DEFINICIJA Bios iosenzor se može ože definisa isati kao uređaj koji ima ugrađenu biološki aktivnu komponentu u bliskom kontaktu sa fizičk fizičko-h o-hem emijsk ijskim im pretva pretvarač račem em i proces procesoro orom m elektr elektrons onsko kog g signala Analit od interesa
Smetaj etajuća ućavrsta vrsta
Biokom Bi okomponenta Pretvarač
Signal
Procesor
Slika 1. - Shema biosenzora
Svaki biosenzor se sastoji od
o Pretvarača
(transducer) - pretvara uočenu promenu (fizičku ili hemijsku) u mereni signal
Prepoznavajuće ajućeg g o Prepoznav
agensa agensa – koji koji omogućav omogućava a merenje merenje samo one vrste koja nam je od interesa a koja se nalazi u smeši sa drugim vrstama
Slika 2. – Princip biosenzora
BIOKOMPONENETE Enzimi Antitela Membrane Organele Ćelije Tkiva Receptori PRETVARAČI Elektrohemijski Optički Piezo-električni Kalorimetrijski Akustični Enzimi Biološki elementi koji se najčešće koriste Mogu biti korišćeni u čistom obliku ili prisutni u mikroorganizmima ili biljnom materijalu bez prethodnog izolovanja Aktivnost mnogih enzima uključuje oksidaciju i redukciju koje mogu biti detektovane elektrohemijski Postoji pet glavnih klasa enzima. Oksidoreduktaze Transferaza Hidrolaze Liaze Izomeraze Oksidoreduktaze Dehidrogenaze Oksidaze Peroksidaze Oksigenaze
Prednosti enzima:
*
lako se vežu za odgovarajući supstrat
*
visoko su selektivni
*
imaju katalitičku aktivnost
*
brzo se aktiviraju
Enzimi su najčešće korišćene biološke komponente Mane enzima:
* *
skupi su
često pretvaraču
*
gube
aktivnost
dok
se
imobilizuju
na
gube aktivnost posle relativno kratkog vremenskog
perioda Antitela Vezuju se specifično za odgovarajući antigen Prednosti:
*
veoma su selektivni
*
ultra osetljivi
*
veoma se snažno vezuju
Jedina mana im je što nemaju katalitički efekat Nukleinske kiseline slične antitelima koriste se za detekciju genetskih bolesti, kancera i virusnih infekcija
DNK istraživanja često uključuju dodatak označene DNK u
sistem dodatkom nekog radioaktivnog elementa ili elektrofore Metode imobilizacije Povezivanje selektivnih elemenata adsorpcijom selektivnog elementa na površinu kovalentnim vezivanjem mikrokapsulacijom cross-linking – koristi se bifunkcionalni agens da hemijski poveže pretvarač i selektivnu komponentu ‘zarobljavanjem’ - selektivni element se nalazi uhvaćen unutar gela, paste, ili polimera TIPOVI BIOSENZORA Enzim/metabolički biosenzori
* Enzimske elektrode i ćelijske elektrode Bioafinitetni senzori
* Antitela * Nukleinske kiseline * Lektin Enzim/metabolički senzori Supstrat + Enzim Bioafinitetni senzori Ovi senzori se baziraju na interakcijama povezivanja između imobilizovanih biomolekula i analita od interesa.
Ove interakcije su visoko selektivne.
Pimeri obuhvataju antitelo-antigen interakcije, nukleinske kiseline za komplementarne sekvence i lektin za šećer Bioafinitetni senzori Pretvarači
* Potenciometrijski
* Amperometrijski
* Konduktometrijski POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI Kod potenciometrijskih senzora izmereni potencijal na selektivnoj memembrani ili elektrodnoj površini, koja je u kontaktu sa rastvorom, povezan je sa koncentracijom analita
Potencijal se meri pri nultoj struji i prema referentnoj elektrodi (relativni)
pH elektroda je osnovni potencionetrijski pretvarač u biosenzorima. POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI E = Eo + RT/nF ln[analit]
* Eo konstanta za sistem * R univerzalna gasna konstanta * T apsulutna temperatura * n broj izmenjenih elektrona * F Faradejeva konstanta * ln[analit] prirodni logaritam od aktiviteta analita.
