elektroforeza

Univerzitet Univerzit et u Tuzli  Tehnološki  T ehnološki fakultet fakultet

SEMINARSKI SEMINAR SKI RAD

 Tema:  Tema: Elektroforeza Elektroforeza i njena primjena primjena

1.Uvod 

!roteini i protei"i imaju izuzetan zna#aj u $ziološkim pro%e&ima i kao enzimi i kao &up&trati' Ta #injeni%a &talno pove(ava intere& za njihovo i&tra)ivanje' *jelan#evine &u &up&tan%e reaktivne u $ziološkim u&lovima+a još ve(u o&etljivo&t i la,ilno&t pokazuju &a hemij&ko- a&pekta ka"a ih i&tra)ujemo ili pokušavamo "a ih izolujemo u #i&tom &tanju' Mno-e o" tih &up&tan%i po&tojane &u &amo u ra&tvoru o"re.enop/ i pri ni&koj temperaturi' Ka" &e i&talo)e pove(anjem kon%entra%ije neutralnih &oli+mijenjaju &e ne &amo $zi#ka &voj&tva ne-o na&taju #e&to i "u,lje promjene unutrašnje &trukture' 0ato je o" velike va)no&ti "a &e i&tra)iva# koji &e po&ve(uje i&tra)ivanju ,jelan#evina kori&ti meto"ama $zi#ke hemije' Kom,ina%ijom ovih provjerenih meto"a ,jelan#evine &e mo-u karakteri&ati i mo-u im &e o"re"iti najva)nija &voj&tva ,ez opa&no&ti "a (e &e pri ek&perimentu hemij&ki promjeniti' Najnovijim i&tra)ivanjima i&ti zahtjevi &u &e javili i za &amu DNK+ -ene+ e-zone' Najva)nija takva meto"a je elektroforeza 1*erkeš234' Elektroforeza je elektrokineti#ka pojava+ meto"a i pro%e&' Kao elektrokineti#ka pojava po"razumijeva kretanje naelektri&anih #e&ti%a po" "ej&tvom homo-eno- elektri#no- polja prema kato"i ili ano"i kroz ra&tvor &la,o- elektrolita' Nazivamo je meto"om jer mo)e "a &lu)i za raz"vajanje proteina iz &mješe kako u preparativne tako i u analiti#ke &vrhe' Mo)e "a &e nazove i pro%e& jer mo)emo "a mijenjamo u&love po" kojima &e ra"i "a ,i "o,ili %iljane rezultate'  Kao proizvo" elektroforeze "o,ija &e elektrofore-ram'U literaturi &e &re(e i pojam zimo-ram za elektroforet&ku &liku izoenzima+ a tako.e i za &amu &liku &e ka)e "a je elektroforeza'  Kao što ko" atom&ke &pektrofotometrije atom ka" iz po,u"jeno&tanja prelazi u o&novno &tanje "aje &voju &liku+tako ko" elektroforeze &vaki 5

protein+&ama DNA+ -en i e-zon "aje &voju &liku koja &e mo)e upore"iti &a -enet&kim oti&kom pr&ta'  Tokom elektroforeze &e kre(u naelektri&ane #e&ti%e' 6ne mo-u "a ,u"u: koloi"ne #e&ti%e+ proteini+ imuno-lo,ulini+ je"injenja protein&ke priro"e+ aminoki&eline+ nukleoti"i+ -eni i e-zoni' Tokom elektroforeze naelektri&ane #e&ti%e kre(u &e o"re"jenom ,rzinom' *rzina kretanja je"ne naelektri&ane #e&ti%e zavi&i o": naelektri&anja #e&ti%e+ veli#ine i o,lika naelektri&ane #e&ti%e+ ja#ine elektri#nopolja+ karakteri&tike potporne &re"ine+temperature' Elektroforeza &e izvo"i na inertnim po"lo-ama kao što &u %eluloza7a%etat+ ili a-ar -el' 1.1 Teorijski prikaz elektroforeze

Elektroforeza+ kako &amo ime na-ovještva+ ra"i na prin%ipu elektri#no- polja u kojem &e molekul kre(e kroz &jmešu i kra(i fra-menti &e kre(u mno-o ,r)e o" "u)ih fra-menata+ jer je kra(im fra-mentima lakše "a &e kre(u kroz &jmešu' Sjmeše koje &e kori&te za pravljenje mo-u ,iti o" razli#ito- materijala+ ali "o &a"a &e naj,olje pokazala &jmeša+ tj' -el napravljen o" a-aroze' *rzina kretanja fra-menata kroz -el zavi&i o" više faktora' Kon%entra%ija a-aroze je je"an o" faktora' 8to je kon%entra%ija viša+ kretanje fra-menata+ po-otovo velikih fra-menata+ je te)a' Sam o,lik fra-menata koji &e kre(e tako.e ima uti%aj na ,rzinu' Na primjer molekul mo)e ,iti linearan+ &piralno uvijen u kru- ili linearan &a manjim ošte(enjima' Svaki o" ovih o,lika ima "ru-a#iju ,rzinu kretanja: &piralno uvijeni je naj,r)i+ "ok je linearni naj&poriji' !ri&u&tvo Eti"ijum *roma 1Et*r4 mo)e "a u&pori kretanje molekula jer Et*r ima tu o&o,inu "a mo)e "a razriješi molekul pri &amom kretanju' Tako.e i napon 1elektri#no polje4 koji &e kori&ti ima uti%aj na kretanje+ na primjer najmanje mo-u(e polje je oko 379 ;%m' Kretanje #e&ti%a prilikom elektroforeze zavi&i i o": -u&tine naelektri&anja+ &tepena hi"rata%ije+ "imenzija+ &tepena "i&o%ija%ije #e&ti%a i o" u&lova u kojima &e elektroforeza vrši: vi&koziteta+ p/+ <

