Informe de laboratório Microbiologia general GRUPO 9

Informe de laboratório Microbiologia general GRUPO 9 Elver Forero. [email protected], cod: 79.136.728, tel. 3114603742 CV 201504_2

INTRODUCCIÓN Este trabajo hace parte de la práctica de laboratorios, como complemento del Curso de Microbiología. Previamente hemos recorrido a través de la lectura, los contenidos del curso, y hemos visto y trabajado los videos de apoyo a cada laboratorio. Recoge la experiencia, Una vez inspeccionado el laboratorio iniciamos con las reglas y normas dentro de el. Además es indispensable el uso de la bata blanca, cofia y tapabocas, pues sin ellos no podemos ingresar ya que es uno de los requisitos exigidos Durante el trabajo diario de la sección de microbiología, se dan situaciones de potenciales riesgos que varían según el agente infeccioso y los procedimientos utilizados. Las Normas de Bioseguridad pretenden reducir a un nivel aceptable el riesgo inherente a la manipulación de material peligroso . El trabajo en el laboratorio de microbiología es, como en la mayoría de las otras secciones del Laboratorio Clínico, un trabajo de grupo. La actitud ante las practicas seguras de cada uno de los integrantes del equipo, determinan su propia seguridad, así como la de sus compañeros y la de la colectividad del Laboratorio.

2. Conocer laboratorio.

la

metodología

de

trabajo

del

3. Conocer el equipamiento del laboratorio. 4. Conocer las medidas a tomar en caso de emergencia. 5. Conocer las leyes relacionadas con la seguridad biológica. 6. Respetar y hacer cumplir todo lo anterior. Para que se produzca un accidente por agente biológico deben concurrir básicamente cuatro elementos: Un huésped susceptible Un agente infeccioso Una concentración suficiente de éste Una ruta de transmisión apropiada. De todos ellos, el que

mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de transmisión. Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la percutanea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son posibles. Siendo imposible determinar a ciencia cierta si cualquier material biológico está contaminado con microorganismos del grupo 2 ó 3, ciertas muestras (respiratorias, etc.) en las que sea posible que exista un microorganismo del grupo 3 deben manipularse rutinariamente en las Cabinas de Seguridad Biológica (CSB).

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de microorganismo y la manipulación a la que es sometido. Por ello es básico: 1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio. 2. Conocer laboratorio. la metodología de trabajo del

RECOMENDACIONES DE TRABAJO 1. Lea cuidadosamente el texto de cada práctica antes de realizar la experiencia. 2. Debe revisar su microscopio antes de empezar la práctica. Sí detecta en el alguna anormalidad avise inmediatamente al docente. 3. Cuide su microscopio, evitando que los colorantes manchen los lentes de los objetivos. 4. Racionalice el uso de los reactivos, debido a que ellos son costosos. 5. Percátese de la limpieza del material que va a utilizar en la práctica. Vigile que esté limpio.

3. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA La La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de microorganismo y la manipulación a la que es sometido. Por ello es básico: 1.Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.

mejor se puede controlar en el laboratorio es la ruta de transmisión. Las rutas de transmisión más comunes en el laboratorio son la aérea y la inoculación directa, muy por encima de todas las demás, aunque la oral, la percutanea y el contacto directo con la piel o las mucosas también son posibles. Siendo imposible determinar a ciencia cierta si cualquier material biológico está contaminado con microorganismos del grupo 2 ó 3, ciertas muestras (respiratorias, etc.) en las que sea posible que exista un microorganismo del grupo 3 deben manipularse rutinariamente en las Cabinas de Seguridad Biológica (CSB).

NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de microorganismo y la manipulación a la que es sometido. Por ello es básico: 1. Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio. 2. Conocer laboratorio. la metodología de trabajo del

RECOMENDACIONES DE TRABAJO 1. Lea cuidadosamente el texto de cada práctica antes de realizar la experiencia. 2. Debe revisar su microscopio antes de empezar la práctica. Sí detecta en el alguna anormalidad avise inmediatamente al docente. 3. Cuide su microscopio, evitando que los colorantes manchen los lentes de los objetivos. 4. Racionalice el uso de los reactivos, debido a que ellos son costosos. 5. Percátese de la limpieza del material que va a utilizar en la práctica. Vigile que esté limpio.

3. NORMAS GENERALES DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA MICROBIOLOGÍA La La peligrosidad de un agente está directamente relacionada con el tipo de microorganismo y la manipulación a la que es sometido. Por ello es básico: 1.Conocer los agentes, sustancias y productos peligrosos que existen en el laboratorio.

6. Tenga mucha precaución con reactivos cáusticos y/ o corrosivos. Solicite ayuda al docente, sí  tiene dudas en la manipulación de los mismos. C. mencione las clases de esterilización, cuales son los agentes de esterilización con mas uso en el laboratorio, en que consiste cada uno de ellos y para que materiales se utilizan.

Agente Esterilizante. Condiciones del Proceso. Operativa. 1/ Preparación de los materiales. 2/ Carga de la Cámara. 3/ Ciclo de Esterilización. Toxicidad del peróxido de hidrógeno. Ventajas del sistema. Limitaciones del sistema. ESTERILIZACIÓN ESTE RILIZACIÓN POR GLUTARALDEHÍDO. GLUTARALDEHÍDO. FORMALDEHÍDO Y

MÉTODOS FÍSICOS ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO Agente Esterilizante. Mecanismo de Acción. Precauciones. Condiciones del Proceso. Práctica del método. Observaciones generales. Ventajas y Desventajas del Método. Ventajas. Desventajas. Materiales que se pueden esterilizar con vapor. Materiales que no se pueden esterilizar con vapor. ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Agente Esterilizante. Mecanismo de Acción. Parámetros del Procedimiento. Práctica del Método. Etapas del ciclo de esterilización. Precauciones. Materiales que pueden esterilizarse por calor seco. Materiales que no se pueden esterilizar por calor seco. Ventajas. Desventajas. ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN GAMMA GAMMA Agente Esterilizante. Esterili zante. Mecanismo de Acción. Precauciones. Parámetros del Procedimiento. Práctica del método. Materiales que pueden ser esterilizados por radiación gamma. Ventajas. Desventajas. MÉTODOS QUÍMICOS: ESTERILIZACIÓN POR ÓXIDO DE ETILENO (ETO) Agente Esterilizante. Propiedades. Propiedades Químicas. Mecanismo de Acción. Precauciones y efectos adversos. Práctica del método. Condiciones de proceso. Materiales que se pueden esterilizar por oxido de etileno. Materiales que no se deben esterilizar con oxido de etileno. Acondicionamiento del material y precauciones. Medidas de protección para el personal. ESTERILIZACIÓN POR ÁCIDO PERACÉTICO Agente esterilizante. El sistema esterilizador. Operativa del Proceso. Monitoreos de proceso. Ventajas del sistema. Desventajas del sistema. ESTERILIZACIÓN POR PLASMA DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO.

