Tercera parte
Pruebas en suelos
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E����� �� ��������� ����� ��� �� ������� �� ������ E������ ������ María del Car men Cuevas Díaz, Ronald Ferrera Cerrato, Adriana Roldán Martín y Re fugio Rodr íguez Vázquez
C LASIFICACIÓN
DE L ENSAYO :
E
P�������� �� �� ������ Los bioensayos con lombrices son ampliamente reconocidos como prueba para evaluar la toxicidad de suelos contaminados (Dorn et al ., 1998; Wilson et al., 2002). La lombriz más utilizada ha sido Eisenia en sus especies foetida y andrei, las cuales pertenecen a la amilia Lumbricidae. Estas especies de lombriz son exógenas en México, pero de amplia distribución, ácil manejo y cultivo (Fragoso, 2002). Su principal característica morológica es la presencia de segmentos externos e internos en su cuerpo, son hermaroditas y cuando son adultas se observa una protuberancia epidérmica denominada clitelo, en el que se orman los capullos en los cuales son depositados los huevos (Santamaría, 1996). Esta especie se desarrolla bien en pH de 5 a 7, a temperaturas de 20 a 28 ºC (Kaplan et al., 1980). La lombriz a utilizar es E. 211
a i c n e i r e p x e n o C
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andrei porque su desarrollo y reproducción es mayor que el de E. foetida (Domínguez et al., 2005).
Este ensayo incluye dos clases de pruebas toxicológicas: 1) prueba por contacto con papel filtro y 2) prueba con suelo artificial y muestras de suelo contaminado. La prueba por contacto en papel filtro puede ser utilizada como preliminar para determinar las concentraciones correspondientes a las que se tiene que llevar a cabo la prueba con suelo, siendo esta última más detallada. La prueba de contacto es ácil de realizar y da resultados reproducibles. El suelo artificial y el suelo contaminado son representativos de la exposición de la lombriz al compuesto analizado. El presente ensayo se basa en lo descrito en la guía 207 de la OECD para la evaluación de sustancias (OCDE, 1984)y la publicación 96-327 del Departamento de Ecología del Estado de Washington (WSDE, 1996), así como en las experiencias obtenidas a nivel laboratorio (Cuevas et al., 2006). La prueba por contacto en papel filtro involucra la exposición de las lombrices a sustancias prueba sobre un papel filtro húmedo con la finalidad de identificar el potencial del compuesto tóxico presente en el suelo. Esta prueba tiene una duración de 48 a 72 horas. El uso de suelo artificial involucra colocar las lombrices en un suelo artificial aplicando una serie de concentraciones de la sustancia prueba. Cuando se desea evaluar la toxicidad del suelo contaminado de un sitio en estudio o de un suelo restaurado, la prueba se puede realizar directamente con éste; la mortalidad de las lombrices es evaluada a los 7 y a los 14 días. Para la prueba de contacto la sustancia problema se expresa en mg/cm 2, mientras que para suelo artificial y muestras de suelo contaminado se expresa en mg/kg (base seca). Para que una prueba sea considerada como válida, la mortalidad en el control no debe exceder el 10% al final del período de exposición. Asimismo, es recomendable el uso de un control positivo con un compuesto de reerencia como 2-cloroacetamida, para asegurarse que las condiciones utilizadas en la prueba ueron adecuadas y no presenta ningún cambio significativo. Este ensayo se ha realizado utilizando como medio de prueba suelo artificial, suelo control y suelo contaminado y como sustancias problema a los hidrocarburos totales de petróleo (TPH), benzo[a]pireno y pireno.
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M������� Frascos de vidrio de 0.5 L o 1 L; rascos de vidrio (diámetro de 4.5 cm y altura de 7 cm); pipetas volumétricas clase A de 1 a 100 mL; pipetas serológicas de 1 a 10 mL graduadas; micropipeta de 200 a 1000 µL; termómetro; espátula de acero inoxidable; pinzas; guantes; papel filtro y
malla 2 a 2.36 mm.
E����� Potenciómetro; balanza analítica con capacidad para pesar lombrices de 0.1 g; bBalanza con capacidad para pesar muestras de suelo de 1.0 g; baño o cuarto con control de temperatura 20 ± 2 ºC con intensidad luminosa de 400 a 800 lux y base de agitación o vórtex.
R�������� � ���������� Todos los reactivos utilizados deben tener al menos 99% de pureza. Para la preparación de soluciones se emplea agua destilada. Soluciones amortiguadoras para pH 4, 7 y 10; 2-cloroacetamida (99% pureza) y agua destilada o desionizada tipo II.