temperature i jon&ke ja#ine ra&tvora+ kao i o" elektri#no- napona i trajanja elektroforeze'

=

!o"lo-a za elektroforezu ili -el7no&a# tre,a "a ,u"e o" materijala koji ne(e rea-ovati &a uzorkom i na koji &e molekuli koji &e analiziraju ne(e a,&or,ovati' Ranije &u &e mno-o kori&tile po"lo-e o" &kro,a i a-ara+ a "ana& &e kori&te poliakrilami" i a-aroza' Mno-o,rojne &u pre"no&ti poliakrilami"a u o"no&u na o&tale po"lo-e' !oliakrilami" je hemij&ki inertan i &ta,ilan u širokom op&e-u $zi#ko7hemij&kih u&lova 1&ta,ilan je na promjene p/+ temperature+ nema ap&orp%iju u U o,la&ti i nema pojave elektroo&moze4' !oliakrilami"ni -el na&taje kopolimeriza%ijom akrilami"a i ,i&akrilami"a koji pravi &pojeve izme.u lana%a poliakrilami"a tako "a &e "o,ija mre)a&ta &truktura' Katalizatori polimeriza%ije &u amonijumper&ulfat 1A!S4 i N+N+N>+N>7 tetrametilen"iamin 1TEMED4' Elektroforeza &e mo)e &provo"iti u tzv' kontinuiranom &i&temu ili u "i&kontinuiranom &i&temu' U kontinuiranom &i&temu &e kori&ti i&ti pufer za &provo.enje elektroforeze i za pripremu -ela+ a -el mo)e ,iti je"nolike kon%entra%ije ili &a -ra"ijentom kon%entra%ije poliakrilami"a' U "i&kontinuiranom &i&temu pufer za provo"enje elektroforeze &e po &a&tavu i p/ vre"no&ti razlikuje o" pufera u -elu' 6&im to-a -el &e &a&toji o" "va "ijela 7 -ela za &a,ijanje i -ela za raz"vajanje 7 koji &e razlikuju po &tepenu umre)enja i p/ vrije"no&ti' Nakon završene elektroforeze protein&ki fra-menti &e u -elu mo-u "etektovati razli#itim ,ojama 1,ojanje ?ooma&&ie ,ojom+ ,ojanje &re,rom4 koje &e ve)u na proteine' Elektroforeza &e mo)e kori&titi za: 7 analiti#ke &vrhe 7 i"enti$ka%ija proteina 7 o"re.ivanje molekul&ke ma&e proteina 7 o"re.ivanje ,roja po"je"ini%a proteina 7 o"re.ivanje #i&to(e proteina 7 preparativne+ o"no&no &emipreparativne &vrhe @ iz"vajanje o"re.eno- proteina iz protein&ke &mje&e' 1.2 Podjela elektroforeze 3

0avi&no o" to-a "ali ima no&a# ili ne elektroforeza "ijeli &e na: &lo,o"nu i zon&ku' !rema naponu "ijeli &e na &tan"ar"nu i vi&okonapon&ku+ prema na#inu po&tavljanja komore za elektroforeze "ijeli &e na horizontalnu i vertikalnu' 0avi&no u kojoj "imenziji &e ra"i mo)e ,iti je"no"imenzionalna ili "vo"imenzionalna' !o"jela zon&ke elektroforeze: ' Elektroforeza na papiru' 5' Elektroforeza na %eluloza a%etatu 1?AE4' <' Elektroforeza na &kro,nom -elu' =' Elektroforeza na a-ar -elu 1AE4' 3' Elektroforeza na poliakril ami"nom -elu 1!AE4' B' Elektroforeza 1SDS !AE4' C' Izoelektri#no foku&iranje na poliakril ami"nom -elu 1!AEI4 na &tu,u ili na -elu' 9' Kapilarna eletroforeza U 5D elektroforezi proteini &e me.&o,no raz"vajaju prvo na o&novu naelektri&anja+ a zatim na o&novu ma&e' U prvom koraku proteini &e kre(u kroz -el &a kontinuiranim -ra"ijentom p/' Ka"a "o&ti-nu mje&to na -elu 1vrije"no&t p/4 na kome je njihovo ukupno naelektri&anje je"nako nuli+ zau&tavljaju &e'  Ta p/ vre"no&t je njihova izoelektri#na ta#ka 1pI4' 6va meto"a koja &e naziva izoelektri#no foku&iranje 1IE4 mo)e "a raz"voji proteine koji &e razlikuju po &amo je"noj je"ini%i naelektri&anja' U "ru-om koraku proteini raz"vojeni na IE -elu raz"vajaju &e u "ru-oj "imenziji na o&novu molekul&ke ma&e pomo(u SDS7!AE' '5' Elektroforeza na a%etat7%elulozi 6"vajanje na,ijenih #e&ti%a na a%etat7%elulozi tako.er &e za&niva na razli%i u -u&to(i na,oja' A%etat7%eluloza je elektroforet&ki no&a# -latke površine i je"in&tvene veli#ine pora pa a,&orp%ija+ elektroen"oo&moza i protok pufera mo&ti(ima "jeluju na o"vajanje na,ijenih #e&ti%a u znatno manjoj mjeri ne-o ko" no&a#a poput $lter papira+ pa je i raz"vajanje ,olje' B