Formaldehído (HCHO). Agente Alquilante. Glutaraldehido. Proceso. Desventajas. Toxicidad. Pasos del proceso. Precauciones de Uso. Prevención de contaminación. Agentes de esterilización Esterilización. Agentes Físicos Calor Seco Los métodos más importantes son: a. Flameado: es un procedimiento simple y eficaz, consiste en la exposición de un objeto a efecto de la llama hasta la incandescencia. Se esteriliza de esta forma, p. ej. ansas de cultivo de siembra. Incineración: es el mejor sistema para esterilizar todas aquellos productos en los que no importe su destrucción, p. ej. material biológico Estufa: calor seco a alta temperatura, 20 minutos durate 180º, 60 minutos a 160º, siendo suficiente la esterilización durante 60 minutos a 100-140º, se lo utiliza para esterilizarmaterial de vidrio debidamente envuelto en papel, metal. etc. Calor Húmedo. La esterilización con calor húmedo (vapor d agua) es mucho más rápida y eficaz que el calor seco debido a que las moléculas de agua desnaturalizan las proteínas de forma irreversible mediante rotura de los uniones H entre los grupos peptídicos a

temperaturas relativamente bajas. a. Autoclave: horno a presión, consiste en una cámara en la que el aire puede ser sustituído por vapor de agua sometida a presión. Se opera a 121ºC y 1 atm. de presión durante 20 minutos. De esta forma se consigue destruir todas las formas vegetativas y esporas. Se lo utiliza para esterilizar todo material resistente a esa temperatura y es muy utilizado para la esterilización de medios de cultivos Tindalización: (esterilización intermitente) consiste en someter el producto a calentamientos intermitentes entre 56 y 100ºC durante 30 minutos con lo que se asegura destruir las formas vegetativas. En los intervalos se mantiene a temperatura ambiente o a 37ºC, las esporas germinan y

b.

c.

b.

las bacterias resultantes se hacen más sensibles al calentamiento posterior. Radiaciones a. Luz UV: es absorbida a una longitud de onda de 240 a 280 nm por ácidos nucleicos causando daños genéticos alterando las bases. Se la utiliza en la preparación de vacunas, cabinas de seguridad biológica, lugares de trabajo como mesadas de laboratorios, est. Radiaciones ionizantes: actúan lesionando ácidos nucleicos. Se la utiliza sobre todo en procesos industriales para esterilizar dispositivos quirúrgicos, guantes, jeringas, etc.

ESTERILIZACIÓN es el proceso de destrucción de toda vida microbiana. El término estéril es absoluto; algo está estéril o no lo está. DESINFECCIÓN es el proceso de destrucción de los agentes infecciosos. No es una esterilización. Un desinfectante es la lejía, por ejemplo, que mata las formas vegetativas de los microorganismos, pero no necesariamente sus formas de resistencia o esporas. Los términos desinfección y esterilización se entremezclan con frecuencia, lo que puede generar confusión. Esto es debido a que los procedimientos de desinfección se han clasificado en tres niveles: bajo, medio y alto. La desinfección de alto nivel se aproxima, en cuanto a efectividad, a veces, a la esterilización. Por otro lado, las esporas pueden sobrevivir a la desinfección de nivel intermedio y muchos microorganismos conservan la viabilidad después de esta. Los desinfectantes de alto nivel se utilizan para objetos relacionados con intervenciones agresivas que no soportan la esterilización. La desinfección de los objetos es mucho más efectiva si ésta va precedida de una limpieza adecuada de las superficies para eliminar la materia orgánica. La desinfección de nivel intermedio se emplea para superficies limpias o instrumentos en los que se considera improbable la contaminación con esporas bacterianas y otros microorganismos resistentes. Finalmente, los desinfectantes de bajo nivel se utilizan para instrumentos no críticos, que aunque están en contacto con el paciente no penetran en las superficies mucosas ni en tejidos. Por otro lado, el nivel de desinfección utilizado para las superficies ambientales está condicionado por el riesgo relativo de que tales superficies actúen como reservorio de microorganismos patógenos. Así, se debe utilizar una desinfección de nivel superior para limpiar la superficie de instrumentos contaminados con sangre o material purulento, que para suelos y encimeras. Se considera una excepción a esta regla general la superficie implicada en alguna infección nosocomial concreta y en esos casos se debe seleccionar un desinfectante apropiado contra el patógen complicado . Esterilizaciónquímica:

b.

Agentes Químicos. Los agentes químicos como el óxido e etileno, formaldehído o glutaraldehído reaccionan con gran facilidad con diferentes grupos funcionales de los ácidos nucleicos y proteínas alquilando estos radicales esenciales. a) Óxido de etileno. Es un gas inflamable y potencialmente explosivo, muy penetrante que incativa microorganismos sustituyendo átomos de hidrógeno lábiles por otros grupos como hidroxilos, carboxilos, etc. El material se expone a esterilizar a un 5-10% de óxido de etileno en dióxido de carbono a 50-60º en condiciones de humedad controlada durante 4 a 6 horas. Es necesario someterlo después a

un período de aireación debido a su carácter mutegénico. Es un agente efectivo en la esterilización de material termolábil como prótesis, catéteres, etc. b) Formol o formaldehído. Es un gas fácilmente soluble en agua que se utiliza al 40% (formalina). Usado en forma gaseosa y en cámara cerrada se emplea en la esterilización hospitalaria y en la industria farmacéutica. También es muy utilizado como desinfectante ambiental de salas altamente contaminadas que una vez tratadas deben airearse. c) Glutaraldehído. Se emplea sumergiendo el material limpio en una solución al 2%, se emplea sobre todo en la esterilización de instrumentos ópticos y los utilizados en terapia respiratoria. D. Establezca diferencias entre esterilización y desinfección.

Los gases y vapores se utilizan para esterilizar objetos e instrumental que no soportan el calor. Se utilizan como desinfectantes químicos a bajas temperaturaslosaldehídos (glutaraldehído), ácido peracético y peróxido de

hidrógeno. La esterilización por calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación irreversible, desnaturalización de enzimas y proteínas.

