2. predavanje
16.10.2013.
ELEKTROFOREZA NUKLEINSKIH KISELINA Elektroforeza nukleinskih kiselina je metoda promjene kvaliteta ekstrahovanih nukleinskih kiselina ili način određivanja veličine fragmenata nukleinskih kiselina na agaroynom ili poliakrilamidnom gelu. Pored ove analitičke upotrebe elektroforeze, elektroforeze može bit ii preparativna, tj. možemo izdvojiti izdvo jiti određeni fragment izrezivanjem gela i daljnjom purifikacijom doći do šistog ciljanog fragmenta. Takve fragmente možemo dalje analizirati, npr. sekvencionirati. Način razdvajanja DNA fragmenata je električno polje kroz koje se fragmenti nukleinskih kiselina kreću ka pozitivnoj elektrodi (anodi). Najjednostavnija je horizontalna agarozna gel-elektroforeza. gel-elektroforeza. Uglavnom služi za provjeru kvalitete ekstrahiranih nukleinskih nukleinskih kiselina, kao i za detekciju fragmenata nakon PCR rekacije ili RFLP metode. Ovo još i nazivamo i fragmentalna analiza. Tokom elektroforeze dolazi do kretanja DNA molekula prema anodi, a etidium- bromida bromida prema katodi, što omogućava interkalaciju (umetanje) (umetanje) etidium- bromida bromida između baza. Tokom pripravljanja agaroznog a garoznog gela dodaje se određena o dređena količina etidiumetidium- bromida. bromida. Znači, vizualizaciju DNA fragmenata na agaroznom gelu vršimo etidiumetidium- bromidom bromidom uz pomoć UVUVsvjetla. Naime, pod UV-zracima DNA fragmenti sa interkaliranim etidium-bromidom svijetle, njihove pozicije možemo slikati te tako dokumentovati rezultate ekstrakcije ili fragmentalne analize (PCR, RFLP). Agarozna gel-elektroforeza je korisna i jednostavna te brza metoda. Ne zahtijeva skupe hemikalije, a njome možemo razdvojiti vrlo jasne fragmente koji su međusobno duži za 100 baznih parova. Za bolju razdvojivost (razlučivost) koristimo polikarilamidnu elektroforezu. Aparatura za agaroznu elektroforezu je jednostavna i sadrži kalup za izlijevanje većih i manjih manjih gelova, kao i kadu za samu elektorforezu u koju moramo naliti pufer i uroniti formirani gel, koji na sebi ima formirane džepiće za nanošenje uzoraka, a koje smo formirali sa češljevima različitih debljina, zubaca i koji dolaze uz aparaturu. Za vertikalnu gel-elektroforezu se koristi samo poliakrilamidni gel i ona nam služi za precizno razdvajanje DNA fragmenata ili proteina. Aparatura se sastoji od staklenih ploča, kalupa za izlijevanje gela, češljeva, spejsera (plastična traka između 2 staklene ploče), k ao ao i vertikalne kade za elektroforezu. Poliakrilamidnu gel elektroforezu možemo korisiti za razdvajanje nukleinskih kiselina i proteina (naročito proteina) u dvije dimenzije obrtanjem ploča. Takva elektroforeza se naziva 2D elektroforeza. Polikarilamidnu gel gel elekroforezu (PAGE) najčešće koristimo za indikaciju (detekciju) pecifičnog fragmenta DNA, kojeg možemo prenijeti drugom metodom na nitrocelulozni papir, jer je on elektropozitivan i dobro vezuje za sebe DNA fragmente. Ovaj prenos DNA fragmenata sa svježeg svježeg (nativnog) gela na nitrocelulozni papir nazivamo metodom južne mrlje ili southern blotting. Postupak transfera DNA fragmenta sa agaroznog ili nitroceluloznog gela vrši se u kadi sa puferom, a transfer se odvija uglavnom preko noći uz pomoć kapilarnog kretanja fragmenta kroz gel.
2. predavanje
16.10.2013.
