“UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN”
FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE BIOLOGÍA-MICROBIOLOGÍA
INFORME DE PRÁCTICAS PRE PROFESIONALES
ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE MUESTRAS DE AGUAS, ALIMENTOS Y SUPERFICIES VIVAS E INERTES
Institución: Dirección Ejecutiva de Salud Ambiental
Presentado por: Israel José Salazar Quispe 15 de Febrero – 15 de Mayo Tacna – Perú 2012
INDICE GENERAL
I.
GENERALIDADES………………………………………………….Pág.03
Razón social de la empresa o institución – descripción
………….Pág.03
Ubicación……………………………………………………………….. . Pág.04
Organización de la empresa o institución……………………….. ...Pág.05 Objetivos de la práctica……………………………………………… ....Pág.22
II. FUNDAMENTO TEORICO…………………………………………Pág.25 Agua………………………………………… Agua…………………………………………………………………… …………………………....Pág 25 Vigilancia de la calidad de agua de consumo humano….............. ....Pág.26 Requisitos de calidad del agua para consumo humano…............ ...Pág.28 Aspectos generales generales de microbiología microbiología de aguas…........... aguas…....................... ............ .....Pág.31 Alimentos…............... Alimentos…............................ ............................ ........................... ........................... ............................ ............. ....Pág.35 Normativa sanitaria de alimentos…............................................. ......Pág.38 Aspectos microbiológicos….. microbiológicos….............. ......................... ............................ .............................. ................. .....Pág.38 Superficies vivas e inertes relacionadas a alimentos….... .................Pág.41
III.
………...................................... ................ ... ...........Pág.48 MATERIAL Y METODO……….........................
Preparación y esterilización de medios de cultivos y diluyentes…… Pág.48 Instructivo de preparación y dilución de muestras………………… . ..Pág.53 Procedimiento de recuento de bacterias heterotróficas………….. … Pág.57 Procedimiento de Monitoreo Ambiental …………………………… ……………………………… …Pág.65
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Procedimiento de análisis para la detección de Salmo ……Pág. ……Pág.66 Salmo nella spp Procedimiento de análisis para la numeración de S t a p h y l o c o c c u s áu r e u s ………………………………………………………………….......Pág.80 Procedimiento de análisis de coliformes fecales por filtro de membrana ……………………………………………………Pág.94
Procedimiento de análisis de coliformes totales, fecales y E. … c o l i ………………………………………………………………………….. ………………………………………………………………………..Pág.103
Procedimiento para análisis de superficies …………………………….Pag.114
IV. RESULTADOS………………………………………………………..Pág.121 Muestras de Agua Potable (Cuadro 1) ………………………………..Pág.121 Muestras de Agua Natural (Cuadro 2) ……………………… ………..Pág.133 Muestras de Agua de Mar (Cuadro 3) ……………………………. …Pág.139 Muestras de Alimento (Cuadro 4) …………………… ………………..Pág.144 Muestras de Análisis de superficies (Cuadro 5) ………………… …..Pág 147
V. CONCLUSIONES Y Pág.153 SUGERENCIAS……………………………………………………….Pág.153 5.1
Conclusiones………………………………………………………..Pág.153
5.2
Sugerencias……………………………………………………....... Pág.154.
VI. BIBLIOGRAFÍA ……………………………………………………….. Pág 157 Pág.159 VII. ANEXOS……………………………………………………………….Pág.159
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I. 1.1.
GENERALIDADES
Razón social de la empresa o institución – descripción: La Dirección Ejecutiva de Salud Ambiental de la Dirección Regional de
Salud Tacna, es una institución que despliega una serie de acciones de control y asesoramiento técnico a las diferentes empresas que desarrollan sus trabajos en los sectores de pesquería, industria manufacturera, agroindustria y transportes a fin de que la ejecución de estas actividades económico - productivas, no ocasionen impactos negativos en el medio ambiente y la salud humana. Para ello cuenta con el personal profesional y Técnico capacitado en sus diferentes divisiones. La cuál tiene como función básica la dirección y coordinación de actividades técnico-administrativas de alto nivel de responsabilidad en programas de línea asignados al Área de competencia del Ministerio de Salud y Gobierno Regional de Tacna. La función básica es lograr que se cumpla la política, visión, misión, objetivos y normas nacionales y regionales de salud.
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Relaciones internas: Se encuentra bajo la Dirección del MINSA, y de la Gerencia
Regional de Desarrollo Social del Gobierno Regional de Tacna, ante quienes da cuenta de su gestión. Dirige y supervisa a las Unidades Orgánicas de la Dirección
Regional de Salud-Tacna y sus Órganos desconcentrados del Hospital Hipólito Unánue de Tacna y Dirección de Red de SaludTacna.
Relaciones externas:
Entidades y organizaciones públicas y privadas del sector y Sistema Nacional, Macro-regional y Regional de Salud.
1.2.
Ubicación: El laboratorio de salud ambiental se localiza en la dirección ejecutiva
de salud ambiental, ubicado en la prolongación dos de mayo s/n segundo piso.
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1.3.
Provincia
Tacna
Departamento
Tacna
Distrito
Tacna
Organización de la empresa o institución: La Dirección Ejecutiva de Salud Ambiental de la Dirección Regional de
Salud Tacna, como Autoridad Sanitaria tiene por función la Protección del Medio ambiente, el Saneamiento Básico, la Higiene Alimentaria y el Control de Zoonosis para lo cual está dividido en cuatro grupos de trabajo los cuales son los siguientes:
Equipo de trabajo de saneamiento básico, higiene alimentaria y zoonosis.
Equipo de trabajo de ecología, ecología, protección ambiental y salud ocupacional.
Equipo de trabajo de sanidad aérea, marítima y de fronteras.
Laboratorio.
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Para ello cuenta con el personal profesional y Técnico capacitado en sus diferentes Direcciones.
ORGANIGRAMA ESTRUCTURAL DE LA DIRECCIÓN EJECUTIVA EJECUT IVA DE SALUD AMBIENTAL
DIRECCION REGIONAL DE SALUD TACNA
DIRECC DIRECCII N EJECU EJECUTIV TIVA A DE SALUD AMBIENTAL
Secretaria Laboratorio
EQUIPO DE TRABAJO DE SANEAMIENTO BASICO, HIGIENE ALIMENTARIA ALIMENTARIA Y
EQUIPO DE TRABAJO DE ECOLOGÍA, PROTECCIÓN AMBIENTAL Y SALUD OCUPACIONAL
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EQUIPO DE TRABAJO DE SANIDAD ÁEREA, MARÍTIMA Y DE FRONTERAS
1.3.1. Organigrama estructural estructural de la dirección de saneamiento básico higiene alimentaria y control de zoonosis: z oonosis:
DIRECTOR DIRECTOR DE DE SANEA SANEAMIENTO MIENTO B SICO HIGIEN HIGIENE E ALIMENTARIA Y CONTROL DE ZOONOSIS
DE LA DIVI DIVIS SI N DE DE DIVIS DIVISII N DE SERVI SERVICI CIOS OS BÁSICOS
AREA DE SERVICIOS BÁSICOS
AREA DE RESIDUOS
DIVISIÓN DE CONTROL DE
VIGILANCIA Y CONTROL DE
ZOONOSIS Y VECTORES
ALIMENTOS Y SERVICIOS SERVICIOS
AREA DE CONTROL DE ZOONOSIS
AREA DE CONTROL DE VECTORES
AREA DE INSP. INSP. A ESTABLECIMIENTOS DE ELABORACIÓN DE ALIMENTOS Y BEBIDAS BEBIDAS AREA DE INSPECCIÓN A CENTROS RECREACIONALES
DOMICILIARIOS AREA DE INSPECCI INSPECCI N A ESTABLECIMIENTOS DE SERVICIOS
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1.3.2. Organigrama estructural de la dirección de ecología, protección del ambiente y salud ocupacional:
DIRECCION DE ECOLOG A, PROTECCI N DEL AMBIENTE Y SALUD OCUPACIONAL
AREA DE PROTECCION DE RECURSOS HÍDRICOS Y DE AGUAS COSTERA
VIGILANCIA DE RECURSOS HIDRICOS
AREA DE PREVENCI N Y CONTROL DE LA CONTAMINACION
AREA DE PROTECCI N DE PREVENCIÓN. DE RECURSOS. NATURALES, FLORA Y FAUNA
VIGILANCIA Y CONTROL DE LA CALIDAD DEL AIRE
AREA SALUD OCUPACIONAL
VIGILANCIA Y CONTROL DE RESIDUOS PELIGROSOS
PROGRAMA DE VIGILANCIA Y CONTROL EN SALUD, HIGIENE
VIGILANCIA Y CONTROL DE CEMENTERIOS
PROGRAMA DE VIGILANCIA EN PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES Y ACCION OCUPACIONAL
VIGILANCIA DE VERTIMIENTOS
CONTROL Y CONTAMINACION ATMOSFERICA
VIGILANCIA DE ZONAS COSTERAS
CONTAMINACION POR RUIDO
VIGILANCIA Y DESARROLLO SOSTENIBLE DE LA BIODIVERSIDAD
VIGILANCIA DE EMFERMEDADES CAUSADAS POR CONTAMINACION ATMOSFERICA
VIGILANCIA Y CONTROL DE LAS EXPORTACIONES / IMPORTACIONES TRANSFRONTERISOS
VIGILANCIA Y CONTROL DE SUSTANCIAS PELIGROSAS
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1.3.3. Organigrama estructural de la dirección de sanidad aérea marítima y fronteras
DIRECCCI N DE SANIDAD A REA MARÍTIMA Y FRONTERAS
ADMINISTRACIÓN
AREA DE TERRESTRE
SANTA ROSA
AREA DE PUERTOS
PUERTO ARICA
ZOFRA - TACNA PUERTO GRAU PALCA
TOMASIRI
ESTIQUE FERROCARRIL 9
AREA DE AEROPUERTOS
1.3.4. Laboratorio de salud ambiental: El laboratorio de salud Ambiental brinda soporte analítico a los equipos de trabajo del DESA , en la ejecución de las acciones de vigilancia y control en salud ambiental, mediante el diagnóstico de la calidad sanitaria del agua ( mar , piscinas , potable, residuales, cuencas ) , alimentos , superficies en contacto con los alimentos ( superficies vivas e inertes ) identificando y cuantificando los contaminantes biológicos contribuyendo de este modo a la adecuada y oportuna toma de decisiones, especialmente en casos de contingencia y alertas sanitarias. Es en este contexto el laboratorio viene consolidando la implementación de un sistema de gestión de la calidad de acuerdo a la Norma NTP ISO/IEC 17025:2006 con el fin de buscar el reconocimiento de su competencia. La dirección ejecutiva de salud ambiental pertenece a la dirección de salud Tacna.
A. Objetivo:
Brindar resultados analíticos confiables y eficaces en apoyo a los diferentes programas sanitarios ambientales de la dirección ejecutiva de salud ambiental.
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B. Funciones:
Brindar soporte analítico cualitativo y cuantitativo mediante ensayos biológicos de contaminantes relacionados a las actividades de identificación, vigilancia y control de riesgos ambientales para la salud.
Implementar el sistema de gestión de la calidad
Brindar soporte analítico a solicitud de parte en los ensayos de su competencia.
Planificar, organizar y monitorear las actividades para implementar y mejorar el sistema de gestión de la calidad del laboratorio de salud ambiental.
Implementar el sistema de gestión de la calidad del laboratorio en base a la política y objetivos del laboratorio.
Mantener actualizada la documentación del sistema de gestión de la calidad.
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Mantener interacción permanente con los usuarios del laboratorio con relación a los métodos característicos resultados de los ensayos.
Realizar los ensayos microbiológicos en muestras de aguas, alimentos y superficies en contacto con alimentos aplicando los criterios de calidad para garantizar la confiabilidad de los resultados de los ensayos que constituyen el soporte técnico de las acciones de control y vigilancia en aspectos higiene.
Implementar métodos de análisis de acuerdo a las necesidades de la DESA y en cumplimiento con la normativo vigente actualmente se viene fortaleciendo el análisis de microorganismos patógenos como Salmonella , E coli y S. áu reu s .
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El laboratorio está dividido en 5 áreas:
LABORATORIO DE SALUD AMBIENTAL
Área de recepción de muestras
Área de almacén
Área de preparación de medios de cultivo
Área de esterilización y lavado
rea de análisis Microbiológico
1.3.5. Área de recepción de muestras: Área destinada a recepcionar las muestras que ingresan de las diferentes localidades de Tacna; para su respectivo análisis microbiológico, abarcando muestras derivadas de acciones de vigilancia, control, fiscalización sanitaria, denuncias entre otros.
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Esta área cuenta con su respectivo procedimiento aprobado “recepción de muestras para análisis microbiológicos”, el cual establece las
condiciones y requisitos de recepción, que aseguran la representatividad y características necesarias que deben reunir las muestras para ser analizadas, y nos menciona lo siguiente:
Finalidad: Contribuir a asegurar la confiabilidad y reproductibilidad de los resultados de los análisis de agua que se efectuaran en el laboratorio de Salud ambiental de la dirección ejecutiva de salud ambiental – DESA.
Procedimiento de Aplicación: Las principales características para recepcionar las muestras de agua y alimentos son:
Frascos de vidrio estériles, conteniendo un mínimo de 250 o 500 ml de muestra de agua según sea el caso. Para muestras de alimentos las bolsas de plástico, estériles deben tener una capacidad adecuada para que la cantidad de muestra a recolectar pueda sellarse firmemente tras su llenado.
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Para el caso de superficies vivas los frascos deben contener 100 ml solución diluyente.
Para el caso de superficies inertes los tubos de ensayo deben contener 10 ml de agua peptonada tamponada al 0,1 %, con sus respectivos hisopos estériles.
Deben estar claramente rotulados (código de campo).
El transporte de las muestras debe realizarse en recipientes refrigerados (coolers) para que el material recolectado se conserve por debajo de los 10 ºC.
El tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta la llegada al laboratorio; para el caso de muestras de agua tratada, superficies vivas e inertes, no debe pasar más de 24 horas mientras que para muestras de alimentos, agua de mar, aguas residuales, aguas naturales, no debe exceder de más 6 horas.
Deben presentar la respectiva cadena de custodia (previamente llenada).
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La cadena de custodia refleja en los documentos en donde se registra toda la información relevante para asegurar la integridad de la muestra desde la recolección hasta el reporte de resultados por parte del laboratorio. La importancia de contar con este documento radica en prevenir la falsificación y/o alteración de los datos de campo, así como para definir la cantidad y tipos de análisis requeridos, el tipo de pre tratamiento al que ha sido sometido, la fecha y hora de muestreo, el numero de frascos remitidos por punto de muestreo, la fecha y hora de remisión, la identificación del responsable del muestreo y todo lo relacionado con la recepción por parte del laboratorio; para luego asignarle a cada una de las muestras un código de laboratorio y posteriormente
ser
procesadas
en
el
área
de
análisis
microbiológico.
Toda la información es recopilada a través de las cadenas de custodia las cuales son transferidas a la base de datos que se encuentra en el área de recepción de muestras para fines institucionales.
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1.3.6. Área de almacén: Debido a la demanda que tiene el laboratorio de salud ambiental, es necesario que tengan un almacén el cual debe abastecer las necesidades que esta requiera, para su normal funcionamiento y por ende brindar los análisis respectivos. Es un área destinada a guardar stock de los materiales e insumos necesarios para el funcionamiento del laboratorio. Esta área también cuenta con una base informativa que controla el ingreso y salida de los diferentes materiales de uso común en un laboratorio.
1.3.7. Área de lavado, control y esterilización de materiales: Área destinada al lavado, preparación y esterilización del material necesario para el análisis microbiológico; para lo cual se requiere uso de material de vidrio, equipos de esterilización a calor húmedo y seco, etc. Esta área cuenta con su respectivo procedimiento aprobado “lavado de material de cristalería y esterilización “el cual proporciona las siguientes
instrucciones:
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Finalidad: Reunir todas las condiciones necesarias y de seguridad para poder realizar actividades de preparación y esterilización de materiales.
Procedimiento de aplicación:
Descontaminar todo material de vidrio proveniente de incubación, antes de someter al proceso de lavado en autoclave por 30 minutos a 121ºC y a 15 libras de presión.
Sumergir en solución de Tegol al 0,5 % o solución desinfectante de hipoclorito de sodio, todo material utilizado durante ensayos microbiológicos antes del lavado.
Utilizar una solución de detergente neutro (alconox) y dejar inmerso el material durante 1 hora a temperatura ambiente.
Para esterilización a calor seco, colocar el material de vidrio e instrumentos envueltos en papel kraff en el horno durante 3 horas a 170 ºC.
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Control del proceso de esterilización: Para el control del proceso de esterilización en el horno se coloca una cinta indicadora de esterilización de calor seco por cada lote de material a esterilizar, el cambio de color en la cinta indicará que el material ha sido expuesto a temperatura de esterilización, de igual manera se utiliza otra cinta para esterilización a calor húmedo.
Control de calidad de material de vidrio: Para comprobar que se ha realizado un buen lavado de material de vidrio se añade unas gotas de azul de bromotimol al 0.04 % (ABT) y observar en cambio en el color. En el caso que el ABT virara al color azul indicará presencia de álcali; al color amarillo indicará presencia de ácido y el color verde corresponderá el neutro. Si la reacción es neutra, el material se liberara para su uso, caso contrario se repetirá el lavado. Para comprobar que no existen residuos de grasa en el material de lavado, tomar de manera aleatoria cualquier pieza y dejar escurrir el agua observando si la película es continúa.
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1.3.8. Área de preparación de medios de cultivo: Área destinada a la preparación y al control de todos los medios de cultivo para los análisis microbiológicos. En esta área cuenta con su respectivo procedimiento aprobado “preparación de medios de cultivo y diluyentes” el cual nos proporciona las
siguientes instrucciones:
Finalidad: Llevar a cabo la preparación, esterilización y controles de esterilidad de los medios de cultivo y diluyentes.
Procedimiento de aplicación:
Para la preparación de medios de cultivo utilizar recipientes que tengan el doble del volumen que se va a preparar siguiendo las instrucciones del fabricante para pesar la cantidad exacta del medio y proceder a disolverla en agua destilada.
Calentar hasta disolver el medio, con cuidado de no sobrecalentar e inmediatamente distribuirlo en frascos de vidrio o tubos de
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ensayo y esterilizarlo como máximo dentro de las dos horas siguientes.
Verificar el pH del medio antes y después de la esterilización utilizando una cinta indicadora y reajustar con soluciones de NaCl y HCl si es necesario.
Examinar los medios recién preparados para comprobar el color el oscurecimiento o posible precipitación. Si los tubos contienen campanas Durham, manipular cuidosamente para no formar burbujas de aire.
1.3.9. Área de análisis microbiológico: En esta área se evalúa y analiza los parámetros microbiológicos de todas las muestras que ingresen al laboratorio de Salud Ambiental.
Función: Realiza ensayos microbiológicos en muestras de aguas alimentos y superficies vivas e inertes en contacto con alimentos, aplicando los criterios de esterilidad para garantizar la confiabilidad de los resultados de los
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ensayos que constituyen el soporte técnico de las acciones de control y vigilancia en aspectos de higiene alimentaria y calidad de agua de consumo humano. Implementa métodos de análisis de acuerdo a las necesidades de la DESA, y en cumplimiento con la normativa vigente. Actualmente se viene fortaleciendo el análisis de microorganismos patógenos como Salmonella , , Staph ylo co ccu s áur eus . Escherichia Coli
Procedimiento de aplicación: Cada procedimiento cuenta con un protocolo dependiendo de la muestra que se va a analizar.
1.4.
Objetivos de la práctica: Objetivo general: 1. Adquirir conocimientos prácticos y teóricos en los
análisis
microbiológicos de muestras de aguas, alimentos, superficies inertes y vivas ingresadas al laboratorio de la Dirección Ejecutiva de Salud Ambiental.
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Objetivos específicos: 1. Aplicar los métodos y/o técnicas microbiológicas apropiadas para el análisis de aguas, establecidas por la DIGESA NTP ISO / IEC 17025: 2006.