E. Que es un medio de cultivo; de que están compuestos principalmente: como se clasifican según su proporción de agar y según su suministro de nutrientes? Solución que cuenta con los nutrientes necesarios para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos (bajo condiciones favorables de temperatura y pH), así como efectuar pruebas de susceptibilidad. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado sólido, semisólido y líquido. Clasificación Según su aspecto físico: fosiferoliquidos Semi-sólidos Sólidos duros o muy duros Según su uso: Selectivos Selectivos de enriquecimiento Diferenciales Para cultivar gérmenes anaerobios Para medir potencia de antibióticos De transporte en micro Para filtración a través de membrana Para cultivo de hongos y levaduras Para cultivo de protozoarios F. Cual es la utilidad de los medios de cultivo y que diferencia un caldo de un medio sólido? El tipo de medio de cultivo a utilizar depende del microorganismo de interés y de la necesidad de realizar ese cultivo. Los medios se pueden utilizar para el crecimiento de una especie o para diferenciar entre cepas o especies. Según su consistencia o estado físico pueden ser: o Líquidos o caldos: se emplean fundamentalmente para cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la producción de metabolitos específicos, estimular y promover la selección de algún o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen, identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioquímicas. o Semisólidos Se utilizan para identificaciones bioquímicas y averiguar si el germen estudiado es móvil. Los medios semisólidos tienen una consistencia blanda. o Sólidos o Agares Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. A diferencia de los líquidos se les agrega Agar. El agar es un polisacárido acídico producido por ciertas algas

rojas, es un elemento solidificante que se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. El agar Se usa a una concentración del 1,5%. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él. La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación. Tipos de medios de cultivo por utilidad práctica: No selectivos o generales: permiten el cultivo y crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Por ejemplo, Caldo nutritivo, Agar nutritivo, Agar Soya Tripticasa (TSA), Agar marino 2216 o Zobell. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, Factor X, Factor V, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.) Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) permiten el aislamiento y crecimiento del microorganismo o grupo de microorganismos de interés, para lo cual se manipulan factores ya sean de tipo nutricional o de tipo ambiental. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto químico, como la azida sódíca, el telurito potásico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. En el caso de factores nutricionales se añaden al medio sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de microorganismos,

permitiendo a la vez el crecimiento de otros. Los antibióticos, el cloruro sódico en altas concentraciones, colorantes y algunas sustancias químicas son ejemplos de agentes selectivos que se añaden a los medios para inhibir el crecimiento de otros microorganismos diferentes al de interés.El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicación alimentaria. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. Por ejemplo, los colorantes, que se añaden al Agar, inhiben selectivamente determinados microorganismos, es el caso del verde brillante (Agar verde brillante) utilizado para determinar la presencia de Salmonella en heces fecales ya que inhibe las bacterias Gram positivas, y la mayoría de las bacterias intestinales. Para el caso de factores ambientales se manipula la temperatura, el grado de humedad, el pH, la concentración de oxígeno o la intensidad de la luz. Así el Agar glucosado de Sabouraud ajustado a pH 5,6, se usa para el aislamiento de hongos, que a ese pH crecen mejor que las bacterias. Son ejemplo de este tipo de medios: Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa (TCBS) para cultivo de Vibrio y Agar Cetrimida para cultivo de Pseudomonas.

Enriquecidos: suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K). Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de microorganismos, ayudando a su identificación (Lowenstein). En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Diferenciales: permiten distinguir unos microorganismos de otros por las características que presentan las colonias. Se elaboran con base en las características fisiológicas específicas de los microorganismos, por ejemplo, nutrición, respiración entre otras. Algunos medios diferenciales llevan incluido un indicador de pH, que pone de manifiesto la degradación de un nutriente específico (generalmente un azúcar) por el cambio de color que se origina cuando éste es metabolizado, como en el caso del medio CLED. Los colorantes que se añaden a estos medios actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido. Un ejemplo es el Rojo Fenol es de color rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. A través del cultivo en medio diferencial se puede distinguir las bacterias que fermentan la lactosa (con producción de ácido) de las no fermentadoras. Otros colorantes actúan como inhibidores del crecimiento de unos microorganismos y no de otros, por ejemplo la Violeta de Genciana inhibe el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas). Algunos medios pueden ser a la vez selectivos y diferenciales. El agar Mac Conkey es un ejemplo de medio selectivo y diferencial. La presencia de sales biliares y cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias no entéricas (acción selectiva); la fermentación de lactosa con liberación de productos ácidos hace virar un indicador de pH incorporado en el medio (acción diferencial). El agar sangre es un agar que contiene hematíes y permite reconocer los microorganismos que producen hemólisis por ejemplo para aislar la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre. Las colonias de esta bacteria producen hemólisis, es decir, muerte y lisis de los hematíes generando una zona transparente a su alrededor. El Agar eosina-azul de metileno (EAM) permite identificar el crecimiento de coliformes y E. coli. Este medio contiene peptona, lactosa y los colorantes eosina y azul de metileno. En dicho medio se inhibe el crecimiento de otras bacterias, pero no el de las coliformes (éstas desarrollan colonias típicas). E. coli muestra colonias grandes,

oscuras, negro-azuladas, centro casi negro, con brillo metálico verdoso causado por la luz reflejada. La presencia de coliformes como Enterobacter se manifiesta en colonias grandes, de color rosado pálido, mucosas, con centro oscuro y sin brillo metálico. Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metabólicos ácidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación). Primera Práctica NORMAS DE SEGURIDAD EN LA UTILIZACIÓN DE EQUIPOS 1. NORMAS GENERALES Los equipos y aparatos nunca deben colocarse en zonas de paso, en particular en los pasillos del laboratorio. Todos los aparatos con toma eléctrica deberán cumplir las normativas de seguridad correspondientes. Nunca deben

utilizarse en zonas mal aisladas y expuestas a la humedad. Las fuentes de calor (calentadores, termobloques, etc.), sobre todo si se alcanzan temperaturas elevadas, deberán estar debidamente señalizadas para evitar quemaduras accidentales. Todos los procedimientos de utilización de aparatos deberían contar obligatoriamente con apartados relativos a su utilización segura. 2. NEVERAS Un adecuado mantenimiento, limpieza y desinfección sistemáticos de los aparatos reduce considerablemente los riesgos asociados a su utilización. Sin embargo, aun en estas condiciones, hay que tener en cuenta lo siguiente:  No deben almacenarse cultivos de microorganismos patógenos por inhalación en recipientes que no estén convenientemente cerrados, especialmente si la cámara tiene un sistema de circulación de aire. No deben almacenarse reactivos que contengan compuestos volátiles inflamables (éter etílico, por ejemplo) en neveras que no posean un sistema de protección antideflagración. En los aparatos de tipo

