COMPARACIÓN DE LOS PASOS ENTRE LA REPLICACIÓN
IN VIVO DEL
ADN Y LA REPLICACIÓN
REPLICACIÓN IN VIVO
REPLICACIÓN IN VITRO ( PCR)
INIC INICIA IAC CI N
DESNA DESNATUR TURAL ALIZA IZACI CI N
TERM TERMIN INAC ACII N
EXTENCION
IN VITRO DE
LA PCR.
Mediante consumo de ATP en dirección 5'-3', la Helicasa actúa rompiendo Desnaturalización del ADN a temperatura elevada, a fin de convertir el ADN los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble hélice. Las bicatenario en ADN monocatenario. proteínas SSB (single-stranded DNA binding proteins , proteínas ligantes de Para obtener la desnaturalización del ADN, la temperatura suele aumentarse ADN monocatenario) son las encargadas de la estabilización estabilización del ADN hasta unos 93 - 96°C. De esta manera se rompen los puentes de H y aumenta monocatenario generado por la acción de las Helicasas, impidiendo así que el el número de bases desapareadas. La reacción se completa cuando todo el ADN forme de nuevo nuevo la doble hélice, hélice, de manera que pueda pueda servir de molde. ADN bicatenario bicatenario se convierte en monocatenario. monocatenario. Por otro lado, las Topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos que generan las Helicasas. ELON ELONGA GACI CI N ANILLAMIENTO . La ADN Polimerasa III cataliza la síntesis de las nuevas cadenas, añadiendo Unión (anillamiento) de dos oligonucleótidos, utilizados como cebadores, al nucleótidos sobre el molde. ADN diana. La unión o rehibridación de las hebras de ADN se efectúa a una (generalmente, entre 55 y 65 ºC). De esta forma, hebras Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es temperatura inferior (generalmente, necesario que una ARN primasa catalice la formación de un fragmento corto complementarias de ADN monocatenario tienden a formar de nuevo una específico de ARN llamado cebador, que determinará el punto por donde la molécula de ADN bicatenario. En esta fase, los cebadores se mueven ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. La replicación en la hebra libremente y es continua la formación y la ruptura de puentes de hidrógeno adelantada es continua. entre el cebador monocatenario y el ADN molde también monocatenaria. En ese pequeño fragmento de ADN bicatenario (ADN molde con cebador) puede fijarse la polimerasa y empezar a copiar el ADN molde. La replicación en la hebra retardada es discontinua, dando lugar a la unión de Extensión de la cadena de ADN por adición de nucleótidos a partir de los los fragmentos de Okazaki. Cuando la ADN Pol III hace contacto con el cebadores utilizando ADN polimerasa como catalizador, en presencia de iones extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de éste Mg2+. es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son Los cebadores se extienden a lo largo de la secuencia diana utilizando utilizando una ADN polimerasa polimerasa termoestable (frecuentemente (frecuentemente se trata de la ADN Taq unidos. En la eliminación del fragmento de Okazaki intervienen dos enzimas: por un polimerasa) en presencia de dNTP, lo que produce la duplicación del material lado la ADN Pol III, que va eliminando el ARN con su actividad exonucleasa diana inicial a una temperatura de 72°C . 5'-3' y simultáneamente rellenando con ADN mediante su actividad polimerasa 5'-3' (proceso denominado nick-traslation). Al final queda rotura el extremo 3'OH libre y el fosfato 5' de la cadena sintetizada; por último, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reacción de condensación entre el grupo f osfato y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo, completando el enlace fosfodiéster; para ello, es preciso hidrolizar una molécula de ATP. El final de la replicación se produce cuando la ADN polimerasa III se encuentra con una secuencia de terminación. Se produce entonces el desacople de todo el replisoma y la finalización de la replicación.
