Biosenzori Bibliografie 1.
B. Eggins, Biosensors. An Introduction, Ed. Willey Teubner, 1996.
2.
L. Kekedy, Senzori elecrochimici metalici ionselectivi, Ed. Academiei, Bucureşti, 1987.
3.
X. Zhang, H. JU, and J. Wang, Electrochemical Sensors, Biosensors and Their Biomedical Applications, Ed. Elsevier, 2008.
Biosenzori
şi
1
§1. Introducere 1.1. Definiția biosenzorului. Structura. Parametrii. Biosenzorul este un circuit analitic care convertește un răspuns biologic într-un semnal electric. Este folosit pentru determinarea concentrațiilor substanțelor și a unor parametri biologici. Este alcătuit din trei părți: elementul biologic sensibil, traductorul și electronica pentru prelucrarea semnalelor.
12/3/2010
Biosenzori
1
2
r Structura unui biosenzor
(a) bio-reacție – transformă substratul (S) în produs (P); (b) traductor – determină reacția și o transformă într-un semnal electric; (c) amplificator – amplifică semnalul electric; (d) circuit de prelucrare a semnalelor - prelucrarea semnalului electric amplificat; (e) dispozitiv de afișare – afișarea rezultatului prelucrării semnalului. 12/3/2010
Biosenzori
3
r Exemplu de biosenzor : nasul Structura nazal
sistemului
olfactiv
Nările preiau un eșantion de miros, care este apoi sesizat de membrana olfactivă (elementul biologic). Răspunsurile membranei olfactive sunt convertite de către celula nevoasă olfactivă (traductorul) în semnale electrice, care sunt transmise dealungul fibrelor nervoase creierului pentru interpretare. Astfel, creierul se comportă ca un microprocesor (circuit de prelucrare a semnalelor), transformând semnalul într-o senzație, pe care o numim miros. 12/3/2010
Biosenzori
2
4
m Substratul (analitul) • Orice substanță care este consumată sau produsă într-un proces biochimic poate fi, în principiu, analizată de un bisenzor construit în acest scop. • Exemple: zaharuri, urea, creatina, etanolul, acidul glutamic, acidul lactic, fosfatul, colesterolul, penicilina, paracetamolul, aspirina, TNT, diferiți aminoacizi.
m Elementul biologic sensibil • Importanța elementului biologic constă în faptul că interacțiunea sa cu substratul este în cea mai mare parte realizată doar cu acesta, fără influența (interferența) altor substanțe. Elementul biologic poate cataliza o reacție implicând substratul (enzima) sau se poate lega selectiv cu substratul (anticorpi). • Exemple: enzime sau componente care conțin enzime (microorganisme și țesuturi), anticorpi, acizi nucleici. 12/3/2010
Biosenzori
5
m Traductoare - Electrochimice: (a) Potențiometrice Implică măsurarea potențialului unei celule la curent egal cu zero. Potențialul este proporțional cu logaritmul concentrației substanței care trebuie determinată. (b) Voltametrice O creștere (descreștere) de potențial este aplicată celulei până la oxidarea substanței analizate. În acestă situație apare o creștere (descreștere) a curentului prin celulă. Înălțimea vârfului de curent este proporțională cu concentrația materialului electroactiv. Dacă potențialul corespunzător oxidării este cunoscut, mărimea analizată este curentul. Acest mod este cunoscut sub numele de amperometric. (c) Conductimetrici Soluțiile care conțin ioni conduc electricitatea. Valoarea conductivității depinde de reacția chimică sau biologică. Relația dintre concentrație și conductanță depinde de natura reacției. 12/3/2010
Biosenzori
3
6
- Senzori bazați pe tranzistoarele cu efect de câmp (FET – Field Effect Transistor ) Miniaturizarea poate fi obținută prin realizarea unora dintre senzorii precizați anterior (cel mai adesea senzorii potențiometrici, dar și pentru cei voltametrici sau conductimetrici) pe cipul unui tranzistor FET. - Optice Sunt bazate pe tehnicile: absoția spectroscopică, spectroscopia fluorescentă, spectroscopia luminișcentă, spectroscopia reflexiei interne, împrăștierea luminii. - Piezoelectrice Acestea implică generarea unor curenți electrici într-un cristal care vibrează. Frecvența vibrației este afectată de masa materialului absorbit în suprafața sa, care poate fi legată la o reacție biochimică activă. - Unde acustice de suprafață - Metode termice Procesele chimice și biochimice implică producerea sau absoția de căldură. Aceasta poate fi măsurată cu termistoare și, astfel, legată de o parte a reacției. 12/3/2010
Biosenzori
7
r Parametrii unui biosenzor - Selectivitatea: - indică abilitatea de a deosebi diferite substraturi. Este, în principal, o funcție a elementului biologic. - Domeniul de sensibilitate: - în general este ordinul sub-milimolar, dar poate coborî, în cazuri speciale, la ordinul femtomolar (10-15 M). - Precizia: - în general este în jurul valorii de ± 5 %. - Natura soluției: - condiții precum indicele pH, temperatura, forța ionică, care trebuie considerate. - Comportarea dinamică: - timpul de răspuns – timpul necesar pentru a ajunge la 95% din răspuns (poate fi 30 s sau mai mare); - timpul de revenire – timpul necesar biosenzorului pentru a putea fi gata pentru analizarea unui nou eșantion (nu trebuie să depășească câteva minute); - durata de funționare – este determinată de instabilitatea elementului biologic (poate varia de la câteva zile la câteva luni). Exemplu: biosenzorul pentru măsurarea glucozei în sânge – 1 an. 12/3/2010
Biosenzori
4
8
r Metode de imobilizare a elementului biologic de traductor • Elementul biologic trebuie să fie conectat cât mai bine de traductor. Sunt mai multe metode de realizare a acestui lucru: - Metoda adsorției la suprafață − este cea mai simplă metodă
- Microîncapsularea – prinderea se face între membrane. Este cea mai veche metodă (este folosită pentru biosenzorii de măsurare a glucozei și ureii). - Prinderea “în capcană’” – elementul biologic este prins într-o structură de gel, de pastă sau de polimer. Este cea mai des folosită metodă.
12/3/2010
Biosenzori
9
- Atașare covalentă - între elementul biologic și traductor se realizează legături chimice covalente. - Legătură încrucișată - este utilizat un agent bifuncțional pentru realizarea unei legături între traductor și elementul biologic. Se utilizează, adesea, împreună cu metoda adsorției și a prinderii în capcană.
12/3/2010
Biosenzori
5
10
1.2. Primii biosenzori m Poartă denumirea de biosenzori bazați pe enzime (enzyme-based biosensors).
r Biosenzorul pentru determinarea glucozei în sânge m Primul biosenzor bazat pe enzime a fost senzorul pentru determinarea glucozei în sânge descris de Clark și Lyons (1962). • Glucoza este foarte importantă deoarece este implicată în procesul metabolic. La bolnavii de diabet nu se produce suficientă insulină în pancreas pentru a controla adecvat nivelul de glucoză în sânge. Pentru a elimina acest neajuns se administrează o doză de insulină. De asemenea, este necesar ca bolnavii să-și verifice în mod regulat nivelul glucozei în sânge. • Biosenzorul pentru determinarea glucozei în sânge este cel mai utilizat și, ca urmare, cel mai studiat biosenzor. Cu acest biosenzor pacientul își extrage o mică picătură de sânge, care apoi este analizată pentru determinarea concentrației de glucoză, iar în final rezultatul este afișat pe un dispozitiv. Durata analizei aproximativ 1 minut. 12/3/2010
m
Biosenzori
1
Biosenzorul se bazează pe faptul că enzima glucozoxidaza (GOD – Glucose OxiDase) catalizează oxidarea glucozei în acid gluconic
GOD Glucoză + O2 + H2O
Acid gluconic + H2O2
m În cadrul primilor biosenzori oxigenul a fost utilizat ca agent de oxidare. Consumul de oxigen a fost urmat de o reacție de reducere chimică la electrodul de platină, ca în cazul electrodului de oxigen a lui Clark. La acest electrod reacția este:
O2 + 2e- + 2H+ = H2O2 12/3/2010
Biosenzori
6
2
Structura electrodului oxigen realizat de Clark (1953)
12/3/2010
Biosenzori
3
m O tensiune egală cu –0,7 V este aplicată între catodul de platină și anodul de argint, suficientă pentru a reduce oxigenul, iar apoi curentul prin celulă, care este proporțional cu concentrația de oxigen, este măsurat. Concentrația de glucoză este astfel proporțională cu scăderea curentului (concentrația de oxigen).
12/3/2010
Biosenzori
7
4
Schema biosenzorului cu electrodul oxigen realizat de Clark
Electrodul oxigen are o membrană permeabilă de oxigen (de exemplu polietilenă sau celofan) care acoperă electrozii. Un strat de enzimă (glucozoxidază) este plasat deasupra acestei membrane, urmat de o altă membrană din teflon. 12/3/2010
Biosenzori
5
Schema straturilor biosenzorului cu electrodul oxigen realizat de Clark
M1 = membrană din celofan; M2 = membrană din teflon.
Substratul (soluția de glucoză) și oxigenul pot penetra prima membrană. Acestea reacționează cu enzima și formează produșii. Numai oxigenul care rămâne poate penetra a doua membrană. Acesta este măsurat cu ajutorul electrodului. 12/3/2010
Biosenzori
8
6
r Biosenzorul pentru determinarea ureii m A fost realizat pentru determinarea ureii, care este componenta majoră a urinei. Primul biosenzor a fost realizat de Guibault și Montalvo (1969). m Ureea este hidrolizată de enzima ureează formând amoniacul și dioxidul de carbon
CO(NH2)2 + H2O
12/3/2010
ureează
Biosenzori
CO2 + 2NH3
7
m Concentrația de amoniac este monitorizată prin intermediul unui electrod sensibil la ioni de amoniu. Tensiunea electrodului este măsurată la un curent apropiat de zero. Această tensiune este proporțională cu logaritmul concentrației de amoniac, care este proporțională cu concentrația de uree. m Electrodul sensibil de amoniu este un electrod pH din sticlă modificat. Enzima este amestecată cu un gel și dispusă pe o membrană de nailon care acoperă electrodul. Aceasta este urmată de o a doua membrană.
12/3/2010
Biosenzori
9
8
1.3. Domenii de aplicații ale biosenzorilor m Medicină -
Este principalul domeniu de aplicație. Se utilizează în măsurări ale sângelului, gaze, ioni și diferiți produși metabolici. Acestea sunt necesare pentru determinarea stării metabolice a pacientului – în special pentru pacienții din spitale și mai ales pentru cei aflați la terapie intensivă. Prin utilizarea biosenzorilor se evită efectuarea analizelor de laborator care durează foarte mult – ore sau chiar zile.
m Controlul proceselor industriale Biosenzorii pot fi utilizați în diferite stadii ale proceselor de fermentație: - off-line în laborator; - off-line, dar apropiat de operația efectuată; - on-line, în timp real. - Monitorizările în timp real pentru indicele pH, temperatură, CO2 și O2. - Biosenzori utilizați pentru monitorizarea diferiților reactanți: diferite zaharuri, drojde, malț și alcool. Aplicații în industria alimentară.
-
12/3/2010
Biosenzori
9
m Monitorizarea mediului înconjurător Biosenzorii sunt folosiți, de regulă, pentru analiza aerului, apei și solului. Sunt analizate: aciditatea, pesticidele, îngrășămintele chimice, deșeurile industriale și menajere. - În plus, biosenzorii sunt folosiți și în alte aplicații precum: agricultură (lucrări asupra pămâtului), grădinărit, domeniul veterinar și minerit.
-
12/3/2010
Biosenzori
10
10
§2. Elemente biologice 2.1. Introducere m Elementele biologice furnizează elementul selectiv principal într-un biosenzor. Ele trebuie să fie substanțe care se atașează ele însele cu o substanță particulară și nu cu altele. Materiale care pot realiza acest lucru se împart în patru grupe: enzimele, anticorpii, acizii nucleici și receptorii.
r Enzimele
• Se folosesc cel mai adesea ca elemente biologice. • Pot fi utilizate fie în formă pură, fie prezente în microorganisme sau în părți din țesuturi intacte. • Sunt catalizatori biologici pentru reacții specifice și se pot lega ele însele cu substraturi specifice. Acțiunile catalizatoare sunt utilizate în cadrul biosenzorilor. 12/3/2010
Biosenzori
1
r Anticorpii
• Se leagă cu antigenii corespunzători în scopul eliminării acestora din sfera de acțiune, dar nu au un efect catalizator. • Sunt capabile să dezvolte o sensibilitate foarte ridicată în cadrul biosenzorilor.
r Acizii nucleici • Au fost utilizați mai rar până în prezent. • Operează selectiv datorită caracteristicilor lor de formare de perechi de bază (base-pairing). • Au un mare potențial de utilizare în identificarea dezordinii genetice, în special la copii.
r Receptorii • Înăuntrul membranei de plasmă cu două straturi a lipidei, care înconjoară o celulă, sunt proteine care traversează întreaga lățime a membranei și care au proprietăți de recunoaștere moleculară. Acestea se numesc receptori. • Sunt dificil de izolat, dar realizează o legătură a dizolvanților cu un grad de afinitate și o potrivire specifică a anticorpilor. 12/3/2010
Biosenzori
11
2
2.2. Enzimele m Enzima este o macromoleculă complexă cu conținut mare de proteină, uzual conținând un grup proteic, care include adesea unul sau mai mulți atomi de metal. m La multe enzime, în special la cele utilizate în biosenzori, modul de acțiune implică reacții de oxidare sau de reducere, care pot fi detectate electrochimic.