A%etat7%eluloza na&taje o,ra"om hi"rok&ilnih &kupina %eluloze anhi"ri"om o%tene ki&eline' Svoj&tva elektroforet&ko- no&a#a o" a%etat7%eluloze ovi&na &u o &tupnju a%etila%ije+ po&tupku pre"pranja pri-o"om &ame izra"e+ vr&ti a"itiva+ veli#ini pora i "e,ljini no&a#a' A%etat7%eluloza kao no&a# kori&ti &e za elektroforet&ko raz"vajanje proteina u &erumu+ mokra(i+ likvoru kao i za raz"vajanje razli#itih varijanti hemo-lo,ina' Elektroforeza proteina u &erumu ja "o,ar te&t pretra)ivanja+ prven&tveno za otkrivanje monokon&kih proteina' Tako.er je "o,ar pokazatelj funk%ije jetre+ ,u,re-a i imunološko- &u&tava' !o završetku elektroforeze raz"vojene protein&ke frak%ije &e o,oje+ &uvišak ,oje i&pere+ trake u#ine prozinima i "enzitometrij&ki o"re"i relativni ,roj#ani u"io poje"inih protein&kih frak%ija' '5'< Eletktroforeza na &kro,nom i a-ar -elu U zon&koj elektroforezi kori&te &e razni no&a#i kao što &u $ltar papir+ a%etat %eluloza+ a-ar+ a-aroza+ škro, i akrilami"' iltar papir u elektroforezi &lu)i je"ino kao potporni elektroforet&ki no&a# koji ne preno&i toplinu i ima mali u#inak na &am pro%e& o"vajanja na,ijenih #e&ti%a' Sto-a &e na,ijene #e&ti%e u takvom elektroforet&kom no&a#u o"vajaju u-lavnom prema -u&to(i na,oja' Na&uprot tomu+ a-ar+ a-aroza+ škro, i akrilami" &e o"likuju velikom vi&koznoš(u i velikim otporom trenja' 6ni+ o&im što &prije#avaju prijeno& topline i &manjuju "ifuziju+ aktivno &u"jeluju u po&tupku o"vajanja "jeluju(i na elektroforet&ku pokretljivo&t na,ijenih #e&ti%a+ što je ovi&no o njihovoj veli#ini' Rezultat ovo- "jelovanja je "a &e #e&ti%e u a-aru+ a-arozi+ škro,u i akrilami"u o"vajaju i prema -u&to(i na,oja i prema veli#ini' Svoj&tvo elektroforet&ko- no&a#a "a razlikuje molekule prema njihovoj veli#ini pripi&uje &e nje-ovom kapa%itetu pro&ijavanja z,o- #e-a je ovaj u#inak "o,io naziv u#inak molekularnopro&ijavanjaF' 6n nije je"nako izra)en u &vim vr&tama C