2. Determinar la calidad microbiológica de las muestras de agua potable (agua de consumo humano), agua natural, aguas de piscinas y agua de mar mediante la aplicación de los procedimientos
técnicos
específicos
basados
en
normas
internacionales y establecidas por la DIGESA-DS N° 031-2010SA.
3. Determinar la calidad microbiológica de las muestras de alimentos, superficies vivas e inertes, según la aplicación de la norma sanitaria, Resolución Ministerial N° 461-2007 / MINSA.
4. Aplicar el procedimiento normalizado para el monitoreo ambiental (calidad microbiológica del aire y superficies) del área de análisis microbiológicos basado en la norma ISO / IEC 17025-1999. Ítem 5.3
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5. Conocer
como
recepcionar las muestras que lleguen al
laboratorio de la dirección ejecutiva de salud ambiental según procedimiento.
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II. 2.1.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Agua: El agua es uno de los bienes más importantes y escasos que tienen
las personas alrededor del mundo, nuestro país no es una excepción; muchas de nuestras poblaciones se ven obligados a beber de fuentes cuya calidad deja mucho que desear y produce un sin fin de enfermedades a niños y adultos. El acceso al agua potable es una necesidad primaria y por lo tanto un derecho humano fundamental, en este contexto con la finalidad de garantizar su inocuidad, prevenir los factores de riesgos sanitarios, así como proteger y promover la salud y bienestar de la población el estado elaboró el Reglamento de los requisitos Oficiales Físicos, Químicos y Bacteriológicos que deben reunir las aguas de bebida para ser consideradas potables en (1946), luego en el año 2000, la Dirección General de Salud Ambiental, asume la tarea de elaborar el “Reglamento de la Calidad del Agua para Consumo Humano” , tarea que el 26 de setiembre del 2010, a través del D.S.
N° 031-2010-SA, se vió felizmente culminada.(MINSA,2010)
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2.2.
Vigilancia de la calidad de agua de consumo humano: La vigilancia sanitaria del agua para consumo humano es una
atribución de la Autoridad de Salud, que se define y rige como:
1. La sistematización de un conjunto de actividades realizadas por la Autoridad de Salud, para identificar y evaluar factores de riesgo que se presentan en los sistemas de abastecimiento de agua para consumo humano, desde la captación hasta la entrega del producto al consumidor, con la finalidad de proteger la salud de los consumidores en cumplimiento de los requisitos normados en este Reglamento.
2. Un sistema conducido por la Autoridad de Salud, el cual está conformado por consumidores, proveedores, instituciones de salud y de supervisión de ámbito local, regional y nacional
3. El establecimiento de prioridades y de estrategias para la prevención o eliminación de los factores de riesgo en el abastecimiento del agua, que la Autoridad de Salud establezca para el cumplimiento por el proveedor
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Programa de vigilancia: La DIGESA y las Direcciones de Salud o las Direcciones Regionales de Salud o las Gerencias Regionales de Salud en todo el país, administran el programa de vigilancia sanitaria del abastecimiento del agua, concordante a sus competencias y con arreglo al presente Reglamento. Las acciones del programa de vigilancia se organizan de acuerdo a los siguientes criterios:
1. Registro: Identificación de los proveedores y caracterización de los sistemas de abastecimiento de agua.
2. Ámbito: Definición de las zonas de la actividad básica del programa de vigilancia, distinguiendo el ámbito de residencia: urbano, peri urbano y rural, a fin de determinar la zona de trabajo en áreas geográficas homogéneas en cuanto a tipo de suministro, fuente y administración del sistema de abastecimiento del agua.
3. Autorización sanitaria: Permiso que otorga la autoridad de salud que verifica los procesos de potabilización el agua para consumo humano, garantizando la remoción de sustancias o elementos contaminantes para la protección de la salud.
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4. Monitoreo: Seguimiento y verificación de parámetros físicos, químicos, microbiológicos u otros señalados en el presente Reglamento, y de factores de riesgo en los sistemas de abastecimiento del agua.
5. Calidad del agua: Determinación de la calidad del agua suministrada por el proveedor, de acuerdo a los requisitos físicos, químicos, microbiológicos y parasitológicos del agua para consumo humano establecidos en el presente Reglamento.
6. Desarrollo de indicadores: Procesamiento y análisis de los resultados de los monitoreos de la calidad del agua, del sistema de abastecimiento y del impacto en la morbilidad de las enfermedades de origen o vinculación al consumo del agua.
2.2.1. Requisitos de calidad del agua para consumo humano: Parámetros microbiológicos y otros organismos: Según el Artículo 60° de la norma sanitaria del Reglamento de la Calidad del Agua para Consumo Humano de la DIGESA DS N° 031-2010SA.
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Toda agua destinada para el consumo humano, como se indica en el Anexo 1, debe estar exenta de:
1. Bacterias coliformes totales, termotolerantes y Escherichia coli . 2. Virus. 3. Huevos y larvas de helmintos, quistes y ooquistes de protozoarios patógenos.
4. Organismos de vida libre, como algas, protozoarios, copépedos, rotíferos y nemátodos en todos sus estadios evolutivos.
5. Para el caso de Bacterias Heterotróficas menos de 500 UFC/ml a 35°C.
Parámetros de calidad organoléptica: Según “Artículo 61° del reglamento N° 031-2010-SA.” El noventa por ciento (90%) de las muestras tomadas en la red de distribución en cada monitoreo establecido en el plan de control, correspondientes a los parámetros químicos que afectan la calidad estética y
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organoléptica del agua para consumo humano, no deben exceder las concentraciones o valores señalados en el (Anexo 2).
Parámetros inorgánicos y orgánicos: Según “Artículo 62° del reglamento N° 031-2010-SA.” Toda agua destinada para el consumo humano, no deberá exceder los límites máximos permisibles para los parámetros inorgánicos y orgánicos señalados en el (Anexo 3).
Parámetros de control obligatorio (PCO): Según “Artículo 63° del reglamento N° 031-2010-SA.” Son parámetros de control obligatorio para todos los proveedores de agua, los siguientes:
Coliformes totales
Coliformes termotolerantes
Color
Turbiedad
Residual de desinfectante
pH 30
En caso de resultar positiva la prueba de coliformes termotolerantes, el proveedor debe realizar el análisis de bacterias Escherichia coli , como prueba confirmativa de la contaminación fecal.
2.2.2. Aspectos generales de microbiología de aguas: Los microorganismos presentes en los diferentes tipos de aguas, constituyen una gran variedad de géneros y especies que juegan roles importantes, por ejemplo, en los ciclos biogeoquimicos, transformando los diferentes componentes orgánicos e inorgánicos, contribuyendo de esta forma a la transferencia de energía, en presencia de oxigeno; siendo estos los iniciadores de la cadena trófica en los cuerpos de aguas naturales. (Lazcano, 2000) Así mismo, la acción metabólica de los microorganismos, es aplicada en los sistemas de bioestabilización para la transformación de la materia orgánica (DBO) presente en aguas de desechos, contribuyendo de esta forma a descontaminar las fuentes receptoras de aguas y suelos. (Lazcano, 2000)
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Cuando las descargas de desagües, principalmente domésticos, son arrojadas a los cuerpos de agua, los microorganismos allí presentes representan un riesgo potencial para la salud de la población usaría, especialmente cuando estas constituyen fuentes de abastecimiento de agua de bebida, siendo frecuentes las enfermedades hídricas por consumo de aguas sin tratamiento, o con tratamientos deficientes, especialmente en la desinfección. (Lazcano, 2000) El grupo coliforme y principalmente la bacteria Escherichia coli , es el indicador de mayor importancia en la calidad sanitaria del agua, y los métodos de diagnóstico para la detección cualitativa o cuantitativa de los indicadores, debe ser realizada por personal entrenado, a fin de obtener resultados confiables, que permitan tomar decisiones en caso fuera necesario, a fin de evitar o minimizar los riesgos epidémicos y/o focos infecciosos puntuales. (ICMFS, 2000) Los métodos usados comúnmente en el diagnostico microbiológico de aguas se basan principalmente en el tipo de aguas que se trate , así las aguas con turbiedades excesivas (mayores de 20 NTU) o con presencia de detritos , materia orgánica u otros elementos, deben analizarse por métodos
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cualitativos, semi-cuantitativos o por el método de tubos múltiples , para estos exámenes existen medios de cultivo apropiados para diversos parámetros analíticos y los reportes finales se dan en NMP ( numero más probable) por 100 ml de muestra.(Lazcano,2000) Cuando las muestras de agua corresponden a bajas turbiedades , lo más recomendable es usar la técnica de filtración por membrana , la que retiene de acuerdo al tamaño de poro ( generalmente se usa el de 0,45 µm) a todos los microorganismos presentes y que colocada en la superficie de un medio de cultivo líquido o sólido selectivo para el tipo de microorganismo a usar , e incubando a una temperatura y tiempo de incubación adecuado , se obtienen colonias las que se pueden contar a simple vista o con la ayuda de un microscopio estereoscópico .Los resultados se reportan siempre como UFC
(unidades
formadoras
de
colonias)
por
unidad
de
volumen.(Lazcano,2000)
Organismos patógenos: Representados por virus como los de la hepatitis, poliomelitis, etc bacterias como el Vibrio cho lerae , Salmonella , Shigella , Escherichia coli enterotoxigénico y enteropatogénico, Yersinia enterocolitica , etc los que
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son eliminados fácilmente con la adición de cloro quistes de protozoarios como Giardia intestinalis y C r y p t o s p o r i d i u m p a r v u m los que son altamente resistentes a la acción de cloro, por lo que su eliminación debe realizarse en los procesos de coagulación y filtración.
Indicadores de contaminación fecal: El concepto del indicador, se ha usado hace mucho tiempo para definir a un microorganismo o procedimiento que señale el grado de contaminación fecal de una fuente y su riesgo potencial en la salud pública. Un indicador debe cumplir con los siguientes requisitos:
Debe ser aplicable a todos los tipos de aguas.
Si es un microorganismo, debe estar presente en mayor número que el o los patógenos.
No debe incrementar significativamente en ausencia del patógeno.
La metodología para el análisis debe ser rápida y poco costosa.
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Principales indicadores de contaminación fecal e indicadores alternativos:
2.3.
Coliformes totales
Coliformes termotolerantes
Escherichia coli
Enterococcu s faecalis
Bacterias heterótrofas
Clostridium perfringens
Klebsiella pneumon iae
Aeromonas sp.
Pseudom onas aeruginosa
Alimentos: Alimento es cualquier sustancia natural o sintética que contenga uno o
varios de los principios que la química a catalogado como hidratos de carbono, grasas, proteínas, vitaminas y sales orgánicas. Se define como alimento a cualquier sustancia que introducida en la sangre, nutre, repara el desgaste y da energía y calor al organismo, sin perjudicarlo ni provocarle pérdida de su actividad funcional. 35
Los alimentos son ecosistemas complejos, los ecosistemas están constituidos por el medio ambiente y por los organismos que viven allí. El ambiente de un alimento está compuesto por factores intrínsecos inherentes al alimento y factores extrínsecos que son externos a él .Se pueden manipular todos estos factores intrínsecos y extrínsecos para conservar el alimento, y de este modo puede considerarse la conservación de alimentos como “la ecología de crecimiento cero”. (Michael P. Doyle, 1997)
Las interacciones mutuas entre los microorganismos por una parte y las plantas y los animales por otra, son naturales y constantes .Como quiera que los alimentos que consume el hombre procedan básicamente de las plantas y de los animales o de productos derivados de los mismos, resulta comprensible que dichos alimentos puedan contener microorganismos que interaccionen con ellos. En la mayoría de casos los microorganismos utilizan nuestros alimentos como fuente de nutrientes para su propio crecimiento, hecho que, naturalmente, puede ocasionar su alteración. Los microorganismos pueden “echar a perder” un alimento porque se multiplic an en él, porque utilizan
nutrientes, porque producen modificaciones enzimáticas y porque le
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comunican sabores desagradables mediante el desdoblamiento de determinadas sustancias o mediante la síntesis de nuevos compuestos. (Doyle, 2003) Además de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminación durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminación cruzada; algunos de los microorganismos contaminantes pueden ser patógenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la aparición de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA’s). (Técnicas para el Análisis Microbiológico
de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México) En el Perú, las enfermedades transmitidas por Alimentos (ETA ’s) representan un gran problema en la salud pública, en especial los grupos vulnerables (niños y adultos). Desde el año 1998 se reportaron una serie de brotes de ETA’s en diferentes zonas del País, aislándose Salmon ella sp , por el consumo de mayonesa casera y salsa de rocotos preparados artesanalmente, en restaurantes turísticos y puestos de venta ambulatoria. (MINSA)
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2.3.1. Normativa sanitaria de alimentos: La LEY DE INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS “Decreto Legislativo N° 1062” El Peruano, 28 de junio de 2008 (Ley) 03 de julio de 2008 (Fe de
erratas) Se creó con la finalidad de establecer el régimen jurídico aplicable para garantizar la inocuidad de los alimentos destinados al consumo humano con el propósito de:
Proteger la vida y la salud de las personas
Reconocer y asegurar los derechos de los consumidores
Promover la competitividad de los agentes económicos
2.3.2. Aspectos microbiológicos: La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos productos. En realidad, si se exceptúa el reducido número de productos esterilizados, cada bocado de alimento contiene levaduras inocuas, mohos, bacterias y otros microorganismos. La mayor parte de los alimentos se convierten para el consumidor solo después de que han sido violados los
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principios de higiene, limpieza y desinfección. Si los alimentos han estado sometidos a condiciones que pudieran haber permitido la llegada a los mismos y/o la multiplicación de agentes infecciosos toxigénicos, pueden constituirse en vehículo de transmisión de enfermedades tales como la salmonelosis o la intoxicación estafilocócica. (ICMFS, 2000) El examen microbiológico rutinario de los alimentos para detectar en ellos toda una serie numerosa de microorganismos patógenos y de sus toxinas no es practicable en la mayoría de laboratorios .Sin embargo, es imperativo realizar los análisis microbiológicos de rutina correspondientes siempre que la información epidemiológica o de otro tipo de que se disponga sugiera o haga pensar en la presencia de un agente patógeno especifico en un determinado alimento. Para ellos se utilizan un grupo de microorganismos cuya enumeración o recuento se realiza con mayor facilidad y cuya presencia en los alimentos indica que estos productos estuvieron expuestos a condiciones que pudieran haber introducido organismos peligrosos y/o permitido la multiplicación de especies infecciosas o toxigénicas. Los grupos o especies utilizadas con estos fines se denominan microorganismos indicadores y sirven para evaluar
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tanto la seguridad que ofrecen los alimentos en cuanto a microorganismos y sus toxinas, como su calidad microbiológica.(ICMSF,2ºEdicion) Los exámenes microbiológicos realizados a los microorganismos indicadores son:
Recuento en placa de bacterias
Bacterias entéricas indicadoras
Salmonellas
Shigelas
Escherichia coli
Vibrio parahemoliticus
Vibrio cholerae
Staphylococ cus aureus
C l o s t ri d i u m b o t u l i n u m y Clostridium perfringens
Bacillus cereus
Estreptococos
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2.3.3. Superficies vivas e inertes relacionadas a alimentos: El análisis de superficies vivas e inertes se realizaran en el establecimiento donde se procesan, elaboran, almacenan, fraccionan o expenden alimentos y bebidas, sea fábrica, almacén, servicios de alimentos, quiosco, puesto, comedor, u otro. Comprende las siguientes operaciones consecutivas, realizadas por personal capacitado en la materia:
1. Procedimiento para la selección de la muestra. 2. Selección del método de muestreo. 3. Procedimiento para la toma de muestra.
Procedimiento para la selección de la muestra: El procedimiento para seleccionar las muestras, debe estar en función de los riesgos sanitarios relacionados a las diferentes etapas de la cadena alimentaria, sea de la fabricación, de la elaboración y/o expendio.
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En fábricas de alimentos y bebidas: Superficies inertes: Se seleccionarán aquellas que están o tendrán contacto directo con los alimentos que no serán sometidos a un proceso térmico posterior u otro que
disminuya la carga
microbiana.
Superficies vivas: Se seleccionarán a los manipuladores de alimentos, con o sin guantes, que están en contacto directo con los alimentos que no serán sometidos a un proceso térmico posterior u otro tratamiento que disminuya la carga microbiana.
En establecimientos de elaboración y expendio: Superficies inertes: Se seleccionarán aquellas superficies que están en contacto con los alimentos destinados al consumo directo, como utensilios, vajilla, superficies de corte, menaje, equipos, entre otros.
Superficies vivas: Se seleccionarán las manos de los manipuladores, con o sin guantes, que están en contacto con los alimentos destinados al consumo directo.
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Selección del método de muestreo: La selección del método de muestreo debe estar en función de las características de la superficie a muestrear.
METODO DE
SUPERFICIES A MUESTREAR
MUESTREO Se utiliza para superficies inertes regulares e irregulares, tales como tabla de picar, bandejas,
Método del hisopo
mesas de trabajo, utensilios, cuchillas de equipos, cortadora de embutidos, cortadora de pan de molde, fajas transportadoras, tolvas, mezcladoras, pisos, paredes y otros.
Método esponja
de
la El método de la esponja se utiliza preferentemente para muestrear superficies de mayor área. Se utiliza para superficies vivas (manos) y para
Método del
objetos pequeños o para el muestreo de superficies interiores de envases, botellas, bolsas de plástico, etc.
enjuague
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Procedimiento para la toma de muestra: Método del hisopo: Consiste en frotar con un hisopo estéril previamente humedecido en una solución diluyente, el área determinada en el muestreo.
Conservación y Transporte de la muestra: Las muestras se colocarán en un contenedor isotérmico con gel refrigerante, el cual se distribuirá uniformemente en la base y en los laterales, de tal manera de asegurar que la temperatura del contenedor no sea mayor de 10°C, a fin de asegurar la vida útil de la muestra hasta su llegada al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de muestra y la recepción en el laboratorio estará en función estricta de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y excepcionalmente las 36 horas. Se debe registrar la temperatura del contenedor al colocar las muestras y a la llegada al laboratorio a fin de asegurar que las mismas hayan sido transportadas a la temperatura indicada.
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Temperaturas superiores a 10°C invalidan la muestra para su análisis.
Método de la esponja: Consiste en frotar con una esponja estéril, previamente humedecida en una solución diluyente, el área determinada en el muestreo.
Conservación y Transporte de la muestra: Las muestras se colocarán en un contenedor isotérmico con gel refrigerante, el cual se distribuirá uniformemente en la base y en los laterales, de tal manera de asegurar que la temperatura del contenedor no sea mayor de 10°C, a fin de asegurar la vida útil de la muestra hasta su llegada al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de muestra y la recepción en el laboratorio estará en función estricta de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y excepcionalmente las 36 horas. Se deberá registrar la temperatura del contenedor al colocar las muestras y a la llegada al laboratorio a fin de asegurar que las
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mismas hayan sido transportadas a la temperatura indicada. Temperaturas superiores a 10°C invalidan la muestra para su análisis.
Método del enjuague: Dependiendo de la muestra, el método consiste en realizar un enjuague (botellas, frascos, similares) o inmersión (manos, objetos pequeños) en una solución diluyente.
Para recipientes (frascos, jarras, otros): Para esto: a. Vaciar en el recipiente a muestrear una parte de la solución estéril (frasco con 100 mL) y agitar vigorosamente.
b. Regresar la solución a su frasco original. c. Cerrar herméticamente el frasco para su traslado. Para objetos pequeños (piezas de equipos, otros): Se introduce individualmente cada objeto en el frasco o bolsa con la solución estéril y agitar vigorosamente.
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1. Con una pinza estéril, retirar el objeto pequeño del frasco o bolsa. 2. Si se muestrea más de un objeto pequeño de igual naturaleza, se debe considerar esto en el cálculo de resultados.