12/3/2010
Biosenzori
3
m Reacția catalitică la care participă o enzima E și substratul S
k1 S+E
ES
k2
E+P
k-1
k1, k-1, k2 = constante de viteză chimică de reacție La ciocnirea (cu o anumită viteză și sub un anumit unghi) unei moleculei de enzimă E cu o moleculă de substrat S se formează o moleculă de compus intermediar enzimă-substrat notat ES (enzima se “atașează” substratului). Moleculele ES pot da naștere unui produs P cu eliberarea enzimei E. Enzima joacă, astfel, rolul de catalizator pentru transformarea substratului S în produsul P.
12/3/2010
Biosenzori
12
4
m Exemplu: Glucoză + O2 + GOD
ES
Acid gluconic + H2O2
S = Glucoză + O2 E = Glucozoxidază (GOD) P = Acid gluconic + H2O2
12/3/2010
Biosenzori
5
m Modelul matematic al reacției enzimatice este constituit dintrun sistem neliniar cu două ecuații diferențiale, neliniaritatea fiind de tip biliniar. m Pentru rezolvarea sistemului se consideră ipoteza: concentrația complexului enzimă-substrat este constantă. Astfel, viteza de formare a complexului din componentele sale este echilibrată de viteza de descompunere înapoi în enzimă și înainte în produs. m Ipoteza este plauzibilă dacă avem o concentrație mult mai mare a substratului în raport cu enzima, ceea ce este în concordanță cu realitatea.
12/3/2010
Biosenzori
13
6
Viteza de formare a complexului = k1[S][E] – k-1[ES] Viteza de descompunere a complexului = k2[ES] • Datorită ipotezei avem:
k1[S][E] – k-1[ES] – k2[ES] = 0 • Vom descrie concentrația enzimei în termeni totali:
[E0] = [E] + [ES] k1[S][E0] – k1[S] [ES] – k-1[ES] – k2[ES] = 0
12/3/2010
Biosenzori
[ES ] =
7
k1 [E 0 ][S ] k −1 + k 2 + k1 [S ]
• KM = (k-1 + k2)/k1 – constanta Michaelis
[ES ] = [E0 ][S ] K M + [S ] • Viteza chimică totală de reacție (viteza de formare a produsului) este dată de ecuația Michaelis – Menton:
ν=
12/3/2010
k [E ][S ] d [P ] d [S ] =− = k 2 [ES ] = 2 0 dt dt K M + [S ]
Biosenzori
14
8
• Dacă [S] >> KM, atunci viteza chimică de reacție este maximă:
V max = k 2 [E 0 ] • Dacă [S] = KM, atunci ν = Vmax/2
12/3/2010
Biosenzori
9
• Pentru a obține grafic o dreaptă se determină inversa ecuației Michaelis – Menton:
1 /ν =
K M + [S ] KM K 1 = + = M k 2 [E0 ][S ] k 2 [E0 ][S ] Vmax Vmax
1 1 + [S ] Vmax
• Graficul 1/ν = f(1/[S]) este o dreaptă cu panta KM/Vmax și decalajul 1/Vmax. Ca urmare, valorile pentru KM și Vmax pot fi determinate.
12/3/2010
Biosenzori
15
10
2.2.1. Exemple de biosenzori bazați pe enzime
r Ureea • Reacția de descompunere hidrolitică a ureii este catalizată de enzima ureează, obținându-se amoniacul și dioxidul de carbon:
CO(NH2)2 + H2O
ureează
CO2 + 2NH3
• Reacția este, în general, urmărită în funcție de potențial cu ajutorul unui electrod sensibil la ioni de amoniac, care poate detecta ≈ 10-6 M de amoniac.
12/3/2010
Biosenzori
11
m Performanțe: • Domeniu: 3 x 10-5 – 5 x 10-2 M; • Timpul de răspuns: 1 – 5 minute; • Timpul de revenire: 5 – 10 minute; • Durata de funcționare: 60 zile.
12/3/2010
Biosenzori
16
12
r Glucoză •
Reacția de oxidare a glucozei de către oxigenul molecular, catalizată de enzima glucozoxidază (GOD), care conduce la obținerea acidului gluconic și a apei oxigenate:
GOD Glucoză + O2
Acid gluconic + H2O2
• Reacția a fost inițial urmărită cu ajutorul electrodului oxigen a lui Clark, care monitorizează pe baza curentului descreșterea concentrației de oxigen.
12/3/2010
Biosenzori
13
m Performanțe: • Domeniu: < 1 - 30 mM; • Timpul de răspuns: 1 – 1,5 minute; • Timpul de revenire: 30 secunde; • Durata de funcționare: câteva luni.
12/3/2010
Biosenzori
17
14
2.2.2. Avantajele și dezavantajele enzimelor m Avantaje: • Se leagă de substrat. • Au o sensibilitate ridicată. • Acționează ca și catalizatori, ceea ce conduce la creșterea sensibilității. • Acțiunea lor este relativ rapidă. • Sunt cele mai utilizate componente biologice.
12/3/2010
Biosenzori
15
m Dezavantaje: • Sunt scumpe. Prețul de extragere, izolare și purificare a enzimelor este foarte ridicat, iar uneori și prețul sursei de proveniență este ridicat. Cu toate acestea, un număr mare de diferite enzime este disponibil pe piață. • Imobilizarea cu traductorul conduce la o pierdere a acțiunii lor. • Într-un interval de timp relativ scurt acțiunea lor tinde să se piardă conducând la dezactivare.
12/3/2010
Biosenzori
18
16
2.3. Țesuturile m Țesuturile din plante și animale pot fi utilizate direct, fiind necesară doar o minimă preparare. m În general țesuturile conțin mai multe enzime, și de aceea, nu pot fi așa de sensibile ca și enzimele purificate. Cu toate acestea, enzimele se găsesc în starea lor naturală și, astfel, sunt mai puțin supuse la degradare. Ca urmare, biosenzorii care folosesc țesuturile ca element biologic au un timp de funcționare mai mare. m Răspunsul lor este mai lent atunci când se folosește o cantitate mai mare de țesut pentru substrat. În acest caz cantitatea de țesut diluează (reduce) efectul enzimelor. m Sunt mai stabile la acțiunea dizolvanților si la modificările de temperatură și pH. 12/3/2010
Biosenzori
1
m Avantaje: • Enzimele sunt menținute în mediul lor natural. • Activitatea enzimei este stabilizată. • Uneori pot funcționa acolo unde enzimele purificate nu pot funcționa. • Sunt mai ieftine decât cele care utilizează enzime purificate.
m Dezavantaj: • Poate avea loc un proces de interferență, care conduce la reducerea sensibilității.
12/3/2010
Biosenzori
19
2
m Exemple: 1.
Arginina este un amino acid complex care este, adesea, găsit în formă activă (sau catalitică) în proteine și enzime. Cu toate că este considerată un amino acid esențial, care se obține din dietă, acest lucru este adevărat doar în perioada juvenilă. Arginina se află în proteine în procent de aproximativ 4,7% într-o cantitate egală cu un mol. Surse naturale de arginină: orez brun, nuci, popcorn, struguri și toate produsele din grâu.
12/3/2010
Biosenzori
3
Arginina
12/3/2010
Biosenzori
20
4
Arginina este descompusă, folosind un țesut din ficat de bovină, în uree și ornitină. Ureea este, apoi, determinată cu ajutorul unui biosenzor potențiometric care utilizează enzima ureează. ficat de bovină
arginină
uree + ornitină ureează
uree + 2H2O
12/3/2010
2.
2NH4+ + HCO3-
Biosenzori
5
Glutamina este cel mai abundent amino acid liber în corpul uman. Ea constituie 50-60% din totalul amino acizilor liberi din muschiul scheletic și aproximativ 20% din plasma de amino acizi. Ea este esențială în multe funcții homeostatice, care includ echilibrul pH și al fluidului corpului, reglarea temperaturii și a ritmului cardiac, precum și în funcținarea optimă a mai multor țesuturi ale corpului, în particular sistemul imun și intestinul. Glutamina este implicată în transportul nitrogenului de la un organ la altul și influențează direct balanța de sinteză a proteinelor și degradare a proteinelor. Glutamina se găsește în majoritatea surselor de proteină din animale și plante.
12/3/2010
Biosenzori
21
6
Locurile de producere și de utilizarea a glutaminei în corpul uman
12/3/2010
Biosenzori
7
Glutamina este descompusă, folosind un țesut din ficat de porc, în amoniac și acid glutamic. Amoniacul este, apoi, măsurat folosind un electrod sensibil la ioni de amoniac.
ficat de porc
glutamina + H2O
12/3/2010
NH3 + glutamat
Biosenzori
22
8
3.
Determinarea nivelului de dopamină din creier. Dopamina este un derivat catecol.
12/3/2010
m
m
m
Biosenzori
9
Țesutul din banană (la fel ca și țesuturile din măr, castravete și ciupercă) conțin polifenolaza. Aceasta catalizează oxidarea moleculelor, care conțin grupuri catecol, în o-chinonă. Biosenzorul pentru măsurarea dopaminei este bazat pe un țesut din banană. Enzima polifenol oxidază din țesutul din banană catalizează oxidarea formei dihidroxid a dopaminei în forma chinonă utilizând oxigenul din mediul ambiant. Reacția de reducere a chinonei înapoi în forma dihidroxid conduce la apariția unui curent, care este proporțional cu concentrația de dopamină. Biosenzorul conține un electrod de pastă de carbon. La acest electrod se realizează un amestec de pulbere de grafit cu ulei de parafină (Nujol) și se formează o pastă densă. În plus, la acest biosenzor, țesutul din banană este amestecat cu această pastă. Această pastă este, apoi, introdusă în suportul în care se află electrodul.
12/3/2010
Biosenzori
23
10
Structura biosenzorului
12/3/2010
Biosenzori
11
m Alte exemple în care se utilizează țesuturile:
12/3/2010
Biosenzori
24
12
2.4. Microorganismele m Microorganismele joacă un rol important în multe procese biotehnologice, cum ar fi de exemplu: producerea berii, sinteza farmaceutică, realizarea produselor alimentare, tratarea apei reziduale și producerea energiei. Pentru monitorizarea acestor procese au fost realizați mai mulți biosenzori, bazați pe microorganisme imobilizate pe traductor. m Microorganismele pot asimila compuși organici, care conduc la o modificare a activității respiratorii și pot produce produși metabolici electroactivi.
12/3/2010
Biosenzori
13
m Avantaje: • Sunt surse mai ieftine de enzime în comparație cu enzimele izolate. • Sunt mai puțin sensibile la acțiunea dizolvanților și mai tolerante la modificările pH și ale temperaturii. • Au o durată de funcționare mai mare.
m Dezavantaje: • Au, câteodată, un timp de răspuns mai mare. • Au un timp de revenire mare. • La fel ca și țesuturile, ele conțin, adesea, multe enzime și, astfel, pot avea o sensibilitate mai mică. 12/3/2010
Biosenzori
25
14
m Exemple: 1.
In procesul de fermentație a melasei trestiei de zahăr, care conține diferite zaharuri, este important să se determine toate zaharurile asimilate. Acest lucru poate fi realizat folosind toate celulele ale bacteriei Brevibacterium lactofermentum imobilizată pe electrodul oxigen.
2.
Biosenzorul pentru măsurarea glucozei poate fi realizat utlizând bacteria Pseudomonas fluorescens imobilizată pe electrodul oxigen. Schema acestui biosenzor este prezentată în figura următoare.
12/3/2010
Biosenzori
15
a – anod; b – catod de platină; c, d – inele de cauciuc; e – gel electrolit; f – membrană; g – microorganisme reținute pe plasa de nailon; h – membrană de celofan.
12/3/2010
Biosenzori
26
16
3.