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doméstico que se utilizan en el laboratorio debe anularse la lámpara de la luz. 3. CONGELADORES La congelación es un proceso que mantiene la viabilidad de muchos agentes infecciosos, de ahí un potencial riesgo y las siguientes recomendaciones:  Tratar de identificar en ficheros, listas, etc. el contenido de lo almacenado y sus riesgos potenciales. El material potencialmente infeccioso debe colocarse en tubos, recipientes, etc. bien cerrados. No se llenarán completamente, para evitar que rebosen por efecto del aumento de volumen tras la congelación. Descongelar periódicamente, desinfectar si fuese procedente. limpiar y

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Los microondas interfieren con los marcapasos. No deben ser colocados a una distancia inferior a 2 m de las personas que sean portadoras de uno de estos dispositivos.

6. AUTOCLAVES Los autoclaves deben poseer manómetro y termostato, así como válvula de seguridad, sistema de desconexión rápido y la purga del vapor ha de realizarse a un recipiente estanco y con agua, jamás directamente al exterior.  No deben usarse si no se conocen perfectamente todos los mandos y su fundamento. Usar guantes especiales para protegerse del calor. No abrir jamás si el manómetro no está a "0" y la purga no ha sido abierta. Controlar una vez al mes su capacidad de desinfección mediante esporas, no siendo suficiente el método químico. El uso de registros de presión y temperatura de cada proceso y la instauración de un programa de mantenimiento también puede ser una alternativa válida al control mediante esporas. El agua debe ser cambiada regularmente.

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Utilizar guantes para manipular el contenido. Si la temperatura es baja (por ejemplo -70ºC o inferior), los guantes representan una protección adicional.

4. INCUBADORAS La limpieza y la desinfección, periódicas y sistemáticas, son el método recomendable para reducir los riesgos derivados de la contaminación accidental del personal del laboratorio. 5. MICROONDAS Los microondas cada vez son más populares en el Laboratorio

de Microbiología y constituyen una nueva fuente de accidentes, entre los más frecuentes las explosiones cuando se usan para calentar medios con agar, ya que la diferencia de velocidad de calentamiento produce burbujas que pueden estallar.  Las botellas o matraces deben tener el tapón aflojado, ya que si está cerrado estallan fácilmente. Estar siempre presente, con la ropa y pantalla facial adecuadas, y controlar la intensidad del aparato, que sólo puede ser la máxima con agua y la mínima si se usa con agar. Deberá existir una tabla bien visible de los tiempos en cada posición del potenciómetro y de las cantidades a emplear.

7. CENTRÍFUGAS Los mayores riesgos derivan, sobre todo, de la contaminación por los aerosoles generados durante la centrifugación de materiales biológicos y, en menor medida, de los traumatismos accidentales. Se recomienda:  Cuando se centrifugue material biológico potencialmente infeccioso deben utilizarse tubos cerrados; la centrífuga debe disponer de rotores o cestillos de seguridad que protejan al operador de los posibles aerosoles. La rotura accidental de un tubo y su vertido en la cubeta representa una incidencia importante que debe ser comunicada inmediatamente al Supervisor o responsable, de forma que se proceda a la desinfección segura del aparato No se deben utilizar centrífugas antiguas que no posean sistema de cierre de seguridad, del que disponen todos los aparatos actuales,

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Prueba

Medios

Diagrama

Análisis y conclusiones

Flora Ambiental

Agar Nutritivo Agar Sabouraud

Toma de ambientes en medios de agar nutritivo y agar sabouraud, se colocan estas cajas ya con el medio gelificado en el área de esterilización, por 20 minutos. Posteriormente se incuban las cajas de agar nutritivo se incuba a 37ºC y las cajas de agar sabouraud en incubadora de 25ºC Luego al observar el resultado del AN, (caja petri) en el cuenta colonias, se observa que presenta 1 UFC, arrojando como resultado que no presenta estado de contaminación. En cambio el AN (caja petri) por Agotamiento muestra liquida presenta 19 UFC, arrojando como resultado un alto nivel de contaminación.

Flora Ambiental

Agar Nutritivo Agar Sabouraud

Flora de superficie

Agar Nutritivo Agar Sabouraud

Flora de superficie

Agar Nutritivo Agar Sabouraud

Toma de superficies en medios de agar nutritivo y agar sabouraud, en esta prueba se escoge un área se humedece un hisopo con agua destilida esteril y se procede a pasar el hisopo por el area delimitada, se abre la caja respectiva y se pasa suavemente el hisopo sobre el agar haciendo un zig-zag en la superficie luego se cierra la caja, luego se desinfecto el área delimitada con clorox y se realizo la misma operación, anterior. Al observar el AN (caja petri) de la muestra antes de limpiar la superficie, presenta moderado crecimiento bacteriano. Por lo contrario el AN (caja petri) de la muestra después de limpiar la superficie con el desinfectante clorox, no presenta crecimiento bacteriano, queriendo decir que el desinfectante pasó la prueba de eliminación de bacterias. Se escoge el área de la palma de la mano como área a

evaluar, se procede a humedecer el hisopo y se realiza el frotis en la mano sin lavar, luego se procede a realizar un lavado de manos con jabón y luego se realiza de nuevo el procedimiento de toma de muestra.

Determinación flora humana

Agar nutritivo

Determinación flora humana

Agar nutritivo

Resultado: Se evidencia un abundante crecimiento bacteriano , en la toma de muestra sin lavarse las manos ya que la caja de la izquierda presenta gran contenido de bacterias, además el procedimiento de lavado fue efectivo ya que la segunda muestra presenta una reducción notable significativa, frente a la muestra No 1. Se recogió una muestra de cultivo de la (caja petri) al lado del mechero y se lleva a una lamina portaobjetos previamente desengrasada y marcada.

Cultivo de bacteria. Tinción simple Solución salina. Azul de metileno.

Cultivo de bacteria. Tinción simple Solución salina. Azul de metileno.

Luego se llevan las laminas al soporte de coloración y se realiza tinción con azul de metileno, se esperan dos minutos se lava y se observa con el objetivo 100x, agregando aceite de inmersión.

Cultivo de bacteria. Tinción simple Solución salina. Azul de metileno.