elektrofret&kih no&a#a' Dok je neznatno izra)en u a-aru+ u škro,u i akrilami"u ima -lavnu ulo-u' '5'= ' Elektroforeza na poliakril ami"nom -elu 1!AE4 Elektroforeza na poliami"akrilnom -elu je vertikalna elektroforeza' !oliami"akrilni -el 1!AE4 je ,aziran na ko 7 polimeriza%iji akrilami"a i ,i& 7 akrilami"a' !AE je je"na o" naj,oljih meto"a koja &e kori&ti za raz"vajanje i vizueliza%iju nuklein&kih ki&elina' !re"no&ti !AE7a u o"no&u na a-arozni -el &u: ve(a rezolu%ija 1mo-u(e je raz"vojiti molekule #ija je razlika u "u)ini &amo nekoliko ,aznih parova4+ vi&oka #i&to(a uzorka i ve(a ,rzina izvo.enja' !rilikom pripreme -ela o"re.uje &e nje-ova-u&tina+ o"no&no veli#ina pora 1,unari(a4+ o" #ije veli#ine zavi&i raz"vajanje molekula DNK razli#itih "u)ina' uš(i -el ,olje raz"vaja ,li&ke fra-mente male "u)ine+ "ok re.i -el &lu)i za raz"vajanje velikih fra-menata' !ripremljeni -el potapa &e u ka"i%u za elektroforezu u kojoj &e nalazi o"-ovaraju(i pufer 1provo"nik4' Uzor%i koji &e analiziraju prvo &e pomešaju &a puferom za nalivanje uzoraka 1en-l' loa"in,uGer4+ koji pove(ava -u&tinu uzorka 1#ime je omo-u(eno "a uzorak pa"ne na "no ,unari(a4+ ,oje uzorak i omo-u(avaju pra(enje elektroforeze' !o&le to-a uzor%i &e &ipaju u ,unari(e na -elu 1 ,unari( H  uzorak4 i uklju#uje &e &truja o"-ovaraju(e- kon&tantnointenziteta' !ore" uzoraka+ nalivaju &e i pozitivna i ne-ativna kontrola i markeri u po&e,ne ,unari(e' Markeri 1lenjiri4 &u i&e#ene &ekven%e poznatih "u)ina' !ore.enjem ,rzine kretanja molekula koji i&pitujemo &a ,rzinom kretanja molekula poznatih "u)ina+ elektroforezom pro%enjujemo veli#inu %iljne &ekven%e koja je pre"met i"enti$ka%ije' Na o&novu to-a &e mo)e re(i "a li je %iljna &ekven%a pri&utna ili ne u i&pitivanom uzorku' !o završetku elektroforeze vrši &e vizueliza%ija raz"vojenih fra-menata ,ojenjem -ela eti"ijum 7 ,romi"om ili &re,ro 7 nitratom' Eti"ijum 7 ,romi" je kan%ero-ena 9

&up&tan%a koja &e interkalira izm.u "ijelova molekula i koja uore&%ira ka"a &e &tavi po" U &vetlo' Eti"ijum 7 ,romi"ni -el je naj#eš(e upotre,ljavan+ ali nije trajan jer ,oja ,rzo iz,le"i+ tako "a &e mo-u #uvati &amo 75 "ana' 0a trajno #uvanje -ela kori&ti &e ,ojenje &re,ro @ nitratom+ -"e &e fra-menti vizuelizuju kao tamne trake -olim okom na -elu' 6vako o,ojeni -el #uva &e umotan u folije+ zašti(eni o" i&ušivanja u fri)i"erima na J= &tepena ?elziju&a' '5'3 Elektroforeza 1SDS !AE4 SDS7!AE 1&o"ijum "o"e%il &ulfat poliakrilami" -el elektroforeza4  je tehnika za raz"vajanje "enaturi&anih proteina prema njihovoj relativnoj molekul&koj ma&i' SDS je jon&ki "eter")ent koji &e vezuje za proteine+ pri #emu "olazi "o narušavanja njihove kvaternerne+ ter%ijarne i &ekun"arne &trukture' SDS je ne-ativno naelektri&an+ a ,roj vezanih molekula SDS7a propor%ionalan je M "ato- proteina' Na taj na#in &e ne-ativno naelektri&ani proteini kre(u prema pozitivno naelektri&anoj elektro"i u elektri#nom polju i "olazi "o raz"vajanja proteina na o&novu molekul&ke ma&e' Raz"vajanje proteina je"no"imenzionom SDS7!AE u kontinuiranom pufer&kom &i&temu : !riprema L &epara%iono- poliakrilami"no- -ela za elektroforezu: 9'5 ml "/56 1autoklavirana4 B'B ml A%rlami"e;*i& A%rlami"e 3 ml '3M ,uGer Tri&7/?l L'5 ml L SDS Nepo&re"no prije razlivanja -ela u &mešu "o"ati LLOl L amonijum per&ulfata 15Lm- A!S;5LLOl ""/564 i LOl TEMED7a' Smešu la-ano promešati i razliti -el "o nazne#ene linije+ nakon #e-a tre,a po&taviti #ešlji(e i o&taviti -el "a polimerizuje' !olimeriza%ija traje =3min7h+ nakon #e-a &e mo)e pri&tupiti nanošenju uzoraka' A%rlami"e 1?
*i&A%rlami"e 1N+N>7Methlene,i&A%rlami"e47kro& linker+ povezuje polimere akrilami"a Ammonium per&ulfate 1A!S4 i TEMED 1N+ N+ N>+ N>7 tetramethlethlene"iamine47ini%ijatori I katalizatori polimeriza%ije akrilami"a'  Sa&tav pufera za elektroforezu: ER* 1ele%tro"e runnin- ,uGer4 LP kon%entrovani
&e kre(e ka pozitivnoj elektro"i 1ano"i4' Taj komplek& je štapi#a&ta #e&ti%a+ #ija "u)ina zavi&i o" molekul&ke ma&e 1M4 proteina' !ošto  je -u&tina naelektri&anja je"naka za &ve molekule za koje je vezan SDS+ pokretljivo&t štapi#a&te #e&ti%e zavi&i(e &amo o" molekul&ke ma&e proteina' SDS7!AE ne mo)e "a raz"voji proteine &a malim razlikama u molekul&koj ma&i+ ve( &e za raz"vajanje ovakvih proteina mora primeniti neka "ru-a $zi#ka karakteri&tika' Naj#eš(e &e kori&ti razlika u naelektri&anju koje poti#e o" ki&elih i ,aznih o&tataka aminoki&elina u proteinu' '5'B' Izoelektri#no foku&iranje na poliakril ami"nom -elu 1!AEI4 na &tu,u ili na -elu Izoelektri#no foku&iranje 1IE4 je elektroforet&ka tehnika u kojoj &e o"vajanje proteina provo"i na o&novi razlike u njihovim elektroforet&kim to#kama' Izoelektri#na to#ka proteina je"naka je p/ vrije"no&ti otopine ko" koje &u proteini elektri#ki neutralni' 6na  je ovi&na o &a&tavu proteina i prema tome je $zikalno7kemij&ka kon&tanta za &vaki protein' Kako je o"no& aminoki&elina i njihov ,roj razli#it za &vaki protein+ ra&pon izoelektri#nih to#aka je vrlo širok' Elektroforeza &e provo"i u -elu poliakrilami"a u kojem je pretho"no u&po&tavljen po&tojan p/ -ra"ijent izme.u "viju elektro"a' ra"ijent &e u&po&tavlja pomo(u &mje&e no&e(ih amfolita 1or-an&ke ,aze i ki&eline4 koji &e ra&pore"e u -elu prema njihovim izoelektri#nim to#kama ka" &e -el po"vr-ne "jelovanju elektri#ne &truje 1prefoku&iranje4' U fazi foku&iranja i&pitivani proteini putuju prema ano"i ili kato"i+ ovi&no o njihovom na,oju o"no&no prema zoni koja ima p/ vrije"no&t je"naku njihovoj izoelektri#noj to#ki' Kako &u u toj to#ki proteini elektri#ki neutralni+ oni -u,e elektroforet&ku pokretljivo&t i foku&iraju &e u u&koj zoni' Izoelektri#no foku&iranje je prema tome ravnote)na tehnika u kojoj ne po&toji u#inak "ifuzije i &to-a je izuzetno o&jetljiva tehnika'