Biosenzor pentru determinarea etanolului sau a acidului acetic - care utilizează bacteria Trichosporon brassicae și un senzor de măsurare a oxigenului pentru etanol sau acidul acetic. Pentru determinarea acidului acetic indicele pH este menținut la o valoare mai mică decât constanta de disociere a acidului acetic pKa (= 4,75) pentru ca ionii de acetat să nu treacă prin membrană. Trebuie remarcat faptul că nu există răspuns la compuși volatili cum ar fi de exemplu acidul formic sau metanolul, sau la nutrieți cum ar fi fosfatul sau glucoza. În schimb, există inteferențe de la acidul propionic, acidul butanoic sau etanol, dar aceștia nu sunt, în general, prezenți în procesul de fermentație. În modul alcool indicele pH este menținut sub valoarea de 6 pentru ca acidul acetic, acidul propionic, etc. să fie în starea lor de ionizare și să nu poată trece prin membrană. Acest biosezor are o mare sensibilitate. A fost realizat comercial în Japonia.
12/3/2010
Biosenzori
17
m Alți biosenzori în care se utilizează microorganisme:
12/3/2010
Biosenzori
27
18
2.5. Mitocondria m Mitocondria sunt particule multi-enzime subcelulare care pot fi utilizate ca și componente biocatalitice. m Ele pot fi, uneori, utile în îmbunătațirea răspunsului biosenzorului și a sensibilității acestuia, atunci când întregul țesut își pierde din proprietățile necesare.
12/3/2010
Biosenzori
19
r Caracteristicile biosenzorilor care măsoară nivelul de glutamină realizați folosind: enzime izolate, mitocondria, bacterie și țesut din ficat de porc
12/3/2010
Biosenzori
28
20
m Concluzii: • Sensibilitatea (panta în mV/decadă) cea mai redusă este obținută în cazul utilizării enzimelor izolate. În celelalte cazuri este mai mare, dar nu depășeste niciodată valoarea Nernst (59 mV/decadă). • Răspunsurile în termeni de limite de detecție și domeniu liniar sunt similare. Cel mai peformant este biosenzorul care utilizează un țesut din ficat de porc. • Timpul de răspuns este lung în toate cazurile. Cel mai mare este în cazul biosenzorului care utilizează un țesut din ficat de porc. • Durata de funcționare cea mai mică o are biosenzorul care utilizează enzimele izolate, iar cea mai mare o are cel care utilizează un țesut din ficat de porc.
12/3/2010
Biosenzori
21
2.6. Anticorpi m Organismele dezvoltă anticorpi (Ac). Acestea sunt proteine care se pot lega cu un antigen (Ag), legătură fiind reversibilă:
Ac + Ag
Ac · Ag
m Interacțiunea anticorp – antigen este similară cu interacțiunea dintre o enzimă și substratul ei, cu deosebirea că aceasta din urmă nu este reversibilă. În plus, anticorpii se leagă cu o mai mare putere și o mai mare specificitate cu antigenul corespunzător decât enzimele cu substraturile lor.
12/3/2010
Biosenzori
29
1
m Forțele care intervin la realizarea legăturii dintre anticorp și antigen sunt exclusiv necovalente. Forța tuturor interacțiunilor necovalente este denumită afinitate. m Anticorpii cu afinitate scăzută pentru un anumit antigen tind să se lege slab la acesta și să se disocieze repede. Asocierea celor două componente poate fi caracterizată printr-o constată de asociere Ka, iar disocierea printr-o altă constată, numită constantă de disociere Kd. Cele două constante sunt invers proporținale (Ka = 1/Kd). m Constanta Ka reprezintă și constanta de echilibru a reacției. Este dată de relația:
Ka = [Ag· Ac]/[Ag]·[Ac] m Ka se exprimă în M/litru sau M-1. 12/3/2010
Biosenzori
2
m Rata de disociere Kd reprezintă o măsură cantitativă a stabilității complexului respectiv. Ea se exprimă în M/litru sau M. m Cu toate că nu au o activitate catalitică ca și enzimele, anticorpii sunt ultra - sensibili. m Anticorpii se folosesc, adesea, în forme etichetate. m Anticorpii necunoscuți pot fi determinați utilizând anticorpi etichetați. Etichetarea poate fi realizată folosind radioizotopi, enzime, celule roșii, sonde fluorescente sau sonde chemiluminiscente (chemiluminiscență = lumina obținută în urma unei reacții chimice fără producere de căldură). m Anticorpii au fost utilizați în imunodozări. 12/3/2010
Biosenzori
30
3
m Avantaje: • Sunt foarte selectivi. • Sunt ultra-sensibili. • Se leagă foarte puternic.
m Dezavantaj: • Nu au un efect catalitic.
12/3/2010
Biosenzori
4
m Putem clasifica imunodozările enzimă legată în funcție de metoda electroanalitică utilizată.
r Analiza amperometrică bazată pe electrodul oxigen al lui Clark m Un exemplu este determinarea gonodotrofinei corionice (hCG) utilizând catalaza etichetată hCG. Gonodotrofina corionică este un hormon secretat de către placentă în timpul primelor luni de sarcină. m Un anticorp a fost imobilizat pe membrana de celuloză, care este, apoi, plasat deasupra membranei din PTFE (politetrafluoretilenă) a electrodului oxigen.
12/3/2010
Biosenzori
31
5
Senzorul amperometric hCG
m Ambele hCG etichetat și neetichetat sunt în competiție pentru anticorpul imobilizat în membrană. m Membrana este, apoi, spălată pentru a elimina legătura de la hCG liber. m Electrodul este expus la soluția de apă oxigenată (peroxid de hidrogen), care produce oxigenul și catalaza. Oxigenul este, apoi, măsurat folosind electrodul oxigen. 12/3/2010
Biosenzori
6
r Imunodozări enzimă legată amperometrice m Un exemplu este serul orosomucoid (hso) etichetat cu fosfataza alcalină (AP). m Serul orosomucoid este acidul glicoproteinic α-1 (α-globulinele plasmei sanguine). m Există o reacție competitivă între anticorp și hso imobilizat pe suprafața unei cuvette și enzima etichetată hso. Aceasta este eliminată și substratul fosfat de fenil este adăugat:
fosfat + fenol
fosfat de fenil + H2O
m Concentrația fenolului este măsurată prin oxidare electrochimică la electrodul pastă de carbon. 12/3/2010
Biosenzori
32
7
r Imunodozări potențiometrice m Dezvoltarea biosenzorilor bazați pe anticorpi care utilizează traductoare potențiometrice a fost lentă și cu multe probleme. Cu toate acestea, au fost realizate câteva exemple de astfel de bionsenzori cu performanțe satisfăcătoare. m Un exemplu este determinarea estradiolului 17β, ultilizând un electrod sensibil la ioni de iodură. Estradiolul 17β este un hormon mai mult specific femeilor (la bărbați există în niveluri scăzute), care reprezintă majoritatea esterogenului. Are efect asupra oaselor. m Anti-estradiolul 17β a fost imobilizat pe o membrană de gelatină pe suprafața electrodului sensibil la ioni de iodură. m Analiza a fost realizată pe baza competiției dintre peroxidaza etichetată antigen și eșantionul antigen. 12/3/2010
Biosenzori
8
Determinarea estradiolului 17β
12/3/2010
Biosenzori
33
9
m Cantitatea de eșantion antigen este invers proporțională cu cea a antigenului etichetat. m Antigenul etichetat este determinat prin adăugarea de H2O2 și iodură, care apoi este convertită în iodură în prezența peroxidazei. m Electrodul sensibil la ioni măsoară iodura. Se obține un grafic de calibrare al t.e.m în funcției de log[estradiol].
12/3/2010
Biosenzori
10
2.7. Acizi nucleici m Acizii nucleici operează în multe cazuri ca și anticorpii. Perechile de bază (perechi de nucleotide) specifice dintre direcțiile de acțiune a acizilor nucleici conduc la creșterea codului genetic care determină obținerea de replici ale caracteristicilor tuturor părților celulelor vii și, astfel, a caracteristicilor moștenite ale membrilor individuali ai unei specii. m Testele DNA pot fi utilizate pentru determinarea bolilor genetice, cancerului și infecțiilor virale. Ele sunt utilizate fie în forme sintetice ‘scurte’ sau în forme ‘lungi’ produse prin clonare. La fel ca anticorpii, o analiză DNA necesită, adesea, adăugarea în cadrul analizei de DNA etichetate. Acestea pot fi radioactive, fotometrice, enzimice sau electroactive.
12/3/2010
Biosenzori
34
11
m DNA (acidul deoxyribonucleic) este denumit ‘planul vieții’ deoarece conține codul sau instrucțiunile pentru construirea organismului și asigură funcționarea corectă a acestuia. m El este componenta chimică a cromozomilor, care sunt localizați în nucleele fiecărei celule. Gena este un segment din DNA care codează pentru o proteină, care schimbă codurile într-o anumită caracteristică (nuanța pielii, culoarea ochilor, etc.). m Copierea identică (replica) DNA este procesul prin care DNA realizează o copie a sa însăși. Acest proces este semiconservativ, deoarece jumătate din copie conține jumătate din DNA inițial. Acest lucru reduce numărul de copii eronate. m DNA rămân în nuclee. Transmiterea informației către ribozomi, unde se realizează proteinele, este realizată prin intermediul acizilor ribonucleici (RNA). 12/3/2010
m
Biosenzori
12
Folosind ingineria genetică și proteică sunt posibile alte utilizări ale DNA în realizarea biosenzorilor.
1. Îmbunătățirea producției de enzime m
Anumite enzime, care sunt adesea utilizate, sunt prezente în cantități mici, situație în care izolarea acestora este dificil de realizat. Un astfel de exemplu este glucoz-dehidrogenaza (GDH), care poate fi utilizată în realizarea unui biosenzor de măsurare a glucozei. O sursă de GDH este bacteria Acinetobacter calcoaceticus, care este prezentă doar în cantități mici. Numărul acestora poate fi crescut prin tehnici de clonare, care dublează genele codate GDH, producând până la 50 de copii ale vectorului plasmidic (mai mulți DNA) per celulă și, în conseință, un număr mare de enzime.
12/3/2010
Biosenzori
35
13
2. Îmbunătățirea proprietăților enzimelor m
Modificări în cadrul enzimelor pot fi realizate fie direct prin inginerie proteică sau prin modificarea genelor obținute prin copiere utilizând ingineria genetică. Acestea pot: - îmbunătăți numărul de descompuneri (turnover) a enzimei; - modifica dependența de indicele pH; - modifica răspunsul liniar la concentrația substratului; - îmbunătăți stabilitatea în timpul stocării și operării; - reduce susceptibilitatea la substanțele cu care interferă; - lărgește sau micșorează specificitatea substratului; - modifică cerințele legate de cofactor.
12/3/2010
Biosenzori
14
2.8. Receptorii m Cele mai multe cercetări referitoare la receptori au fost realizate asupra neuroreceptorilor și cu recunoașterea neurotransmițătorilor, neurotransmițătorilor antagoniști și neurotoxine. m Aplicațiile receptorilor în cadrul biosenzorilor sunt încă la început. Cu toate acestea, au fost realizate o serie de aplicații ale receptorilor în cadrul biosenzorilor. m Neurotransmițătorii și receptorii hormonali sunt exemple de biosenzori ai corpului uman (de exemplu membrana olfactivă a nasului).
12/3/2010
Biosenzori
36
15
m Legatura unui ligand (moleculă capabilă să formeze un complex cu altă moleculă) la un receptor declanșează un răspuns psihologic, cum ar fi: - deschiderea unui canal ionic; - al doilea sistem mesager; - activarea enzimelor. m Acești receptori biologici tind să aibă o afinitate pentru o serie de compuși cu o anumită structură în locul unui analit specific. Această caracteristică este foarte atractivă pentru a fi utilizată în cadrul biosenzorilor. Adesea biosenzorii sunt utilizați cu materiale etichetate, la început cu molecule ligand etichetate radioactiv, iar în prezent și cu molecule ligand etichetate enzimatic sau fluorescent. Alternativ, receptorul poate fi etichetat.
12/3/2010
Biosenzori
16
m Biosenzorii pot fi în mare grupați în biosenzori bazați pe receptori intacți și biosenzori bazați pe receptori izolați. m Exemplu din cadrul primului grup – chemoreceptorul prototip (1986). Acesta utilizează contribuția structurii olfactive a crustaceelor pentru sesizarea neuronală a moleculelor ligand chemoreceptoare cu ar fi: aminoacizii, hormoni de sex și substanțele chimice bazate pe piridină. Legătura dintre ligand și chemoreceptorul corespunzător declașează stimularea unui potențial de acțiune (AP) în nerv care poate fi detectat printr-un microelectrod de sticlă conectat în afara celulei. m Exemplu din al doilea grup – acetilcolina nicotinică. Aceasta a fost utilizată cu diferite traductoare, cum ar fi de exemplu de tip capacitiv și cu ISFET. Cel mai eficient este, însă, cel care utilizează o fibră optică de undă foarte mică cu molecule ligand etichetate fluorescent. Durata de funcționare a acestui biosenzor este 30 de zile. 12/3/2010
Biosenzori
37
17
§3. Traductoare electrochimice m Pentru traductoarele folosite în cadrul biosenzorilor sunt trei procese electrochimice de bază: - potențiometric – se realizează măsurarea potențialului celulei la curent egal cu zero; - voltammetric (amperometric) – potențialul de oxidare sau de reducere apare între electrozii celulei, iar curentul este măsurat; - conductimetric – conductanța celulei este măsurată folosind o punte de c.a.