Se observan numerosas bacterias (basilos)

G. cual es el fundamento de la coloración de Gram.?

Tinción de GRAM

I. indique las principales características y estructuras en hongos y levaduras? Características de las levaduras: Son microorganismos unicelulares ampliamente distribuido en la naturaleza (frutos, hojas, suelos, etc.. ) y finalmente transportable por el aire. Crecen profundamente en medios líquidos que contienen azúcares y suelen agruparse en cadenas que se rompen al agitar el medio. Sus células pueden elipsoides o alargadas. ser esféricas, ovoides, 

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La tinción de Gram es uno de los métodos de tinción más importantes. Se utiliza para diferenciar la morfología celular bacteriana (cocos, bacilos, positivos, negativos.). Esta tinción se denominada así por el bacteriólogo danés Christian Gram, quien la desarrolló en 1844. Sobre la base de su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, Gram-positivas y Gram-negativas (en este caso, los términos positivo y negativo no tiene nada que ver con carga eléctrica, sino simplemente designan dos grupos morfológicos distintos de bacterias). Las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la estructura de sus paredes celulares. H. que diferencias encuentras en las bacterias Grampositivas y Gramnegativas? La pared de la célula Grampositiva es gruesa y consiste en varias capas interconectandas de peptidoglicano así como algo de ácido teicoico. Generalmente, 80%-90% de la pared de la célula Gram-positiva es peptidoglicano. La pared de la célula Gram-negativa, por otro lado, contiene una capa mucho más delgada, únicamente de peptidoglicano y está rodeada por una membrana exterior compuesta de fosfolípidos, lipopolisacáridos, y lipoproteínas. Sólo 10% - 20% de la pared de la célula gram-negativa es peptidoglicano. Diferencias en la composición de la pared celular de Gram positivos y Gram negativos Pared de las Bacterias Gram Positivas

Se reproducen por brotación, por fisión o por esporas. La "zimasa" de las levaduras es un complejo enzimático de origen intracelular, capaz de actuar fuera de la célula viva Las levaduras son raramente patógenas y ampliamente empleadas por el hombre en fermentaciones. 

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Características de los Hongos: No poseen clorofila. Están ampliamente difundidos en la naturaleza, especialmente sobre el suelo. Intervienen en el despoblamiento de la materia orgánica en el suelo. Son útiles para el hombre para la producción de antibióticos, de enzimas. Estructura de hongos y levaduras: Pared de las Bacterias Gram Negativas Los hongos pluricelulares, aunque frecuentemente en la misma especie se observan fases de uno y otro tipo. Tienen una membrana plasmática (donde predomina el ergosterol en vez de colesterol), núcleo, cromosomas (los hongos son, por lo general, haploides), y orgánulos intracelulares. Aunque ningún hongo es estrictamente anaeróbico, algunos pueden crecer en condiciones anaeróbicas. La pared celular es rígida, con un componente polisacarídico, hecho de mananos, glucanos y quitina, asociado íntimamente con proteínas. Los hongos se presentan bajo dos 

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formas principales: hongos filamentosos (antiguamente llamados "mohos") y hongos levaduriformes. El cuerpo de un hongo filamentoso tiene dos porciones, una reproductiva y otra vegetativa.[2] La

parte vegetativa, que es haploide y generalmente no presenta coloración, está compuesta por filamentos llamados hifas (usualmente microscópicas); un conjunto de hifas conforma el

micelio[3] (usualmente visible). A menudo las hifas están divididas por tabiques llamados septas. multinucleado y zigosporas. Ejemplos de este tipo de hongos son: el moho negro del pan, o muchos formadores de endomicorrizas. Ejemplo Rhizopus, Mucor, Penicillium Los Ascomicetos presentan ascas o estructuras semejantes a un saco el cual contiene las ascosporas o esporas sexuales. Su micelio es aseptado. Es el grupo con mayor número de especies. Entre ellas destacan muchos hongos fitopatógenos (oídios, cornezuelo, grafiosis del olmo, etc.), parásitos en humanos Candida, Cryptococcus. Los Basidiomicetos presentan basidios en donde se encuentran las basidiosporas o esporas sexuales. Pertenecen a este grupo los hongos comestibles. Aquí pueden hallarse los hongos más conocidos, como las típicas setas, y algunos fitopatógenos de enorme importancia como royas y carbones. Los Deuteromicetos presentan hifas tabicadas.

Los hongos levaduriformes  o simplemente levaduras  son siempre unicelulares, de forma casi esférica. No existen en ellos una distinción entre cuerpo vegetativo y reproductivo. Las levaduras se identifican por el estudio de sus características metabólicas; mientras que la clasificación de los hongos filamentosos se basa en sus características morfológicas. Los hongos se han clasificado con criterios muy diferentes según el interés de los estudiosos (taxonómico, patogénico, epidemiológico). Desde el punto de vista taxonómico estricto, se clasifican según el tipo de reproducción sexual, en cuatro grupos: Zigomicetos, Ascomicetos, Basidiomicetos y los Deuteromicetos u hongos imperfectos que son los hongos superiores para los que se desconoce el tipo de reproducción sexuada, porque sus estructuras sexuales no están bien identificadas no se han descubierto o no existen. Los Zigomicetos son los hongos más simples con hifas aseptadas, micelio cenocitico, es decir

Prueba

Medios

Diagrama

Análisis y conclusiones El fundamento de la técnica se hace con base en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano , además de dos clases de ácido teicoico. Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana

plasmática, se encuentra el acodo lipòteicoico y en la superficie, el ácido teicoico que está anclado solamente en el peptidoglucano (también conocido como mureína) Recoger muestra estéril - Hacer el extendido en espiral - Dejar secar a temperatura ambiente - Fijar la muestra al calor (flamenado 3 veces aprox.) - Agregar cristal violeta al y esperar 1 minuto. Este tinte dejará de color morado las bacterias Gram

Cristal violeta. Coloración de Gram. Lugol Alcohol acetona. Fushina.

Cristal violeta Coloración de Gram. Lugol Alcohol acetona Fushina..

positivas. - Enjuagar con agua corriente. * - Agregar lugol y esperar 1 minuto. - Enjuagar con agua corriente . - Agregar alcohol y acetona por goteo y esperar 15 segundos. Enjuagar con agua. - Agregar safranina y esperar 30 segundos. Este tinte dejará de color rosado las bacterias Gram negativas. Enjuagar con agua. - Chorro suave ya sea con piseta o directo de la llave - Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión

Cristal violeta Coloración de Gram. Lugol Alcohol acetona Fushina. Y como resultado presenta, gran cantidad de estreptococos Gram. Negativos, por su organizaron y color.

