Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo múltiple (número más probable o NMP) OBJETIVOS Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales. Organizar e interpretar los resultados.
GENERALIDADES Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de contaminación fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme constituyen un grupo heterogéneo con hábitat primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicación fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar frente a una contaminación reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prácticas sanitarias. Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este grupo está conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h de incubación a 44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más prominente es Escherichia coli. La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las características que presentan sus factores de virulencia únicos, cada grupo provoca enfermedad mediante un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plásmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países subdesarrollados y afecta principalmente a los niños. Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullición hasta por 30 minutos. La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser más baja. Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células mucosas. La infección por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crónica. Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plásmido, ambas proteínas permiten su unión a los enterocitos y la destrucción de las microvellosidades intestinales. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones del antígeno H (flagelar). Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La
enfermedad se presenta comúnmente en niños de países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células epiteliales de la mucosa intestinal. A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas características importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogénicas. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de mono verde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina tiene propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG. La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la cocción completa de la carne En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por las cepas de Escherichia coli antes descritas. Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli patógenas ETEC EPEC EHEC EIEC Toxina Lábil/estable Shiga o vero Invasiva Intiminas Enterohemolisina Aspecto de las heces Presencia de leucocitos en heces Fiebre
-
-
-
+
-
+
+
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-
-
+
-
Aguadas
Aguadas Aguadas muy Mucoides y sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
-
-
-
+
baja
+
-
+
Intestino involucrado Dosis infectiva Serotipos
Delgado
Delgado
Colon
Alta
Alta O26, O111 y otros
baja O157:H7, O26, O111 y otros
varios
Colon y parte baja del delgado Alta Varios
FUNDAMENTO La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C 1C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinación del número más probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1. Para análisis de agua Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1. 5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado concentración doble o triple con campana de Durham a. 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb. 5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC MUG con campana de Durham b.
2 cajas Petri con agar para métodos estándar d 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional) e 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons (opcional)e
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
Frascos gotero con reactivo de Ehrlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2e COLORANTES PARA TINCIÓN DE GRAMd
MATERIAL Y EQUIPO
Mechero, a,b,c,d,e. Propipetaa. Gradillaa,b,c,e. Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c Lentes de seguridadc Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna. Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna. Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d Asa bacteriológicab,c,d,e Portaobjetosd Microscopio ópticod Termómetro calibradob Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.b Incubadora a 35° ± 2,0ºCa. Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca Autoclavea
NOTAS a Material necesario al inicio de la práctica. b Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica. c Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica. d Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica. e Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.
DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES
37°C 24 - 48 h
Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) doble concentración (2X)
CLSS + 20.0 mL de muestra
2 a 3 asadas/tubo
Siembra con asa bacteriológica de los tubos positivos (producción de gas) en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC
2 a 3 asadas/tubo
37°C
44.5°C
24 – 48 h
24 – 48 h
-
Tubos con 10.0 mL de caldo lactosa verde brillante bilis 2%
Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /100 ml de muestra
Tubos con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG
Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /100 ml de muestra.
Siembra de tubos positivos en placas de Agar EMB para la búsqueda de Escherichia coli
PROCEDIMIENTO 1. Agua y hielo 1.1 Prueba presuntiva
Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra.
CUADRO 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio
INOCULO (mL)
CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (mL)
VOLUMEN DE CALDO LAURIL MEDIO MAS TRIPTOSA INOCULO REQUERIDO g/L (mL)
CONCENTRACIÓN
1
10 o más
11 o más
35,6
1X
10
10
20
71,2
2X
10
20
30
53,4
1.5 X
20
10
30
106,8
3X
100
50
150
106,8
3X
100
35
135
124.6
3.5 X
100
20
120
142.4
4X
Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si hay formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa producción de gas, incubar 24 h. más. 1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a tubos que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham.
Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h..
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h..
Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes totales/100 mL.
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a tubos con caldo EC.
Agitar suavemente los tubos para su homogeneización.
Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un baño de agua con circulación durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de organismos coliformes fecales/ 100 mL.
Control de calidad para coliformes fecales 1. Inocular en tubos de caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar junto con las muestras. 1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología microscópica y pruebas bioquímicas.
Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.
Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.
1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). A partir de las cajas de agar cuenta estándar, selecionar una colonia, resuspenderla en 2 ml de solución salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas. a. Producción de indol (I)
Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo con caldo triptona, incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.
Finalizada la incubación, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs o Ehrlich.
La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera como prueba positiva para la presencia de indol.
b. Producción de ácidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)
Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar a 35°C por 48 ± 2 h.
Finalizada la incubación, adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa.
c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar a 35°C por 48 ± 2 h.
Finalizada la incubación , adicionar 0.6 mL de solución KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2 mL de solución alfa- naftol (VP2 )y agitar.
Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilización del citrato (C)
Tomar una asada de la suspensión bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons (opcional) Incubar a 35°C por 96 h.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser, se considera una prueba positiva.
NOTAS Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al medio SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacteriologíca de forma recta. Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo. Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono, también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva Para evitar resultados falsos positivos, el inoculo no debe ser muy abundante, tanto en el caldo citrato como en el agar citrato de Simmons
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metil-umbeliferil--D-glucuronido)
FUNDAMENTO Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli. a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) tomar una asada de cada tubo que muestre formación de gas y sembrar en un número igual de tubos con medio ECMUG.
Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más.
Finalizado el periodo de incubación, irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar cuantos tubos presentan fluorescencia
Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae como control negativo. CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al procedimiento señalado en la tabla 1, para estimar la población de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli en muestras de agua. TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo. No. de Tubos positivos 0 1 2 3 4 5
NMP/100 mL <1,1 1,1 2,6 4,6 8,0 >8,0
95% de Límite de Confianza (aproximado) Inferior Superior 0 3,0 0,05 6,3 0,3 9,6 0,8 14,7 1,7 26,4 4,0 Infinito
TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo. No. de Tubos Positivos 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
NMP/100 mL <1,1 1,1 2,2 3,6 5,1 6,9 9,2 12,0 16,1 23,0 >23,0
95% de Límite de Confianza (aproximado) Inferior Superior 0,0 3,0 0,03 5,9 0,26 8,1 0,69 10,6 1,3 13,4 2,1 16,8 3,1 21,1 4,3 27,1 5,9 36,8 8,1 59,5 13,5 Infinito
Todos los cultivos que: Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos, no esporulados, fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h. a 35°C. y se obtenga las siguientes combinaciones para las pruebas IMVIC: Biotipo 1(++--) Biotipo 2 (-+--) son consideradas como Escherichia coli. Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporción de los tubos positivos de la prueba confirmatoria en caldo EC.
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