S���� ���������� El suelo artificial tiene una composición de: 10% musgo (materia orgánica), 20% arcilla y 70% arena. Se utiliza CaCO 3 para ajustar el pH a 7.0 ± 0.5
M������ �� ����� Se necesitan cuando menos 1100g de suelo, ya que se prepara un mínimo de 4 réplicas de 200 a 250g de suelo contaminado. Los 100 a 200 g del remanente se utilizan para realizar las determinaciones de pH, humedad y concentración del compuesto; pero si se requiere caracterizar la muestra es necesaria la recolección de mayor cantidad de suelo. Los recipientes deben ser llenados en su totalidad. Si el análisis no se realiza de inmediato, las muestras deben ser selladas, empacadas y almacenadas a 4 ºC en la oscuridad, para minimizar la pérdida de compuestos volátiles. De preerencia, la evaluación de la toxicidad se debe realizar en un lapso de 24 horas; de no ser posible se debe procurar
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hacerlo en un plazo no mayor a 14 días, ya que la toxicidad pudiera no ser representativa por degradación o pérdida del contaminante.
O��������� �� ������ Se utilizan lombrices adultas de al menos 2 meses de edad (cliteladas) del mismo cultivo y la misma especie. Estos organismos pueden desarrollarse en dierentes residuos animales, especialmente en estiércol de caballo, aunque puede prepararse una mezcla 50:50 de estiércol y residuos vegetales. El pH debe mantenerse alrededor de 7 ± 0.5 y la conductividad debe ser menor de 6.0 miliSiemens. Para asegurar una buena producción de lombrices se debe tener 20 kg de residuos por 1 kg de lombrices. C������ ��� ������� El control con 2 cloroacetamida (control positivo) sirve como una reerencia para determinar la sensibilidad del organismo. Por lo que cada vez que haya un cultivo nuevo, se debe realizar este control. Esta parte de la prueba debe llevarse a cabo previo a la exposición de la lombriz a la sustancia de prueba. Para el control positivo se requieren cuando menos tres concentraciones dierentes con cloroacetamida. Se sugiere utilizar las siguientes concentraciones: 19.25, 38.5 y 77.0 mg/kg de compuesto tóxico de reerencia (WSDE, 1996). A continuación se presentan los cálculos para determinar la cantidad a preparar de una solución patrón de 2-cloroacetamida a adicionar a 600 g de suelo artificial (200g c/u). Usando la concentración de 38.5 mg/kg. T = W * F * C
donde: T = Cantidad de compuesto tóxico de reerencia a adicionar (mg) W= Peso de la muestra (g) F = Factor de conversión (1kg/1000g) C = Concentración del compuesto tóxico de reerencia (mg/kg) Ejemplo: W = 600 g, C = 38.5 mg/kg
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T = (600 g) (1kg/1000g) (38.5 mg/kg) = 23.1 mg En este caso, 23.1 mg es lo que se necesita para 600 g de suelo, pero es necesario preparar una solución patrón usualmente de 22.5 mg de 2cloroacetamida/mL de agua (se puede utilizar cualquier concentración, tratando de evitar residuos). Si se utiliza la solución patrón propuesta 22.5mg/mL (pesar 4.5 g y disolver en 200 mL de agua), realizar el siguiente cálculo: V=
R S
donde: V = volumen de la solución patrón a adicionar (mL) R = cantidad del compuesto de reerencia a adicionar (mg) S = concentración de la solución patrón (mg/mL) Ejemplo R = 23.1 mg, S = 22.5mg/mL V = (23.1 mg)/(22.5 mg/mL) = 1.03 mL Se debe recordar que es necesario hidratar el suelo en 45%, lo que equivale a adicionar 270 mL de agua. Si se considera que la 2-cloroacetamida de la solución patrón está disuelta en agua entonces se tendría 270 -1.03 = 269 mL de agua por adicionar. Los 269 mL de agua y 1.03 mL de la solución patrón se mezclan en un matraz agitando y se adicionan a los 600 g de suelo. Se mide también el pH y la humedad.
P���������� �� ��� �������� �� ����� D������������ �� ������� Se calcula la humedad inicial para adicionar el agua de hidratación necesaria. Para determinar la humedad se toma una alícuota de 25 g de la muestra de suelo, se coloca en una cápsula de porcelana, previamente preparada a peso constante, y se pesa. Se seca a 103-105 ºC durante 24 horas y posteriormente se coloca en un desecador para enriar. Una vez ría se pesa. La dierencia de pesos nos da el peso seco final (WSDE, 1996).