12/3/2010
Biosenzori
1
3.1. Traductoare potențiometrice r Celule și electrozi m Dacă o piesă metalică este introdusă într-o soluție electrolitică apare o separare de sarcină electrică între metal (electrodul) și soluție. Circuitul se numește semicelulă. Structura unei semicelule
12/3/2010
Biosenzori
38
2
m Prin combinarea a două semicelule se obține o celulă voltaică sau galvanică. m Celula voltaică convertește energia chimică a oxidanților și reactanților în energie electrică. m O celulă voltaică conține doi electrozi și o punte de sare. m Cei doi electrozi sunt: anodul (-) și catodul (+). Procesul de oxidare are loc la anod, iar procesul de reducere are loc la catod. Anodul se dezintegrează, iar la catod au loc depuneri solide. Electronii se deplasează de la anod la catod. m Puntea de sare permite migrarea ionilor în scopul închiderii circuitului electric. m Reacția chimică se numește reacție REDOX (REDuction and OXidation). 12/3/2010
Biosenzori
3
m Metalele care în seria de reactivitate se găsesc înaintea hidrogenului sunt folosite ca și anod, iar cele care se găsesc după hidrogen sunt folosite ca și catod. În cazul în care cele două metale se găsesc de aceeași parte a hidrogenului, atunci metalul mai reactiv va fi folosit ca și anod, iar celălalt ca și catod. Caz particular: ca electrod al hidrogenului se folosește platina (este înconjurată de hidrogen).
K Ca Na Mg Al Zn Fe Sn Pb H Cu Hg Ag Pt Au
Se oxidează (anod -)
12/3/2010
Se reduc (catod +)
Biosenzori
39
4
m Diferența potențialelor celor doi electrozi reprezintă t.e.m. a celulei (e.m.f. = electromotive force). Aceasta se măsoară folosind un voltmetru numeric (DVM) cu o impedanță internă de valoare ridicată. m Valoarea t.e.m. a celulei depinde de: - natura electrozilor M1 și M2; - natura și concentrațiile soluțiilor S1 și S2; - potențialul joncțiunii lichidului la puntea de sare.
12/3/2010
Biosenzori
5
Structura unei celule
M1 = metal 1 M2 = metal 2 S1 = soluție electrolitică 1 S2 = soluție electrolitică 2 V = voltmetru
12/3/2010
Biosenzori
40
6
m Reacția chimică globală într-o celulă voltaică constă în două reacții chimice - una pentru reacția de oxidare și cealaltă pentru reacția de reducere. m Numărul de electroni câștigați în reacția de reducere trebuie să fie egali cu numărul de electroni pierduți în reacția de oxidare. m O celulă voltaică produce electricitate. Ca urmare, t.e.m a celulei este pozitivă Ecelulă > 0.
12/3/2010
Biosenzori
7
Celula voltaică Daniell
Anod = Zn Catod = Cu S1 = sulfat de zinc S2 = sulfat de cupru puntea = recipient poros Presupunem că soluțiile electrolitice au aceeași concentrație (1 M). 12/3/2010
Biosenzori
41
8
La anod: Zn
Zn2+ + 2e-
La catod: Cu2+ + 2e-
Cu
La celulă: Zn + Cu2+
Zn2+ + Cu
m La anod are loc oxidarea zincului în ioni de zinc. m Anodul de zinc se dezintegrează în timp. m La catod ionii de cupru sunt reduși la atomi de cupru. m Cuprul se depozitează în timp pe catodul din cupru. m Electronii se deplasează de la anodul de zinc la catodul de cupru. m În cadrul reacției REDOX zincul donează electroni către ionii de cupru. m Culoarea albastră a soluției de sulfat de cupru pălește în timp fiind înlocuită de soluția de sulfat de zinc mai puțin colorată. 12/3/2010
Biosenzori
9
m Recția REDOX apare spontan. Ca urmare, E0 > 0. m Energia liberă Gibbs pentru această reacție este negativă:
∆G = -nFE unde: n este numărul de electroni transferați (în cazul nostru n = 2); F este constanta Faraday (F = 96487 C/mol); E este t.e.m. a celulei (presupunem că potențialul joncțiunii lichidului este egal cu zero). m Energia Gibbs este potențialul chimic care este minimizat atunci când sistemul ajunge la echilibru la presiune și temperatură constante. Această energie este utilizată ca și criteriu de spontaneitate pentru procese caracterizate prin temperatură și presiune constante. m Deoarece E > 0 rezultă ∆G < 0 și reacția se produce spontan. 12/3/2010
Biosenzori
42
10
m Ne punem problema determinării valorii energiei ∆G. Pentru aceasta, conform relației energiei libere Gibbs, trebuie să determinăm t.e.m. aferente proceselor de oxidare și de reducere. În acest scop se utilizează două celule. În fiecare dintre celule se utilizează un electrod de H2. Ceilalți electrozi fiind, în prima celulă, de Zn, iar în a doua celulă de Cu. m Hidrogenul nu este un metal, dar prin oxidare poate genera un cation H+ prin eliminarea unui electron, i.e. H
H+ + e-
care poate fi scrisă: H2
12/3/2010
2H+ +2e-
Biosenzori
11
m Pentru reacția anterioară energia ∆G este definită ca fiind egală cu zero pentru starea standard ([H+] = 1M, presiunea parțială a hidrogenului este egală cu 1 atm și T = 298 K (25oC)). Pentru starea standard energia liberă Gibbs se notează ∆G0 (∆G0 = 0). m Conform relației de definiție a energiei libere Gibbs rezultă că în starea standard potențialul pentru electrodul de H2 este egal cu zero E0H = 0 V. m Electrodul de hidrogen din starea standard (SHE) se mai numește și electrodul de hidrogen normal (NHE).
12/3/2010
Biosenzori
43
12
Structura unei celule
12/3/2010
Biosenzori
13
r Pentru prima celulă avem: La anod: H2
2H+ + 2e-
La catod: Cu2+ + 2e-
Cu
La celulă: H2 + Cu2+
2H+ + Cu
E0H = 0 V
E0Cu = +0,34 V
Ecelulă1 = E0CU – E0H = +0,34 V
12/3/2010
Biosenzori
44
14
r Pentru a doua celulă avem: La anod: H2
2H+ + 2e-
La catod: Zn2+ + 2e-
Zn
La celulă: H2 + Zn2+
2H+ + Zn
E0H = 0 V
E0Zn = -0,76 V
Ecelulă2 = E0Zn – E0H = –0,76 V
r Pentru celula Daniell avem: Ecelulă = Ecelulă1 – Ecelulă2 = 0.34 – (–0,76) V = 1,10 V 12/3/2010
Biosenzori
15
r Electrozi de referință m Ca electrod de referință (RE) se poate utiliza electrodul normal de hidrogen, care poate fi foarte uşor realizat în laborator. Cu toate acestea, datorită faptului că măsurările implică curgerea hidrogenului, care prezintă pericol de explozie, nu se utilizeză acest electrod ca electrod de referință. m În practică se utilizează alți electrozi de referință. Aceștia au următoarele caracteristici: sunt ușor de realizat practic, sunt nepolarizați, furnizează potențiale reproductibile care au coeficienți de temperatură de valoare redusă. m Cei mai utilizați elctrozi de referință sunt: electrodul clorură de argint – argint și electrodul calomel saturat.
12/3/2010
Biosenzori
45
1
r Electrodul argint/ clorură de argint m Clorura de argint are avantajul de a fi moderat solubilă în apă. m Reacția chimică corespunzătoare semicelulei este: AgCl + e- = Ag + Cl- E0 = +0,22 V m Electrodul constă într-un fir de argint acoperit cu clorură de argint și introdus într-o soluție de clorură de potasiu (uzual 1 M). O soluție pentru acoperirea cu clorură de argint a firului de argint este următoarea. Se utilizează o celulă electrochimică în care anodul este firului de argint, catodul este din Pt, iar soluția electrolitică este clorura de potasiu. Electroliză se realizează 30 min, timp în care se aplică argintului o tensiune de 0,5 V. Suprafața argintului se oxidează în ioni de Ag, care atrag ionii de clorură, formându-se, astfel, stratul de clorură de argint. 12/3/2010
Biosenzori
2
Electrod de referință argint/ clorură de argint
12/3/2010
Biosenzori
46
3
r Electrodul calomel saturat m Calomel este vechea denumire a clorurei de mercur Hg2Cl2. Aceasta este moderat solubilă în apă. m Reacția chimică corespunzătoare semicelulei este: Hg2Cl2 + 2e- = 2Hg + 2Cl- E0 = +0,25 V m Electrodul constă într-un bazin de mercur aflat în contact cu o pastă obținută prin amestecarea de mercur, pudră de clorură de mercur și soluție de clorură de potasiu saturată. Pasta este în contact cu soluție de clorură de potasiu saturată. Soluția saturată poate fi obținută prin amestarea prin agitare a clorurii de potasiu cu apa până nu se mai dizolvă. m Acest electrod este foarte potrivit în cazul soluțiilor apoase. 12/3/2010
Biosenzori
4
Electrod de referință calomel saturat
12/3/2010
Biosenzori
47
5
r Relații cantitative. Ecuația lui Nernst m Ne punem problema determinării efectului concentrațiilor diferite ale electroliților asupra potențialului electrodului. m Pentru o semicelulă reacția chimică este:
ox + ne- = red unde: ox și red sunt speciile care suferă reducerea și oxidarea; n este numărul de electroni schimbați în reacție. m Substanțele reduse și oxidate dintr-o semireacție formează un cuplu redox și se notează ox/red (de exemplu la celula Daniell cuplurile redox sunt Cu2+/Cu și Zn2+/Zn).
12/3/2010
Biosenzori
6
m Ecuația lui Nernst este:
E = E0 +
RT aox ln nF ared
RT = E0 + ln (Q ), nF
unde: E este t.e.m. a celulei; E0 este potențialul standard al semicelulei; T este temperatura absolută; aox, ared sunt activitățile chimice ale speciilor ox și red; Q = aox/ ared este câtul reacției; F este constanta lui Faraday – sarcina electrică aflată într-un mol de electroni (F = 9,6485·104 C/mol); R este constanta gazelor (R = 8,324472(15) JK-1mol-1).
12/3/2010
Biosenzori
48
7
m Activitatea chimică a unei specii x, aX este dată de relația:
ax = γx·cx unde γx este coeficientul de activitate, iar cx este concentrația speciei x Observație: La concentrații mici coeficientul de activitate γx tinde către 1, situație în care avem: ax ≅ cx. m Presupunem că valorile concentrațiilor sunt mici. În acest caz ecuația lui Nernst devine:
E = E 0 + 2,303
12/3/2010
[ox] RT log nF [red ]
Biosenzori
8
m Pentru T = 293 K (200C) obținem 2,303RT/F = 0,0580, iar pentru T = 298 K (250C) obținem 2,303RT/F = 0,0591. m Ținând cont de valorile de mai sus ecuația lui Nernst scrisă anterior o putem aproxima prin:
[ox] . E = E 0 + 0,06 log [red ] m Specia red este, de obicei, un metal. În acest caz [red] =1, iar relația de mai sus devine:
E = E 0 + 0,06 log([ox]).
12/3/2010
Biosenzori
49
9
m Ecuația lui Nernst poate fi scrisă sub o forma mai simplă de utilizat în practică:
E = K + S log([ox]), unde K este decalajul, iar S este panta. m Rezultatele experimentale obținute pentru K și S sunt comparate cu cele teoretice E0 (pentru decalaj) și 2,303RT/F (pentru pantă) .
12/3/2010
Biosenzori
10
m În continuare introducem potențialul electrodului de referință (EREF) și potențialul joncțiunii lichidului (E1,j) ca în figura de mai jos. Electrod de referință combinat cu altă semicelulă
12/3/2010
Biosenzori
50
11
m Avem relațiile:
E celulă = E ' E'
M ,M
Rezultă:
n+
M ,M n+
− E RE − E1, j
([
= E '0 + S log M n +
(
])
)
E celulă = E '0 − E RE − E1, j + S log([ M n + ]) Relația de mai sus poate fi scrisă:
Ecelulă = K + S log([M n + ]), unde K = E
'0
− E RE − E1, j .
12/3/2010
Biosenzori
12
r Concentrația celulelor m În continuare în locul electrodului de referință introducem o semicelulă similară cu acelaşi cuplu redox, dar cu diferite concentrații ale speciei ox, ca în figura de mai jos. Celulă cu concentrații diferite ale speciei ox.