 Tehnika izoelektri#no- foku&iranja kori&ti &e u la,oratorij&koj "ija-no&ti%i za raz"vajanje raznih varijanti hemo-lo,ina+ o"re.ivanje fenotipova Q7antitrip&ina+ raz"vajanje oli-oklon&kih I- i t"' Izoelektri#no foku&iranje izvo"i &e na -otovim+ komer%ijalnim !A plo#ama razli#ito- p/ ra&pona koji &e po&ti)e "o"atkom raznih amfolina' el pri#vrš(en na el*on" $lm pomo(u par kapi vo"e prilijepi &e na plo#u & hla.enjem u ka"i za elektroforezu' Mo&ti(e o" "e,elo- $ltar papira uronjene u ano"nu i kato"nu otopinu po&tavi &e na ru,ove -ela i &poje elektro"e' Nakon prefoku&iranja+ nane&u &e uzor%i u )eljeno po"ru#je p/' !o završetku izoelektri#no- foku&iranja na -elu+ $k&iranja raz"vojenih proteina izvo"i &e ,ojenje ,ilo &re,rom ,ilo ,ojom kao što je ?ooma&&ie7 *lue' '5'C Kapilarna elektroforeza Kapilarna elektroforeza je je"na o" "ana& naj#eš(e korištenih tehnika za raz"vajanje &up&tan%i'E$ka&no&t+ ,rzina i  je"no&tavno&t u po"ešavanju &elektivno&ti+ o&novne &u pre"no&ti koje je vrlo#e&to #ine o"a,ranom tehnikom o"vajanja i o"re.ivanja #ak i u konkuren%iji &a vi&okoe$ka&nom te#nom hromato-ra$jom 1/!?4' Raz"vajanja kapilarnom elektroforezom izvo"e &e u kapilarama 1naj#eš(e fu&e" &ili%a 4+ #iji je unutrašnji pre#nik naj#eš(e 537C3 Om 1mo-u ,iti u op&e-u 37LL Om4 u elelktri#nom polju #ija ja#ina mo)e i(i i "o CLL ;%m+ uz o"-ovaraju(i pufer i na#in "etek%ije' 6&novni faktori koji o"re.uju e$ka&no&t raz"vajanja &u: '0a-rijavanje u&lje" u&mjereno- kretanja naelektri&anih #e&ti%a u elektri#nom polju1D)ulov zakon4 5'Elektroo&moza <' Di&perzija 1širenje4 zona raz"vajanja Svi ovi faktori "irektno zavi&e o" o&o,ina uzorka 1Mr + pK + &truktura+ o,razovanje komplek&a4+o&o,ina pufera 1p/+ vi&kozno&t+ a"itivi+ "ielektri#na kon&tanta4 i in&trumenta kojim &eo"re.ivanje izvo"i 1"u)ina kapilare+ ja#ina primijenjeno- elektri#no- polja4 5