PRACTICA No 2 CONDICIONES DE CRECIMIENTO Y METABOLISMO BACTERIANO Siembra de medio sólido a medio líquido Marque correctamente los tubos con el número del grupo, sistema de siembra utilizado y la fecha. Para crear un ambiente de esterilidad encienda el mechero y trabaje siempre al lado de el. Esterilice un asa recta a la llama de un mechero y déjela enfriar Tome el tubo que contiene la muestra a sembrar, retire la tapa del tubo, flamee la boca del tubo. Introduzca el asa en tubo sin tocar las paredes y tome un poco de colonia del cultivo, flamee nuevamente la boca del tubo, tapelo y dejelo en una gradilla. Tome el tubo de caldo nutritivo estéril en el cual va a colocar la muestra, destapelo, flameando la boca el tubo con el mechero e introduzca el asa con la muestra obtenida.Realice movimientos de rotación con el asa para emulsionar con el caldo las paredes del tubo.

Retire el asa, flamee la boca del tubo y tape. Esterilice el asa en el mechero después de usarla. Incube los tubos a 37ºC por 24 horas. Observar el crecimiento obtenido. Si no hay crecimiento el caldo queda transparente Siembra de medio líquido a sólido Se procede en la misma forma que en la siembra anterior pero con el asa de argolla. Si la siembra es en tubo recuerde hacer punción y estría. Si es en caja de Petri puede utilizar diferentes sistemas

como estría, agotamiento, rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra de medio sólido a sólido Se realiza de la misma forma que en la siembra anterior pero utilizando el asa recta. Los medios sólidos contienen agar en proporción de 1.5 a 2.0% y se emplean para obtener colonias aisladas. Las placas de agar se pueden inocular mediante varios métodos: como estrías, agotamiento y rejilla con el fin de lograr un cultivo puro. Siembra en rejilla

que contiene la muestra a sembrar, luego frote toda la superficie del agar. Le evaluación del crecimiento en las placas de agar se hace a través de la observación de colonias en la superficie. Siembra en agar inclinado

Realice una estría que atraviese el centro del agar. Luego realice estrías en ángulo recto con respecto a la estría inicial. Voltee el agar en ángulo de 90 grados y realice estría hasta cubrir todo el agar. Siembra por agotamiento Tome una placa de agar, marque la base de la caja de petri con los números 1, 2 y 3. Coloque la muestra a sembrar en el numero 1, realice estrías hasta la mitad de la caja. Esterilice el asa y gire la caja hasta el numero 2, tome las dos ultimas estrías y siga estriando hasta el numero 3. Gire la caja y termine de estriar, tenga cuidado de no tocar las estrías ya hechas. Siembra por estrías Marque la caja en 6 puntos. Coloque la muestra en el punto numero uno, realice estrías hasta el numero 2. Esterilice el asa, tome las dos ultimas estrías y extiéndalas hasta el numero 3, tome las dos ultimas estrías y extiéndalas hasta el numero 4 y así sucesivamente hasta llegar al numero 6. Siembra masiva Tome un hisopo estéril e introdúzcalo en el tubo Prueba Influencia de la temperatura Medios Diagrama

Esta se realiza por punción y por estría. Por punción: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada que de salida. Por estría: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag. No olvide flamear la boca del tubo antes y después de la siembra. Evalué la presencia de crecimiento en el agar por la formación de una película o por el crecimiento de colonias en la superficie. Siembra en profundidad Marque la caja de petri estéril con el número de grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri cerca del mechero. º Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur plástica, transfiera 1 ml de éste cultivo a la base de la caja de petri estéril. Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. º Vierta un poco de agar nutritivo en la caja de Petri, tape la caja y luego realice movimientos suaves sobre el mesón, en el sentido de las agujas del reloj, luego al contrario, en forma de L y L invertida, y por último en forma de 8. Esto garantiza una distribución homogénea de las bacterias en todo el agar para facilitar su posterior recuento. º Envuelva las cajas de Petri y los tubos con cinta de enmascarar, márquelos con el número de grupo, la fecha. Luego incube 37º c por 48 horas Análisis y conclusiones

Tubo 1: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 4ºC Nevera Tubo 2: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 37ºC Ambiente Tubo 3: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y 55ºC Incubadora

Influencia del pH

Tubo 1 pH 3.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 3.0 Tubo 2 pH 7.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 7.0 Tubo 3 pH 11.0: No. de grupo, fecha, no. de bacteria y pH 11.0 Incube los tres tubos a temperatura de 37 ºC por 24 a 48 horas.

Influencia de la Tensión de oxígeno

Tubo de Tioglicolato: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y tioglicolato y microaerófilo (recuerde que el tioglicolato se usa para el cultivo y aislamiento de anaerobios estrictos y facultativos de microorganismos microaerófilos Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y aerobio. Tubo de Caldo Nutritivo: No. del grupo, fecha, no. de bacteria y anaerobio. Adicione 2 ml de aceite mineral estéril a los tubos de tioglicolato y al anaerobio para crear un ambiente de anaerobiosis. Incube los tubos a 37ºC por 24 a 48 horas.

Metabolismo microbiano, reacciones bioquímicas de algunas bacterias Materiales y equipos: Tubos con los siguientes medios de cultivo inclinados estériles  Lisina Hierro Agar LIA  Triple azúcar hierro TSI  Citrato CIT  SIM Tubos con los siguientes medios líquidos estériles  Caldo lactosado BRILLA con campana de Durham  Caldo nutritivo CN

Cajas de petri con los siguientes medios estériles  Agar nutritivo AN  Eosina azul de metileno agar EMB  S.S. agar SS Microscopio, asas bacteriológicas, mechero de bunsen, incubadora, bacteria

Tubos con agar inclinado TSI, LIA, CIT realice una punción en el fondo del tubo y una estría en la superficie.  Tubo con medio semisólido agar SIM: se inocula con una punción hasta el fondo del tubo.

Tubos con medio líquido BRILLA, CN: tome un poco de la muestra y suspéndala directamente en el caldo, homogenice.

Cajas de agar nutritivo AN, EMB, SS: utilice el sistema de siembra de rejilla para obtener unidades formadoras e colonias individuales.