SOUTHERN BLOT METODA Koristi se za izdvajanje specifičnog fragmenta nukelinske kiseline uz pomoć sonde poznate nukleotidne sekvence. Da bi vizuelizirali mjesto vezivanja poznate sonde sa nepoznatim fragmentom, taj hibrid moramo obojiti-otuda i naziv “mrlja”. Naziv “southern” vjerovatno potiče od pravca kretanja pufera odozdo na gore (od juga ka sjeveru). Ova metoda se puno koristi u istraživanjima genoma nepoznate sekvence, zatim u detekciji različitih vrsta mutacija ili nukleotidnih polimorfizama. Prethodno smo rekli da ovoj blot metodi prethodi fragmentiranje genomske DNA, zatim razdvajanje tih fragmenata na gel-elektroforezi, a nakon toga prenošenje DNA fragmenata na membranu. Postoji više modifikacija osnovne metode elektroforeze. Jedna od njih je i razdvajanje proteina pod djelovanjem električne struje u ograničenim uslovima. Ovu elektroforezu su nazvali kretanje u graničnoj elektroforezi (moving boundary electrophoresis). U ovoj elektroforezi otopina proteina se unosi u cijev U profila, a elektrode su postavljene na krajevima U-cijevi. U električnom polju molekula proteina se kreću prema različitim elektrodama različitom brzinom, praveći određene zone istih molekula. Granična polja između zona moguće je odrediti optičkim čitačem. Ovu metodu koristimo za određivanje mobilnosti određenih molekula. Najprimjenjivaniji tip elektroforeze je tzv. zonska elektroforeza. U ovom slučaju uzorak se nanosi u obliku tačke ili trake na čvrstu podlogu ili želatin. Od čvrstih podloga najčešće se koristi Watmanov papir, a od želatina gel. U uspostavljenom električnom polju molekule putuju po površini papira ili kroz gel određeno vrijeme tokom kojeg se analizirane materije razdvajaju u zone (bendove, trake). Naravno ovo kretanje molekula se odvija u električnom polju sa puferom. Gel posjeduje pore, pa ujedno i predstavlja molekularno sito, koje pomaže u razdvajanju molekula. Kada koristimo papir, nejgove trake obavezno uronimo u rezervoare sa puferom. Napon struje se kreće oko 20 V/cm² papirne tr ake, a molekule se razdvajaju putujući prema suprotno nabijenim elektrodama. Razdvojene molekule bojimo određenim bojama, tako ih vizueliziramo, a zatim eluiramo (ispiramo) sa papira ako su nam potrebne za daljnju analizu. Kad je u pitanju razdvajanje proteina, agaroznu gel-elektroforezu koristimo za sepraciju biomolekula molekulske mase od 200 kDa i više, a veličina pore glea kroz koju mogu proći takve molekule je 10 nm. Veličinu pore u gelu definišemo procentualnim učešćem agaroze na 100 mL vode, pa tako 1% agarozni gel bi imao pore od 500 do 150 nm u promjeru. Ovu gustinu gela koristimo i za razdvajanje nukleinskih kiselina. Poliakrilamidni gel ima neke prednosti u odnosu na agarozni, kao pto su stabilnost na promjene pH, temperatura, itd. Za pravljenje poliakrilamidnog gela koristimo poliakrilamid i bisakrilamid koji pravi poprečne spojeve između dugačkih lanaca poliakrilamida; na taj način dobijemo gel sa definisanom mrežastom strukturom, a aveličinu pora kod ovog gela definišemo promjenom koncentracije akrilamida i bisakrilamida. Pri pravljenju polikarilamidnog gela moramo voditi računa da u otopini gela ne bude zraka, jer on ometa polimerizaciju navedenih polimera. Evo primjera razdvajanja 5 glavnih frakcija proteina seruma, od kojih su 2/3 albumini, a ostatak su globulini.
2. predavanje
α-1 globulini α-2 globulini β globulini γ globulini sadrže imunoglobuline
16.10.2013.
α1 lipoprotein, α1 antitripsin, kiseli glikoprotein α2 makroglobulin, α2 lipoprotein, haptoglobin, ceruloplazmin i Hs glikoprotein β lipoprotein, transferin, hemopeksin, plazminogen, β glikoprotein, fibrinogen IgM, IgA, IgG, IgD, IgE
Globulini su heterogena grupa i kod hereditarnih bolesti jedna frakcija tih proteina može nedostajati (agamaglobulinemija, hipoalbuminemija). Kod bolesnika sa multiplim mijelomom monoklonalni proteini se javljaju u području γ globulina, između β i γ globulina ili u zoni α2 globulina. Pacijenti sa cirozom jetre često imaju snižene albumine i povišene globulinske frakcije. Neki pacijenti koji boluju od karcinoma imaju snižene γ globuline i albumine, a povišene α i β globuline; slično je i kod nefrotičnog sindroma. Elektroforezu proteina možemo koristiti u: -
analitičke svrhe za identifikaciju proteina za određivanje mase proteina za određivanje broja podjedinica proteina za određivanje čistoće proteina u preparativne, odnosno semipreparativne svrhe za izdvajanje određenog proteina iz smjese.
U 2D proteinskoj elektroforezi proteini se međusobno prvo razdvajaju na osnovu naelektrisanja, a zatim na osnovu mase. U prvom koraku proteini se kreću kroz gel sa diskontinuiranim pH gradijentom. Kada proteini dostignu mjesto na gel usa određenom pH vrijednošću, na kome je njihovo ukupno naelektrisanje jednako nuli, zaustavljaju se. Ta pH vrijednost je njihova izoelektrična tačka (pI). Ova metoda koja se naziva izoelektrično fokusiranje (IEF), može da razdvoji proteine koji se međusobno razlikuju zas amo jednu jedinicu naelektrisanja. U drugom koraku proteini razdvojeni na IEF gelu razdvajaju se u drugoj dimenziji na osnovu molekulske mase, na istom gelu, pomoću SDS-PAGE.