Conservación y Transporte de la muestra: Las muestras se colocarán en un contenedor isotérmico con gel refrigerante, el cual se distribuirá uniformemente en la base y en los laterales, de tal manera de asegurar que la temperatura del contenedor no sea mayor de 10°C, a fin de asegurar la vida útil de la muestra hasta su llegada al laboratorio. El tiempo de transporte entre la toma de muestra y la recepción en el laboratorio estará en función estricta de dicha temperatura, no debiendo exceder las 24 horas y excepcionalmente las 36 horas. Se deberá registrar la temperatura del contenedor al colocar las muestras y a la llegada al laboratorio a fin de asegurar que las mismas hayan sido transportadas a la temperatura indicada. Temperaturas superiores a 10°C invalidan la muestra para su análisis.
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III.
MATERIAL Y MÉTODO
El laboratorio de Salud ambiental de la Dirección Ejecutiva de Salud Ambiental consta de 4 áreas en las cuales en cada una de ellas se empleará un material y métodos distintos para lograr los fines específicos de dichas áreas.
3.1.
Preparación y esterilización de medios de cultivos y diluyentes: Objetivo: Indicar la metodología llevada a cabo para la preparación esterilización y controles de esterilidad de los medios de cultivos y diluyentes.
Materiales: Probetas.
Material de vidrio, tubos de ensayo, frascos de vidrio de Borosilicato.
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Otros materiales, balones, matraces, vasos de precipitación, espátulas.
Equipos:
Balanza, con capacidad de 2Kg exactitud ± 0,01 g
Autoclave
pH metro , con exactitud de ± 0,1 unidades de pH
Refrigeradora de laboratorio
Agitador
Horno
Baño María
Pesado: 1. Para la preparación de los medios de cultivo y diluyentes se utilizó únicamente agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica adecuada, se midió los volúmenes de agua a utilizar con probetas graduadas.
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2. Se preparó los medios de cultivo en recipientes que tenían al menos el doble de volumen del medio que se iba a preparar, para esto se utilizó materiales de vidrio bien lavados y enjuagados. 3. Se preparó los medios de cultivo y reactivos siguiendo las instrucciones del medio. 4. Posteriormente se procedió a pesar la cantidad necesaria del medio deshidratado, luego se cerró el frasco del medio de cultivo. 5. El pesado de medios de cultivo que no se sometieron a esterilización como el Agar XDL se realizó en condiciones de esterilidad (haciendo uso de agua destilada y frascos previamente esterilizados).
Disolución y medición de pH: 1. Se disolvió la porción pesada de acuerdo a lo requerido, para esto se tuvo cuidado de no sobrecalentar, para lo cual se utilizó una la cocina eléctrica.
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2. Tras rehidratar el medio, se distribuyó en los frascos y se esterilizó como máximo dentro de las dos horas siguientes. 3. Se verificó el pH de cada medio (según el instructivo de medición de pH). 4. El personal responsable de la preparación de medios de cultivo registro en el formato de “Preparación de medios de cultivo y diluyentes” (F01 -AM-IT-05)
5. Se esterilizó los medios de cultivo y diluyentes al tiempo y la temperatura indicada. 6. Luego se retiró los medios esterilizados de la autoclave tan pronto cuando la presión de la cámara llegó a cero.
Verificación de la esterilización de medios de cultivo preparados: 1. Se examinaron los medios de cultivo recién preparados para comprobar el color, el oscurecimiento o posible precipitación. 2. Se examinaron los tubos recién preparados para determinar la existencia o no de burbujas de gas.
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3. Posteriormente se realizó la verificación de calidad de cada lote de medio de cultivo o diluyente preparado incubando a la temperatura y tiempo correspondiente a las condiciones usadas durante el ensayo. 4. El personal responsable registró los datos necesarios en el formato de “preparación de medios de cultivo y diluyentes”.
Mantenimiento de los medios de cultivo preparados: 1. Se mantuvo los medios de cultivo a temperaturas de refrigeración de 4 a 8 °C y en tiempos indicados en anexo 4 .Se tomó las precauciones de preparar cantidades de medio de cultivo que se vayan a utilizar dentro de los límites de tiempo indicados. 2. Los tubos o frascos con medios de cultivo se guardaron a una temperatura alrededor de 25 °C durante no más de una semana para que la evaporación no sea rápida y dar lugar a alteraciones importantes de la concentración de los ingredientes. 3. El personal responsable se encargo de colocar una etiqueta en los medios de cultivo preparados indicando la fecha de preparación.
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Utilización de medios de cultivo: 1. Para esto se fundió los agares solidificados. Se mantuvo fundidos los agares en baño María de 44 a 46 ºC hasta el momento de usarlos nunca por un período superior a 3 horas. 2. Se temperó los tubos y frascos con medio líquido que hayan estado guardado a bajas temperaturas, manteniéndolos a temperatura ambiente por un lapso de media hora o por un período aproximado de 15 minutos a 44-46ºC.
3.2.
Instructivo de preparación y dilución de muestras de alimentos aguas y superficies vivas para análisis microbiológicos: Objetivo: Describir el procedimiento para la preparación de las muestras y de las diluciones decimales para el análisis microbiológico de muestras de alimentos de acuerdo a lo indicado en la norma ISO 6887-1: 1999
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Resumen: Se basa en la preparación de diluciones primarias, para obtener una distribución lo más uniforme posible de los microorganismos presentes en la porción de prueba.
Diluyentes:
Agua de peptona buferada.
Solución diluyente
Equipos y materiales:
Balanzas, con una sensibilidad de 0,01 g
PH- metro, exactitud ± 0.1 unidad de pH a 25 °C.
Homogenizador tipo Vórtex
Refrigeradora
Frascos de dilución, capacidad de 100 ml autoclavables.
Pipetas graduadas de capacidad de 1 y 10 ml, graduado en divisiones de 0,1 y 0,5 ml respectivamente.
Tubos con tapa rosca de 16 x 160 mm de diámetro.
Probetas, matraces, espátulas. 54
Material de diverso como alcohol 70%, algodón, plumón indeleble.
Preparación de las muestras: Se manipuló las muestras de tal manera que se trató de evitar todo riesgo de contaminación, para ello se tomó las siguientes precauciones: 1. Como no se trabajó en una cabina de bioseguridad, se hizo siempre cerca de la flama del mechero. 2. Se limpió la superficie del envase de la muestra que será abierta con etanol al 70 %. 3. Todos los instrumentos utilizados para tomar la muestra (plantillas, frascos, pipetas, tubos de ensayo, etc.) que se proporcionaron a los muestreadores fueron estériles. 4. Se marcó cuidadosamente el código de laboratorio de la muestra, en el frasco recipiente que serán utilizados para analizar las muestras.
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Preparación de la suspensión inicial (primera dilución): 1. Se pesó en un recipiente estéril, previamente tarado, 10 g o 10 ml de la muestra; se adiciono 90 ml del diluyente. 2. Para evitar dañar los microorganismos, por un cambio de temperatura, la temperatura del diluyente durante el análisis fue aproximadamente el mismo de la temperatura ambiente. 3. Se homogenizó la muestra, con el homogenizador tipo Vórtex.
Preparación de las diluciones adicionales: 1. Se transfirió, por medio de una pipeta, 1 ml de la suspensión inicial (primera dilución) a un tubo conteniendo 9 ml de diluyente estéril a la temperatura apropiada. 2. Se mezcló cuidadosamente con un homogenizador durante 5 a 10 segundos, para obtener la dilución 10 -2. 3. Se repitió esta operación tomando 1ml de la dilución 10 -2. Luego se
utilizó una pipeta estéril diferente para cada una de las
diluciones 10-2, 10-3, 10-4, etc. Hasta que se obtuvo el número apropiado de microorganismos. 56
3.3.
Procedimiento de recuento de bacterias heterotróficas: Objetivo: Describir el método de ensayo para calcular el número de bacterias vivas heterótrofas en muestras de agua de acuerdo a lo indicado en el Estándar Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21th edition 9215 B.
Resumen: El recuento de bacterias heterotróficas en placa, anteriormente denominado recuento estándar en placa, consiste en agregar un mililitro de muestra o de la dilución de la muestra a una placa Petri estéril, por duplicado y verter un volumen adecuado de Agar Plate Count; el cual debe de estar a una temperatura de 45 ° C a 46°C, luego se realiza la homogenización, se deja solidificar e incubar a 35° C por 48 horas .El conteo de las colonias se expresa como UFC/ml.
Materiales:
Agar PlateCount (Agar para Recuento en Placa)
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Composición: Peptona de caseína
5.0 g
Extracto de levadura
2,5 g
Glucosa
1,0 g
Agar
15,0 g
Agua destilada
1L
Se disolvió el medio deshidratado luego se calentó hasta su completa disolución en forma frecuente, evitando que hierva. Posteriormente se repartió en frascos, luego se cerró y esterilizó en autoclave durante 15 minutos a 15 lbs de presión y 121 °C, el pH final fue de 7,2 ± 0.2 a 25°C.
Agua de dilución (solución tampón de fosfato): Para preparar el agua de dilución de tampón de fosfato, se necesitó la preparación de soluciones Stock A Y B.
Solución Stock A: Se disolvió 34g de fosfato mono potásico (fosfato di hidrogeno de potasio) KH 2PO4 en 500ml de agua destilada luego ajustamos el PH a 7,2 con hidróxido de sodio (NaOH) al 1N y se
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completó al volumen a un litro con agua destilada. Posteriormente autoclavamos por 15 minutos a 121°C.
Solución stock B: Disolvimos 81,1g de cloruro de magnesio (MgCl 2 6H2O) en un litro de agua destilada. Se autoclavó por 15 minutos a 121°C. Se agregó 1,25mL de la dilución Stock A y 5 ml de la solución Stock B a un litro de agua destilada .Distribuimos en frascos en cantidades adecuadas 9 ± 0,2 ml o 90 ± 2ml y se autoclavó por 15 minutos a 121º C.
Equipos y Materiales:
Incubadora de aire caliente a 35 °C ±0,5 °C.
Frascos con agua de dilución, con una capacidad de 100 ml autoclavables.
Pipetas de 10 ml
Placas Petri de vidrio 100 x 15 mm esterilizable.
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Preparación de muestra: 1. Luego de colocar la muestra, se inició el análisis lo antes posible para reducir al mínimo las alteraciones de la población microbiana. 2. “El tiempo máximo recomendado que puede transcurrir entre la toma de muestra y el análisis es de 8 horas ( tiempo máximo de traslado 6 horas y 2 horas de tiempo de procesamiento) .Si el análisis no puede iniciarse en las primeras 6 horas , mantener la muestra a una temperatura inferior a 4°C , pero sin congelarla .No debe permitirse que el intervalo máximo entre la toma de muestra y el análisis supere las 24 horas” (Guia de preparación de
diluciones según el Estándar Methods for the Examination of Water and Wastewater, 21th edition 9215 B.) 3. Antes de proceder con el análisis, se marcó cada placa con el código de la muestra, fecha y la dilución. 4. Se mezcló cuidadosamente todas las muestras o diluciones mediante movimientos completos de arriba hacia abajo (y de adelante a atrás).
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Diluciones de muestra: 1. Las diluciones se realizaron de forma que el número de colonias en una placa sea 30 a 300 colonias .Por ejemplo si se sospecha que el recuento de heterótrofos en placa alcanzara 3000 se prepararán placas con diluciones 10 -2. 2. Para realizar diluciones, se utilizó una pipeta estéril, la cuál se cambio para cada dilución que se preparó, en algunos casos que hubo contaminación se sustituyó por otra esterilizada.
Plaqueo: 1. Se licuó el Agar Plate Count con mucho cuidado evitando que hierva, se mantuvo el medio líquido en un baño de agua entre 44 y 46°C hasta que llegó el momento de usarlo. 2. Se Limitó el número de muestras a ser plaqueadas a una serie, de
manera
que
no
transcurran
más
de
20
minutos
(preferiblemente 10 minutos) entre la dilución de la primera muestra y adición del medio a última placa de la serie.
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3. Se vertió de 15 a 20 ml del medio licuado mantenido de 44 a 46 °C en cada placa Petri levantando suavemente la tapa de la placa lo suficiente para agregar el agar. 4. Se evitó el vertido del medio fuera del envase o en el borde de la placa, cuando se vertió el agar de frascos o tubos que han sido mantenidos en agua, se secó con un papel toalla y se flameo el cuello del frasco antes de verter el agar. Una vez añadido el medio a todas las placas, se mezcló cuidadosamente el medio líquido con la porción de muestra previamente colocada en la placa con cuidado de no proyectar la mezcla contra el borde, girando primero la placa y en una dirección y después en dirección opuesta, o haciendo girar la placa en forma de ocho varias veces. Se dejó solidificar la placa durante 10 minutos e invirtiéndose y se colocó en la incubadora. 5. Con los controles, se comprobó la esterilidad del medio y de los blancos de agua de dilución preparando con ellos placas fluidas en cada serie de muestras .Se prepararon controles adicionales para determinar la contaminación de las placas y del ambiente.
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Incubación: Se incubó a 35° C x 48 horas.
Recuento de colonias: 1. Inmediatamente después de la incubación, se procedió a contar todas las colonias de las placas seleccionadas. 2. Consideramos solo las placas que tuvieron entre 30 y 300 colonias,
aunque
hubo
casos
en
que
el
exceso
de
microorganismos sobrepasaban estos valores y se tuvieron que adecuar para el cálculo del recuento bacteriano por mililitro, multiplicando el número promedio de colonias de las dos placas seleccionadas perteneciente a la misma dilución por el inverso de la dilución utilizada reportar UFC/ ml. 3. En casos en que ninguna de las placas de una muestra se obtuvo colonias, se reportó como un recuento inferior. 4. Cuando aparecieron colonias expansivas en la placa, se tomó por criterio como una colonia cuando hubo: cadenas de colonias que
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parezcan ser consecuencia de la desintegración de un grupo de bacterias al mezclar el agar y la muestra; expansiones que se desarrollaron como placas de crecimiento entre el agar y la base de la placa petri. Se contó como colonias individuales aquellas que poseían aspecto de colonias y crecían muy cerca unas de otras, También se contaron como colonias individuales las adyacentes con aspecto distinto en lo que se refiere a forma color etc. 5. En caso de que hubo exceso de crecimiento expansivo en una placa, se considero como "diseminantes". En el caso de las placas que resultaron incontables por que se haya perdido el factor de dilución, se hayan caído accidentalmente: estén contaminadas o las placas de control indiquen que el medio, otros materiales o el instrumental estén contaminados, se refirieron en el reporte como "accidente de laboratorio"
Reporte: Se dio en UFC/ml, cuando el tercer dígito de la izquierda fue (5, 6, 7,8 o 9), se redondeó a la unidad superior, en caso que el tercer dígito fue menor (1, 2, 3,4) quedó tal como está.
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3.4.
Procedimiento de Monitoreo Ambiental: Tiempo y temperatura de incubación:
Las placas conteniendo el PCA fueron expuestas durante 15 min luego se cerraron e incubaron a 35°C por 48 horas, para mesófilos.
Para el caso de mohos y levaduras utilizamos utilizamos placas con Agar Sabourand, exponiéndolas por un tiempo de 15 min, de igual forma se cerraron e incubaron a 22 °C por 5 días.
Frecuencia de realización de los controles: Semanal. Área a monitorear para la toma de muestras:
Sala de microbiología: mesa 1, mesa 2 y mesa 3.
Límite de tolerancia: 1. Para una exposición durante durante 15 minutos de las placas se permitirá permitirá hasta 15 colonias.
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2. Los resultados se expresaron como unidades formadoras de colonias (ufc) por placa.
Acciones correctivas a ejecutar en caso de sobrepasarse el límite de tolerancia: En algunos casos en que se sobrepasaron del límite se tomó medidas correctivas limpiando y desinfectando dichas áreas con el personal encargado, cerrando las ventanas en algunas ocasiones para evitar más contaminación y una verificación hasta que el límite de tolerancia se cumpla.
3.5.
Salmo nella spp Procedimiento de análisis para la detección de Salmo :
La detección de Salmonella , requirió de 5 etapas sucesivas: a. Enriquecimiento no selectivo. b. Enriquecimiento selectivo. c. Siembra en placa placa de medios sólidos selectivos selectivos y diferenciales. d. Estudio de las características bioquímicas de las colonias sospechosas, en los medios adecuados.
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Los pasos a) hasta c) se refirieron al aislamiento, y el d)
a la
identificación. El paso a) tiene como fin la revitalización de las Salmonelas dañadas por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento. El paso b) es de enriquecimiento selectivo y sirvió para favorecer el crecimiento de las salmonellas en un ambiente que puede contener gran número de bacterias diferentes de ellas mismas. El paso c) permitió la visualización de las colonias sospechosas, por su aspecto característico. El paso d) se refirió a la identificación bioquímica.
Medios de Cultivo, reactivos y suero:
Medio de pre-enriquecimiento no-selectivo: agua peptonada tamponada.
Primer medio de enriquecimiento selectivo: Rappaport-Vassiliadis con soya (Caldo RVS).
Segundo medio de enriquecimiento selectivo: Caldo MullerKauffmann tetrationato con novobiocina (Caldo MKTTn), en
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nuestro caso no contamos con este caldo pero trabajamos con el Caldo Selenito Cistina (CSC).
Medio sólido selectivo:
Primer medio: Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (Agar XLD).
Segundo medio: Agar Verde Brillante Rojo de Fenol Lactosa según Kauffmann
Medios y reactivos para las pruebas bioquímicas:
Agar Nutritivo.
Agar Hierro Tres Azúcares azucares (agar TSI).
Agar Úrea (Christensen).
Medio L-Lysina Descarboxilasa.
Reactivo para Voges Proskauer (Reactivo VP).
Reactivos para la Reacción de Indol (Reactivo de Kovack).
Agar Nutritivo semi-sólido.
Solución salina
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Equipos y Materiales:
Balanzas, 2000 g de capacidad y sensibilidad de 0,01g.
Incubadora, a 37°C ± 1°C.
Incubadora baño Maríaa44a 47ºC.
Asas de siembra, aproximadamente 3 mm de diámetro.
Cucharas estériles u otro instrumento para transferir las muestras.
Botella o frascos de cultivo de boca ancha, pueden usarse botellas o frascos de tapas herméticamente metálicas no tóxicas o de plástico de 500 ml de capacidad. Frascos, Erlenmeyer, beakers estériles de 250 ml u otros recipientes de capacidad apropiada para colocar la muestra.
Tubos de ensayo, de 16 x 160 mm o de 13 x 100 mm de diámetro.
Pipetas graduadas, estériles con capacidad de 10 mL y un 1mL.
Placas Petri, estériles de 15 x100mm de diámetro.
Preparación de las muestras, porción de ensayo y suspensión inicial: Para la preparación de la suspensión inicial, se añadió 25 g de la muestra a 225 mL del medio de pre-enriquecimiento. 69
Pre-enriquecimiento no-selectivo: Se incubó la suspensión inicial a 37 °C ± 1°C, por 18 horas.
Enriquecimiento Selectivo: 1. De la suspensión inicial obtenida, se transfirió 0, 1 ml a un tubo que contenía 10mL de caldo Rappaport – Vassiliadis (RV) y 1 ml a un tubo conteniendo 10 mL del Caldo Selenito Cistina. 2. Se incubó el caldo Rappaport – Vassiliadis (RV) a 41.5 °C ± 1°C por 24h ± 3h y el caldo Selenito Cistina a 37 °C ± 1°C por 24h ± 3h. Se tuvo que tener cuidado de la temperatura máxima de incubación permitida, no debió exceder de 42,5°C.
Plaqueado e identificación: 1. Del cultivo obtenido del medio RV, luego de la incubación por 24h, se inoculó por medio de un asa, en la superficie de una placa Petri conteniendo el primer medio selectivo (agar XLD) de manera que se pudo obtener las colonias.