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Opcionalmente, se puede utilizar una balanza del tipo de Kern MB-3 con capacidad de 50 g para determinar humedad, para lo cual se utiliza 1 g de suelo y 10 minutos más tarde se tiene el resultado en por ciento. Para determinar la humedad del suelo se utiliza la siguiente ecuación:
[ ]
HS =
(A-B) C-(A-B)
*100
donde: HS = humedad de la muestra en % A = peso inicial de la muestra + cápsula (g) B = peso seco final de la muestra + cápsula (g) C = peso de la alícuota inicial (g) Ejemplo: A = 77.168 g, B = 76.448 g, C = 25.078 g HS = (77.168-76.063)/[25.024-(77.168-76.063)]*100 HS = 4.61% H���������� �� �� ������� �� ����� Las muestras se pueden hidratar de 35 a 45%, correspondiente al peso del suelo utilizado en la prueba (WSDE, 1996). Para ello se utiliza la siguiente órmula: HA = T -HS
donde: HA = hidratación necesaria (%) T = humedad que se quiere obtener (%) HS = humedad del suelo (%) Ejemplo T = 45%, HS = 4.6% HA = 45% - 4.6% = 40.4%
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Para determinar la cantidad de agua a adicionar se utiliza la siguiente órmula:
[ ]
V=
W * HA 100
*F
donde: V = cantidad de agua a adicionar (mL) W = peso de la muestra (g) HA = hidratación necesaria (%) F = actor de conversión (1 mL/1g) Ejemplo: HA = 40.4%, W = 250 g V = (250 g * 40.4%/100)*(1 mL/1g) = 101 mL
P������������ �� �� ������ P����� �� �������� �� ����� ������ ������ ���� � �� ������ �� �� ���� Para esta prueba se deben lavar los contenedores de vidrio (diámetro de 4.5 cm y altura de 7 cm) con agua caliente y detergente, se deben enjuagar y dejar secar. Cortar papel filtro con 4 cm de ancho por 15 cm de longitud según el rasco y depositarlo en él, no debe exceder del borde del rasco. Se debe realizar una prueba de humedad con papel filtro, para lo cual se preparan cuando menos 5 viales con dierentes cantidades de agua (1 a 5.5 mL) y se deposita una lombriz en cada uno de ellos. La cantidad de agua a adicionar, previo a la prueba, será la correspondiente a la mínima cantidad de agua en donde la mortalidad corresponda a 0. La sustancia problema se disuelve en agua o en un disolvente orgánico (acetona o diclorometano) para dar una concentración conocida. Se deposita 1 mL de esta solución problema en el papel filtro (con micropipeta), cuidando que se distribuya homogéneamente, y se seca por rotación del rasco con papel filtro (figura 14.1).
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Los controles son: papel filtro con agua deionizada o destilada y papel filtro impregnado del disolvente seleccionado y secado. Después de secado el papel filtro, se adiciona en cada vial de 1 a 5.5 mL de agua deionizada o destilada (de acuerdo a los resultados de humedad del papel filtro explicado previamente), cada vial es tapado con tela (organza) y con papel aluminio que se ha perorado para obtener orificios que permitan preservar la humedad y acilitar el intercambio de aire. Figura 14.1. Secuencia general de la prueba con papel filtro con lombriz de tierra
Papel filtro
Frasco lavado y seco
Adicionar solvente con el compuesto a probar
Secar con campana
Adicionar agua destilada o desionizada
Depositar la lombriz lavada, secada y pesada
E������ Concentraciones a utilizar:
Cantidad aplicada al papel filtro (mg/cm2) 1.0 0.1 0.01 0.001 0.0001
Concentración de la solución aplicada (g/mL) 7 x 10-2 7 x 10-3 7 x 10-4 7 x 10-5 7 x 10-6
En este ejemplo 70 mg /70cm 2 = 1.0 mg/ cm 2, el área depende del tamaño del papel y del rasco, al igual que la concentración. Las concentraciones a emplear no deben ser menos de cinco. Para cada tratamiento o nivel de concentración se preparan 10 réplicas. Una lombriz se coloca en cada rasco, depositándola sobre el papel filtro húmedo. Antes de ser colocadas en los viales, las lombrices son depositadas por tres horas en papel filtro humedecido, con la finalidad de vaciar sus intestinos; después son lavadas y secadas. Los viales son colocados en orma horizontal