RE1, RE2 – electrozi de referință.
12/3/2010
Biosenzori
51
13
m Ecuațiile Nernst aferente reacțiile celor două semicelule sunt:
E1 = E 0 + S log([ox]1 ) E 2 = E 0 + S log([ox]2 ). m Prin scăderea celor două relații se obține:
[ox ]1 . ∆E = E1 − E 2 = S log ox [ ] 2
m Concentrația [ox]2 este menținută constantă (concentrație de referință). În această situație relația de mai sus devine:
∆E = const + S log([ox ]1 ), unde const este o constantă egală cu –Slog([ox]2). 12/3/2010
Biosenzori
14
m Rezultatul obținut anterior este utilizat în majoritatea electrozilor sensibili la ioni (ISE). În practică, în general, aranjamentul este ca în figura prezentată anterior. m În partea stângă este soluția de test, care urmează a fi determinată, în care se introduce un electrod de referință. În partea dreaptă este soluția standard (de referință), care are o concentrație fixată (cunoscută). În aceasta este introdus al doilea electrod de referință. La mijloc, între cele două soluții, se află o membrană selectivă la ioni. Între cei doi electrozi se conectează un voltmetru care are o impedanță internă de valoare ridicată. Apoi, sistemul de electrozi este calibrat. m Tensiunea măsurată este dată de diferența de potențial a electrozilor celor două semicelule, care sunt identice, cu excepția faptului că valorile celor două concentrații ale ionilor sunt diferite. 12/3/2010
Biosenzori
52
15
m T.e.m. a celulei este dată de relația:
E = E REF1 + E REF 2 + E1, j − S log(a2 ) + S log(a1 ), unde a1 este activitatea soluției de test, iar a2 este activitatea soluției de referință (standard). m Relația de mai sus poate fi scrisă:
E = K + S log(a1 ), unde
K = E REF1 + E REF 2 + E1, j − S log(a 2 ).
12/3/2010
Biosenzori
16
r Aspecte practice legate de electrozii selectivi la ioni m În scopul obținerii unor rezultate consistente, reproductibile cu limitele de detecție cele mai mici trebuie avute în vedere o serie de precauții. Următorii factori trebuie avuți în vedere: - Concentrația ionică trebuie menținută constantă de la un eșantion la următorul. Aceasta poate fi realizată prin adăugarea unui electrolit cu concentrație constantă, destul de mare. Un astfel de electrolit nu interferă în nici o direcție cu fiecare eșantion și fiecare standard. - Indicele pH trebuie controlat cu o anumită eroare. Acest lucru este mai important în cazul anumitor substanțe ionice, e.g. fluorurile. - Poate fi posibil și de dorit să se adauge componente care minimizează sau elimină ionii de interferență. 12/3/2010
Biosenzori
53
17
m Amestecurile cele mai potrivite pentru îndeplinirea acestor proprietăți sunt soluțiile folosite pentru reglarea concentrației ionice – ISA (Ionic Strength Adjusters) și substanțele tampon folosite pentru reglarea concentrației ionice totale – TISAB (Total Ionic Strenght Adjustement Buffers). m Exemple: Pentru ISE de nitrați substanța ISA este sulfatul de sodiu. Aceasta menține indicele pH între limitele cerute 2 -12. Cu toate aceastea, această substanță ISA nu elimină interferențele importante din partea fluorurilor și nitriților. Din acest motiv, s-a folosit substanța ISA sulfat de argint, iar în prezent o substanță mult mai complexă, dar mai ieftină, care este un amestec de acetat.
12/3/2010
Biosenzori
18
Electrozii pentru floruri necesită un amestec mult mai complex care conține: 1 M clorură de sodiu (pentru controlul concentrației ionice) + 1 M acid acetic, ajustat până la indicele pH de 5,5 cu hidroxid de sodiu (pentru controlul indicelui pH, deoarece un indice pH ridicat conduce la interferenţe din partea hidroxidului) + 10-3 M citrat de sodiu. m Temperatura trebuie controlată foarte precis deoarece în ecuația lui Nernst intervine temperatura. O variație a temperaturii cu 1 K conduce la o eroare de 2% de măsurare a concentrației. Similar, alți factori cum ar fi de exemplu timpul de agitare și de echilibrare (de regulă 30 s – 2 min) înainte de citire trebuie standardizat.
12/3/2010
Biosenzori
54
19
r Măsurarea și calibrarea
• Graficul de calibrare m O serie de soluții sunt realizate prin adăugarea soluțiilor ISA, iar apoi potențialele electrozilor sunt măsurate. În continuare se reprezintă grafic dependența tensiunii de logaritmul zecimal al concentrației. Acest grafic se numește grafic de calibrare. Deviațiile față de liniaritatea graficului ideal dat de ecuația Nernst sau obținearea unei pantei diferite de cea ideală nu au nici o importanță. Eșantioanele sunt tratate în același mod, iar valoarea logaritmului zecimal al concentrației este citită de pe graficul real. Aceste grafice de calibrare sunt realizate în mod regulat.
12/3/2010
Biosenzori
1
• Adaos standard m Eșantionul este preparat așa cum s-a precizat anterior și tensiunea sa este citită. Apoi o cantitate cunoscută de soluție standard de concentrație ridicată (în general de zece ori mai mare decât concentrația așteptată să se obțină) este adăugată și are loc citirea noii tensiuni. În continuarea se stabilește o ecuație care aproximează cel mai bine datele obținute prin măsurare. Această ecuație trebuie să conțină o corecție pentru diluarea realizată prin adăugarea noii soluții standard.
12/3/2010
Biosenzori
55
2
m Notăm cu Cu concentrația necunoscută într-un volum Vu cm3 de soluție și Cs concentrația standard adăugată într-un volum Vs cm3 de soluție. m Ecuațiile Nernst pentru cele două situații sunt următoarele:
E1 = K + S log(Cu ),
C V + C sVs E 2 = K + S log u u Vu + Vs
.
m Prin scăderea celor două relații se obține:
C (V + V s ) E = E1 − E 2 = S log u u . C V + C V s s u u
m Din relația de mai sus se obține concentrația necunoscută: Cu =
12/3/2010
•
Cs V 10 E / S 1 + u V s
Vu − V s
Biosenzori
.
3
Graficul Gran
m Acesta reprezintă o extensie a metodei de adaos standard prezentată anterior care utilizează adaosuri standard multiple. Procedura este aceeași ca și în cazul metodei de adaos standard cu excepția faptului că sunt realizate mai multe adosuri (cinci sau mai multe). m Utilizând notațiile anterioare, cu excepția faptului că Cs este variabilă și reprezintă creșterea în concentrația eșantionului de soluție produsă de fiecare adaos. m Ecuația Nernst pentru această situație este:
E = K + S log(C u + C s ). m Din relația de mai sus se obține:
10 E / S = K ' (Cu + C s ), unde K ' = 10 K / S . 12/3/2010
Biosenzori
56
4
m Dependența 10E/S = f(Cs) reprezintă graficul lui Gran.
Graficul lui Gran
12/3/2010
Biosenzori
5
r Exemple de electrozi ion-selectivi
•
Electrodul cu membrană de sticlă
m Cel mai cunoscut exemplu este electrodul cu membrană de sticlă folosit pentru măsurarea concentrației ionilor de hidrogen sau a acidității, denumit uzual electrodul pH. Membrana subțire de sticlă are o mare selectivitate la ionii de hidrogen într-un domeniu foarte larg de variație a concentrațiilor. Performanța electrodului pH depinde în foarte mare măsură de compoziția sticlei. Dacă aceasta se modifică membrana de sticlă devine selectivă la alți ioni. Compoziția folosită adesea pentru sticla selectivă la ioni de hidrogen este: 22% Na2O, 6% CaO și 72% SiO2.
12/3/2010
Biosenzori
57
6
Schema tipică a unui electrod pH
Electrod Ag/AgCl Electrod pH
12/3/2010
Biosenzori
7
m Al doilea electrod de referință se află într-un tub de sticlă concentric și înconjoară tubul electrodului principal. Contactul dintre acest electrod și soluția de test este realizată pe baza unei sticle poroase din ceramică care permite trecerea soluției. m Electrozii de referință sunt, de regulă, de tipul Ag/AgCl. m Electrodul pH este calibrat în termeni de pH și nu în termeni de activitate chimică:
( )
pH = − log a H + .
12/3/2010
Biosenzori
58
8
m Ecuația Nernst aferentă este:
( )
E = K + 0,0591 log a H + = K − 0,0591 pH . m Pe baza relației de mai sus rezultă:
pH =
E−K . 0,0591
m Alți electrozi ion-selectivi din membrană de sticlă au fost realizați pentru Na+, Li+, K+ și Ag+.
12/3/2010
•
Biosenzori
9
Electrodul cu stare solidă
m În figura următoare se prezintă structura generală a unui astfel de electrod.
12/3/2010
Biosenzori
59
10
m În mod normal acest traductor are un electrod de referință separat, care este introdus în soluția de test. Acesta poate fi, dar nu este necesar să fie, de același tip cu electrodul de referință intern realizat de fabricant. m Membrana poate fi realizată dintr-un cristal solid cum ar fi de exemplu fluorura de lantan (LaF3) în cadrul electrodului pentru fluoruri sau din peleți presați din materiale sub formă de pudră cum ar fi de exemplu sulfura de argint (Ag2S) în cadrul electrodului pentru sulfuri. m Exemple de acest tip de electrozi: F-, Cl-, Br-, I-, SCN- și S2-. Dintre acestea electrodul pentru fluoruri este des utilizat în instalațiile de tratare a apei pentru măsurarea nivelului de fluoruri din apa potabilă.
12/3/2010
•
Biosenzori
11
Electrodul ion-schimbați cu membrană lichidă
m În figura următoare se prezintă structura generală a unui astfel de electrod.
12/3/2010
Biosenzori
60
12
m Membrana este realizată dintr-un material hidrofob (nu se combină cu apa și nu se îmbibă de apă) cum ar fi material PVC plastifiat. În această membrană este absorbit doar materialul lichid ion-schimbați cum ar fi de exemplu valinomicin pentru potasiu. m Pentru a menține același nivel de concentrație în cadrul membranei există un rezervor de lichid ion-schimbați dizolvat într-un solvent organic. m Exemple de acest tip de electrozi: NO3-, Cu2+, Cl-, BF4-, ClO4- și K+. Dintre acestea electrodul pentru nitrați este foarte des utilizat pentru măsurarea nivelului de nitrați din sol și apă.
12/3/2010
•
Biosenzori
13
Electrodul de gaz
m În figura următoare se prezintă structura generală a unui astfel de electrod.
12/3/2010
Biosenzori
61
14
m Acești electrozi se bazează, în principal, pe electrozii pH și pot detecta gazele care în soluții apoase formează soluții acide sau baze. m Ei conțin o membrană permeabilă de gaz atașată ca în figură. Între această membrană și membrana de sticlă selectivă la hidrogen se află o soluție electrolitică internă care conține materialul care va forma o substanță tampon cu gazul. De exemplu, pentru electrodul de amoniac se utilizează clorura de amoniac. În acest caz echilibrul presupune următoarele reacții chimice:
NH4Cl = NH4+ + ClNH3 + H+ = NH4+
12/3/2010
Biosenzori
15
m Constanta de disociere Ka este dată de relația:
Ka = [NH3]·[H+]/[NH4+] m Pe baza relației de mai sus se obține:
log([NH3]) = pH +pKa + log([NH4+]) m Datorită concentrației ridicate a clorurii de amoniu concentrația ionilor de amoniu este constantă. De aceea, logaritmul concentrației de amoniac este direct proporțional cu indicele pH al soluției. m În mod similar sunt realizați electrozii pentru SO2, NO2 și H2S.
12/3/2010
Biosenzori
62
16
r Electrozi ion-selectivi utilizați în biosezori m Relativ puțini electrozi ion-selectivi (ISE) sunt utilizați în cadrul biosenzorilor. Cei mai utilizați sunt: H+, NH4+ și NH3, care se bazează pe principiul electrodului pH. Mai rar se utilizează electrozii CO2, I- și S2-.
12/3/2010
Biosenzori
17
3.2. Traductoare voltametrice r Voltametria liniară m Se aplică un potențial liniar variabil între electrodul de lucru (la care are loc reacția chimică) și electrodul de referință a unei celule electrochimice. Aceasta conține un electrolit de concentrație ridicată, care asigură că soluția va fi conductoare electrică, numit electrolit de suport și speciile care suferă reducerea și oxidarea numite specii electroactive. Curentul prin celulă este monitorizat continuu. Acesta se reprezintă grafic în funcție de potențial. Acest grafic poartă numele de voltamogramă. Această tehnică se numește voltametrie liniară.