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2. Se procedió de la misma manera con el segundo medio selectivo usando un asa de siembra y placa Petri. 3. Del cultivo obtenido en el caldo Selenito Cistina, se repitió el procedimiento. 4. Se invirtieron las placas obtenidas y se incubaron a 37°C para el primer medio selectivo. Se siguieron las instrucciones del medio para el segundo medio selectivo. 5. Después de la incubación por 24h se examinó las placas y se observaron la presencia de colonias típicas de Salmonella y colonias atípicas qué podrían ser Salmonella .Se marcó su posición en la base de la placa. 6. Según la bibliografía del procedimiento nos menciona las colonias típicas de Salmonella . 7. Las colonias típicas de Salmonella en agar XLD tienen un centro negro y una zona ligeramente transparente debido al cambio de color del indicador.
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Nota: Las colonias de Salmonella H 2S negativas en XLD (e.g S. paratyphi A) son rosadas con un centro rosado oscuro. Salmonella Lactosa-positivas en XLD son amarillas con o sin centro negro. Incubar el segundo medio selectivo en la temperatura indicada y examinar después del tiempo indicado y verificar la presencia de colonias sospechosas de ser Salmonella .
Confirmación: Selección de colonias para su confirmación: 1. Para la confirmación, se tomó cinco colonias consideradas típicas o sospechosas de cada placa de medio selectivo. 2. En nuestro análisis tuvimos menos de 5 colonias típicas o sospechosas para lo cual procedimos a confirmar todas las colonias típicas o sospechosas. 3. Estriamos las colonias seleccionadas sobre la superficie de las placas de Agar Nutritivo pre-secado, de manera que se permitió el desarrollo de colonias bien aisladas. Se incubó las placas inoculadas a 37°C ± 1 h por 24 h.
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4. Se utilizó cultivos puros para la confirmación bioquímica y serológica. 5. Pueden utilizarse kits disponibles comercialmente para la identificación bioquímica de Salmonella . Estos deben usarse siguiendo las indicaciones del fabricante. 6. “En el caso del labo ratorio de Salud Ambiental no se cuenta con estos kits de análisis para lo cual solo trabajamos con las pruebas bioquímicas”
a) Confirmación bioquímica: Se inoculó en cada uno de los medios las colonias sospechosas seleccionadas:
Agar TSI: Se estrió en la superficie del agar, luego en la columna por puntura. Se incubó a 37°C ± 1h por 24h ± 3h. Y se interpretó los cambios del medio de cultivo como se señala a continuación:
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Columna: Amarillo
: Glucosa positiva (fermentación de la glucosa)
Rojo o sin cambio
: Glucosa negativa (no fermenta la glucosa)
Negro
: Formación de hidrógeno sulfurado
Burbujas o rotura
: Formación de gas a partir de la glucosa.
b) Superficie inclinada: Amarillo
: Lactosa y/o sacarosa positiva. (Uso de lactosa y/o sacarosa).
Rojo o sin cambio de color
: Lactosa y/o sacarosa negativa. (Uso de lactosa y/o sacarosa).
Los cultivos típicos de Salmonella presentan alcalinidad. (Rojo) en la superficie inclinada con formación de gas y ácido (Amarillo)
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en la columna. (En 90% de los casos) con formación de hidrógeno sulfurado, ennegrecimiento del agar) Cuando una Salmonella lactosa-positiva es aislada, la superficie inclinada del TSI es amarilla. Por lo tanto, la confirmación preliminar de los cultivos de Salmonella no deberá basarse solamente en los resultados de los ensayos del agar TSI. (Instructivo para análisis de Salmonella Cod: LSA 15.2.01 - 2008)
Agar Úrea: 1. Se estrió en la superficie del agar. Incubando a 37°C ± 1°C por 24 h ± 3.h y se examinó en intervalos. 2. Según la bibliografía dice que si la reacción es positiva, quiere decir que se hidrolizó la úrea liberando amoniaco, lo que cambia el color de rojo fenol a rosa-rosado luego a un cereza intenso. La reacción es frecuentemente aparente después de las 2 a 4 horas.
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Medio L-Lisina descarboxilasa (LIA): 1. Se estrió en la superficie y se incubó a 37°C ± 1 h por 24 h ± 3h. 2. Según la bibliografía un color púrpura luego de la incubación, indica una reacción positiva, un color amarillo indica una reacción negativa.
Detección de O-Galactosidasa: Es este caso no se realizó esta prueba porque no se contaba con el reactivo para la preparación del medio.
Medio para la reacción de Voges-Proskauer: 1. Se suspendió con un asa una colonia sospechosa en un tubo estéril que contenía 3mL del medio VogesProskauer. Se incubó a 37°C ± 1 h por 24 h ± 3h. 2. Después de la incubación, se añadió 2 gotas de solución de creatina, 3 gotas de solución etanólica de 1-naftol (VP1) y luego 2 gotas de hidróxido de potasio (VP2), se
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agitó después de añadir cada reactivo. Después de 15 minutos, se observó, la formación de un color rosado a rojo brillante, esto indica reacción positiva.
Medio para la reacción de Indol: 1. Se inoculó un tubo con 5 ml de medio Triptona 1 Triptófano con la colonia sospechosa. 2. Se incubó a 37°C ± 1h por 24h ± 3h. Después de la incubación, añadió 1mL del reactivo de Kovac's. 3. La formación de un anillo rojo indica una reacción positiva. La formación de un anillo amarillo-marrón indica una reacción negativa.
Confirmación definitiva: Las cepas que son consideradas como Salmonella, o aquellas que puedan ser Salmonella, se envían al Laboratorio de Salud Ambiental de la DIGESA, adjuntando toda la información concerniente a la cepa.
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En nuestro análisis bioquímico no se encontró la presencia de este patógeno.
Reporte: Los resultados para cada muestra se registran en el informe respectivo.
Control de calidad: 1. Se incluyeron controles positivos y negativos de los medios de cultivo. Para realizar esto se inoculó el medio de pre- enriquecimiento con una cepa apropiada de Salmonella, y se procedió a trabajar según el protocolo analítico usado para la muestra prueba. Un medio de control positivo asegura que ninguna sustancia en el medio de cultivo es inhibido para Salmonella . 2. Se incluyeron además dos tipos de control negativo. Un medio de control negativo que aseguró que el medio preparado no estuvo contaminado con Salmonella . El control se preparó colocando un frasco de medio de
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cultivo sin inocular. Un segundo control negativo, control del cultivo, para demostrar la aparición de flora competitiva en varios medios o mostrar que esta no Salmonella no crecerá en los medios selectivos usados para el análisis. Este control se preparó inoculando el medio inicial con una cepa no Salmonella y se siguió el mismo procedimiento que para las muestras de prueba. 3. Las placas de Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD) se prepararon un día anterior al aislamiento ya que las placas recién preparadas pueden inhibir el crecimiento de Salmonella. Las placas se almacenaron de 4 a 5°C y se mantuvieron a temperatura ambiente antes de su uso para evitar la condensación de humedad en la superficie. 4. Se picó ligeramente el centro de una colonia sospechosa en la placa de agar selectivo para evitar la transferencia de: Salmonella no viable que pueden estar situadas bajo o adyacentes a una colonia sospechosa de Salmonella .
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5. El agar TSI en plano inclinado se tapó ligeramente durante la incubación para mantener condiciones aeróbicas y prevenir reacciones ácidas erróneas en la zona de plano inclinado y excesiva producción de H 2S en la zona de profunda del tubo. 6. Por cada tipo de determinación bioquímica se incluyo un tubo de medio sin inocular (control negativo del medio).
3.6.
Procedimiento
de
análisis
S t a p h y l o c o c c u s coagulasa
para
la
numeración
de
Positivo (Staphylococcus aureus y
otras): Resumen: El método de numeración de Staphylococcus se basa en la inoculación sobre la superficie de un medio de cultivo sólido selectivo usando placas por duplicado, con una cantidad específica de la muestra si el producto es líquido, o con una cantidad específicade.la suspensión inicial en el caso de otros productos. La incubación de las placas se realiza a 35°C y el examen luego de 24 horas y/o 48 horas.
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El cálculo del número de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva por mililitro o por gramo, de muestra proviene del número de colonias típicas y/o atípicas obtenidas de las placas en las diluciones elegidas da un resultado significativo y confirmado por el resultado de la prueba coagulase-positiva.
Medios de cultivo reactivos y/o suplementos:
Agar Baird Parker (BP).
Emulsión de yema de huevo con telurito.
Equipos y Materiales:
Incubadora Baño María de 47°C.
Incubadora a 35°C ó 37°C.
Pipetas graduadas, con capacidad de 1 mL, 2 mL.
Placas Petri de vidrio de 22 x 150 mm.
Placas Petri de vidrio de 15 x 100 mm.
Tubos de ensayos, con dimensiones de 13 x 100 mm de diámetro.
Asas de siembra.
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Preparación de la muestra, suspensión inicial y diluciones: Se utilizó el mismo procedimiento de preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis microbiológico.
Inoculación: 1. Se transfirió, por medio de una pipeta estéril 0,1 mL de la suspensión inicial (dilución 10-1), a cada una de las dos placas con Agar Baird Parker (superficie del agar previamente secada). 2. Se repitió el procedimiento para las siguientes diluciones. 3. Se preparó duplicados usando 2 placas grandes o seis pequeñas. 4. Se extendió el inóculo rápida y cuidadosamente sobre la superficie de la placa con agar, usando una espátula de Digralsky, se procuró no tocar los lados de la placa. Se dejó secar las placas cerca de 15 minutos con las tapas hacia arriba a temperatura de laboratorio.
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Incubación: 1. Se invirtieron las placas inoculadas y se incubaron de 24 a 48 horas a 37°C. 2. Se seleccionaron las placas para su interpretación 3. Después de la incubación por 24h, se marcó sobre las bases de las placas, las posiciones de algunas colonias típicas presentes. 4. Se re-incubó todas las placas a 35°C ó 37°C por 24 horas, y se marcó la aparición de alguna colonia típica nueva. También se marcó alguna colonia atípica presente. 5. Se tomó para la numeración sólo aquellas placas que tengan como máximo 300 colonias con 150 colonias típicas y/o atípicas en dos diluciones sucesivas. 6. En caso de que hubo menos de 15 colonias típicas y/o atípicas presentes en placas inoculadas con la muestra líquida o en la dilución más baja de otros productos, es posible hacer un conteo estimado como se describe en más adelante.
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Nota 1.- Las colonias típicas son negras o grises, brillantes y convexas (1 mm a 1,5 mm de diámetro después de la incubación por 24 horas y 1,5 mm a 2,5 mm de diámetro luego de la incubación por 48 horas) y rodeada por una zona clara. Después de incubar por lo menos 24 horas puede aparecer un anillo opalescente en esta zona clara, en contacto inmediato con las colonias. Nota 2.- Las colonias atípicas tienen el mismo tamaño como las colonias típicas y pueden presentar una de las siguientes morfologías: a) Colonias negro brillante con o sin un borde blanco estrecho, la zona clara está ausente o escasamente visible y el anillo opalescente está ausente o fuertemente visible. b) Colonias grises sin zonas claras. Las colonias atípicas están formadas
principalmente
por
cepas
contaminantes
de
S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva, por ejemplo, productos
lácteos, camarones y menudencias de pollo. Estas son menos frecuentes en otros productos.
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Nota
3.-
Otras
bacterias
no
pertenecientes
al
género
S t a p h y l o c o c c u s pueden dar colonias con apariencia similar a
colonias S t a p h y l o c o c c u s . El examen microscópico de una coloración Gram, antes de la confirmación ayudaría a la diferenciación de otros géneros que nos sean S t a p h y l o c o c c u s .
Confirmación (Prueba de la Coagulasa): De la superficie de cada colonia seleccionada, se removió un inóculo con un asa estéril y se transfirió a un tubo de infusión de cerebro corazón. 1. Se incubó a 37°C por 24 horas. 2. Asépticamente se añadió 0,1 mL de cada cultivo a 0,3 ml de plasma de conejo en tubos de 13 x 100 mm e incubamos a 37°C. 3. Agitando el tubo, examinamos la coagulación del plasma después de 4 a 6 horas de incubación, y, si la prueba es negativa re-examinamos a 24 horas de incubación.
85
4. Se consideró la prueba de coagulasa como positiva si el volumen de coágulo ocupa más de la mitad del volumen original del líquido. 5. Como control negativo, para cada lote de plasma, añada 0,1mL del caldo de infusión de cerebro-corazón a la cantidad recomendada de plasma de conejo e incubar sin inoculación. Para que la prueba sea válida, el plasma de control no debe mostrar signos de coagulación.
Cálculos: Los cálculos se efectuaron según lo indicado en “El instructivo de análisis para recuento de Staphylococcus aureus ”, el cual menciona:
Caso General: Cálculo del número "a" de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva identificados para cada placa seleccionada.
86
Calcule, para cada una de las placas el número V de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva identificados, de acuerdo a la
ecuación:
Donde: Ac: Nº de colonias típicas sometidas a la prueba de la coagulasa. Anc: Nº de colonias atípicas sometidas a la prueba de la coagulasa. bc: Nº de colonias típicas coagulasa-positiva. bnc: Nº de colonias atípicas que muestran ser coagulasa positiva. cn: Nº total de colonias típicas contadas en la placa Petri. cnc : Nº total de colonias atípicas contadas en la placa Petri. Se redondeo el resultado calculado a dos cifras: Cálculo del número "N' de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva identificados, presente en la porción de prueba. Para aquellas placas Petri que contienen un máximo de 300 colonias con 150 colonias típicas y/o atípicas en dos diluciones consecutivas, calcule el número
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de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva para cada placa Petri como se especifico y calcule en un promedio de las dos diluciones consecutivas, el número 'N' de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva identificados presentes en la muestra, usando la siguiente ecuación:
Donde: : Es la sumatoria de las colonias de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva identificados en todas las placas Petri seleccionados. V:
Es el volúmen de inóculo encada placa Petri, en mililitros.
n 1:
Es el número de placas Petri seleccionados en la primera dilución.
n2:
Es el número de placas Petri seleccionados en la segunda dilución.
d:
Es la dilución correspondiente a la primera dilución seleccionada (la suspensión inicial es una dilución). Redondear los resultados calculados en 2 cifras
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significativas. Reportó el resultado como el Número de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa-positiva por mililitro para productos líquidos o por gramo (otros productos) expresados como un número entre 1,0 y 9,9 multiplicado por 10X donde X es la potencia asignada a 10.
Reporte: Los resultados obtenidos, se expresaron UFC de S t a p h y l o c o c c u s coagulasa positiva/gramo o mililitro. Los resultados para cada muestra se transcribieron en el “Registro interno de resultados ”
Control de Calidad: Se sembró en el medio de cultivo una cepa de S t a p h y l o c o c c u s , y se procedió a trabajar según el protocolo, para luego compararlo con nuestra muestra. También se incluyó un control negativo, que aseguró que el medio preparado no estuvo contaminado con S t a p h y l o c o c c u s. El control se preparó colocando una placa con el medio de cultivo sin inocular
89
a través de todo el procedimiento realizado para la muestra prueba.
3.7.
Procedimiento de análisis para la numeración presuntiva de Escherichia coli:
Resumen: La numeración presuntiva de E s c h e r i c h i a c o l i , requiere de 3 etapas sucesivas: Empleo del caldo lauril sulfato triptosa, seguido de la confirmación de los tubos positivos con gas y turbidez en caldo E.C., y la confirmación de E. co li a través de la prueba de la producción de indol.
Medios de cultivo y reactivos:
Medio selectivo enriquecido: Caldo lauril sulfato triptosa
Segundo medio selectivo: Caldo EC
Agua triptona
Reactivo de Kovacs
Equipos y Materiales:
Incubadora de 35°C
90
Baño de Agua María a 45°C ±0,5 °C.
Pipetas graduadas de 1 mL y 10 mL.
Tubos de ensayo
Tubos Durham
Asas de siembra.
Preparación de la muestra, suspensión inicial y diluciones: Se procedió según lo mencionado el “Instructivo de preparación y dilución de muestras de alimento s para análisis microbiológico”.
Inoculación e Incubación: 1. Se tomó 3 tubos de medio selectivo enriquecido de doble concentración. Usando una pipeta estéril, se transfirió a cada uno de estos tubos 10mL de la muestra. 2. Luego se tomó 3 tubos de medio selectivo enriquecido de simple concentración. Usando una pipeta estéril nueva, se transfirió a cada uno de estos tubos 1mL de la muestra. 3. Para las siguientes diluciones, se realizó la inoculación como la
91
primera dilución. Para esto se usó una pipeta estéril nueva para cada dilución, mezclando cuidadosamente el inóculo y el medio. 4. Se incubaron los tubos de medio selectivo de doble y simple concentración en la incubadora de35 - 37 °C por 24 h ± 2 h en caso de que no hubo formación de gas o turbidez, se continuó la incubación otras 24 h ± 2 h.
Inoculación del segundo medio selectivo: Cuando hubo formación de gas en los tubos incubados, se inoculó con un asa en 10mL del segundo medio selectivo previamente calentado a 45°C.
Segunda incubación: Se incubó los tubos inoculados en el baño de agua a 45°C por 24h ± 2h. Si en esta etapa no se observó la formación de gas se dejó incubar por 48 horas más.
Inoculación en Agua triptona e Incubación: Para cada tubo incubado y que se observó la formación de gas, se
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inoculó con un asa el agua de triptona, previamente calentado a 45°C. Se incubó los tubos inoculados en baño de agua a 45°C por 48 horas.
Prueba para la producción de Indol e interpretación: Se añadió 0,5mL del reactivo de Kovacs en tubos que contenían agua de triptona inoculado, mezclando bien y examinando después de un minuto. Para cada dilución se contó el número de tubos con un color rojo en la fase alcohólica, indicando la presencia de Indol (tubos positivos).
Interpretación final: Por cada dilución, se contó el número, total de tubos en la cuál se observó la formación de indol, (tubos positivos).
Reporte: Los resultados obtenidos, se expresaron en NMP de Escherichia coli, 1 gramo o mililitro. Los resultados para cada muestra se transcribieron
93
al registro interno de resultados que luego se archiva.
Control de Calidad: Para el control de calidad utilizamos solo un control negativo, el control fue preparado colocando un tubo con el medio de cultivo sin inocular.
3.8.
Procedimiento de análisis de coliformes fecales por filtro de membrana: Resumen: La prueba consiste en hacer filtrar volúmenes de agua adecuados, con ayuda de una bomba de vacío, a través de una membrana de nitrocelulosa de 47mm de diámetro, con una porosidad de 0.45 pm; la cual es colocada en una placa Petri conteniendo el caldo mFC, se incubara a una temperatura de 44.5 °C ± 0,2°C por 24 horas. Esta técnica permite examinar volúmenes muy variables de agua y ofrece un resultado directo de la concentración de
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bacterias Coliformes (por el recuento de colonias), en lugar de un estimado estadístico, como es el caso de Tubos Múltiples.
Medios de Cultivo: Caldo M-FC Composición: Triptosa
10,0 g
Proteosa, peptona N O3 ó Polipeptona
5,0 g
Extracto de Levadura
3,0 g
Cloruro sódico, NaCI
5,0 g
Lactosa
12,5 g
Sales biliares Nº 3 o mezcla Sales biliares
1,5 g
Azul anilina
0,1 g
Agua destilada
1000 mL
Preparación: Se disolvió 37 gr del medio deshidratado en un litro de agua destilada (estéril), que contenía 10mL de ácido rosólico al 1% en solución 0,2N de NaOH. Se calentó evitando la ebullición y el sobrecalentamiento. El pH final fue de 7,4 ± 0,2. No se autoclavó el medio. Se guardó el medio de líquido a 4°C dentro
95
de un frasco para reducir la pérdida de humedad.
Acido Rosólico: Se disolvió 1,0 g de ácido rosólico en 100 ml de solución de NaOH 0,2 N, no se esterilizó y se guardó la solución en oscuridad y entre 2 °C y 10 °C.
Agua de dilución (Solución tampón de fosfato): Para preparar el agua de dilución (solución de tampón de fosfato) fue necesario la preparación de soluciones Stock A y B
Solución Stock A: Se disolvió 34g de fosfato monopotásico (fosfato di hidrogeno de potasio) (KH 2PO4) en 500 ml de agua destilada, ajustamos el pH á 7,2 ± 0,5 con hidróxido de sodio (NaOH) al 1N y se completó el volumen a un litro con agua destilada .Posteriormente se autoclavó por 15 minutos a 121°C.