0a-rijavanje u&lje" u&mjereno- kretanja naelektri&anih #e&ti%a u elektri#nom polju 1D)ulovzakon4 "irektno je propor%ionalno kva"ratu ja#ine &truje+ što pre"&tavlja znatan pro,lem ka"a &eelelktroforeza izvo"i kla&i#nim putem 1u ka"ama+ naj#eš(e na poliakrilnom -elu @ SDS !a-e4'!o&otojanje -ra"ijenta temperature uzrokuje po&tojanje -ra"ijenta -u&tine i pojavu konvek%ije i"ifuzije z,o- #e-a "olazi "o širenja pikova i &manjenja rezolu%ije' !romjena temperature tokom izvo.enja elektroforeze "ovo"i I "o promjene elektroforet&ke mo,ilno&ti &up&tan%i što tako.er uzrokuje širenje pikova i &manjenu repro"u%i,ilno&t "o,ijenih rezultata' !romjena temperaturemo)e "ove&ti i "o promjene o&o,ina pufera i &up&tan%i koje &e raz"vajaju' Elektroo&moza tako.e ima veliki uti%aj'!ovršina kapilara prekrivena je &ilanolnim -rupama #iji &tepen "i&o%ija%ije+ a time i koli#inanaelektri&anja na zi"u kapilare+ zavi&e o" p/ korištenopufera' Ki&elo&t &ilanolnih -rupa pro%jenjena je p/7metrij&kom titra%ijom @ pK '3+ pa je ve( na p/5 više o" C3  po&toje(ih -rupa "i&o%irano' 0i" kapilare je u ovim u&lovima ne-ativno naelektri&an i elelktro&tati#ki privla#i pozitivno naelektri&ane jone iz ra&tvora pa "olazi "o o,razovanja "vo&truko- elektri#no-&loja' !ozitivno naelelktri&ani joni &e kre(u ka kato"i no&e(i u i&tom &mjeru i molekulera&tvara#a' 6vo kretanje ra&tvara#a u kapilari po" uti%ajem elektri#no- polja naziva &eelektroo&mot&ki protok' Tokm analize+ nenaelektri&ani mlekuli putuju ,rzinom koju o"re.uje ,rzina elektroo&mot&koprotoka+ i "o njihovo- raz"vajanja -otovo i ne "olazi' *rzina kretanja pozitivno naelektri&anih jona &e pove(ava+ a ne-ativnih &manjuje' Ukupna mo,ilno&t 1O4&up&tan%i u kapilari pre"&tavlja &umu elektroforet&ke i elektroo&mot&ke mo,ilno&ti' !re"no&ti po&tojanja elelktroo&mot&ko- protoka &u kra(e vrijeme trajanja analiza i mo-u(no&t "etek%ije i ne-ativno i pozitivno naelelktri&anih jona na kato"i+ pa &e prakti#no kapilarna elektroforeza u-lavnom izvo"i u ne-ativnom mo"u+ tj'unošenje <

uzoraka &e izvo"i u ano"nom pro&tou+ a "etektor je po&tavljen u kato"nom pro&toru' S "ru-e &trane+ eletroo&mot&ki protok &e tokom &erije analiza u i&toj kapilari mijenja z,o- a"&orp%ije i&pitivanih &up&tan%i na zi"u kapilare1kapilara &e #eš(e mora i&pirati4 i poneka" -a je teško kontroli&ati+ što &manjuje pro"u%i,ilno&t o"re.ivanja kapilarnom elektroforezom' Di&perzija zona u kapilarnoj elektroforezi zavi&i o" "ifuzije molekula u kapilari+ o" na#ina unošenja i zapremine unijetouzorka+ elektroo&mot&ko- protoka+ interak%ija &up&tan%i &a zi"om kapilare i još nekoliko faktora koji &la,ije uti#u na "i&perziju' E$ka&no&t raz"vajanja &e i ov"je izra)ava &tepenom raz"vajanja pikova na elektrofero-ramu' Kapilarna elektroforeza je trenutno &ve&trana tehnika+ koja nu"i veliku ,rzinu+ veliku o&jetljivo&ti ni&ka o-rani#enja "etek%ije' !re"&tavlja -lavni tren" u analiti#koj nau%i+ te na polju hiralne &epara%ije+ z,o- #e-a &e ,roj na&lova iz ove o,la&ti pove(ao ek&poneni%jalno u nekoliko po&lje"njih -o"ina' Uz pomenutu meto"u hiralne &epara%ije putem elektroforeze+ kori&te &e i"ru-i o,li%i kapilarne elektroforeze+ kao što &u: kapilarna zonalna elektroforeza+ i&ota%hforeza+kapilarna -el elelktroforeza+ kapilarno izoelektri#no foku&iranje+ kapilarna elektroforezaa$niteta+ te &epara%ija na mikro#ipovima' Iako &e kori&ti u velikoj mjeri+ tre,a napomenuti "akapilarna elektroforeza nije "o&ti-la &tatu& rutin&ke analiti#ke tehnike u hiralnoj &epara%iji+ z,o-o"re.enih vezanih ne"o&tataka' 6-rani#ena primjena ove meto"e je z,o- ne"o&tatka razvojamo"ernih hiralnih faza'