12/3/2010
Biosenzori
63
1
m În figura de mai jos se reprezintă o voltamogramă tipică.
12/3/2010
Biosenzori
2
m La început (punctul A) curentul este foarte mic. Între punctele A și B acesta crește foarte lent din cauza curentului rezidual (datorat impurităților) și a sarcinii dintre straturile duble (interfața electrod-soluție se comportă ca un condensator). Acest curent este denumit, câteodată, curent din urmă (background). În punctul B potențialul se apropie de cel de reducere al speciei ox. Creșterea potențialului conduce la transferul de electroni de la electrod la specia ox cu o rată de creștere conform reacției chimice generale:
ox + ne-
12/3/2010
red
Biosenzori
64
3
m Creșterea ratei de reducere cauzează creșterea curentului prin celulă. Se poate arăta că, în această regiune, valoarea curentului prin celulă este dată de suma algebrică a curentului catodic (de reducere) ic și a curentului anodic (de oxidare) ia:
i = ia + ic. m Expresiile acestor curenți sunt dați de ecuația Butler-Volmer:
ic = nFAk 0f Cox e
−
(
αnF E − Eeq
)
RT
(1−α )nF (E − Eeq )
ia =
− nFAkb0 C red e
RT
,
unde Cox și Cred sunt concentrațiile speciilor ox și red la suprafața electrozilor, α este coeficientul de transfer, A este suprafața electrodului, k0f și k0b sunt ratele de transfer ale electronilor (sunt constante). 12/3/2010
Biosenzori
4
m Din relațiile anterioare se observă că dacă E (potențialul aplicat) scade, atunci curentul ic crește, iar curentul ia scade. Acest lucru conduce la o creștere a curentului în forma de undă voltametrică, care atinge un maxim în punctul C. După aceea curentul începe să scadă deoarece transportul speciilor electroactive către electrod de către fenomenul de difuzie a golit de specii ox vecinătatea electrodului (scade concentrația speciei ox).
12/3/2010
Biosenzori
65
5
m Efectul de difuzie este prezentat în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
6
m Valoarea curentului limitat prin difuzie este obținută din legea întâi de difuzie a lui Fick:
Φ=D
dC dx
unde Φ este fluxul de material spre suprafața electrodului, D este coeficientul de difuzie, iar dC/dx este gradientul de concentrație. m Expresia curentului este:
id = nFAD
12/3/2010
dC . dx
Biosenzori
66
7
m Efectul de golire progresivă în timp este stabilit de legea a doua de difuzie a lui Fick:
dC d 2C =D 2 dt dx m Rezolvarea ecuației de mai sus este foarte dificilă. În practică se obține o soluție aproximativă folosind metode numerice de integrare implementate folosind un calculator. m Trebuie menționat faptul că există anumite situații particulare care conduc la soluții simple. O astfel de situație permite obținerea curentului de vârf din punctul C. Pentru situația în care transferul de electroni este reversibil curentul de vârf este dat de ecuația Randles-Sevcik:
12/3/2010
Biosenzori
8
la 298 K
i p = 2,68 × 10 5 n 3 / 2 AD1 / 2 C oxν 1 / 2 , unde ν este viteza de baleiaj. m Dacă reacția nu este reversibilă sau dacă rata de transfer de electroni este redusă (valori mici pentru ratele de transfer ale electronilor k0f și k0b), reacția este numită ireversibilă, iar expresia curentului de vârf este: la 298 K
i p = 2,98 × 10 5 n(αn a )AD 1 / 2 C oxν .
12/3/2010
Biosenzori
67
9
Observație: În ambele cazuri (reacție reversibilă și reacție ireversibilă) curentul de vârf este proporțional cu concentrația speciei ox. m Pentru o reacție reversibilă relația de legătură dintre potențialul la care apare vârful de curent, Ep și potențialul redox standard pentru cuplul redox ox/red este: Ep = E0 +
0,056 . n
m Pentru o reacție ireversibilă relația depinde și de alți factori.
12/3/2010
Biosenzori
10
r Voltametria ciclică m Odată cu procesul de golire a speciei ox la suprafața electrodului prin reacția de reducere, aceasta este înlocuită de specia red care difuzează mai la distanță în cadrul soluției. De aceea, dacă inversăm sensul de variație al potențialului începând de la vârful pozitiv se obține efectul revers. În momentul în care potențialul ajunge la valoarea potențialului redox speciile red încep să fie reoxidate către specia ox. Curentul va începe să crească în direcția negativă (de oxidare) până în momentul în care vârful de oxidare este obținut.
12/3/2010
Biosenzori
68
11
m Variația în timp a potențialului este prezentată în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
12
m Voltamograma ciclică este prezentată în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
69
13
m În cadrul voltamogramei ciclice se observă două vârfuri de curent – unul corespunde procesului de reducere a substratului original, cel de-al doilea corespunde reoxidării produsului înapoi la substratul original. m Cele două vârfuri de curent au practic aceeași înălțime, iar diferența potențialelor aferente celor două vârfuri de curent este egală cu (0,056/n) V. m Media potențialelor celor două vârfuri este egală cu valoarea potențialului redox standard E0, indiferent de concentrația substratului, coeficienții de difuzie sau rata de transfer a electronilor. m Dacă procesul este ireversibil, atunci vârfurile de curent se află la o distanță mai mare unul față de celălalt Ep(c) – Ep(a) > (0,056/n) V. Cu toate acestea, media potențialelor celor două vârfuri poate fi folosită pentru determinarea potențialului E0. 12/3/2010
Biosenzori
14
m Câteodată vârful de curent corespunzător efectului revers nu apare sau are o formă diferită sau distorsionată. Acest lucru indică o reacție complet ireversibilă datorită unei reacții suplimentare a produsului obținut prin reducere format inițial. Un exemplu foarte des întâlnit este acela al 4-acetilaminofenol (paracetamol), care poate fi ușor oxidat folosind un electrod pastă de carbon. m În figura următoarea se prezintă voltamograma ciclică a paracetamolului.
12/3/2010
Biosenzori
70
15
12/3/2010
Biosenzori
16
m Deoarece reacția inițială este cea de oxidare (pierdere de electroni), vârful de curent inițial este în jos. Pe partea reversibilă vârful de curent este în mare măsură separat de vârful de oxidare inițial. De asemenea, el este mai larg.
12/3/2010
Biosenzori
71
17
r Amperometria m Acesta este numele uzual pentru aplicația analitică a tehnicii cronoamperometrie. m Folosind anumite celule și configurații de electrozi curentul de descreștere atinge după un anumit timp o stare aproximativ stabilă (este prezentată pe porțiunea hașurată a graficului din figura următoare). În acestă stare curentul devine independent de timp, fiind dat de relația: nFADCox i= ,
δ
unde δ este o constantă funcție de grosimea suprafeței de difuzie. m Relația de mai sus este foarte utilă pentru studiul analitic, chiar dacă curentul a scăzut foarte mult de la valoarea sa maximă. 12/3/2010
Biosenzori
1
m Forma de undă a curentului id este prezentată în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
72
2
r Efecte cinetice și catalitice m În majoritatea aplicațiilor cu biosenzori reacții reversibile sau ireversibile simple sunt rare. În general există o reacție chimică cuplată, poate cu transferul unui singur proton, dar care poate fi uneori o o reacție mult mai complexă (de exemplu paracetamolul). O reacție generalizată este:
ox + ne- = red k
red + A
12/3/2010
B
Biosenzori
3
m Un alt efect care este foarte util și utilizat în cadrul biosenzorilor este reacția catalitică, în care reactantul original ox este regenerată în reacția următoare. Acest lucru este arătat prin ecuația:
red + ne- = ox ox + A
k
red + B
m Efectul reacției de mai sus este că ciclii procesului redox se înconjoară de mai multe ori. Reacția de reducere inversă a speciei ox nu se vede, în schimb vârful corespunzător reacției de oxidare directă este mărit de mai multe ori. m Exemplu – voltamograma ciclică reversibilă a ferocenului (v. figura următoare). Forma de undă catalitică este cauzată de interacțiunea cu glucoz-oxidaza în prezența glucozei. 12/3/2010
Biosenzori
73
4
12/3/2010
(A)
Voltamograma ciclică a acidului monocarboxilic ferocen în prezența glucozei;
(B)
La fel ca și pentru (A), dar la care se agaugă glucozoxidaza (GOD).
Biosenzori
5
3.3. Conductometrie m Conductivitatea este folosită ca o măsură a trecerii curentului prin soluție. m Conform legii lui Ohm avem:
E = I ⋅ R, sau
E = I / G, în care G este conductanța, G = 1/R. m Conductanța se măsoară în siemens (S): 1S = 1Ω-1.
12/3/2010
Biosenzori
74
6
m Conductanța este legată de dimensiunile celulei în mod similar cu rezistența. Astfel, pentru o celulă de lungime l și arie a secțiunii transversale A, conductanța este egală cu:
G = κA / l , în care κ este conductivitatea (inversul rezistivității) sau conductanța specifică (în S·cm-1). m Pentru a obține conductivitatea molară Λ, conductivitatea este împărțită la molaritatea soluției:
Λ = κ / C, în care C este molaritatea soluției (în mol·cm-3).
12/3/2010
Biosenzori
7
m Conductivitatea este proporțională cu concentrația ionilor din soluție. m Pentru măsurarea conductivității se poate utiliza puntea Wheatstone.
R
este rezistența variabilă; aceasta se modifică pentru ca puntea să ajungă la echilibru.
12/3/2010
Biosenzori
75
2
8
m Conductivitatea depinde de sarcina ionului, mobilitatea ionului și de gradul de disociere al ionului. Din acest motiv apar o serie complicații. În plus, tehnica în sine nu conduce la o sensibilitate ridicată. Astfel, această tehnică necesită impunerea unei selectivitate prin introducerea unei membrane sau a unui înveliș. m Măsurarea se face în c.a. Ca urmare mărimea care se măsoară este admitanța (inversul impedanței). Aceasta depinde de conductanță și de capacitatea sau de inductivitatea sistemului. m Diagrama Argand realizează reprezentarea părții imaginare a unei impedanțe în funcție de partea reală a impedanței (v. figura următoare).
12/3/2010
Biosenzori
9
Diagrama Argand
12/3/2010
Biosenzori
76
10
m În principiu o modificare a conductanței poate fi folosită pentru a urmări orice reacție care produce o modificare a numărului de ioni, încărcarea ionilor, disocierea ionilor sau mobilitatea ionilor. În acest scop, în general, se utilizează o celulă de tip diferențial. O astfel de celulă este prezentată în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
11
m Exemple: (1)
uree + H2O
ureează
2NH4+ + HCO3-
Evident reacția de mai sus implică o modificare a ionilor. Aceasta poate fi urmărită conductimetric cu îmbunătățirea vitezei și a sensibilității în comparație cu metodele colorimetrice. Măsurarea conductanței nu este afectată de culoare sau de turbiditate. (2) O serie de enzime conduc la o modificare a conductivității • Amidaza (enzimă care desface legătura dintre carbon și azot din diferite substanțe, fixând elementele apei) – generează grupuri ionice.
12/3/2010
Biosenzori
77
12
• Dehidrogenaza (enzimă care participă la degradarea glucozei) și decarboxilaza (enzimă catalizatoare a unei reacții de carboxilare) – conduc la o separare a sarcinilor nedorite. • Esteraza (enzimă care catalizează hidroliza esterilor în constituienții lor acizi și baze) – implică migrarea (deplasarea) protonilor. • Kinaza (enzimă care catalizează transferul grupării fosfat) – cauzează modificarea gradului de asociere a ionilor. • Fosfataza (enzimă care se găsește în cantități mari în oase și ficat, dar poate fi întâlnită în placentă și în intestine) și sulfataza (enzimă care se găsește în toate organele corpului animalelor, îndeosebi în rinichi) – conduce la modificarea dimensiunii grupurilor purtătoare de sarcină.
12/3/2010
Biosenzori
13
3.4. Tranzistoare cu efect de câmp m Tranzistoarele cu efect de câmp (FET) sunt circuite în care tranzistorul în montaj amplificator este adaptat pentru a fi un traductor miniaturizat. Traductorul este utilizat în scopul detecției și măsurării semnalelor de potențiale diferite produse de către procesul unui senzor potențiometric pe poarta tranzistorului FET. Este necesar un electrod de referință. Legăturile circuitului sunt miniaturizate. Ca urmare, zgomotele electronice sunt reduse, iar sensibilitatea este mărită. m Tranzistoarele FET pot fi incluse în cadrul unui circuit integrat care realizează citirea și/sau prelucrarea datelor.