Solución Stock B: Se disolvió 81.1 g de cloruro de magnesio (MgCl26H20) en un litro de agua destilada. Se autoclavó por 15 minutos a 121°C. Se agregó 1,25mL de la dilución Stock A y 5 ml de la solución Stock B a un litro de agua destilada. Se distribuyeron en frascos 96
en cantidades adecuadas de 90 ± 2mL y autoclavamos por 15 minutos a 121ºC
Caldo EC Composición: Triptosa o tripticasa
20,0g
Lactosa
5,0g
Mezcla de sales biliares N° 3
1,5g
Di potasio hidrogeno fosfato K 2HPO 4 Potasio di hidrógeno fosfato, KH 2PO4 Cloruro de sodio
2,75g 2,75g 5,0g
4-rnetylumberiferil-B-D-glucoronido (MUG) Agua destilada
0,05g 1L
Preparación: Se disolvió 37g de medio EC - MUG en un litro de agua destilada. Se distribuyeron 10mL, en tubos de ensayo provisto con tubos Durham invertidos. Se esterilizó en autoclave durante 15 minutos a 121 °C.
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Equipo y Materiales:
Incubadora de baño de agua a 44,5 ± 0,2 °C.
Equipo de filtración.
Equipo generador de vació (Bomba)
Membrana de nitrocelulosa de 0,45 micras de porosidad y 47 mm de diámetro.
Frascos con agua de dilución, Con una capacidad de 100mL, autoclavables.
Pipetas de 10mL y 1mL.
Tubos de ensayo y tubos Durham.
Pinzas de punta plana.
Asas de inoculación.
Almohadillas absorbentes.
Placas petri de vidrio esterilizables.
Preparación de la Muestra: 1. Se seleccionó el volumen de la muestra en el caso de las muestras de agua potable, estuvo limitada por el grado de turbidez o por el crecimiento de no Coliformes en el medio. 98
2. Las muestras se recolectaron en frascos estériles de 250 ml, de boca ancha con tapa rosca. 3. Las placas de caldo M-FC, estuvieron preparadas, antes de iniciar el proceso de análisis, así, mismo se marcó cada placa con el código de la muestra. 4. Para preparar las placas de cultivo, se siguieron los siguientes pasos: Se colocó una almohadilla absorbente en la placa Petri y se agregó de 1,8 a 2mL de medio M-FC, hasta saturar la almohadilla. Se eliminó cuidadosamente de la placa de cultivo el posible exceso de líquido. 5. La muestra, se agitó vigorosamente varias veces, para asegurar una buena homogenización.
Filtración de la Muestra: 1. Al comienzo de cada serie de filtraciones, se utilizó unidades de filtración estériles (mediante autoclave), se evitó la interrupción de una serie de filtración en para lo cual teníamos 3 filtros y al momento de cambiar a otra muestra
99
limpiábamos con agua destilada estéril por un volumen superior al que filtramos. Se utilizó una nueva serie y se esterilizó los soportes de los filtros de membrana que se estaban utilizando. 2. Se colocó con una pinza estéril un filtro de membrana estéril (con la trama hacia arriba) sobre la placa porosa del receptáculo. Se situó con cuidado en el embudo correspondiente sobre el receptáculo y se fijó. 3. Se realizó un control de calidad previo al análisis, se filtró 100mL de agua destilada estéril y se procedió como si fuera una muestra mala. 4. La filtración se llevó a cabo bajo un vacío parcial terminado el proceso, se procedió a retirar el embudo y la membrana con unas pinzas estériles, colocándola en el medio seleccionado caldo M-FC, evitando que quedase atrapado debajo de la membrana. 5. Las placas de cultivo sembradas, se sellaron y envolvieron,
100
y se colocaron en bolsas de plástico impermeables y luego sumergirlas en un baño de agua, donde se incubaron a 44,5ºC durante 24 hrs. 6. Las placas se fijaron bajo la superficie del agua para mantener la temperatura necesaria se situaron los cultivos preparados en el baño de agua antes de transcurrir 30 minutos de la filtración.
Recuento: Se contaron todas las colonias de diferentes matices de color azul. En caso de que no hubo colonias típicas se contaron las atípicas las cuales eran de tonos grises a cremosas.
Verificación de Coliformes Fecales: Se seleccionó 5 colonias azules típicas, con una asa de inoculación, se repicó cada colonia en un tubo con medio EC, incubamos a 44,5°C ± 0,2 por 24 hrs ± 2 hrs. La incubación se llevó a cabo en un baño de agua caliente,
101
luego de cumplirse el tiempo se procedió a realizar las lecturas, apuntando los tubos positivos, que son aquellos que presentan turbiedad y formación de gas.
Cálculo de la Densidad de Coliformes: Se reportó como el número de Coliformes fecales por 100mL. Calculamos el recuento utilizando en los filtros de membrana que tenían de 20 - 60 colonias de Coliformes fecales por membrana. Se aplicó la siguiente fórmula:
Coliformes fecales/100mL = Colonias de Coliformes fecales contadas x 100 Vol. de muestra filtrado
Si no se observaron colonias de Coliformes fecales, reportamos l os resultados como: <1 Coliforme/100 mL.
102
En el caso que se utilizaron diluciones, se aplicó la siguiente fórmula:
Coliformes fecales/100 mL = Colonias de Coliformes fecales contadas x 100 Vol. de muestra filtrado x Dilución
3.9.
Procedimiento de análisis de coliformes totales, fecales y E. coli para alimentos, aguas y agua de mar. Resumen: La metodología de análisis se basa en 2 etapas: La
prueba
presuntiva
consistió
en
colocar
volúmenes
determinados de muestra de agua en una serie de tubos conteniendo caldo lauril sulfato que luego fueron incubados a 35 ± 0.5°C durante 24 - 48 horas.
La prueba confirmativa para la determinación de coliformes totales, consistió en inocular los tubos positivos de la prueba presuntiva en el caldo verde brillante bilis, incubarlos a 35 ± 0.5 °C por 48
horas,
en
el
caso de coliformes fecales y
103
E s c h e r i c h i a c o l i , se sembró en caldo EC- MUG para muestras
de alimentos y sólo en caldo EC para las demás muestras de agua , los tubos se incubaron a 44.5 ± 0.2 °C por un tiempo de 24 horas.
Para el caso de muestras de agua de mar utilizamos por cada muestra 5 tubos con medio A1 de doble concentración y 10 tubos con medio A1 de simple concentración, se inoculó volúmenes de 10ml, 1ml, y 0,1ml respectivamente de cada 5 tubos y se incubó en baño María a 44.5°C por 24 horas pasado este tiempo se contó los tubos positivos y negativos y se dejó incubar por 24 horas más para así poder determinar la densidad de coliformes fecales a través de la tabla del NMP. La formación de gas en los tubos de Durham así como la presencia de fermentación y turbiedad en los tubos, se consideró
como
reacción
resultados se expresaron en
positiva términos
(NMP) de microorganismos.
104
de de
coliformes.
Número
Los
Más Probable
Medios de cultivo:
Caldo Lauril Sulfato(CLS)
Caldo Verde Brillante Bilis lactosa (BRILLA)
Caldo EC
Caldo A1
Agua de dilución
Equipos y Materiales:
Incubadora Baño María a 44,5 ± 0,2 °C.
Incubadora a 35°C.
Frascos de dilución, capacidad de 100mL, autoclavables.
Pipetas de 10mL.
Tubos de ensayos de 18 x 150mm (para medios de
concentración simple) y 20 x 150 mm (para concentración doble).
Tubos (campanas) Durham. Probetas, matraces, espátulas, vasos de precipitación. Asas de siembra.
105
Dilución de la muestra: 1. Recepcionadas las muestras, se procedió a preparar las diluciones respectivas, el número de procedencia de agua superficial o natural. 2. Se agitó vigorosamente varias veces
para asegurar una
buena homogenización, se transfirió con una pipeta estéril un volumen de 10 ml de la muestra a un frasco con 90mLde agua de dilución. De esta manera se obtuvo la primera dilución (10 -1). 3. Se homogenizó el frasco que contenía la dilución (10 -1), con una nueva pipeta estéril, se transfirió 10 ml
a un nuevo
frasco de dilución, teniendo así la segunda dilución (10 -2).Se continuó con este procesó hasta realizar todas las diluciones, dependiendo del grado de contaminación de la muestra. 4. Se ordenó los frascos conteniendo las diluciones, en secuencia decreciente de concentración (de mayor a Menor dilución).
106
Prueba presuntiva: Para el caso de alimentos y agua natural (AP), agua superficial (AT): 1. Se preparó una batería con series de cinco tubos conteniendo 10mL de CLS de concentración doble y series de cinco tubos con 10mL de CLS de concentración simple; ésta serie dependió del número de diluciones que se hayan realizado de la muestra. Se colocó los tubos en gradillas y se codificó anotando el número asignado a la muestra, y dilución a inocular. Para agua de consumo humano se utilizó 10 tubos de 10mL de CLS a doble concentración. 2. Se agitó vigorosamente el frasco con la última dilución efectuada y con una pipeta transferimos 1mL de la dilución en cada uno de los tubos con CLS de concentración simple correspondiente a dicha dilución. 3. Se procedió de la misma forma, transfiriendo 1mL de la muestra más diluida a la más concentrada, utilizando para
107
ello la misma pipeta. 4. Transferimos también 1mL de la muestra original a cinco tubos con CLS de concentración simple y 10 ml. en cinco tubos con CLS de doble concentración. 5. Se incubó los tubos a 35°C. Después de 24 horas examinamos y separamos los tubos con CLS positivos, aquellos que presentaron
formación de gas en el tubo
Durham (fermentación) y turbiedad. Se anotó los resultados. Todos los tubos positivos pasaron a la siguiente fase, la prueba confirmativa. 6. Se re-incubó los tubos negativos por 24 horas más. Se realizó la segunda lectura a las 48 horas. Nuevamente separamos y anotamos los resultados de los tubos positivos y pasamos a la prueba confirmativa. Los tubos negativos no se tomaron en cuenta y se descartan.
Para el caso de muestras de agua de mar (AM): Se trabajó con 5 tubos de medio A1 de concentración doble, a los
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cuales agregamos 10 ml de la muestra, luego otros 5 tubos de medio A1 de simple concentración a las cuales agregamos 1ml y por último se agregó 0,1ml a otros 5 tubos de concentración simple, luego incubamos en Baño María a 44,5°C por 24 horas y pasado este tiempo se realizó la lectura y se separaron los tubos positivos de los negativos de igual manera y se volvió a incubar por otras 24 horas más a los tubos a los tubos negativos, separamos y anotamos los resultados de los tubos positivos y pasamos a la prueba confirmativa.
Prueba confirmativa: Coliformes Totales: Para el caso de alimentos y agua natural (AP), agua superficial (AT): 1. Se colocó en gradillas, los tubos conteniendo el medio BRILLA, atemperamos previamente durante 30 minutos a temperatura ambiental, codificamos cada tubo con el número asignado a la muestra y con la dilución inoculada.
109
2. Se agitaron los tubos positivos de la prueba presuntiva para una completa homogenización antes de ser inoculados a los tubos con el caldo BRILLA. 3. Con un asa de siembra estéril, se transfirió una o más asadas de un cultivo positivo de CLS a un tubo con el medio BRILLA. 4. Se repitió el mismo procedimiento para todos los tubos presuntivos. 5. Se incubó los tubos inoculados a 35 ± 0.5ºC por 24 ± 3 horas, 6. Se retiró los tubos de la incubadora luego del período de incubación, agitamos suavemente para observar la producción de gas y procedimos a realizar la lectura, consideramos positiva toda formación de gas en los tubos- Durham (Fermentación) y turbiedad en los tubos. Se anotaron los resultados. Todos los tubos positivos pasaron a esterilización para ser descartados. 7. Re-incubamos los tubos negativos por otras 24 ± 3 horas. 8. Se realizó la segunda lectura, nuevamente separamos y
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anotamos los resultados de los tubos positivos. Los tubos negativos no se tomaron en cuenta. 9. Con los resultados obtenidos de las dos lecturas calculamos el NMP.
Coliformes Termotolerantes (Fecales): 1. Se colocó en gradillas; los tubos conteniendo el medio atemperado durante 30 minutos a temperatura de 44.5 ± 0.2 °C. 2. Se codificó cada tubo con el número asignado a la muestra, y la dilución a inocular. 3. Se agitaron los tubos positivos de la prueba presuntiva para una completa homogenización antes de ser inoculados a los tubos con el caldo EC. 4. Con un asa de siembra estéril, se transfirió una o dos asadas de los cultivos positivos de CLS a los tubos con el medio EC. 5. Se incubó los tubos inoculados a 44.5 ± 0.2 °C en incubadora Baño María por 24 ± 2 horas.
111
6. Se retiró los tubos del Baño María luego del período de incubación, agitamos suavemente para observar la producción de gas y procedimos a realizar la lectura, considerando positiva toda formación de gas en los tubos Durham (Fermentación) y turbiedad en los tubos. 7. Se anotó los resultados. Todos los tubos positivos pasaron a esterilización para ser descartados. Los tubos negativos no se tomaron en cuenta.
Para el caso de muestras de agua de mar (AM): 1. Pasadas las lecturas de las 24 y 48 horas se tomaron los tubos positivos de los medios A1 de simple y de doble concentración y se procedieron a repicar cada tubo positivo en caldo EC para determinar coliformes fecales, en muestras de agua de mar solo evaluamos este parámetro porque es el indicador de mayor importancia según la norma técnica peruana de la DIGESA. 2. Con los resultados obtenidos calculamos el NMP.
112
Determinación del Número Más Probable (NMP) El cálculo de la densidad probable de bacterias Coliformes totales, fecales y E. co li está basado en la combinación de los resultados: positivos y negativos obtenidos en cada dilución. La densidad de coliformes se expresa como NMP; de coliformes por 100mL y se obtiene a través de tablas en las que se presenta el límite de confianza de 95% para cada valor de NMP determinado. Los valores de NMP presentados en el anexo 5 se refieren específicamente a la combinación de resultados positivos obtenidos cuando son inoculados series de 5 tubos con volúmenes de 10mL, 1mL, 0,1mL de muestra. Si los volúmenes de muestra inoculados se encuentran en las tablas reportar el valor correspondiente al número de tubos positivos como NMP/100mL.
113
3.10. Procedimiento para análisis de superficies: Procedimiento para la toma de muestra:
Método del hisopo: a) Descripción: Consistió en frotar con un hisopo estéril previamente humedecido en una solución diluyente, el área determinada en el muestreo.
b) Materiales:
Hisopos de algodón, de largo aproximado de 12 cm.
Tubo de ensayo con tapa hermética conteniendo 10mL de solución diluyente estéril.
Plantilla estéril, con un área en el centro de 100 cm 2 (10cm x 10cm) o alternativamente, plantilla estéril, con un área en el centro de 25 cm2 (5 x 5 cm).
Gradillas.
Guantes descartables.
114
Protector de cabello.
Mascarillas descartables.
Plumón marcador para vidrio.
Caja térmica.
Refrigerante.
c) Procedimiento: 1. Se colocó una plantilla (10cm x 10cm) sobre la superficie que muestreamos. 2. Se humedeció el hisopo en la solución diluyente y presionamos ligeramente en la pared del tubo con un movimiento de rotación para quitar el exceso de solución. 3. Con el hisopo inclinado en un ángulo de 30º, se frotó la superficie delimitada por la plantilla, cada una en dirección opuesta a la anterior. 4. En el caso que utilizamos la plantilla de 5cm x 5cm, repetimos ésta operación en 3 lugares diferentes de la misma superficie, para obtener 100cm2. 115
5. Se colocó el hisopo en el tubo con la solución diluyente, quebrando la parte del hisopo que estuvo en contacto con los dedos del muestreador, la cual se eliminó.
Método de la esponja a) Descripción: Consistió en frotar con una esponja estéril, previamente humedecida en una solución diluyente, el área determinada en el muestreo.
b) Materiales:
Esponja estéril de poliuretano o de celulosa, de 5cm x 5cm.
Plantilla estéril, con un área en el centro de 100 cm 2 (10cm x 10cm).
Frascos con tapa rosca de 250mL de capacidad, con 100mL de solución diluyente estéril.
Pinzas estériles.
Bolsas de polietileno de primer uso. 116
Guantes descartables de primer uso.
Protector de cabello.
Mascarillas descartables.
Plumón marcador para vidrio.
Caja térmica.
Refrigerante.
c) Procedimiento: 1. Se retiró la esponja de su envoltura con la pinza estéril o con los guantes descartables. 2. Humedecimos
con
la
solución
diluyente
estéril
(aproximadamente 10mL). 3. En condiciones asépticas se frotó vigorosamente el área muestreada. En el caso de superficies regulares, se frotó el área delimitada por la plantilla y en el caso de superficies irregulares (cuchillas, equipos, utensilios, etc.), frotamos abarcando la mayor cantidad de superficie.
117
4. Se colocó la esponja en el frasco con el resto de la solución diluyente luego colocamos la esponja con la muestra en una bolsa de plástico de primer uso. 5. El del hisopo y método de la esponja se utilizaron para analizar superficies inertes como mesas, para estos dos métodos los parámetros microbiológicos que analizamos fueron:
E. coli
Coliformes totales
Método del enjuague: a) Descripción: El método consistió en realizar un enjuague (botellas, frascos, similares) o inmersión (manos, objetos pequeños) en una solución diluyente.
118
b) Materiales:
Frascos con tapa hermética de boca ancha de 250 mL de capacidad, con 100 mL de solución diluyente estéril.
Bolsas de polietileno de primer uso.
Pinzas estériles.
Guantes descartables de primer uso.
Protector de cabello.
Mascarillas descartables.
Plumón marcador para vidrio.
Caja térmica.
Refrigerante.
c) Procedimiento: Para manos: 1. Vaciamos el diluyente del frasco (100 mL) en una bolsa plástica de primer uso. 2. Introducimos las manos a muestrear hasta la altura de la muñeca. 119
3. Se solicitó al manipulador que realice un frotado de los dedos y particularmente alrededor de las uñas y la palma de la mano, durante un (01) minuto aproximadamente. 4. Luego de retirar las manos se regresó el líquido al frasco o se dejó en la bolsa con la protección adecuada; en este caso, la bolsa que se utilizó fue estéril. Los parámetros microbiológicos que evaluamos para superficies vivas como lavado de manos fueron:
Staphylococ cus aureus
Coliformes totales
Estos parámetros se analizaron de la misma manera que mencionamos anteriormente.
120
IV.
RESULTADOS
Los resultados obtenidos los presentaremos a continuación en diferentes cuadros dependiendo del tipo de muestra que sea, ya sea:
Agua potable (AP)
Agua Natural (AT)
Agua de Mar (AM)
Alimento (AL)
Análisis de Superficie
121
CUADRO: 1 MUESTRAS DE AGUA POTABLE (AP)
NºRef Lab
NºCad .Cust. Localidad
Distrito
Origen de la Fuente
199
77-cc
Vilavilani
Palca
Ojo de agua
200
77-cc
Vilavilani
Palca
Ojo de agua
201
77-cc
Palca
Ojo de agua
202
79-cc
Curibaya
Ojo de agua
203
79-cc
Curibaya
Ojo de agua
204
79-cc
Curibaya
Ojo de agua
205
79-cc
Curibaya
Ojo de agua
206
79-cc
Curibaya
Ojo de agua
207
79-cc
Vilavilani Anexo Paquiña Anexo Paquiña Anexo Paquiña Anexo – Totorales Anexo – Totorales Anexo – Totorales
Curibaya
Ojo de agua
208
80-cc
209 210
Curibaya
Ojo de agua
80-cc
Curibaya Pampa Curibaya Pampa
Cambaya
Ojo de agua
80-cc
Curibaya
Curibaya
Ojo de agua
Coliformes Coliformes Bacterias Totales Fecales heterótrofas(U FC/ml) 35ºC(UFC/100 44,5ºC(UFC/1 ml) 00ml)
Fecha, Hora de muestreo
Fecha, Hora de llegada al Lab.