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en la oscuridad, a una temperatura de 20 ± 2 ºC, durante un período de 48 horas, y opcionalmente hasta 72 horas. Las lombrices se consideran muertas cuando no responden a ningún estímulo mecánico. Cualquier síntoma patológico se reporta. Esta prueba es rápida y nos indica las concentraciones a utilizar en la prueba de 14 días. Para adicionar la sustancia problema al papel filtro, se realiza previamente una extracción de la misma del suelo contaminado, determinando su concentración y procediendo a realizar diluciones si es necesario, tomando como solución madre a la concentración inicial del suelo. P����� ��� ����� ����������� � ����� ���������� Se determina la humedad del suelo contaminado, se pesan 250 g y se depositan en un rasco de vidrio, ajustando la humedad; se preparan un total de 4 réplicas. La duración de la prueba es de 14 días, realizando una evaluación a los 7 días. La temperatura debe mantenerse a 20 ± 2º C, con luz continua, con la inalidad de asegurarse que las lombrices se encuentran en todas partes del medio. La mortalidad se evalúa después de 7 días, por vaciamiento del medio en un recipiente de vidrio, separando las lombrices y observando sus reacciones a los estímulos mecánicos: Posteriormente, se vuelven a depositar en su contenedor hasta su evaluación final a los 14 días. Para cuantificar la mortalidad se analiza cada contenedor, contándose las lombrices. Por ejemplo: en el contenedor de la concentración 1, réplica 1, se depositan 10 lombrices al inicio de la prueba, si al final se cuentan 5 lombrices, se anota el resultado; a continuación, se cuentan las 4 réplicas siguientes y para calcular CL 50 se utiliza el siguiente sofware: www.igv.kvl.dk/download/sofware. Al término de la prueba se determina la humedad y el pH. Control
El control puede consistir en suelo no contaminado de la misma textura que la muestra, al que se ajusta la humedad de la misma orma en que se procedió para la muestra. También se puede utilizar como control suelo artificial, previo ajuste de humedad y pH. En cualquiera de los dos casos se colocan 4 réplicas, cada una de 250 g. Se adicionan 10 lombrices libres de alimento, para lo cual 3 horas antes se colocan en un contenedor de vidrio cubierto con papel filtro humedecido con agua destilada o desionizada. Las lombrices se lavan, se secan y pesan.
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Al igual que a la muestra, a los controles también se les determina la humedad y el pH al finalizar la prueba. Suelo artificial
La OECD (1984) describe una prueba con suelo artificial de la misma composición que la proporcionada en el listado de reactivos y soluciones. Éste puede ser utilizado para suelos muy arcillosos en los que el movimiento de la lombriz se dificulte por la textura del suelo. En este caso se utiliza el extracto del suelo contaminado. Como controles se tienen, además del suelo humedecido, un suelo al que se le ha adicionado el disolvente utilizado en la extracción (acetona, diclorometano, etc.) con la finalidad de corroborar el eecto del disolvente sobre el organismo prueba. Prueba de toxicidad directa
La determinación denominada directa se puede utilizar para suelos contaminados y aquellos que se encuentran sujetos a bioremediación, para lo cual se pesan 200g de suelo problema, se ajusta con 10% de tierra de hoja y 15% de arena de río. Se ajusta la humedad y el pH de la manera descrita anteriormente (previamente se ha determinado humedad y pH). Se colocan cuando menos 5 contenedores de vidrio, depositando en cada uno de ellos 10 lombrices cliteladas, con el intestino limpio, lavadas, secadas y pesadas. Las lombrices se dejan a 20 ± 2 ºC (también pueden dejarse a una temperatura de 24 ± 2 ºC, sin que se observe eecto por la temperatura). El control puede ser suelo artificial sin contaminante o suelo cercano al sitio de recolección de la muestra, que no contenga el contaminante. Se revisa al día 7 y al día 14, las lombrices se sacan, cuentan, lavan, secan y pesan.
E�������� �� ���������� Los datos de concentración/mortalidad se utilizan para calcular la concentración letal media o CL 50, la cual se puede determinar por el método Probit o Trimmed-Spearman, según sea el caso. Para ello, se puede utilizar el sofware proporcionado por la USEPA.