1.3 Primjena elektroforeze

=

Elektroforeza je vrlo mo(na la,oratorij&ka meto"a i njene mo-u(no&ti u-lavnom zavi&e o" vr&te koja &e kori&ti' 6&novni %ilj  je "a &e primjenom ove meto"e &azna više o $ziološkim i meta,oli#kim pro%e&ima koji &u povezani &a o&novnim funk%ijama or-anizma+ i&hranom+ z"rav&tvenim &tanjem i -enetikom' 6va meto"a &lu)i za raz"vajanje proteina kako u preparativne tako i u analiti#ke &vrhe+ kao i za o"re"jivanje njihovih -enet&kih varijanti' Ve"inke na molekul&kom nivou znatno &e više razlikuju ne-o što to na prvi po-le" iz-le"a' Meto"ama elektroforeze koje nam &toje na ra&pola-anju mo)emo "a otkrijemo &amo je"an "io na&jle"ne promenljivo&ti+ jer mno-e promjene koje &e "ešavaju na nivou molekula+ prije &ve-a promjene u &ekven%i neutralnih aminoki&elina koje ne "ovo"e "o promene elektri#no- optere(enja+ ne mo-u "a &e otkriju' Elektroforeza &e u me"i%ini+ farma%iji+ veterini i &to#ar&tvu primenjuje za i&pitivanje tjele&nih te#no&ti kao što &u: krv+ &erum+ plazma+ urin+ %ere,ro&pinalni likvor+ hormoni+ izoenzimi i hi"rolizati miši(a' U najnovije vreme i&pituju &e &amo DNA+ njeni "elovi i -eni' Elektroforezom na &kro,nom -elu o"re"jene &u -enet&ke varijante hemo-lo,ina ko" ova%a koje &u u korela%iji &a proizvo"nim o&o,inama ova%a' 6"re"jene &u tako"je na &kro,nom -elu i -enet&ke varijante hemo-lo,ina ko" -ove"a' Na &kro,nom -elu o"re"jene &u i -enet&ke varijante tran&ferina ko" -ove"a' Kori&te(i elektroforet&ke tehnike 1Kalimanov&ka+ 2924 je o"re"ila -enet&ke varijante izoenzima ko" lju"i' Stoiljkovi(12254 je o"re"ila izoelektri#nim foku&iranjem na poliakril ami"nom -elu -enetki polimor$zam alfa7 anti trip&in inhi,itora i povezala -a &a z"rav&tvenim &tanjem ko" lju"i i pojavom em$zema plu(a'  Voš je *erkeš 1234 i&takao "a u farma%eut&koj in"u&triji elektroforeza &lu)i kao kontrolna meto"a za i&pitivanje Wi&toXe preparata za vrijeme proizvo"nje+ a i kona#no- proizvo"a+ na 3

primjer hormon&kih preparata 1in&ulin4+ aminoki&elina 1hi&ti"in4+ pri izolovanju izoenzima+ u ,romatolo-iji 1ovo al,umin+ proteini mleka i )itari%a+ o"re"jivanje anti trip&in inhi,itora i "ru-ih anti nutritivnih materija protein&ke priro"e+ u proizvo"nji preparativnih proteina plazme u imunolo-iji 1&erumi i antitok&ini4+ u ,akterijolo-iji 1i&pitivanje ,akterija i aler-ena4' Najnovija &aznanja na nivou DNA i -ena kori&te &e i "ana& u farma%iji' !rimjenjuje &e u &u",enoj 1forenzi#koj4 znano&ti z,o- mo-u(no&ti &epara%ije i "etek%ije &li#nih makromolekula iz vrlo malih koli#ina uzorka+ te u klini#koj "ija-nozi razli#itih o,oljenja' Meto"om elektroforeze uz višefazni pufer mo-u &e utvr"iti promjene na makromolekulama proteina i nuklein&kih ki&elina na&tale tijekom &porih pro%e&a evolu%ije ili ,rzim promjena u in"u&trij&koj o,ra"i ,iološko- materijala' Naro#ito široku primjenu ima u analizi ,rzih promjena na makromolekulama tijekom in"u&trij&kih prera",enih pro%e&a u prehram,enoj tehnolo-iji i ,iotehnolo-iji+ po&e,i%e u kontroli kvalitete' *rzo &e mo-u utvr"iti pojave ,akterij&ke raz-ra"nje proteina' Mo-u &e utvr"iti promjene z,o- kvarenja prehram,enih proizvo"a tijekom "u-otrajnije- &kla"ištenja+ a koje uzrokuju termi#ko otporni ,akterij&ki enzimi+ tj' proteaze i lipaze o&tale u namirni%i nakon termi#ke o,ra"e ,iološko-a materijala i razaranja ,akterija+ promjena na makromolekulama z,o- kemij&kih reak%ija me.u &a&toj%ima proizvo"a 1npr' Maillar"ove reak%ije4' 8iroko &e primjenjuje pri utvr.ivanju patvorina u prehram,enim proizvo"ima+ npr' &a"r)aj kravlje- mlijeka u "eklariranim kozjim ili ov#jim &irevima+ u i"enti$ka%iji varijeteta &a&tojaka+ npr' tvr"e ili meke pšeni%e+ varijeteta krumpira+ vr&ta 1kultivara4 le-uminoza te razli#itih vr&ta me&a i ri,e' Kvantitativnim mjerenjem koli#ine makromolekula u elektroforet&kim vrp%ama mo-u &e o"re"iti kvantitativni o"no&i &a&tojaka u miješanim prehram,enim B