01/04/12 16:20 Hrs. 01/04/12 14:40 Hrs. 01/04/12 14:55 Hrs.
02/04/12 – 13 Hrs 02/04/12 – 13 Hrs 02/04/12 – 13 Hrs
<1
<1
24 x 102
10
<1
13
03
<1
32
08/04/12 ; 17.00 hrs 08/04/12 ; 17.10 hrs 08/04/12 ; 17.25 hrs 08/04/12 ; 17.32 hrs 08/04/12 ; 17.43 hrs 08/04/12 ; 17.50hrs 08/04/12 18:20 hrs 08/04/12 18:27 hrs 08/04/12 18:39 hrs
09/04./12; 11.00 hrs 09/04./12; 11.00 hrs 09/04./12; 11.00 hrs 09/04./12; 11.00 hrs 09/04./12; 11.00 hrs 09/04./12; 11.00 hrs 09/04./12. 11.00 hrs 09/04./12. 11.00 hrs 09/04./12. 11.00 hrs
1
<1
20
<1
<1
62
<1
<1
23x10
1
1
45
1
<1
21
14
01
12x10
12
04
15
10
04
<1
<1
122
71 01
211
80-cc
Curibaya
Curibaya
212
80-cc
Curibaya
Curibaya
213
82-cc
Cairani
214
82-cc
Cairani
215
82-cc
Cairani
216
82-cc
Cairani
217
83-cc
Coruca
218
83-cc
Coruca
Ojo de agua
Ojo de agua Agua Cairani Subterránea Agua Cairani Subterránea Agua Cairani Subterránea Agua Cairani Subterránea Agua Sama Inclán superficial Agua Sama Inclán superficial Agua Sama Inclán superficial
219
83-cc
Coruca
220
85-cc
Yabruco
Susapaya
Manantial
221
85-cc
Yabruco
Susapaya
222
87-CC
PESCHAY
POCOLLAY
223
89-cc
Jirata
Candarave
224
89-cc
Jirata
Candarave
225
89-CC
B. Vista
Candarave
226
89-CC
B. Vista
Candarave
Manantial I.E SANTA EUFRACIA ManantialLadera ManantialLadera Agua superficial Agua superficial
08/04/12 18:47 hrs 08/04/12 18:58 hrs
09/04./12. 11.00 hrs 09/04./12. 11.00 hrs
<1
<1
10
<1
<1
11
10/04/12 16:30 Hrs. 10/04/12 16:47 Hrs. 10/04/12 16:55 Hrs. 10/04/12 17:05 Hrs. 11/04/2012 12.55 hrs 11/04/2012 13.30 hrs 11/04/2012 13.57 hrs 16.04.12 / 05:20 Hrs. 16.04.12 / 06:00 Hrs. 17/04/2012 12:55 HRS. 17/04/12 10:30 Hrs. 17/04/12 10:40 Hrs. 17/04/12 11:25 Hrs. 17/04/12 11:30 Hrs.
11/04/1216:30hrs 11/04/1216:30hrs 11/04/1216:30hrs 11/04/1216:30hrs 12/04/1210:58hrs 12/04/1213:30hrs 12/04/1213:57hrs 06/04/1214:30hrs 06/04/1214:30hrs 17/04/2012 12:55 HRS. 17/04/2012 12:55 HRS. 17/04/2012 12:55 HRS. 18/04/1208:05hrs 18/04/1208:05hrs
20x10
15x10
51x10
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
13
>16x102**
28x10 **
23x10 2**
>16x10 **
16x10 **
36x10 **
33 **
7.8 **
27x10 2**
27
<1
34
<1
<1
68
<1
<1
<1
27
<1
29
8
2
10
14x10
56
22x10
16
14
51x10
123
06
227
89-CC
Aricota
Candarave
228
89-CC
Aricota
Candarave
229
89-CC
Marjani
Candarave
230
89-CC
Marjani
Candarave
231
88-cc
Tacalaya
Candarave
232
88-cc
Tacalaya
Candarave
233
88-cc
Tacalaya
Candarave
234
88-cc
Coranchay
Candarave
235
88-cc
Coranchay
Candarave
236
88-cc
Turunturo
Candarave
237
88-cc
Turunturo
Candarave
238
88-cc
Caracara
Candarave
239
88-cc
Caracara
Candarave
240
88-cc
San Lorenzo
Candarave
241
88-cc
San Lorenzo
Candarave
242
90-cc
Talabaya
Estique
Manantial – Ladera Manantial – Ladera Manantial – Ladera Manantial – Ladera Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Agua Subterráneo Manantial de Fondo
17/04/12 12:00 Hrs. 17/04/12 12:15 Hrs. 17/04/12 15:40 Hrs. 17/04/12 16:00 Hrs. 17/04/2012 9.40 hrs 17/04/2012 9.50 hrs 17/04/2012 10.10 hrs 17/02/2012 11.12 hrs 17/02/2012 11.30 hrs 17/04/2012 11.58 hrs 17/04/2012 12.20 HRS 17/04/2012 13.50 hrs 17/04/2012 13.58 hrs 17/04/2012 15.10 hrs 17/04/2012 15.30 hrs 17/04/12 11.00 hrs
124
18/04/1208:05hrs 18/04/1208:05hrs 18/04/1208:05hrs 18/04/1208:05hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1207:50hrs 18/04/1209:27hrs 18/04/1209:27hrs
07
<1
31
08
03
10
17
02
69x10
15
02
32x10
48
39
52
32
30
12x10
42
25
54
44
24
70
60
36
63x10
52
35
72
64
45
18x10
84
06
98x10
11x10
03
11x10 2
16
13
15x10
12
10
57x10
<1
<1
20
243
90-cc
Talabaya
Estique
244
90-cc
Talabaya
Estique
245
91-cc
Susapaya
Susapaya
246
91-cc
Susapaya
Susapaya
247
91-cc
Susapaya
Susapaya
Manantial de Fondo Manantial de Fondo Agua Superficial Agua Superficial Agua Superficial
248
92-cc
Coraguaya
Ilabaya
agua subterráne a
249
92-cc
Coraguaya
Ilabaya
Red
250
92-cc
Coraguaya
Ilabaya
251
92-cc
Vilalaca
Ilabaya
Red Agua subterráne a
252
92-cc
Vilalaca
Ilabaya
Red
253
92-cc
Vilalaca
Ilabaya
254
92-cc
Borogueña
Ilabaya
Red Agua Subterráne a
255
92-cc
Borogueña
Ilabaya
Red
256
92-cc
Borogueña
Ilabaya
Red
257
93-cc
Palca
Palca
Manantial
17/04/2012 11.30 hrs 17/04/201212.00 hrs 19/04/12 05:30 Hrs. 19/04/1205:45 Hrs. 19/04/1206:00 Hrs.
22/04/12 16:00 Hrs 22/04/1216:10 Hrs 22/04/1216:15 Hrs 22/04/12 16:33 Hrs 22/04/12 16:38 Hrs 22/04/12 16:40 Hrs 22/04/12 17:20 Hrs 22/04/1217:33 Hrs 22/04/1217:36 Hrs 24/04/12 15.50 Hrs
125
18/04/1209:27hrs 18/04/1209:27hrs 19/04/1212:40hrs 19/04/1212:40hrs 19/04/1212:40hrs
28
<1
72
07
01
12x10
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
23/04/1209:45hrs
38X10
<1
46X10
23/04/1209:45hrs 23/04/1209:45hrs
38X10
<1
42X10
26X10
<1
28X10
23/04/1209:45hrs
40
02
54
23/04/1209:45hrs 23/04/1209:45hrs
38
04
69X10
16
<1
24X10
23/04/1209:45hrs
36
05
43
23/04/1209:45hrs 23/04/1209:45hrs 25/04/1207:40hrs
03
01
19X10
03
<1
24X10
<1
<1
0
258
93-cc
Palca
Palca
Manantial
259
93-cc
Palca
Palca
Manantial H2o Superficial Rio Sama H2o Superficial Rio Sama E.P.S Tacna E.P.S Tacna H2o Superficial Rio Sama E.P.S Tacna E.P.S Tacna H2o Superficial Rio Sama E.P.S Tacna E.P.S Tacna E.P.S Tacna E.P.S Tacna E.P.S Tacna
260
93-CC
Alto Berlín
Inclán
261
94-cc
Alto Berlín
Inclán
262
94-cc
Poquera
Inclán
263
94-cc
Alto Rayo
Inclán
264
94-cc
Alto Rayo
Inclán
265
94-cc
Poquera
Inclán
266
94-cc
Poquera
Inclán
267
94-cc
Proter
Inclán
268
94-cc
Proter
Inclán
269
94-cc
Tomasiri
Inclán
270
94-CC
Tomasiri
Inclán
271
94-cc
Vilcas
Inclán
272
94-cc
Vilcas
Inclán
24/04/12 16.10 Hrs 24/04/12 16.25 Hrs 24/04/12 11.13 hrs 24/04/12 11.13 hrs 24/04/12 02:45hrs 24/04/12 11.15 Hrs 24/04/12 12.20 Hrs 24/04/12 12.45 Hrs 24/04/12 13.15 Hrs 24/04/12 12:00 Hrs 24/04/12 02:20 Hrs 24/04/12 03:20 Hrs 24/04/12 03.05 Hrs 24/04/12 01.51 Hrs 24/04/12 02.10 Hrs
126
25/04/1207:40hrs 25/04/1207:40hrs
<1
<1
68
<1
<1
03
25/04/1207:40hrs
<1,8 **
<1,8**
01**
25/04/1207:40hrs
<1,8**
<1,8**
03**
25/04/1207:40hrs 25/04/1207:40hrs
49**
2**
43x10**
<1,8**
<1,8**
79x10**
25/04/1207:40hrs
<1,8**
<1,8**
18x10**
25/04/1207:40hrs 25/04/1207:40hrs
79**
33**
76x10**
130**
13**
14x10
25/04/1207:40hrs
<1,8**
<1,8**
48x10**
25/04/1207:40hrs 25/04/1207:40hrs 25/04/1207:40hrs 25/04/1207:40hrs 25/04/1207:40hrs
13**
02**
19x10**
23** 23**
23** 23**
74x10 74x10
23** 23**
23** 23**
38x10 38x10
79** 79**
79** 79**
11x10 11x10
33**
7,8**
22x10**
273
94-cc
Puquio
Inclán
274
94-cc
Puquio
Inclán
275
95-cc
Sitajara
Sitajara
276
95-cc
Sitajara
Sitajara
277
95-cc
Sitajara
Sitajara
278
96-cc
Tarucachi
Tarucachi
279
96-cc
Tarucachi
Tarucachi
280
96-cc
Tarucachi
Tarucachi
281 282
96-cc 96-cc
Tarucachi Tarucachi
Tarucachi Tarucachi
283
96-cc
Tarucachi
Tarucachi
284
96-cc
Tarucachi
Tarucachi
285
96-cc
Tarucachi
Tarucachi
286
97-cc
Tarata
Tarata
Agua Subterráne a Agua Subterráne a ManantialLadera ManantialLadera ManantialLadera Agua Subterráne a Vivienda Inicial Vivienda Final Agua Subterráne a Agua Subterráne a Agua Subterráne a Vivienda Inicial Vivienda Final Agua Superficial
24/04/12 10.50 Hrs 24/04/12 10.15 Hrs 24/04/12 10.18 Hrs 24/04/12 02.20 Hrs 24/04/12 02.25 Hrs 24/04/12 03.20 Hrs 24/04/12 03.25 Hrs 24/04/12 03.35 Hrs 24/04/12 03.45 Hrs 24/04/12 01.51 Hrs 24/04/12 01.59 Hrs 24/04/12 02.10 Hrs 25/04/12 07:05 Hrs. 26/04/12 07:10 Hrs
127
25/04/1207:40hrs
54x10**
49**
17x10**
25/04/1207:40hrs
13x10**
7,8**
11x10**
25/04/1213:22hrs 25/04/1213:22hrs 25/04/1213:22hrs
1.5x10
<1
2.0x10
1.0x10
1
1.6x10
1.2x10
<1
1.8x10
25/04/1214:30hrs
<1
<1
<1
25/04/1214:30hrs 25/04/1214:30hrs
2
1
1,0 X 10
<1
<1
<1
25/04/1214:30hrs
2,2 X 10
<1
6,8 X 10
25/04/1214:30hrs
<1
<1
<1
25/04/1214:30hrs
<1
<1
<1
25/04/1214:30hrs 25/04/1214:30hrs 26/04/12 10:37 Hrs
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1.8 **
<1.8 **
NSD **
295
99-cc
Cambaya
Ilabaya
Agua Superficial Agua Superficial Agua Superficial Agua Superficial Agua Superficial Agua Subterránea Agua Subterránea Agua Subterránea Agua subterránea manantial fondo + rio
296
99-cc
Cambaya
Ilabaya
Red Publica
297
99-cc
Cambaya
Ilabaya
Red Publica
287
97-cc
Tarata
Tarata
288
97-cc
Tarata
Tarata
289
97-cc
Tarata
Tarata
290
97-cc
Tarata
Tarata
291
97-cc
Tarata
Tarata
292
98-cc
Tacna
Tacna
293
98-cc
Tacna
Tacna
294
98-cc
Tacna
Tacna
26/04/12 07.30 Hrs 26/04/12 08.00 Hrs 26/04/12 08.25 Hrs 26/04/12 09.30 Hrs 26/04/12 10.00 Hrs 26/04/12 08.15 Hrs 26/04/12 08.20 Hrs 26/04/12 08.31 Hrs. 25/04/12 05.30 Hrs. 25/04/12 06.40 Hrs. 25/04/12 07.15 Hrs.
128
26/04/12 10:37Hrs
<1.8 **
<1.8 **
NSD **
26/04/12 10:37Hrs 26/04/12 10:37Hrs 26/04/12 8:15Hrs 26/04/12 10:37Hrs 26/04/12 8:15Hrs 26/04/12 8:15Hrs 26/04/12 – 8:15 Hrs
<1.8 **
<1.8 **
NSD **
<1.8 **
<1.8 **
NSD **
<1.8 **
<1.8 **
NSD **
<1.8 **
<1.8 **
NSD **
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
<1
26/04/12 11.30 Hrs
2,2 x 10
<1
4,8 x 10
26/04/12 11.31 Hrs 26/04/12 11.32 Hrs
3,6 x10
<1
5,2 x 10
2,0 x 10
<1
2,9 x 10
OBSERVACIÓN: **: Cuando las muestras analizadas se trabajaron con el método de tubos múltiples. Método de ensayo: Numeración de Coliformes totales, Coliformes fecales: Método Estandarizado de Filtración por membrana. APHA, AWW, WEF. Part. 9222B, 9222D. 21th ed. 2005. Recuento de bacterias heterótrofas: Método de placa fluida APHA, AWW, WEF. Part. 9215B. 21th ed. 2005. Método de ensayo: Numeración de Coliformes totales, Coliformes fecales: Método Estandarizado de Tubos Múltiples. APHA, AWW, WEF. Part. 9221BE, 9221F-1. 21th ed. 2005. Recuento de bacterias heterótrofas: Método de placa fluida APHA, AWW, WEF. Part. 9215B. 21th ed. 2005.
(Agua potable)(NMP/100ml) Método de ensayo: Numeración de Coliformes fecales: Método Estandarizado de Tubos Múltiples. APHA, AWW, WEF. Part. 9221B, 9221E2. 21th ed. 2005. (Agua de mar) Coliformes Fecales 44,5ºC (NMP/100ml)
UFC = Unidad formadora de colonias (*) En caso de analizar por la técnica del NMP por tubos múltiples = < 1,8 /100 ml
129
Coliformes totales: Interpretación de resultados para muestras de Agua Natural (AP) TOTAL Muestras positivas Muestras negativas
99 58 41
De las 99 muestras analizadas 58 resultaron positivas para coliformes totales sobrepasando el límite permisible por el Reglamente de la calidad del agua DS N° 031-2010-SA, la cual el límite es de (0) UFC por el método de filtración y < 1,8 /100 ml en caso de analizar por la técnica del NMP por tubos múltiples. Las muestras negativas dieron un valor de de 41, lo cual nos indica que las muestras positivas contaminadas tienen un valor elevado con respecto a las negativas.
Total de Muestras de Agua Potable : 99 Negativos : 41
Positivos : 58 41%
59%
130
Coliformes Fecales: Interpretación de resultados para muestras de Agua Natural (AP) TOTAL Muestras positivas Muestras negativas
99 42 57
Para el caso de los coliformes fecales del total de muestras, 42 resultaron positivas sobrepasando el límite máximo permisible según el Reglamente de la calidad del agua DS N° 031-2010-SA, la cuál es de (0) UFC por el método de filtración y < 1,8 /100 ml en caso de analizar por la técnica del NMP por tubos múltiples, las 57 muestras restantes resultaron negativas.
Muestras positivas para: coliformes Fecales:
Coliformes fecales Negativos
Positivos
42% 58%
131
Bacterias Heterotróficas: Interpretación de resultados para muestras de Agua Natural (AP) TOTAL Muestras positivas Muestras negativas
99 18 81
Para el caso de las bacterias heterótrofas 18 resultaron positivos sobrepasando el límite máximo permisible que es de 500UFC/mL a 35ºC y 81 restantes resultaron negativos.
Muestras positivas para: Bacterias heterotróficas
Bacterias heterotroficas : 99 Negativas
Positivas
18%
82%
132
CUADRO:2 MUESTRAS DE AGUA NATURAL (AT)
NºRef Lab
NºCad .Cust. Localidad
Distrito
Origen de la Fuente
Punto de muestreo
Fecha, Hora de muestreo
Fecha, Coliformes Hora de Totales 35ºC llegada al Lab. (UFC/100ml)
Coliformes Fecales 44,5ºC
Bacterias heterótrofas
(UFC/100ml)
(UFC/ml)
27 - AT 82 - cc
Cairani
Cairani
AGUA SUBTERRANEA
CAPTACION
10/04/12 16:00 Hrs.
11/04/12 11.29 Hrs.
9
5
86
28 - AT 85 - cc
Yabruco
Susapaya
Manantial
Ingreso de filtro
16.04.12 / 05:15 Hrs
16/04/12 14.30 Hrs.
52
<1
47x10 2
29-AT
89-cc
Jirata
Quil.
Manantial - Ladera
Captación
17.04.12 / 10:00 Hrs.
18.04.12 / 08:05 Hrs.
82
35
52x10
30-AT
89-CC
B. Vista
Quil.
Agua Subterránea
Captación
17.04.12 / 11:15 Hrs.
18.04.12 / 08:05 Hrs.
56
39
15x10
31-AT
89-CC
Aricota
Quil.
Manantial - Ladera
Captación
17.04.12 / 15:00 Hrs.
18.04.12 / 08:05 Hrs.
25
<1
30
32-AT
91-CC Susapaya
Agua Superficial
Ingreso a la Planta
19.04.12 / 05:00 Hrs.
19.04.12 / 12:40 Hrs.