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R������ �� �� ������ En el reporte del ensayo debe incluirse la siguiente inormación: • Los datos del compuesto que se probó • Las características del organismo de prueba, incluyendo la edad, condiciones de cultivo, uente de alimento, número de lombrices utilizadas por réplica • Las condiciones de la prueba, así como cualquier variación de las condiciones de la misma. • La preparación del medio. Esto es, si hay alguna variación en la orma de preparación del suelo artificial o de la muestra de suelo contaminado, así como si existe variación en la cantidad de suelo • Los resultados del peso promedio de los organismos al inicio y final de la prueba. Así como una descripción de cambios ísicos o patológicos observados en los organismos
Figura 14.2. Diagrama de flujo del ensayo de toxicidad aguda con Eisenia andrei Prueba en papel filtro (48-72 horas)
Suelo (14 días) Extracción de la sustancia problema
Suelo contaminado 4 réplicas por concentración + 10 lombrices en c/u
Control: suelo sin contaminante + agua destilada o deionizada; también se puede utilizar suelo artificial 4 réplicas + 10 lombrices en c/u
Suelo artificial 4 réplicas por concentración + 10 lombrices en c/u
Controles: 1) Suelo artificial + agua destilada o deionizada 2) Suelo artificial + disolvente utilizado 4 réplicas + 10 lombrices en cada uno
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• Los valores de humedad y pH del suelo y control, al inicio y final de la prueba • El método usado para calcular la CL 50, incluyendo los datos y resultados de la prueba. Los valores de mortalidad en el control y en las muestras tratadas con la sustancia de prueba. La concentración más alta que no causa mortalidad y la concentración más baja que ocasiona 100% de mortalidad. Tabla 14.1. Condiciones recomendadas para las pruebas de toxicidad aguda con Eisenia andrei Duración del bioensayo Temperatura Fotoperíodo Contenedores Cantidad requerida de muestra de suelo Cantidad requerida por réplica Humedad del suelo Organismo prueba Edad del organismo Número de organismos por réplica Número de réplicas pH del suelo Régimen de alimentación Respuesta a medir Control positivo Control negativo
14 días 20 ± 2 ºC 24 horas, usando luz ambiental(400 luxes) Frascos de vidrio 1000 g 200 – 250 g 35 – 45 % Eisenia andrei
> 2 meses (clitelada) 10 4 5 – 9, no realizar la prueba si el rango no es aceptable No alimentar durante la prueba Supervivencia, alteraciones morológicas 2-cloroacetamida Suelo artificial o suelo blanco no contaminado
B����������� Cuevas, D. M. C., C. Ferrera, L. E. Ríos y V. R. Rodríquez. 2006. Respuesta de Eisenia andrei a TPH´s y pireno en pruebas agudas. En: Congreso de Ecotoxicología y Química Ambiental . Memorias. 24-28 abril 2006. Puebla, pp. 78. Domínguez, J., A. Velando y A. Ferreiro. 2005. Are Eisenia fétida (Savigny, 1826) and Eisenia andrei Bouche (1972) (Oligochaeta, Lumbricidae) differentt biological species? Pedobiologia 49: 81-87.
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Dorn, P. B., T. E. Vipond J. P. Salanitro y H. L. Wisniewksi. 1998. Assessment o the acute toxicity o crude oils in soil using earthworms, microtox and plants. Chemosphere 37(5):845-860. Fragoso, G. C. 2002. Las lombrices de tierra en México: diversidad, distribución y manejo. II Simposium Internacional y Reunión Nacional Lombricultura y abonos orgánicos. Hamilton, M.A., Russo, R.C. y urson, R.V. 1977. Trimmed Spearman-Karber method or estimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environmental Science. Technology 11(7): 714-719 Kaplan, D. L., R. Hartenstein, E. F. Neuhauser y M .R. Maleckit. 1980. Physicochemical requirements in the environment o the earthworm Eisenia foetida. Soil Biology and Biochemistry 12: 347-352. Organization or Economic Cooperation and Development (OECD). 1984. Earthworm, acute toxicity tests. Guideline or testing o chemicals N° 207 (adoptado en april de 1984). OCDE, París, 9 pp. Rida, A. M. y M. Bouché. 1997. Earthworm toxicology: rom acute to chronic test. Soil Biology Biochemistry 29(3, 4): 669-703. Ronco, A. y M. C. Díaz Baez. 2004. Interpretación y manejo de resultados En: G. Castillo (ed.). Ensayos toxicológicos y métodos de evaluación de calidad de aguas. IDRC Books, Canadá. pp 141-149. Disponible en: http://www.idrc.ca/en/ev66572-201-1-DO_TOPIC.html. Santamaría, R. S. 1996. Aspectos biotecnológicos del proceso de vermicomposteo y su aplicación agronómica. Tesis para obtener el título de de Ingeniero Agrónomo. Facultad de Ciencias Agrícolas. Universidad Veracruzana, México. Santamaría, R. S. y C. R. Ferrera. 2002. Dinámica Poblacional de Eisenia andrei (Bouche 1972) en dierentes residuos orgánicos. Terra 20(3): 303-310. Washington State Department o Ecology (WSDE). 1996. Publication No. 96-327. Earthworm Bioassay protocol or soil toxicity screening. Wilson, J. J., J. Hathcer y J. S. Goudey. 2002. Ecotoxicological endpoints or contaminated site remediation. Annalli dell’ Istituto Superiore di Sanitá 38(2): 143-147.