El agar LIA se debe leer en la superficie y el fondo del tubo. En el medio se evalúa la decarboxilación de lisina que se evidencia en el fondo del tubo por el viraje a violeta del indicador púrpura de metacresol. También se evalúa la deaminación de la lisina la cual ocurre en la parte superior del tubo y se evidencia con un color violeta-rojizo. La Fermentación de la glucosa produce acidificación del medio y un cambio de color del indicador de violeta a amarillo. Eventualmente se puede observar la Producción de ácido sulfhídrico (H2S) por la presencia de color negro.

El agar Citrato Si se utiliza el citrato como fuente de carbono, se incrementa el pH del medio y el indicador vira de verde a azul. Cuando no se utiliza el citrato, el indicador de ph azul de bromotimol permanece de color verde El agar TSI En el tubo TSI debe leerse siempre la superficie y el fondo. La fermentación de glucosa se observa en el fondo del tubo por el cambio de color del indicador de rojo a amarillo. También puede observarse la fermentación de lactosa y sacarosa en la superficie del tubo, por el cambio del indicador de rojo a amarillo. La producción de H2S se observa por la aparición de un precipitado negro, debido a las sales de hierro presentes

Agar Sim La motilidad se observa por la turbidez difusa del medio de cultivo alrededor del canal de la picadura. La no motilidad se caracteriza por el crecimiento producido exclusivamente a lo largo de dicho canal. En este medio también puede observarse la formación de H2S por el ennegrecimiento del medio. Caldo Brila Se observa la fermentación de la lactosa con formación de gas, en las campanas de Durham. Para la determinación del Número Más Probable de microorganismos, se observan cada uno de los tubos que tienen presencia de gas y el número de estos se relaciona en la tabla del Número Más Probable. En el caldo nutritivo se realiza la prueba de Indol la cual determina la producción de Triptofanasa por el microorganismo. Cumplido el tiempo de incubación agregar 1 ml del reactivo de Kovacs sobre el caldo de cultivo. Cuando hay moléculas de Indol libre se produce un anillo de color rojo en la superficie del medio de cultivo. En el Agar McConkey las bacterias que degradan lactosa producen ácidos orgánicos, formando colonias color rojo con un halo turbio debido al descenso de ph provocado por los ácidos biliares. Las bacterias que no fermentan lactosa, no bajan el pH, por lo tanto se observan colonias incoloras. En el Agar Eosina  azul de metileno- lactosasacarosa, las bacterias fermentadoras forman colonias de color rojo o negras brillantes.Las bacterias No fermentadoras producen colonias incoloras. Las bacterias Gram positivas, especialmente, resultan inhibidas en su crecimiento, por los colorantes presentes en el medio EMB.

En el agar SS (Salmonella - Shiguella) . Las colonias de gérmenes Lactosa  positivos son rosadas hasta rojas las colonias de gérmenes lactosa  negativos son incoloras. Las colonias de microorganismos formadores de H2S presentan un centro negro

Efecto de los desinfectantes sobre microorganismos

Humedezca un hisopo estéril en el tubo del microorganismo a sembrar. Escurra el exceso con las paredes internas del tubo.  Siembre masivamente cada una de las bacterias en la caja de agar nutritivo que le corresponde Con las pinzas estériles tome un disco de papel de filtro y sumérjalo en la solución de desinfectante y colóquelo sobre el número que le corresponde según la codificación de la base de la caja. Repita lo mismo con cada uno de los desinfectantes utilizados en cada una de las cajas.

Cumplido el tiempo de incubación tome las cajas y con ayuda del cuenta colonias observe la formación de halos de inhibición del crecimiento, que aparecen como zonas transparentes alrededor del crecimiento bacteriano. Mida el tamaño de los halos de inhibición con una regla. Según sus observaciones indique cuál sustancia es mejor en el control de cada microorganismo de prueba

Informe de laboratório. Practica 3. Análisis Microbiológico

Prueba

Medios

Diagrama

Análisis y conclusiones Frasco de agua peptonada sobre La balanza con 11g de Maní. Se agita durante 15 minutos.

Alimento maní 

Mesofilos, 10 -2 Mesofilos, 10 -3 Mesofilos, 10

-1

Con la pipeta marcada -1 10 , se adiciona 1ml del frasco inicial a todo el material marcado -1 10 Lo mismo com la -2 -3 pipeta 10 y 10 a los materiales respectivos.

Análisis Microbiológico Hongos y -1 levaduras. 10 Hongos y -2 levaduras. 10 Hongos y -3 levaduras. 10

Con un asa plástica estéril, se procede a expandir la muestra de cultivo.

TSN. Esporas -1 Clostridium, 10 TSN. Esporas -2 Clostridium, 10 TSN. Esporas -3 Clostridium, 10

Se procede a inocular 1 ml de cada dilucion em cada tubo respectivamente identificado TSN. Esporas -1 Clostridium, 10 TSN. Esporas -2 Clostridium, 10 TSN. Esporas -3 Clostridium, 10

Se llevan a ebullición o 80 C, durante 15 minutos.

Tubos TSN

Análisis Microbiológico

Dejar enfriar y luego adicionar com la pipeta plástica Pasteur, 1ml de médio de cultivo .y dejar solidificar, AL solidificar El médio se procede a agregar de nuevo médio TSN 1 ml aprox. para generar anaerobiosis ya que este microorganismo ES anaeróbio estricto. Se agrega de cada dilucion 0.5 ml, a cada cja petri previamente identificada, despues de esto se adiciona El Agar SPC y se homogeniza em forma de ocho

Agar SPC

Caldo lactosa bilis verde brillante

Se procede a inocular 1 ml em los 3 tubos de cada dilución -1 3 tubos de10 -2 3 tubos de 10 -3 3 tubos de 10

Cuestionario. 1. ¿Cómo se realiza el análisis microbiológico de un alimento o materia prima? Este análisis me sirve para saber si en nuestros alimentos o materias primas existe la presencia de microorganismos patógenos (ppal/ bacterias y hongos) mediante pruebas microbiológicas (cultivos). El fin que busca este tipo de análisis es hacer la inspección del alimento y ver si tiene o no la presencia de patógenos, su cantidad (carga), grado de patogenicidad y posiblemente la cantidad de alimento contaminado consumido Para la toma de muestras es necesario considerar que los patógenos se distribuyen de manera desigual en el alimento, por lo que se debe seguir un esquema de toma de muestras para así tener valores

representativos. Además se debe evitar la multiplicación o inactivación de los microorganismos durante el transporte de la muestra. En el laboratorio se debe especificar el tipo de alimento y el análisis solicitado: cultivo bacteriano, de hongos y su clasificación. Es necesario comparar los valores de referencia con los obtenidos por el laboratorio y analizar si el alimento se ajusta a las BPM (buenas practicas de manufactura) 2. ¿Qué es un recuento viable en placa y como se realiza? Un recuento de viables mide sólo las células vivas de una población, es decir, aquellas capaces de reproducirse (viable significa "que puede vivir"). El recuento se hace de las 'Unidades formadoras de colonias'. Es decir, cuando se hace la siembra, se reparten los microorganismos por toda la superficie. Al incubar la placa, se deja que cada microorganismo viable se multiplicara y formara una pequeña colonia. El recuento se realiza contando el número de UFC que hay en la placa. Dependiendo del microorganismo que se busque, se tendrán establecidos unos máximos y mínimos para el recuento. 3. ¿Cuáles son los métodos de siembre en placa? El método de siembra por estría en placa. Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos .Para ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petrí (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células individuales.