artiklima+ npr' &a"r)aj jaja u kola#ima ili proteina &oje u me&nim proizvo"ima' Kapilarna elektroforeza kori&ti &e u &epara%iji i kvanti$ka%iji opti#kih izomera 1enantiomera4 upotre,om opti#kih o"a,ira#a+ u &epara%iji enantiomera u kapilari & mi%elama+ u pra(enju terapij&ko- u#inka lijekova+ u ,iokemij&koj analizi ,ioloških tkiva+ &eruma+ plazme+ urina i "ru-ih ,ioloških teku(ina+ u analizi uo,i#ajenih klini#kih te&tova+ u analizi -ena i &ekven%iranju nuklein&kih ki&elina+ u analizi muta%ije -ena i &ekven%iranju "eok&iri,onuklein&ke ki&elina 1DNA4+ u analizi urina+ krvi+ &line i 1teku(ine4 &uza+ u analizi tok&ina vezanih na rak i uremiju+ u analizi metalnih iona+ kelatnih i "ru-ih komplek&a metalnih iona+ u analizi "ru-ih anor-an&kih kationa i aniona+ u analizi or-an&kih ki&elina i or-an&kih iona+ u analizi komponenata &a"r)anih u hrani: &ahari"a+ aminoki&elina+ pepti"a i proteina+ lipi"a i hormona+ vitamina+ "ru-ih priro"nih &a&tojaka+ lijekova+ a"itiva+ tok&ina i "e-ra"a%ij&kih pro"ukata+ u &epara%iji i "etek%iji u-ljikohi"rata' Kori&ti &e tako.er u &epara%iji i "etek%iji štetnih &a&tojaka u okolišu u-ljikovo"ika+ fenola i "erivata fenola+ aromat&kih i alifat&kih amina+ nitrozoamina+ kar,onila+ ftalatnih e&tera+ ek&plozivnih &pojeva+ površin&ki aktivnih tvari+ ,ojila i njihovih "erivata+ pe&ti%i"a i her,i%i"a+ or-ano7metalnih &pojeva+ tako.er u analizi &intet&kih polimera na &a"r)aj ne#i&to(a i o&tataka monomera+ u analizi veli#ine polimernih #e&ti%a+ &epara%iji oli-omera o" homopolimera i kopolimera+ za o"re.ivanja relativne molekul&ke ma&e vi&oko molekularnih polimera+ za o"re.ivanje anor-an&kih polimera+ u utvr.ivanju kemij&ke kompozi%ije polimera te u &tu"iju kinetike polimeriza%ije'

1.4 Zaključak  C

Na o&novu pretho"no izne&eno- mo)e &e zaklju#iti &lje"e(e: 7 Elektroforeza je $zi#ko7hemij&ka+ elektrokineti#ka pojava+ pro%e& i meto"a+ koja omo-u(ava "a &e ra"i &a )ivim nepromenjim ,iološkim materijalom' 7 !oznavanje teorije elektroforeze je neopho"no "a ,i mo-lo "a &e ra"i i menjaju parametri tokom ra"a i tako "o,ije realnija &lika' 7 0aje"no &a !?R7om+ elektroforeza omo-u(ava "a &e otvori -enom i pomo(u markera naprave -enet&ke mape za poje"ine ra&e lju"i i )ivotinja' 7 6&novni %ilj je "a &e primenom ove meto"e &azna više o $ziološkim i meta,oli#kim pro%e&ima koji &u povezani &a o&novnim funk%ijama or-anizma+ i&hranom+ z"rav&tvenim &tanjem i -enetikom'

9

iteratura: 7Elektroforeza+1Ivan !ilja% +!rehram,eno7,iotehnooški fakultet 0a-re,4 76&novi teorije elektroforeze i mo-u(no&ti primjene+ 1Trenkov&ki+?miljani(+ Smiljankovi(+MarinkovIn&titut za &to#ar&tvo *eo-ra"4 7Me"i%in&ka "ija-no&tika+1Yeljko Ver#evi(+Me"i%in&ki fakultet rijeka4 7Elektroforet&ke tehnike i&tra)ivanja proteina1Marijana Kr&nik7 Ra&ol+ *iljana *alen+ *ori& Ma#ek+ Du,ravko !avokovi(+!M 0a-re,4 7http:;;'&%ri,"'%om;"o%;5=CL9LB;!rin%ipi7elektroforeze &kripta 7http:;;&h'ikipe"ia'or-;iki;Elektroforeza

2