pada mik ropipet ropipet yang memiliki volume maksimal ≤ 200 µl, ujung tips dicelupkan kedalam air, dan apabila terdapat penurunan permukaan air maka terdapat kebocoran. Selanjutnya dilakukan uji akurasi dan presisi. Volume yang akan diambil disesuaikan dengan mikropipet yang akan digunakan (p20, p200, atau p1000). Selanjutnya tabung eppendorf ditimbang saat kosong dan sesudah diisi cairan untuk mendapatkan berat cairan. Dalam konversi berat ke volume, nilai faktor Z digunakan yang tertera pada tabel. Perbandingan rata-rata berat cairan hasil perhitungan dengan yang yang diharapkan dibandingkan.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil dan Pengolahan Data Pengamatan Pengamatan
Berikut adalah data yang diperoleh berdasarkan percobaan penggunaan mikropipet, Tabel 4.1 Hasil percobaan
m Sebelum
12.1.a 12.2.a 12.3.a
12.1.g 12.2.g 12.3.g
m Sesudah 1.066,7 1.0135 mg mg 1.012 mg 1.060 mg 1.012,4 1.061,7 mg mg Volume rata-rata 1.010,8 1.099,4 mg mg 1.092,8 1.011 mg mg 1.011,4 1.093,3 mg mg Volume rata-rata
Volume Cairan 53,4 µl 48,2 µl 49,5 µl
66,3 µl 64,8 µl 64,9 µl 65,3 µl
Keterangan : a = Aquades g = Gliserol
Akuades ∆m Aquades = msesudah – m msebelum
∆m 12.1.a = 1.066,7 mg mg – – 1.013,5 1.013,5 mg = 53,2 mg ∆m 12.2.a = 1.066 mg – 1.012 1.012 mg = 48 mg ∆m 12.3.a = 1.061,7 mg mg – – 1.012,4 1.012,4 mg = 49.3 mg
V cairan = ∆m x Z Massa jenis Keterangan : Massa jenis air : 1 mg/ µl Z = faktor koreksi = 1,0045
V 12.1.a = 53,2 x 1,0045 = 53,4 µl 1 V 12.2.a = 48 x 1,0045 = 48,2 µl µl 1 V 12.3.a = 49,3 x 1,0045 = 49,5 µl 1 E % = Vrata-rata – Vrata-rata – Vo Vo x 100% Vo E% = 50,3924167-50 50,3924167-50 x 100% = 0,78484 % 50 RSD = SD x 100% Vrata2 RSD = 2,718343545 2,718343545 x 100% = 5,39435 % 50,3924167
Gliserol ∆m Gliserol = msesudah – m msebelum
∆m 12.1.g = 1.010,8 mg – mg – 1.094,4 1.094,4 mg = 83,6 mg ∆m 12.2.g = 1.011 mg – 1.092,8 1.092,8 mg = 81,8 mg ∆m 12.3.g = 1.011,4 mg – mg – 1.093,3 1.093,3 mg = 81,9mg
V cairan = Keterangan : Massa jenis gliserol : 1,261 mg/ µl V 12.1.a = 53,2 = 66,3 µl 1,261 V 12.2.a = 48 = 64,8 µl 1,261 V 12.3.a = 49,3 = 64,9 µl 1,261
∆m Massa jenis
E % = Vrata-rata – Vrata-rata – Vo Vo x 100% Vo E% = 65,371398 – 65,371398 – 3 3 x 100% = 117,9 % 30 RSD = SD x 100% Vrata2 RSD = 0,802220318x 100% = 1,227 % 65,371398
4.2 Pembahasan
Dari hasil pengamatan, perhitungan error percentase percentase pada akurasi mikropipet didapatkan hasil pada akurasi akuades sebesar 0,78% atau 0,0078 µl dan 117,9% atau 1,179 µl pada gliserol. Jika dilihat dari presentase, nilai eror dari perhitungan gliserol sangat besar. Namun hasil yang didapat jika dibandingkan dengan literatur masih dalam jangkauan yang dapat ditoleransi. Literatur yang menyatakan systematic menyatakan systematic error e rror maksimum maksimum yang masih dapat ditoleransi untuk P200 adalah ±1,6 µl. Pada perhitungan RSD, hasil yang didapat untuk akuades adalah sebesar 5,39435 % % dan untuk gliserol adalah sebesar 1,227%. Dari hasil terlihat bahwa gliserol lebih presisi dibandingkan dengan akudes walaupun memiliki akurasi yang lebih rendah dari akuades. Kedua nilai error presisi sama seperti nilai error akurasi yaitu masih dalam jangkauan yang dapat ditoleransi (Gilson, 2007). Pada literatur, nilai maksimum error yang dapat ditoleransi pada “random error” dengan mikropipet yang sama adalah
≤
0,6 µl. Masih ditoleransinya error
pada presisi dan akurasi mengartikan bahwa mikropipet yang digunakan dalam percobaan masih akurat dan presisi (Gilson ,2007). Saat proses pengambilan zat, mikropipet harus selalu dalam keadaan tegak karena larutan yang telah diambil dapat masuk ke dalam pipet dan merusak piston yang terdapat dalam mikropipet. Dan jika piston atau alat lain didalam mikropipet itu rusak, pengukuran volume akan menjadi tidak akurat (COSEE West, 2007).