Los métodos de vertido en placa y extensión en placa. En estos métodos, las suspensiones de células microbianas se diluyen antes de su siembra en placa. En el método de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarán embebidas en el agar y otras crecerán en la superficie. Las colonias superficiales se extenderán y serán más grandes.

4. ¿Cómo se expresan los resultados de un recuento? Después del periodo especificado de incubación se cuentan las unidades formadoras de colonias UFC presentes en las cajas que contengan entre 15 UFC y 300 UFC, los análisis que aplica dicho rango son: Aerobios mesófilos; coliformes, recuento de bacterias termófilas, proteolíticas, lipolíticas, Clostridium sulfito reductores, S. aureus, B. cereus, etc. Excepto para aquellas bacterias cuya norma exige presencia o ausencia.

Después del periodo especificado de incubación se cuentan las unidades formadoras de colonias UFC presentes en las cajas que contengan entre 15 UFC y 150 UFC para Mohos y levaduras. 5. ¿En que consiste el método del número más probable? 6. ¿Qué microorganismos indicadores y que se presencia en un análisis microbiológico? El monitoreo de microorganismos indicadores le permite evaluar si el ambiente y las instalaciones de su planta procesadora de alimentos son las óptimas para elaborar alimentos salubres e inocuos; como también, si estan presentes en altas concentraciones, nos alertan de la posible presencia de bacterias patógenas y de microorganismos que causan el deterioro del alimento y su nivel de envejecimiento:         Microorganismos aerobios y anaerobios Coliformes E. coli Mohos y Levaduras Bacterias lácticas Clostridios sulfito-reductores Enterobacterias Enterococcos

En microbiología de alimentos se hablan de estos grupos porque cada uno de estos grupos me dicen a mí algo como por ejemplo: Los microorganismos aerobios mesófilos: son microorganismos que se desarrollan en temperaturas entre los 10ºC y 45ºC aproximadamente y en donde alla oxigeno aire común y corriente. Hay que tener en cuenta que en casi todos los alimentos a excepción de los recién cocidos a temperaturas adecuadas tienen microorganismos, pero estos según la normatividad no pueden sobrepasar los límites y me indican a mi si las condiciones de elaboración fueron higiénicas y afectan directamente la vida útil de los alimentos. Dentro de estos microorganismos mesófilos están los coliformes y me indican fallas en los procesos de higiene y contaminación cruzada. Hay dos tipos de coliformes: Coliformes totales y los fecales. Los coliformes totales por lo general es contaminación ambiental pero los fecales ya sabras de donde vienen y no debe estar en ningún alimento que este listo para el consumo. Si en un alimento encontramos Staphylococcus aureus es posible que este contaminado con sus toxinas y no este apto para el consumo pues puede desencadenar una ETA Enfermedad Transmitida por Alimentos. También están los mohos y las levaduras que indican contaminación ambiental. Psicrotrofos: viven a temperaturas de refrigeración pero no consumen alimento y no se multiplican Psicrofilos: viven a temperaturas de refrigeración pero si consumen alimentos y se pueden multiplicar. Estos dos grupos indican fallas en los procedimiento de elaboración de alimentos que se realicen a bajas temperaturas. Termófilos: Les gusta temperaturas altas y son indicadores de fallas en procedimiento donde se usen temperaturas altas en procesos de elaboración de alimentos como la pasteurización. Hay otros indicadores que dependen de los tipos de alimentos que mas les gusta: Proteolíticos: alteran alimentos con proteína. Lipolíticos: Aceites y grasas. Sacaroliticos u osmofílicos: Azúcar y a altas concentraciones.

7. Realice una revisión de los fundamentos, forma de actuación e interpretación de los siguientes medios de cultivo: Plate count Agar. Sabouraud agar. Sabouraud Glucose Agar es un medio de uso general para el cultivo de dermatofitos1,2. Hoy en día se utiliza para el aislamiento y cultivo de todos los hongos3-5. Las peptonas en Sabouraud Glucose Agar son fuentes de factores de crecimiento nitrogenoso. La glucosa aporta una fuente de energía para el crecimiento de microorganismos. La alta concentración de glucosa presenta una ventaja para el crecimiento de hongos (estables osmóticamente), mientras que la mayoría de las bacterias no tolera la alta concentración de azúcar. Además, el bajo pH es óptimo para los hongos pero no para muchas bacterias3. Sabouraud Glucose Agar es sólo levemente selectivo frente a las bacterias TSN Agar, Agar selectivo para Clostridium. BAIRD PARKER Agar. Fundamento En el medio de cultivo preparado y completo la peptona y el extracto de carne constituyen la fuente de carbono y nitrógeno, el extracto de levadura aporta vitaminas del complejo B, la glicina y el piruvato estimulan el crecimiento de los estafilococos. Este medio de cultivo es selectivo y diferencial debido al telurito de potasio y al cloruro de litio, los cuales inhiben el desarrollo de la flora acompañante. La yema de huevo permite demostrar la actividad lecitinásica. Los estafilococos coagulasa positiva reducen el telurito a teluro y originan colonias de color grisáceo-negro, y dan reacción sobre la yema de huevo produciendo alrededor de la colonia una zona opaca que a menudo tiene una zona clara mas externa. Se pueden encontrar cepas no lipolíticas, que presentan igual características de colonias pero sin la zona opaca y clara. Se debe confirmar la presencia de S. aureus mediante pruebas bioquímicas. 8. Investigar los rangos microbiológicos vigentes En La norma icontec, Del ministério de salud o Del INVIMA que corresponda al producto o muestra que va analizar. En Colombia podemos afirmar que cada alimento tiene un rango diferente es el mismo para todas las entidades en este caso el INVIMA es el ente regulador para ello.