12/3/2010
Biosenzori
78
14
m Trebuie menționat faptul că nu au fost realizați electrozi de referință miniaturizați de performanțe ridicate. Majoritatea versiunilor realizate nu satisfac o serie de principii de bază ale electrozilor de referință. Cu toate acestea, au fost realizate și folosite o serie de astfel de electrozi începând cu pseudoelectrozii de referință, care constau dintr-un fir de platină sau argint, până la cei realizați prin procedee serigrafice folosind cerneala din argint/clorură de argint. O modalitate eficientă este aceea de utilizare a două tranzistoare FET care operează diferențial, dintre care nu este acoperit la care poarta are un răspuns neglijabil la analit și celălalt acoperit cu o membrană sensibilă la analit.
12/3/2010
Biosenzori
15
m Cel mai des utilizat este tranzistorul cu poartă izolată – IGFET (Insulated Gate FET) a cărui schemă este prezentată în figura de mai jos.
1. Substrat de siliciu de tip p 2. Substrat izolator 3. Poarta de metal 4. Substrat de siliciu de tip n 5. Drena de tip n 6. Contacte metalice la sursă și drenă
12/3/2010
Biosenzori
79
16
m Regiunea sursei (4) realizată dintr-un substrat de siliciu de tip n este separată de regiunea drenei (5), de asemenea, realizată dintr-un substrat de siliciu de tip n, prin intermediul substratului de siliciu de tip p (1) și a substratului izolator (2), realizat din dioxid de siliciu (SIO2). m Sursa este polarizată electric în raport cu drena prin intermediul tensiunii VD. Poarta (3) este realizată din metal, izolată față de restul circuitului. Ca urmare, aceasta formează un condensator sandwich metal/strat izolator/semiconductor (MIS) (v. figura următoare). m Regiunea porții este încărcată prin intermediul tensiunii de polarizare VG. Curentul de la drena (5) la sursă (4) ID este măsurat. m Există, de asemenea, o tensiune de prag, VT, la care substratul de siliciu de tip p devine de tip n, având loc o inversare de suprafață. 12/3/2010
Biosenzori
17
Poarta tranzistorului IGFET
M = Metal, I = Insulator, S = Semiconductor
12/3/2010
Biosenzori
80
18
m Pentru o tensiune VD de valoare mică și VG < VT substratul (1) rămâne de tip p și curentul de drenă este nul. Substratul de siliciu de tip n este polarizat pozitiv în raport cu cel de tip p. Dacă VG > VT, atunci are loc o inversare de suprafață, iar stratul de siliciu de tip p devine de tip n. În acest caz curentul poate trece de la drenă la sursă, fără să treacă prin joncțiunea p-n polarizată invers. Tensiunea VG modulează numărul de electroni de la stratul inversat și va controla conductanța. Curentul ID va circula de la sursă la drenă. El este proporțional cu rezistența electrică a stratului cu inversare de suprafață și cu tensiunea VD.
12/3/2010
Biosenzori
19
r Tranzitor CHEMFET m În scopul transformării tranzistorului IGFET într-un senzor poarta metalică este înlocuită cu o suprafață sensibilă chimic. Se obține astfel un tranzistor CHEMFET (CHEmical FET). Schema de principiu a acestui tranzistor este prezentată în figura următoare. m Membrana sensibilă chimic (3) este în contact cu soluția de analizat (7). Electrodul de referință (8) completează acest circuit via tensiunea de polarizare VG.
12/3/2010
Biosenzori
81
1
Structura de principiu a unui tranzistor CHEMFET
1. substrat de siliciu; 2. strat izolator; 3. membrană sensibilă chimic; 4. sursa; 5. drena; 6. capsula; 7. soluția de analizat; 8. electrod de referință.
12/3/2010
Biosenzori
2
• Determinarea curentului ID m În cadrul tranzistoarelor CHEMFET tensiunea VG este corectată prin diferența dintre potențialul membranei și cel al soluției. m Avem relațiile următoare:
φmem − φsol = 1
1
ni F (µisol − µimem )
ni F (µisol − µimem )
= E0 +
RT ln(ai ) ni F
în care: φmem, φsol sunt funcțiile de lucru ale membranei, respectiv ale soluției; µimem, µisol sunt mobilitățile electronului aferente membranei, respectiv soluției. 12/3/2010
Biosenzori
82
3
m Din relațiile de mai sus rezultă:
φmem − φsol = E 0 +
RT ln(ai ) ni F
m Curentul ID are expresia:
RT I D = K VG − VT − E 0 − ln(ai ) − VD / 2 VD ni F în care: K =C0Wµn/L, unde C0 este capacitatea stratului izolator, W este lățimea canalului, L este lungimea canalului, iar µn este mobilitatea electronului.
12/3/2010
Biosenzori
4
m Curentul ID poate fi măsurat direct, folosind o valoare constantă a tensiunii VG, pe baza schemei prezentată în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
83
5
m O altă metodă de măsurare constă în menținerea constantă a curentului ID prin modificarea tensiunii VG, care apoi este măsurată. Schema de măsurare este prezentată în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
6
m Alături de senzorii CHEMFET există și senzorii ISFET și ENFET. Senzorul ISFET (Ion Selectiv FET) utilizează tranzistorul FET ca un electrod sensibil la ioni. ENFET este un biosenzor la care poarta conține un sistem enzimă.
12/3/2010
Biosenzori
84
7
r Aplicații ale senzorilor FET
• Senzorul CHEMFET m În aplicații cel mai simplu mijloc care poate fi utilizat este tranzistorul IGFET, la care poarta constă dintr-un strat de paladiu evaporat pe cipul de siliciu și acoperit cu un strat de oxid de 100 nm. Aceasta este foarte specific pentru hidrogenul gaz sub 0,01 ppm. Răspunsul este V = kp, în care k = 27 mV/ppm. Există o anumită sensibilitate a acestui electrod la CO, NH3, H2S, CH4 și C4H10. Prin adăugarea unui strat de iridiu sensibiliatea la amoniac crește, iar la hidrogen descrește.
12/3/2010
• Senzorul
Biosenzori
8
ISFET
m Ionoforii sunt tipul de polimeri ion-selectivi cei mai utili pentru utilizarea la tranzistoarele FET, precum și la cele ISFET. m Folosind tranzistoarele FET se obțin răspunsuri speciale pentru H+. m Primul senzor PH ISFET a utilizat poarta izolată ca strat sensibil la ioni, în schimb stratul izolator de SIO2 nu a fost foarte eficient, datorită hidroxilării ușoare a SiO2. Cu toate acestea, senzorii cu poartă cu strat izolator Si3N4 nu se hidrolizează și sunt foarte sensibili la ioni de H+, având un răspuns de 50-60 mV/decadă. TiO2 și Ge conduc la un răspuns similar. Aceste materiale semiconductoare pot fi folosite utilizând aceleași tehnici ca la fabricarea cipurilor tranzistoarelor FET. Pentru alți ioni aceste tehnici sunt mai puțin eficiente. Cu toate acestea, pentru ionii de Na+ sticla borosilicată poate fi depusă în regiunea porții prin procesul folosit în cadrul circuitelor integrate. 12/3/2010
Biosenzori
85
9
m Membranele din polimer au fost utilizate cu succes pentru K+ incorporând eter coroană valinomicin și pentru Ca2+ cu p(1,1,3,3-tetrametilbutil) acid fenilfosforic. Răspunsurile sunt mai mici decât 40 mV/decadă, dacă nu membrana este mai groasă decât 100 µm. m Un senzor ISFET cu patru funcții pentru H+, Na+, K+ și Ca2+ a fost realizat pentru aplicații clinice. Aceasta utilizează o poartă cu strat izolator Si3N4 pentru H+, sticlă pentru Na+, ionosfor derivat din acid fosforic pentru Ca2+ și valinomicin pentru K+. Acesta s-a dovedit satisfăcător în condiții de laborator, dar folosind întregul sânge au fost probleme la analiza sodiului. m Membranele heterogene au, de asemenea, folosite. Cea mai eficientă este fosfazina polifluorurată (PNF) amestecată cu săruri de argint, cum ar fi de exemplu clorura de argint (75%) și PNF (25%). Răspunsul pentru Cl- a fost de 52 mV/decadă. Modificând amestecul și incluzând Ag2S sau AgI se poate ajusta sensibilitatea pentru favorizarea unui anumit ion. 12/3/2010
Biosenzori
10
• Biosenzorul ENFET m Acesta constituie un mijloc excelent pentru miniaturizarea biosenzorilor. În general, structura sa conține două porți, ca în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
86
11
m Cel mai utilizat este senzorul pH-bazat pe tranzistor FET, de exemplu cu penicilină și cu glucoză și uree. A fost realizat un biosenzor dual glucoză-uree, cu trei porți, în care una este folosită ca referință, una cu glucoz-oxidaza și una cu ureează. m Senzorul Pd-MOS FET pentru hidrogen gaz a fost utilizat cu NAD+/NADH și hidrogen-hidrogenază legată cu piruvat/NH3, care cu alanin dehidrogenaza (AlaDH) produce alanina. Alanina (Ala) este un aminoacid neesențial, constituent al proteinelor și glucoformator. NADH este nicotinamida adenin dinucleotidă (coezima -1 sau CoE-1) este o enzimă deosebit de importantă pentru producerea de energie la nivel celular, în special în creier și sistemul nervos central.
12/3/2010
Biosenzori
12
hidrogenază
NADH +
Piruvat + NH3 + NADH
H+
H2 + NAD+ AlaDH
alanină+ NAD+
m Senzorul Ir-MOS pentru amoniac a fost utilizat pentru uree. Alte substanțe au fost detectate în acest mod, ca de exemplu: aspartanul, asparginina, glutamat și creatinina.
12/3/2010
Biosenzori
87
13
Comparația senzorilor chimici integrați (miniaturizați )
12/3/2010
Biosenzori
14
§4. Traductoare optice 4.1. Introducere
m Majoritatea analizelor biologice sunt de tip fotometric. Acestea implică modificări ale speciilor, care conduc la schimbarea puternică a proprietăților lor fotometrice. Cel mai cunoscut exemplu este cel al implicării NAD+/NADH în reacțiile biochimice. De exemplu:
Piruvat + NADH + H+
LDH
L-lactat + NAD+
LDH = lactat dehidrogenaza; L-lactat = formă a acidozei lactice; este unica formă produsă de metabolismul uman. 12/3/2010
Biosenzori
88
15
m NADH are o puternică absorbanță la o lungime de undă λmax = 340 nm, dar NAD+ nu are nici o absorbanță la această lungime de undă. De asemenea, NADH produce fluorescență la 400 nm. Spectrele de absorție ale NAD în formele de oxidare și reducere sunt prezentate în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
16
m Reactanții și soluția de analizat sunt măsurate și amestecate, iar apoi sunt introduse într-o cuvetă în spectrometru. Problema care se pune este aceea de realizare a unui senzor folosind o tehnică optică. m Răspunsul optic de bază este stabilit pe baza legii Beer-Lambert (cunoscută și sub numele de legea lui Beer):
log(I/I0) = A = εCI, unde: I0 este intensitatea luminii incidente; I este intensitatea luminii transmise; A este absorbanța (în general măsurată direct cu aparatul); ε ste coeficientul de extincție; C este concentrația soluției de analizat (analit); l este lungimea parcursă de lumină prin soluție. 12/3/2010
Biosenzori
89
17
m Lungimea parcursă de lumină limitează dimensiunea senzorului, aspect care nu apare în cadrul senzorilor electrochimici. r Avantajele dispozitivelor fotometrice • Nu necesită electrod de referință, dar o sursă de referință este utilă. • Nu apare interferență electrică. • Un reactiv imobilizat nu trebuie să fie în contact cu fibra optică. El poate fi ușor înlocuit. • Nu apar hazarduri de siguranță electrică. • Anumite soluții, cum ar fi de exemplu oxigenul, pot fi sesizate în echilibru. • Au o mare stabilitate a stării stabilită prin calibrare, în special dacă măsurăm raportul intensităților a două lungimi de undă.
12/3/2010
Biosenzori
18
• Ele pot răspunde simultan la mai mult de o substanță utilizând multipli reactivi imobilizați cu diferite lungimi de undă pentru răspuns, e.g. O2 și CO2. • Pot fi realizate măsurări cu lungimi de undă multiple pentru monitorizarea modificărilor în starea reactivului. • Ele pot furniza o cantitate mai mare de informație decât traductoarele electrice.
12/3/2010
Biosenzori
90
19
r Dezavantajele dispozitivelor fotometrice • Ele lucrează numai dacă fazele de reactiv corespunzătoare pot fi dezvoltate. • Ele sunt supuse interferențelor produse de lumina ambientală. Acestea pot fi excluse direct sau utilizând tehnici de modulare. • Au un domeniu dinamic limitat în comparție cu senzorii electrici – tipic 102 (comparativ cu 106 – 1012 pentru electrozii ion-selectivi). • Sunt circuite extensive, dependente de cantitatea de reactiv. Ca urmare, sunt dificil de miniaturizat. • Au probleme cu stabilitatea pe termen lung a reactaților aflați sunt incideața luminii. • Timpul de răspuns poate fi mare datorită timpului de transfer a masei soluției către faza de reactiv.