BAB V KESIMPULAN
Kesimpulan dari percobaan ini adalah, 1. Perbedaan pengambilan cairan kental dengan encer adalah pada cairan encer tombol ditekan hanya sampai stop satu, sedangkan pada cairan kental tombol ditekan sampai stop dua. 2. Nilai 2. Nilai akurasi dan presisi maksimal dari mikropipet P200 berdasarkan percobaan untuk akuades adalah 0,78484 % dan 5,39435 %, dan untuk gliserol adalah 117,9 % dan 1,227 %. 3. Mikropipet yang digunakan masih tergolong akurat dan presisi karena hasil masih berada pada jangkauan nilai maksimum akurasi dan presisi, yaitu ±1,6 µl dan ≤ 0,6 µl. µl.
DAFTAR PUSTAKA
Cabrillo. 2012.”WORKING WITH MICROPIPETS.http://www.cabrillo.edu/~ MICROPIPETS .http://www.cabrillo.edu/~ ytan/Bio1AF04/Lab7%20Micropipetting.pdf.Diakses ytan/Bio1AF04/Lab7%20Micropipetting.pdf. Diakses
pada
tanggal
1
November 2013. Clare. 2012. “Mastering the micropipette”. https://www2.bc.edu/clare micropipette”. https://www2.bc.edu/clare--oconnor/ bcbc/courses/bi204_2014F/3--micropipettes_2013.pdf. bcbc/courses/bi204_2014F/3 micropipettes_2013.pdf. diakses pada tanggal 1 November 2013. COSEE West.2007.”Skill West.2007.”Skill Building Activity 1: Manipulating Small Volumesolumes Student Guide”.San Fransisco. Dean, M., Fraga, D., Morgan, W., Tauer, T., dan L. Stroschine. 2003. “Instruction in Basic Equipment Needed for Chemistry and Biology: Micropipette”. http://www.public.coe.edu/ibench/pipet/parts.htm
Diakses
tanggal
3
November 2013. Gilson SAS.2007.”Verification Procedure for Accuracy and Precision”.Standard Precision”. Standard Operating Procedure Procedure for Pipettes.Perancis. Pipettes.Perancis. Netheler, H., dan Hans Hinz. 2011. 2011. “Eppendorf Research Plus: Micropipette” http://www.eppendorf.com/int/index.php http://www.eppendorf.com/int/index.php?l=211&action=p ?l=211&action=products&contentid roducts&contentid =1&catalognode=67026&productpage=1 Diakses tanggal 2 November 2013. Rhodes,
Richard.
2012.
“Laboratory
3:
Micropipettes”.
http://www.austincc.edu/mlt/mdtech/MLAB2479Lab3UseOfMicropipettesSu mmer2012.doc Diakses tanggal 30 Oktober 2013. Tahir, Iqmal.2008. Paper Seri Manajemen Laboratorium. Laboratorium. Penerbit UGM : Yogyakarta. University of Wisconsin. 2013. http;//www.biotech.wisc.edu/outreach/ 2013. http;//www.biotech.wisc.edu/outreach/ pipettestory.html . Diakses tanggal 30 Oktober 2013 pukul 19.12 WIB. Wadsworth,
Gregory.
2011.
“Use
of
Micropipette”.
http://faculty.buffalostate.edu/wadswogj/courses/BIO21 http://faculty.buffalostate.edu/wadswogj/courses/BIO211%20Page/Resources/ 1%20Page/Resources/ micropipetting%20lab.pdf Diakses tanggal 30 Oktober 2013.