<1
<1
<1
33-AT
96-cc
Tarucachi
Agua Subterránea
Captación Chamalaca
25/04/12 07:30 Hrs
25/04/12 14:30 Hrs
<1
<1
<1
34-AT
96-cc
Tarucachi Tarucachi
Agua Subterránea
Captación Vilaque
25/04/12 07:45 Hrs
25/04/12 14:30 Hrs
9,0 X 10
7,0 X 10
3,8 X 10 2
35-at
97-cc
Agua Superficial
Captación Rio Coldaya
26/04/12 07.00 Hrs
26/04/12 10.37 Hrs
3.3X10
<1.8
NSD
Tarata
Susapaya Tarucachi
Tarata
133
36-at
97-cc
Tarata
Tarata
Agua Superficial
Captación Sta Bárbara
26/04/12 09.00 Hrs
26/04/12 10.37 Hrs
1.3X10
<1.8
NSD
37-at
99-cc
Cambaya
Ilabaya
Agua Subterránea Manantial Fondo trio
Captación
25/04/12 05.30 Hrs
26/04/12 11.30 Hrs
1,5 x10
<1
3,3 x 10
134
Interpretación de resultados para muestras de Agua Natural (AT) Coliformes Totales TOTAL Muestras positivas Muestras negativas
11 9 2
Las muestras de agua natural (AT) son fuentes de captación del agua, es decir, son lugares de almacenamiento de agua, estas muestras se caracterizaban por presentar una mayor turbidez y la presencia de partículas en suspensión. De las 11 muestras analizadas 9 resultaron positivas para coliformes totales sobrepasando el límite permisible por el Reglamente de la calidad del agua DS N° 031-2010-SA, la cual el límite es de (0) UFC por el método de filtración y < 1,8 /100 ml en caso de analizar por la técnica del NMP por tubos múltiples. Las muestras negativas fueron 2, lo cual nos da a entender que las fuentes de agua natural son focos contaminados en los cuales se debe poner atención.
135
Porcentaje del indicador coliformes totales
% de Coliformes Totales Negativos
Positivos 18%
82%
136
Coliformes Fecales TOTAL Muestras positivas Muestras negativas
11 4 7
Para el caso de los coliformes fecales del total de muestras 4 resultaron positivas sobrepasando según el Reglamente de la calidad del agua DS N° 031-2010-SA, la cual el límite es de (0) UFC por el método de filtración y < 1,8 /100 ml en caso de analizar por la técnica del NMP por tubos múltiples, y 7 resultaron negativas.
Porcentaje del indicador para coliformes Fecales:
Coliformes fecales Negativos
Positivos
36% 64%
137
Bacterias Heterotróficas TOTAL Muestras positivas Muestras negativas
11 5 6
Para el caso de las bacterias heterótrofas 5 resultaron positivos y 6 negativos sobrepasando el límite máximo permisible que es de 500UFC/mL a 35ºC.
Porcentaje del indicador para bacterias Heterotróficas
% de Bacterias Heterotroficas Negativos
Positivos
45% 55%
138
CUADRO:3 MUESTRAS DE AGUA DE MAR NºRef Lab NºCad.Cust.
Localidad
Distrito
248
78-cc
Los palos
TACNA
249
78-cc
Llostay
SAMA
250
78cc
Las viejas
SAMA
251
78-cc
La Lobita
SAMA
252
78-cc
Baradero
SAMA
253
78-cc
La Lisera
SAMA
254
78-cc
Las Conchitas
SAMA
255
78-cc
Playita Brava
SAMA
256
78-cc
Planchón
SAMA
257
78-cc
Los Hornos
SAMA
258
78-cc
Tomoyo Beach
SAMA
259
78-cc
Las Gaviotas
SAMA
260
78-cc
Punta Colorada
SAMA
261
78-cc
Vila Vila
SAMA
Fecha, Hora de muestreo
Fecha, Hora de llegada al Lab.
02/04/2012 9.18 Hrs 02/04/2014 9.40 Hrs 02/04/2012 9.52 Hrs 02/04/2012 9.58 Hrs 02/04/2012 10.05 Hrs 02/02/2012 10.10 Hrs 02/04/2012 10.17 hrs 02/04/2012 10.24 Hrs 02/04/2012 10.35 Hrs 02/04/2012 10.42 Hrs 02/04/2012 11.00 Hrs 02/04/2012 11.05 Hrs 02/04/2012 11.14 Hrs 02/04/2012 11.22 Hrs
02/04/2012 13.50Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs
139
Fecha, Hora de análisis
Coliformes Fecales
02/04/12 14:10 Hrs.
13
02/04/12 14:10 Hrs.
2
02/04/12 14:10 Hrs.
<1.8
02/04/12 14:10 Hrs.
<1.8
02/04/12 14:10 Hrs.
<1.8
02/04/12 14:10 Hrs.
4,5
02/04/12 14:10 Hrs.
1,8
02/04/12 14:10 Hrs.
2
02/04/12 14:10 Hrs.
<1.8
02/04/12 14:10 Hrs.
<1.8
02/04/12 14:10 Hrs.
<1.8
02/04/12 14:10 Hrs.
<1.8
02/04/12 14:10 Hrs.
2
02/04/12 14:10 Hrs.
26
262
78-cc
Tres Cruces
SAMA
263
78-cc
Canepa
SAMA
264
78-cc
Pozo Redondo
SAMA
265
78-cc
La Lancha
SAMA
266
78-cc
Puerto Grau
SAMA
267
81-cc
Los palos
TACNA
268
81-cc
Llostay
SAMA
269
81-c
Las viejas
SAMA
270
81-cc
La Lobita
SAMA
271
81-cc
VARADERO
SAMA
272
81-cc
La Lisera
SAMA
273
81-cc
Las Conchitas
SAMA
274
81-cc
Playita Brava
SAMA
275
81-cc
Planchón
SAMA
276
81-cc
Los Hornos
SAMA
277
81-cc
Tomoyo Beach
SAMA
278
81-cc
Las Gaviotas
SAMA
02/04/2012 11.30 Hrs 02/04/2012 11.40 Hrs 02/04/2012 11.51 Hrs 02/04/2012 12.00 Hrs 02/04/2012 12.21 hrs 02/04/2012 09.20hrs 02/04/2012 9.50hrs 02/04/2012 10.00hrs 02/04/2012 10.05 hrs 02/04/2014 10.10hrs 02/04/2012 10.18 hrs 02/04/2012 10.25 hrs 02/04/2012 10.38 hrs 02/04/2012 10.45 hrs 02/04/2012 10.54 hrs 02/04/2012 11.05 hrs 02/04/2012 11.10 hrs
02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 13.50 Hrs 02/04/2012 2.20hrs 02/04/2012 2.20hrs 02/04/2012 2.20hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/20122.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs
140
02/04/12 14:10 Hrs.
11
02/04/12 14:10 Hrs.
1,8
02/04/12 14:10 Hrs.
17
02/04/12 14:10 Hrs.
3,7
02/04/12 14:10 Hrs.
35X10
09/04/12 - 14:38 Hrs.
4,5
09/04/12 - 14:38 Hrs.
<1.8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
<1.8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
14
09/04/12 - 14:38 Hrs.
7,8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
7,8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
6,8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
11
09/04/12 - 14:38 Hrs.
1,8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
<1.8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
<1.8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
<1.8
04/04/2012 11.25 hrs 02/04/2012 11.30 hrs 02/04/2012 11.38 hrs 02/04/2012 11.42 hrs 02/04/2012 11.50 hrs 02/04/2012 12.00 hrs 02/04/2012 12.25 HRS 16/04/2012 9.26 hrs
02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 02/04/2012 2.20 hrs 16/04/2012 2.30 hrs
SAMA
16/04/2012 10.03 hrs
Las Viejas
Sama
86-cc
La lobita
Sama
290
86-cc
Baradero
Sama
291
86-cc
La Lisera
Sama
292
86-CC
Las Conchitas
Sama
293
86-cc
Playita Brava
Sama
279
81-cc
Punta Colorada
SAMA
280
81-cc
Vila Vila
SAMA
281
81-cc
Tres Cruces
SAMA
282
81-cc
Canepa
SAMA
283
81-cc
Pozo Redondo
SAMA
284
81-cc
La Lancha
SAMA
285
81-cc
Puerto Grau
SAMA
286
86-cc
Los Palos
TACNA
287
86-cc
Llostay
288
86-cc
289
09/04/12 - 14:38 Hrs.
<1.8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
79
09/04/12 - 14:38 Hrs.
1,8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
2
09/04/12 - 14:38 Hrs.
<1.8
09/04/12 - 14:38 Hrs.
2
09/04/12 - 14:38 Hrs.
49
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
16/04/2012 10.29 hrs
16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
13
16/04/2012 10.31 hrs
16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
33
16/04/2012 10.45 hrs 16/04/2012 10.50 HRS 16/04/2012 11.15 hrs
16/04/2012 2.30 hrs 16/04/2012 2.30 HRS 16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
16.04.12/ 14:38 Hrs.
2
16/04/2012 11.30 hrs
16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
141
294
86-cc
Planchón
Sama
16/04/2012 11.37 HRS
16/04/2012 2.30 HRS
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
295
86-CC
Los Hornos
Sama
16/04/2012 11.46 hrs
16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
296
86-cc
Tomoyo Beach
Sama
16/04/2012 11.52 HRS
16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
2
297
86-CC
Las Gaviotas
Sama
<1,8
86-cc
Punta Colorada
Sama
16.04.12/ 14:38 Hrs.
13
299
86-cc
Vila Vila
Sama
16.04.12/ 14:38 Hrs.
540
300
86-cc
Tres Cruces
Sama
16/04/2012 2.30 hrs 16/04/2012 2.30 hrs 16/04/2012 2.30 hrs 16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
298
16/04/2012 11.59 hrs 16/04/2012 12.10 hrs 16/04/2012 12.18 hrs 16/04/2012 12.25 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
301
86-cc
Canepa
Sama
16/04/2012 12.35 hrs
16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
302
86-cc
Pozo Redondo
Sama
<1,8
86-cc
La Lancha
Sama
16.04.12/ 14:38 Hrs.
<1,8
304
86-cc
Puerto Grau
Sama
16/04/2012 2.30 hrs 16/04/2012 2.30 hrs 16/04/2012 2.30 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
303
16/04/2012 12.50 hrs 16/04/2012 13.00 hrs 16/04/2012 13.22 hrs
16.04.12/ 14:38 Hrs.
63
142
Interpretación de resultados para muestras de Agua de Mar (AM) TOTAL Muestras positivas Muestras negativas
57 0 57
De las 57 muestras analizadas todas resultaron negativas, es decir todas eran aptas, por debajo de los límites para coliformes fecales la cual mediante la norma sanitaria de playas menciona los límites máximos permisibles los cuales son de un rango de 0-200 es buena, de 201-1000 rango de valor regular, pero un rango > 1000 se considera mala, se sabe que estos rangos miden los coliformes fecales (NMP/100mL) según la Directiva Sanitaria n° 038-Minsa/Digesa-v.01.RM N° 659-2010/Minsa.
143
CUADRO: 4
MUESTRA DE ALIMENTO (AL)
Muestra:
Solterito
Forma de presentación:
Granel-bolsa de polietileno
Condiciones durante la recepción Fecha hora de muestreo:
Muestra refrigerada 17.04.2012/ 12:40hrs.
Código de campo:
ME01
Código de Laboratorio:
AA-06
ENSAYOS Numeración de microorganismos aerobios mesófilos viables (UFC/g) Numeración de coliformes (NMP/g) Numeración de S t a p h y l o c o c c u s áu reu s (UFC/g) Numeración de E. coli (NMP/g) Detección de Salmonella spp . (/25g)
RESULTADOS 15X10
METODOS ISO 4833:2003.
<3.0 NSD
ISO 4831:2006. ISO 68881:1999.Adm.1.2003 ISO 7251:2005. ISO -6579:2002/Cor 1:2004.
<3.0 Ausencia
Nota: <”valor” significa no cuantificable inferior al valor indicado.
Interpretación de resultados: Para la Numeración de microorganismos aerobios mesófilos viables (UFC/g) se trabajó según el método mencionado en la parte metodológica hallando un resultado de 15x10 (UFC/g) el cual está por debajo del límite permisible.
144
En la Numeración de Coliformes con la tabla del NMP se halló un resultado de <3.0 (NMP/g) el cual está por debajo del límite permisible. Numeración de E. coli encontramos un valor de <3.0 (NMP/g) de alimento el cual nos indica que es un valor por debajo del límite permisible. En la detección de Salmo nella spp en (25g) tuvo un resultado de: Ausencia, en la incubación de los agares XDL y BPLS se encontraron colonias atípicas de salmonella las cuales eran de color amarillo y se procedió a realizar la confirmación bioquímica. Al realizar las pruebas bioquímicas el Agar TSI por columna nos dio un color negro, el cual nos indicó formación de hidrógeno sulfurado, lo cual nos da un indicio de que podría ser un cultivo de Salmonella . Para el medio L-Lisina descarboxilasa (LIA) se estrió en la superficie y vimos que nos dio un color púrpura, luego de la incubación indicando reacción positiva. Para realizar la reacción de Indol el tubo que contenía 5ml de medio Triptona se añadió 1 ml del reactivo de Kovacs y se vio la formación de un anillo rojo pálido lo cual era reacción positiva.
145
Finalmente al realizar la prueba con el Agar Urea esta nos dió negativa debido a que la urea debió hidrolizarse, cambiando de color rojo fenol a rosa rosado y un cereza intenso, cosa que no sucedió porque el medio se mantuvo con su color original sin cambios. Al salir negativo esta última se descartó la posibilidad de que sea una especie de Salmonella para lo cual de indicó en el informe como Ausencia.
146
CUADRO: 5 Superficies vivas e inertes (SV y SI) Superficie Viva (SV): Muestra:
Lavado de manos Solución diluyente de muestreo en frasco de vidrio x 100 ml. estéril Muestra en cadena de frío 01 frasco x 100ml 17.04.12 /12:50Hrs. ME03 SV-07
Forma de presentación: Condiciones durante la recepción Cantidad recibida Fecha y hora de muestreo: Código de campo: Código de Laboratorio:
ENSAYOS Numeración de coliformes (UFC/manos) Numeración de Staphylococc us aureus
(UFC/manos)
RESULTADOS
RESULTADOS
NSD
05
ISO 4832:2006
NSD
NSD
ISO 6888-1:1999(E).
Nota: <”valor” significa no cuantificable inferior al valor indicado.
NSD: No se determinó
En la superficie viva que en este caso fue de lavado de manos se determinó el parámetro de numeración de coliformes con el método horizontal para la numeración de Coliformes contando las colonias en Agar VRBA dándonos un valor de 05 UFC/manos La numeración de Staph ylococc us aureus no se pudo determinar.
147
Superficie Inerte (SI): Muestra:
Hisopado de Tabla Solución diluyente de muestreo en tubo de vidrio x10 ml. estéril Muestra en cadena de frío 01 tubo x 10ml 17.04.12/ 12:45 Hrs. ME02 SI-07
Forma de presentación: Condiciones durante la recepción Cantidad recibida Fecha y hora de muestreo: Código de campo: Código de Laboratorio:
ENSAYOS REALIZADOS Numeración de coliformes (UFC/Cm2) Numeración de E. coli (NMP/g)
RESULTADOS 07
NSD
NSD
NSD
RESULTADOS
ISO 7251:2005.
Nota: <”valor” significa no cuantificable inferior al valor indicado.
NSD: No se determinó
Los ensayos realizados para las superficies vivas fueron el de Numeración de coliformes (UFC/Cm 2) y la Numeración de E. coli (NMP/g), en la primera nos dio un valor de 07 UFC/cm2 para ello se utilizó el medio selectivo agar biliado rojo neutro cristal violeta (Violet Red Bite Agar: VRBA) inoculando 1ml de cada dilución en las placas con mucha esterilidad, las colonias que se encontraron fueron colonias rojo purpura. Para la numeración de E.coli no se pudo determinar.
148
Grafico comparativo entre las todas las muestras analizadas y sus resultados positivos y negativos
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 C a n t id a d
Positivos Negativos
AP
AT
AM
AL
Muestras
CUADRO: 6 Análisis de control de calidad del agua destilada:
Fecha
Conductividad
08/03/12
10,0 (umhos/cm)
pH 9,33
Recuento de bacterias heterótrofas 42x102 ufc/ml
Se realizó en análisis físico químico durante la estancia en el área de esterilización y lavado y se realizó en análisis del agua destilada dándonos 149
estos valores 10,0 umhos/cm, el instructivo de control de calidad nos indica que debe de ser superior a > 0,5 megaohmnios de resistencia ó < 2 uhmhos lo cual nos indica que su conductividad esta elevada. Para el caso del pH encontramos un valor de 9,33 y según los límites permisibles para el agua destilada son de 5,5 – 7,5 estando por encima del valor límite lo cual nos da un indicio de contaminación. Por último para el recuento en placa se obtuvieron 42x10 2 ufc/ml y según la norma no debe sobrepasar las 1000 UFC/ml lo cual termina comprobando que existe una contaminación del agua destilada, para contrarrestar esto se tomó las medidas correctivas necesarias limpiando con solución de hipoclorito de sodio al bidón de almacenamiento, así como a la limpieza del equipo destilador en su estructura interna.
150
CUADRO: 7
Análisis del monitoreo ambiental:
Se analizaron las mesas de trabajo del área de microbiología mesa 1, 2 y 3 y se determinó estos dos parámetros el recuento en placa y los hongos y levaduras dándonos valores de:
Fecha
Punto de muestreo
Conforme
Resultados
SI o NO
04/04/12
Mesa 1
Recuento en placa 10 ufc/cm 2
04/04/12
Mesa 2
03 ufc/cm 2
05 ufc/15min
04 ufc/15min
SI
04/04/12
Mesa 3
07 ufc/cm 2
01 ufc/15min
07 ufc/15min
SI
23/04/12
Mesa 1
73 ufc/cm 2
01 ufc/15min
06 ufc/15min
NO
23/04/12
Mesa 2
87 ufc/cm 2
01 ufc/15min
09 ufc/15min
NO
23/04/12
Mesa 3
01 ufc/cm 2
03 ufc/15min
08 ufc/15min
SI
Levaduras
Mohos
01 ufc/15min
07 ufc/15min
SI
Según el instructivo nos menciona que el límite es de 15 ufc/15min para Mohos y levaduras y no mayo de 10ufc/cm2 para el recuento en placa según el instructivo de monitoreo ambiental del aire. Cod: LSA 15.2.01-2008
151
V. 5.1.
CONCLUSIONES Y SUGERENCIAS
Conclusiones:
1. El laboratorio de salud ambiental brinda un servicio en la ejecución de las acciones de vigilancia y control en salud ambiental mediante el diagnóstico de la calidad sanitaria de agua (potable, natural, mar, piscina, cuencas y residuales), Alimentos, y superficies en contacto con los alimentos, identificando y cuantificando los contaminantes biológicos contribuyendo de este modo a la adecuada y oportuna toma de decisiones especialmente en casos de contingencia y alertas sanitarias.
2. Los métodos utilizados para el análisis de muestras de aguas, alimentos y superficies en contacto con alimentos , tales como ; Recuento de bacterias heterotróficas ,Recuento de coliformes fecales y totales por filtración de membrana y por el método de tubos múltiples ,detección de Salmon ella sp y recuento de Staph ylo co cc us
coagulasa positivo, son métodos áureu s
152
realizados de acuerdo a lo establecido en el D.S N° 031-2010 – SA, métodos internacionales acreditados como las normas ISO establecidos por la DIGESA , y bajo la NTP ISO/IEC 17025:2006, fueron aplicados de manera correcta mediante lo cual se obtuvo resultados con certeza.
3. Se evaluó la calidad microbiológica de 99 muestras de agua potable; 11 agua natural; 57 agua de mar; Los cuales obtuvieron una calificación sanitaria establecida por tres variables de estudio; densidad de coliformes totales, coliformes fecales y bacterias heterotróficas, resultando aptas para consumo el consumo humano el 41.2% muestras de agua potable, 18.19% de agua natural; para el caso de muestras de agua de mar se evaluó solo el parámetro de coliformes fecales las cuales el 100% de las muestras resultaron por debajo del límite permisible.
4. El análisis de la calidad microbiológica de 1 muestra de alimento correspondientes al programa de higiene y vigilancia de alimentación colectiva, obtuvo la denominación de aceptable
153
al no exceder los limites microbiológicos para coliformes totales (NMP/100ml), según la guía técnica para el análisis microbiológico de superficies de contacto de alimentos y bebidas R.M.N° 461 – 2007 /MINSA.
5. En el caso del Análisis de control de calidad del agua destilada se reporto un exceso de bacterias heterotróficas de 42x10 2 ufc/ml ,para contrarrestar esto se tomó las medidas correctivas necesarias limpiando con solución de hipoclorito de sodio al bidón de almacenamiento, así como a la limpieza del equipo destilador en su estructura interna.