12/3/2010
Biosenzori
20
4.2. Tehnici optice r Noțiuni introductive m Luminiscența este o radiție luminoasă care apare ca exces al radiației termice a unui corp la o temperatură dată. Pentru apariția luminiscenței este necesară o sursă de energie, care diferă de energia termică de echilibru, corespunzătoare temperaturii date. Se deosebesc: • fotoluminescența – apare ca rezultat al absorției luminii; • electroluminescența – este condiționată de câmpul electric exterior în care este plasată substanța; • catodoluminescența – este excitată de iradierea substanței cu fascicule de electroni rapizi; • triboluminescența – este determinată de acțiuni mecanice exterioare; 12/3/2010
Biosenzori
91
1
• chemiluminescența – apare în unele procese chimice; • bioluminescența – se observă la unele bacterii, ciuperci și animale nevertebrate (de exemplu: licuricii). m După durata luminiscenței se deosebesc fluorescența și fosforescența. În cazul fluorescenței electronul trece, sub acțiunea sursei de energie exterioare, pe un nivel excitat (cu energie mai mică), iar peste 10 ns, trece spontan în starea inițială și emite o cuantă de lumină (de exemplu luminescența lichidelor organice). Denumirea provine de la mineralul fluorină (CaF2). Fluorescența apare la o iluminare cu raze UV. În cazul fosforescenței electronul excitat trece pe un nivel metastabil intermediar, iar după un interval de timp mai mare decât 10 ns se întoarce în starea fundamentală. Cristalele fosforescente (fosfori) conțin atomi străini (activatori), care emit pe o anumită lungime de undă în funcție de natura activatorului. 12/3/2010
Biosenzori
2
Fluorescența
12/3/2010
Biosenzori
92
3
m În figura următoare se prezintă lungimele de undă relative aferente celor mai importante tipuri de radiații: vizibile, ultraviolete și infraroșii.
12/3/2010
Biosenzori
4
m Legea lui Beer (sau legea Lambert-Beer):
A = ε C l = α l, în care: A este absorția; ε este absorția molară a absorbantului; C este concetrația de absorție a speciilor în material; l este distanța străbătută de lumină prin material; α este coeficientul de absorție al substanței.
12/3/2010
Biosenzori
93
5
m Principalele tipuri de comportări fotometrice care au fost utilizate în biosenzori sunt următoarele: • • • • •
absorția ultravioletă vizibilă; emisia fluorescentă și fosforescentă; bioluminescența; chemiluminescența spectroscopia reflexiei interne (IRS – Internal Reflection Spectroscopy); • metode de împrăștiere a luminii laserului.
12/3/2010
Biosenzori
6
. Fibre optice m Fibrele optice sunt ghidurile de undă pentru lumină. Primele fibre optice au fost realizate din sticlă, iar în momentul de față sunt realizate din materiale polimerice, fiind mult mai ieftine decât sticla și decât firele din metal folosite la cablurile electrice. Structura unei fibre optice este prezentată în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
94
7
m Undele luminoase se propagă dealungul fibrei pe baza reflexiei interne totale (TIR – Total Internal Reflection). Aceasta este prezentată în figura de mai jos.
12/3/2010
Biosenzori
8
m Reflexia internă totală depinde de unghiul de incidență și de indicii de refracție a mediului. m Legea lui Snell:
sin θ n2 = = n, sin φ n1 m Dacă φ = π/2 rad și θc = θ, atunci θc = n2/n1, în care θc este unghiul critic pentru reflexia internă totală. Dacă sinθ > n2/n1, atunci avem reflexie internă totală. Dacă sinθ < n2/n1, atunci avem reflexie și refracție. m Principiile de mai sus se aplică unei unde armonice plane și unei unde cilindrice. Trebuie luate, însă, în considerare efectul de modificare a fazei și a coturilor în fibră. 12/3/2010
Biosenzori
95
9
m În cadrul senzorilor ghidurile de undă se utilizează în două moduri: extrinsec și intrinsec. m În modul extrinsec ghidurile de undă se comportă simplu – lumina este transmisă de la sursa de lumină la colectorul luminii. În cadrul acestui mod se utilizează adesea legea lui Beer. m În modul intrinsec lumina este modificată de măsurand: faza, polarizarea și intensitatea pot fi modulate înăuntrul fibrei de către măsurand aflat înăuntrul adâncimii de penetrare pentru câmpul evanescent adiacent ghidului (vezi figura următoare).
12/3/2010
Biosenzori
10
Modelul unui senzor intrinsec bazat pe enzimă care utilizează o fibră cu membrană din polistiren
12/3/2010
Biosenzori
96
11
4. Construcția circuitelor m Spre deosebire de traductoarele electrochimice, la care se utiliza un electrod de referință, la traductoarele optice nu este necesar un astfel de electrod. Cu toate acestea, sistemul funcționează mai bine cu o referință necompletată (spațiu liber), situație în care sursa de lumină este împărțită între eșantion și referință. Detecția poate fi afectată la lungimi de undă analitice și de referință diferite, putând astfel obține raportul semnalelor la două lungimi de undă. Acest lucru elimină împrăștierea și fluctuațiile sursei. m Ghidurile de undă pentru diferite forme de lumină necesită realizarea lor din diferite materiale: - plastic (de exemplu poliacrilamida) pentru λ > 450 nm; - sticla pentru λ > 350 nm; - silice (SiO2) topită pentru λ < 350 nm; - ghiduri din cristal de germaniu pentru λ > 1000 nm. 12/3/2010
Biosenzori
12
m În cadrul senzorilor fotometrici reactivul trebuie imobilizat astfel încât să interacționeze cu analitul pentru formarea unui complex cu proprietăți optice distincte, care pot fi monitorizate de senzor. Aceast lucru poate fi realizat în două moduri, după cum urmează. r Metoda directă m Analitul A poate forma împreună cu reactivul R un complex:
AR
A+R
[ AR] K= [A][R] 12/3/2010
Biosenzori
97
13
m Dacă {R} este concentrația totală de reactiv, atunci avem:
{R} = [R ] + [AR ] m În această situație concentrația reactivului liber este egală cu:
[R ] = {R} 1 + K [ A] iar concentrația reactivului combinat este egală cu
[AR ] = K [A]{R} 1 + K [ A] m Se observă că nu există o relație simplă între semnalul datorat reactivului liber și analitului sau între reactivul combinat și analit. 12/3/2010
Biosenzori
14
m Dacă parametrul optic măsurat este proporțional cu [AR], atunci la concentrații mici răspunsul este proporțional cu [A], astfel încât [A] << 1/K; dacă [A] >> 1/K, atunci răspunsul este saturat la o valoare limită. m Dacă răspunsul este proporțional cu [R], atunci semnalul va scădea o dată cu creșterea concentrației [A]. În această situație se obține o relație liniară:
{R} = 1 + K [A] [R ] m O modalitate mai bună este aceea de a utiliza două lungimi de undă, una pentru AR și alta pentru R (referința). În această situație se obține o relație liniară independentă de {R}:
[AR ] = K [A] [R ] 12/3/2010
Biosenzori
98
15
r Metoda indirectă m Uneori se utilizează metoda legăturii competitive. Aceasta este utilă, în particular, când nici analitul și nici reactivul nu prezintă în cazul legaturii o modificare spectrală, caz în care un analit analog poate fi utilizat. Aceasta este o substanță similară cu analitul care are caracteristici optice inerente sau care induce la legătură o modificare optică. Caracteristica optică este adesea la analitul analog, ca de exemplu, o etichetă fluorescentă. În determinarea glucozei un ‘reactiv’ potrivit, numit bioreceptor, este concavalina A (Con A), iar analitul analog potrivit este dextran etichetat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC-dextran). Con A este o proteină derivată din leguma Conavalia ensiformis (fasolea sabie din Madagascar) care stimulează proliferarea limfocitelor T.
12/3/2010
Biosenzori
1
Concavalina A
12/3/2010
Biosenzori
99
2
m Con A este imobilizată pe o fibră goală cu membrana din celuloză, ca în figura următoare. Două moduri de realizare a biosenzorilor pentru glucoză utilizând dextran etichetat cu izotiocianat de fluoresceină (FITC) și Con A.
12/3/2010
Biosenzori
3
m FITC-dextran se poate deplasa liber în interiorul celulei optice, dar nu poate difuza în afară direct prin membrană. Analitul poate difuza direct prin membrană în celula optică datorită dimensiunilor relative diferite ale analitului și analitului analogic (A*). În absența zaharurilor, analitul analogic formează un complex cu receptorul R:
A* + R
A* ·R
m Complexul obținut elimină o parte din receptor de pe pereții fibrei, fapt care conduce la observarea unui semnal echivalent cu 20% din maximul fluorescenței.
12/3/2010
Biosenzori
100
4
m Când analitul A este introdus apare un echilibru competitiv între analit și receptor:
A·R
A+R
m Aceasta conduce la creșterea cantităților de receptor deplasate de pe pereți rezultând creșterea fluorescenței semnalului. Eventual, întregul receptorul este liber, caz în care nu se vede o creștere a fluorescenței semnalului (semnalul este saturat).
12/3/2010
Biosenzori
5
Răspunsul pentru diferite zaharuri
12/3/2010
Biosenzori
101
6
m Putem analiza comportarea pe baza reacțiilor următoare:
A+R
A·R
A* + R
A*·R
m În cazul unei legături unipolare simple, constantele de echilibru pentru cele două procese de legătură sunt:
K=
[A ⋅ R] [A][R]
K* =
[ A * ⋅R ] [A *][R]
12/3/2010
Biosenzori
7
m Notăm cu {R} concentrația totală a receptorului, iar cu {A*} concentrația totală a analitului analog. m Concentrațiile totale se conservă:
{R} = [R ] + [A ⋅ R ] + [A* ⋅ R]
{A }= [A ]+ [A ⋅ R] *
*
*
m Cele patru ecuații prezentate anterior conduc la următoarea ecuație de gradul doi:
([A ]/{A }) + ([A ]/{A })({R}/{A }− 1) + K{A[A}]K+ 1 − K{A[A}]K+ 1 = 0 *
* 2
*
*
*
*
12/3/2010
Biosenzori
102
*
*
*
8
m [A*]/{A*} reprezintă răspunsul normalizat; el are valori cuprinse între 0 și 1. m Sensibilitatea este funcție de {A*}. m Răspunsul normalizat este funcție de doi termeni {R}/{A*} și (K[A] + 1)/{A*}K*. Concentrația analitului apare în al doilea termen. Astfel, o caracterizare completă a modelului sistemului poate fi obținută prin reprezentarea grafică a răspunsului normalizat în funcție de (K[A] + 1)/{A*}K* pentru diferite valori ale raportului {A*}/{R}. Un exemplu de astfel de grafic este prezentat în figura următoare.
12/3/2010
Biosenzori
9
Dependența [A*]/{A*} =f((K[A] + 1)/{A*}K*), pentru diferite valori ale raportului {A*}/{R}.
12/3/2010
Biosenzori
103
10
Graficele prezentate anterior pot fi utilizate pentru estimarea celor mai potrivite condiții pentru realizarea unui biosenzor, prin următoarea procedură: (i) Se estimează concentrația analitului corespunzătoare mijlocului domeniului, [A’]. (ii) Se selectează un bioreceptor care are o constată de legătură de ordinul 10/[A’]. (iii) Se estimează minimul concentrației analitului analog A* care poate fi estimat cu sistemul optic, [A*’]; se presupune că {A*} este aproximativ egal cu 50[A*’]. (iv) Se selectează (sau sintetizează) un compus analogic astfel încât K* = 1/ [A*’]. (v) Se implementează o tehnică pentru încărcarea compartimentului senzorului cu bioreceptorul R astfel încât concentrația site-urilor să fie aproximativ egală cu 100{A*}. m
12/3/2010
Biosenzori
11
m Aplicând aceste principii la un senzor pentru determinarea glucozei, domeniul pentru glucoza în sânge este de 1 – 5 mgml-1; ca urmare [A’] este egală cu 2,5 mgml-1 (0,025 M). Constanta K pentru Con A legată cu glucoza este de 320 M-1. Cantitatea maximă de Con A care poate fi imobilizată pe suprafața interioară a fibrei de dializă determină o concentrație efectivă de 10-5 M. Constanta de legătură K* între FITC-dextran și Con A este aproximativ egală cu 7,5x104 M-1. Concentrația totală de FITCdextran {A*} este aproximativ egală cu 1,5x10-6 M. Valoarea pentru K[A’] a fost în jurul valorii 6, cu glucoza la nivelul de 2,5 mgml-1, iar {R}/[A*] a fost egală cu 7. m Datele de mai sus satisfac criteriul prezentat anterior.
12/3/2010
Biosenzori
104
12