6. Para el caso del monitoreo ambiental del área de análisis microbiológico basado en la norma ISO / TEC 17025-199 .Ítem 5.3, en la primera fecha revela una adecuada calidad microbiológica del aire, pero en el siguiente análisis de reporto un exceso de contaminantes para lo cual se tomaron medidas correctivas para no exceder los límites permisibles, factor que finalmente influye para la determinación y seguridad de los resultados.
154
5.2.
Sugerencias:
1. Los resultados obtenidos indican la necesidad de desarrollar medidas que mejoren el abastecimiento de agua para consumo humano, estas medidas se deben desarrollar tanto para las fuentes de obtención de agua como a las condiciones en que ocurre su almacenamiento.
2. Se debería analizar las muestras con los volúmenes completos de 10, 50 y 100 ml en la técnica de filtración por membrana para así realizar una mejor comparación entre los coliformes totales, fecales, para ellos se debería pedir un mayor volumen de muestra a los técnicos encargados del muestreo; así mismo se debería utilizar diluciones decimales para el caso de las bacterias heterotróficas.
3. Se debería gestionar el aumento de personal encargado en el laboratorio, para poder tener una mejor eficiencia de la que ya se cuenta.
155
4. Implementar el área de parasitología en el laboratorio para realizar las pruebas respectivas y así tener un análisis completo de los parámetros microbiológicos.
5. La implementación de un equipo cuenta colonias, que permitiría minimizar los esfuerzos en la lectura de resultado de análisis, permitiendo a la vez menor margen de error.
6. Usar el material estéril con la mayor asepsia posible en cada procedimiento realizado.
7. No se deben usar medios que pasen el tiempo límite permisible
156
VI.
BIBLIOGRAFÍA
1. ICMFS. (International Commission on Microbiological Specifications for Foods, of the International Union of Microbiological Societies). 2000. Microorganismos de los alimentos 1. Su significado y métodos de enumeración. .Editorial Acribia.S.A Zaragosa - España.
2. Frazier, W. 1993.Microbiologia de los alimentos. Cuarta Edición. Editorial Acribia,S.A. Zaragosa-España.
3. Doyle, M., et al. 1997. Microbiología de los Alimentos. Editorial Acribia S.A. Apartado 466 50080 Zaragoza – España.
4. Lazcano ,2000.Analisis microbiológico de aguas. Técnicas de filtración por membrana. Gelman laboratory. Lima-Perú
5. MINSA. 2007. Guía Técnica para el Análisis Microbiológico de Superficies en contacto con Alimentos y Bebidas. Perú
157
6. MINSA. Resolución ministerial nº 461-2007.2007. Guía técnica para el análisis microbiológico de superficies en contacto con alimentos y bebidas.
7. Directiva Sanitaria que Establece el Procedimiento para la Evaluación de la Calidad Sanitaria de las Playas del Litoral Peruano Directiva Sanitaria N° 038-MINSA/DIGESA-V.01.RM N° 659-2010/MINSA.
8. Reglamento de la Calidad del Agua para Consumo Humano. DS N° 0312010-SA.
158
VII.
ANEXOS
ANEXO Nº 1: LÍMITES MÁXIMOS PERMISIBLES DE PARÁMETROS MICROBIOLÓGICOS Y PARASITOLÓGICOS Parámetros
Unidad de medida
Bacterias Coliformes Totales. E. Coli
Límite máximo permisible
UFC/100 mL a 35ºC
0 (*)
UFC/100 mL a 44,5ºC
0 (*)
UFC/100 mL a 44,5ºC
0 (*)
UFC/mL a 35ºC
500
Bacterias Coliformes Termotolerantes o Fecales Bacterias Heterotróficas Huevos y larvas de Helmintos, quistes y ooquistes de protozoarios
Nº org/L
patógenos
0
Vírus
UFC / mL
Organismos de vida libre, como algas,
Nº org/L
protozoarios, copépodos, rotíferos, nemátodos en todos
sus
estadios evolutivos
UFC = Unidad formadora de colonias (*)
En caso de analizar por la técnica del NMP por tubos múltiples = < 1,8 /100 ml
Fuente: Reglamente de la calidad del aguaDS N° 031-2010-SA.
159
ANEXO Nº 2: LÍMITES MÁXIMOS PERMISIBLES DE PARÁMETROS DE CALIDAD ORGANOLÉPTICA
Límite máximo Parámetros
Unidad de medida
Permisible
1. Olor 2. Sabor
-----
Aceptable Aceptable
3. Color
UCV escala Pt/Co
15
UNT
5
Valor de pH
6,5 a 8,5
limho/cm
1 500
mgL-1
1 000
8. Cloruros
mg Cl - L-
250
9. Sulfatos
mg SO4 = L-1
250
10. Dureza total
mg CaCO3 L -
500
11. Amoniaco
mg N L-1
1,5
12. Hierro
mg Fe L-
0,3
13. Manganeso
mg Mn L-1
0,4
14. Aluminio
mg Al L-1
0,2
15. Cobre
mg Cu L-
2,0
16. Zinc
mg Zn L-1
3,0
17. Sodio
mg Na L-
200
4. Turbiedad 5.
pH
6. Conductividad (25°C) 7. Sólidos totales disueltos
UCV = Unidad de color verdadero UNT = Unidad nefelométrica de turbiedad
160
ANEXO Nº 3: LÍMITES MÁXIMOS PERMISIBLES DE PARÁMETROS QUIMICOS INORGANICOS Y ORGANICOS Parámetros Inorgánicos 1. Antimonio 2. Arsénico (nota 1) 3. Bario 4. Boro 5. Cadmio 6. Cianuro 7. Cloro (nota 2) 8. Clorito 9. Clorato 10. Cromo total 11. Flúor 12. Mercurio 13. Níquel 14. Nitratos 15. Nitritos
Unidad de medida mg Sb L-' mg As L- mg Ba L-' mg B L-' mg Cd L- mg CN- L-' mg l_-' mg L-' mg L-' mg Cr L-' mg P L-' mg Hg L' mg Ni L- mg NOs L-' mg NO2 L-'
Límite máximo permisible 0,020 0,010 0,700 1,500 0,003 0,070 5 0,7 0,7 0,050 1,000 0,001 0,020 50,00 3,00 Exposición corta 0,20 Exposición larga
16. Plomo 17. Setenio 18. Molibdeno 19. Uranio
mg Pb L-' mg Se L - mg Mo L-i mg U L-
Parámetros Orgánicos
Unidad de medida
1. Trihalometanos totales (nota 3) 2. Hidrocarburo disuelto o emulsionado; aceite mineral 3. Aceites y grasas 4. Alacloro 5. Aldicarb 6. Aldrín y dieldrín 7. Benceno 8. Clordano (total de isómeros)
mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-'
161
0,010 0,010 0,07 0,015
Límite máximo permisible 1,00 0,01 0,5 0,020 0,010 0,00003 0,010 0,0002
9. DDT (total de isómeros) 10. Endrin 11. Gamma HCH (lindano) 12. Hexaclorobenceno 13. Heptacloro y
mgL-' mgL-' mgL-' mgL-'
0,001 0,0006 0,002 0,001
heptacloroepóxido
mgL-'
0,00003
14. Metoxicloro 15. Pentaclorofenol 16. 2,4-D 17. Acrilamida 18. Epiclorhidrina 19. Cloruro de vinilo 20. Benzopireno 21. 1,2-d¡cloroetano 22. Tetracloroeteno 23. Monocloramina 24. Tricloroeteno 25. Tetracloruro de carbono 26. Ftalato de di (2-etilhexilo) 27. 1,2- Diclorobenceno 28. 1,4- Diclorobenceno 29. 1,1- Dicloroeteno 30. 1,2- Dicloroeteno 31. Diclorometano 32. cido edético (EDTA) 33. Etilbenceno 34. Hexaclorobutadieno 35. Acido Nitrilotriacético 36. Estireno 37. Tolueno 38. Xileno 39. Atrazina 40. Carbofurano 41. Clorotoluron 42. Cianazina 43. 2,4- DB 44. 1,2- D¡bromo-3- Cloropropano 45. 1,2- Dibromoetano 46. 1,2- Dicloropropano (1,2- DCP)
mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-'
0,020 0,009 0,030 0,0005 0,0004 0,0003 0,0007 0,03 0,04 3 0,07 0,004 0,008 1 0,3 0,03 0,05 0,02 0,6 0,3 0,0006 0,2 0,02 0,7 0,5 0,002 0,007 0,03 0,0006 0,09 0,001 0,0004 0,04
162
47. 1,3- Dicloropropeno 48. Dicloroprop 49. Dimetato 50. Fenoprop 51. Isoproturon 52. MCPA 53. Mecoprop 54. Metolacloro 55. Molinato 56. Pendimetalina 57. Simazina 58. 2,4,5- T 59. Terbutilazina 60. Trifluralina 61. Cloropirifos 62. Piriproxifeno 63. M¡croc¡st¡n-LR 64. Bromato 65. Bromodiclorometano 66. Bromoformo 67. Hidrato de cloral 68. Cloroformo 69. Cloruro de cianógeno (como 70. Dibromoacetonitrilo 71. Dibromoclorometano 72. Dicloroacetato 73. Dicloroacetonitrilo 74. Formaldehído 75. Monocloroacetato 76. Tricloroacetato 77. 2,4,6- Triclorofenol
mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-' mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1 mgL-1
163
0,02 0,1 0,006 0,009 0,009 0,002 0,01 0,01 0,006 0,02 0,002 0,009 0,007 0,02 0,03 0,3 0,001 0,01 0,06 0,1 0,01 0,2 0,07 0,07 0,1 0,05 0,02 0,9 0,02 0,2 0,2
ANEXO Nº 4: TIEMPO DE ALMACENAMIENTO DE MEDIOS DE CULTIVO PREPARADOS
MEDIOS DE CULTIVO
TIEMPO DE MANTENIMIENTO
Caldo (FM) medio liquido en frascos de tapa rosca a 4 º C.
96 horas
Agar FM en placas con cubiertas de cierre hermético a 4ºC.
2 semanas
Agar o medio liquido en tubos de tapón a presión a 4ºC. Agar o caldo
2 semanas en tubos de cierre
hermético tapa rosca a 4ºC.
3 meses
Placas con agar vertido en bolsas de plástico selladas a 4ºC
2 semanas
Volúmenes de agar o caldo en frascos de cierre hermético tapa rosca a 4ºC.
3 meses
Fuente: APHA, 9220 A Tabla 9020 IV.
164
ANEXO Nº 5: ÍNDICE DEL NMP AL 95% DE CONFIANZA PARA VARIAS COMBINACIONES DE RESULTADOS POSITIVOS CUANDO SE USAN 5 TUBOS POR DILUCIÓN (10 ML, 1.0 ML, 0.1 ML) Combinación de positivos 000 001 010 011 020 021 030 100 101 102 110 111 112 120 121 130 131 140 200 201 202 210 211 212 220 221 222 230 231 240 300 301 302 310 311 312 320 321 322 330 331 332 340 341 350 400 401 402
Limite de confiabilidad Bajo Alto 6.8 0.09 6.8 0.09 6.9 0.7 10 0.7 10 1.8 15 1.8 15 0.1 10 0.7 10 1.8 15 0.71 12 1.8 15 3.4 22 1.8 15 3.4 22 3.4 22 3.5 22 3.5 22 0.79 15 1.8 15 3.4 22 1.8 17 3.4 22 4.1 26 3.4 22 4.1 26 5.9 36 4.1 26 5.9 36 5.9 36 2.1 22 3.5 23 5.6 35 3.5 26 5.6 36 6 36 5.7 36 6.8 40 6.8 40 6.8 40 6.8 40 9.8 70 6.8 40 9.8 70 9.8 70 4.1 35 5.9 36 6.8 40
NMP /100ml < 1.8 1.8 1.8 3.6 3.7 5.5 5.6 2 4 6 4 6.1 8.1 6.1 8.2 8.3 10 10 4.5 6.8 9.1 6.8 9.2 12 9.3 12 14 12 14 15 7.8 11 13 11 14 17 14 17 20 17 21 24 21 24 25 13 17 21
165
Combinación de positivos 403 410 411 412 413 420 421 422 423 430 431 432 440 441 442 450 451 500 501 502 503 510 511 512 513 520 521 522 523 524 530 531 532 533 534 540 541 542 543 544 545 550 551 552 553 554 555
NMP /100ml 25 17 17 21 26 31 22 26 32 38 27 33 39 34 40 47 41 48 23 31 43 58 33 46 63 84 49 70 94 120 150 79 110 140 170 210 130 170 220 280 350 430 240 350 540 920 1600 >1600
166
Limite de confiabilidad Bajo Alto 9.8 70 6 40 6.8 42 9.8 70 10 70 6.8 50 9.8 70 10 70 14 100 9.9 70 10 70 14 100 14 100 14 100 15 120 14 100 15 120 6.8 70 10 70 14 100 22 150 10 100 14 120 22 150 34 220 15 150 22 170 34 230 36 250 58 400 22 220 34 250 52 400 70 400 70 400 36 400 58 400 70 440 100 710 100 710 150 1100 70 710 100 1100 150 1700 220 2600 400 2600 700
ANEXO 6: ÁREA DE ESTERILIZACION ESTERILIZACION Y LAVADO LAV ADO
Figura Nº 1: Equipo: Destilador de agua
Figura Nº 2: Equipo 2: Equipo de autoclave para esterilización
167
Figura Nº 3: Equipo de autoclave para esterilización
168
ANEXO 7: ÁREA DE PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Figura Nº 3: Lugar de almacenamiento de Medios de Cultivo
Figura Nº 4: Medios de cultivo preparados guardados en refrigeración
169
Figura Nº 5: Balones pequeños estériles
170
ANEXO 8: ÁREA DE ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS
Figura Nº 6: Incubadora a 35 º C para muestras de aguas
Figura Nº7: Incubadora a 37 ºC para muestras de alimentos
171
Figura Nº8: Equipo de Baño María a 44 º C
Figura Nº9 y 10: Placas con Agar M-endoles y Caldo MFC
172
Figura Nº 11: Colocando las membranas al equipo de filtración
Figura Nº 12: Colocando los filtros a las placas con Agar M- endoles
173
Figura Nº 13: Colonias Típicas de Coliformes Totales colonias verdes con brillo metálico
Figura Nº 14: Colonias típicas de Coliformes Fecales colonias azules
174
Figura Nº 15: Confirmación de coliformes Totales con Caldo Lauril Sulfato (CLS) a 35ºC.
Figura Nº 16: Confirmación de coliformes Fecales con Caldo EC a 44ºC
175
Figura Nº 17: Colonia Sospechosa de Salmonella en Agar XLD con estriado de inoculo de caldo Rappaport Vasiliaris.
Figura Nº 18: Colonia Sospechosa de Salmonella en Agar BPLS con estriado de inoculo de Caldo Selenito Cistina.
176
Figura Nº 19: Confirmación mediante pruebas Bioquímicas: TSI, LIA, INDOL y Agar Urea para ambas colonias sospechosas.
177
ANEXO 9: MODELOS DE INFORMES DE RESULTADOS DE LOS ANÁLISIS INFORME DE ENSAYO ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS Solicitante : EQUIPO DE SANEAMIENTO BÁSICO HIGIENE ALIMENTARÍA Y ZOONOSIS. P.S. TALABAYA Programa : VIGILANCIA DE AGUA DE CONSUMO HUMANO. DATOS DEL MUESTREO ( Proporcionados por el CONTROL LABORATORIO solicitante) Departamento Fecha/Hora de recepción Provincia
Fecha de inicio del ensayo
Distrito
Fecha de reporte
Fecha/hora de inicio de muestreo Muestreado por RESULTADOS Muestra Código Lab.
Tipo
Ensayos
Origen de la fuente/Punto de muestreo/localidad
Coliformes Totales 35ºC (UFC/100ml)
NOTA: < “Valor” significa no cuantificable inferior al valor indicado. NSD: No se determinó.
Coliformes Fecales 44,5ºC (UFC/100ml)
Bacterias heterótrofa s (UFC/ml)
UFC: Unidades Formadoras de Colonias.
Método de ensayo: Numeración de Coliformes totales, C oliformes fecales: Método Estandarizado de Filtraci ón por membrana. APHA, AWW, WEF. Part. 9222B, 9222D. 21th ed. 2005. Recuento de bacterias heterótrofas: Método de placa fluida APHA, AWW, WEF. Part. 9215B. 21th ed. 2005.
----------------------------------------------Giovanna Paola Velásquez Juculaca Biólogo C.B.P.: 5283 (01) Original. (02) Copia. AMGN/jcb Los ensayos se han efectuado según lo solicitado por cadena de custodia. Los resultados del informe corresponden solo a las muestras sometidas a ensayo. La reproducción parcial de este i nforme, no está permitida sin la autorización por escrito de este laboratorio.
178
INFORME DE ENSAYO ANÁLISIS MICROBIÓLOGICO DE AGUAS Solicitante Programa
: DIRECCIÓN ECOLOGÍA, PROTECCIÓN DEL AMBIENTE Y SALUD OCUPACIONAL. : PROTECCIÓN DE ZONAS COSTERAS Y PLAYAS
DATOS DEL MUESTREO ( Proporcionados por el solicitante) Departamento Provincia Distrito Fecha/hora de muestreo Muestreado por
CONTROL LABORATORIO Fecha de recepción Fecha de inicio del ensayo Fecha de reporte
Muestra Código Lab.
Tipo
Punto de muestreo
Ensayos Coliformes Fecales 44,5ºC (NMP/100ml)
NOTA: < “Valor” significa no cuantificable inferior al valor indicado. NMP: Número Más Probable. Método de ensayo: Numeración de Coliformes fecales: Método Estandarizado de Tubos Múltiples. APHA, AWW, WEF. Part. 9221B, 9221E-2. 21th ed. 2005.
----------------------------------------------Giovanna Paola Velásquez Juculaca Biólogo C.B.P.: 5283 (01) Original. (02) Copia.
AMGNjcb Los ensayos se han efectuado según lo solicitado por cadena de custodia. Los resultados del informe corresponden solo a las muestras sometidas a ensayo. La reproducción parcial de este i nforme, no está permitida sin la autorización por escr ito de este laboratorio.
179
INFORME DE ENSAYO ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS Solicitante
: EQUIPO DE SANEAMIENTO BASICO, HIGIENE ALIMENTARIA Y ZOONOSIS.
Programa
: ALIMENTACIÓN A CLINICAS HOSPITALES
DATOS DE LA MUESTRA (Proporcionada por el solicitante)
CONTROL DE LABORATORIO
Muestra:
Fecha y hora de recepción:
Procedencia de la muestra: Forma de presentación: Condiciones durante la recepción Cantidad recibida: -
-
Fecha y hora de análisis:
Muestreador: Lugar de muestreo: Fecha y hora de muestreo:
Fecha de reporte:
Código de campo: Código de Laboratorio: ENSAYOS
RESULTADOS
METODOS
Numeración de microorganismos
ISO 4833:2003.
aerobios mesófilos viables (UFC/g) Numeración de coliformes (NMP/g)
ISO 4831:2006.
Numeración de Staphylococcus aureus
ISO 6888-
(UFC/g)
1:1999.Adm.1.2003
Numeración de E. coli (NMP/g)
ISO 7251:2005.
Detección de Salmonella spp. (/25g)
ISO -6579:2002/Cor 1:2004.
Numeración de Mohos (UFC/g)
ISO 7954:1987
Numeración de Levaduras (UFC/g)
ISO 7954:1987
Numeración de Enterobacterias
ISO 21528-2:2004
Nota: <”valor” significa no cuantificable inferior al valor indicado. Los ensayos microbiológicos se efectuaron de acuerdo a lo establecido en la Norma Sanitaria que establece los Criterios Microbiológicos para alimentos preparados Resolución Ministerial N° 363-2005/MINSA.
-----------------------------------------Giovanna Paola Velásquez Juculaca Biólogo C.B.P.: 5283
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