Najpoznatiji potenciometrijski senzor je jon-selektivna elektroda (ISE)
Tečne polimerne membranske elektorde su komercijalno raspoložive i rutinski se koriste selektivnu detekciju nekoliko jona (K +, Na+, Ca2+, NH4+, H+, CO32-) u složenim biološkim osnovama Antibiotici nonactin i valinomicin služe kao neutralni nosači za određivanje NH4+ i K +
Glukoza
glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2
enzim:GOD
dolazi do promene pH zbog nastanka glukonske kiseline
merenjem promene potencijala (pH) možemo odrediti koncentraciju glukonske kiseline (a samim tim i glukoze)
ISE koje se koriste u kombinaciji sa imobilizovanim enzimoma mogu da služe kao osnova elektroda koje su selektivne za specifične enzimske supstrate
Od njih su dva glavna: za ureu i za kreatinin.
Ove potenciometrijske enzimske elektrode se prave ubacivanjem enzima ureaze i kreatinaze na površinu katjon osetljive (NH4+) ISE
Urea
CO(NH2)2 + 2 H2O → (NH4)2CO3
koncentraciju uree možemo određivati katjonske amonijum selektivne elektrode
primenom
ili možemo napraviti alkalni rastvor i određivati slobodni amonijak koristeći amonijum selektivnu gasnu elektrodu
Osetljivost odnosno granica detekcije iznosi (10-6 M )
Oksalati
C2O42- → 2 CO2 + H2O
oksalat oksidaza
Određivanje oksalata dijagnostike hiperokslurije
u
urinu
je značajno
prilikom
Potenciometrijski pretvarač kod biosenzora koji se koristi za određivanje koncentracije CO2 (odnosno oksalata u mokraći) je CO2 gasna elektroda
Glukoza
Koristimo jodid selektivnu elektrodu
glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2 enzim:GOD
H2O2 + 2 I- + 2 H+ → I2 + 2 H2O enzim:PO
Jodid-selektivna elektroda prati smanjenje koncentracije jodida što je prouzrokovano dejstvom vodonik-peroksida AMPEROMETRIJSKI BIOSENZORI Kod amperometrijskih biosenzora elektrodni potencijal se drži na konstantnoj vrednosti dovoljnoj za oksidaciju ili redukciju vrste od interesa (ili supstance elektrohemijski vezane za nju)
Jačina struje koja protiče je proporcijonalna koncentraciji analita
Id = nFADsC/d
Amperometrijske enzimske elektrode koje se baziraju na oksidazama u kombinaciji sa vodonik proksid indikatorskim elektrodama postale su najuobičajeniji biosenzori
Kod ovih reakcija prati se, potrošnja kiseonika ili proizvodnja vodonik peroksida
Prvi razvijeni kiseonične elektrode
biosenzor
bazirao
se
na
korišćenju
imobilisan je u poliakrilamidnom gelu na gas-propusnoj membrani koja pokriva elektrodu Kroz razvoj biosensora se susrećemo hronološki sa tri generacije na osnovu mehanizma dejstva: Enzim
*
glukooksidaza
(GOD)
prva generacija – senzori bazirani na kiseoničnim
elektrodama
*
druga generacija – senzori bazirani na medijatorima
*
treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima
i
Mana kiseoničnih senzora je što su veoma skloni smetnjama od strane spoljašnjeg kiseonika
Zbog toga pratimo koncentraciju proizvedenog vodonik peroksida, a ne kiseonika koji se troši u reakciji H2O2 → 2H+ + 2e- + O2
Na primenjenom potencijalu anodne oksidacije vodonik peroksida različita organska jedinjenja se oksiduju (vitamin C, mokraćna kiselina, glutation itd.) Preduzeti su različiti pristupi za povećanje selektivnosti detektujuće elektrode, njenim hemijskim modifikacijama, korišćenjem:
*
membrana
*
medijatora
*
metalizovanjem elektroda
* polimera
1.Membrane. Razvijene su različite permiselektivne membrane, koje kontrolišu vrste koje stižu do elektrode, na bazi naelektrisanja i veličine Primeri
obuhvataju
celuloza acetat (naelektrisanje nafion (naelektrisanje) polikarbonat Nedostatak na
2.
korišćenja membrana
Medijatori
druga
i
i
veličina), (veličina).
je njihov uticaj difuziju.
generacija
biosenzora
Mnogi oksidaza enzimi mogu da koriste veštačke elektron akceptorske molekule, koji se nazivaju medijatori Medijator je niskomolekulski redoks par koji može da prenese elektrone sa aktivnog mesta enzima na površinu elektrode, i na taj način uspostavlja električni kontakt izmađu njih Ovi medijatori imaju širok opseg struktura, a samim tim i osobina, uključujući i opsege redoks potencijala
Kao medijatori se koriste katjoni prelaznih metala i njihovi kompleksi
Jedan od boljih medijatora je ferocen(Fc) – sendvič kompleks gvožđa i dva ciklopentadienil(Cp) anjona
Princip dejstva medijatora na bazi ferocena
glukoza + GODOx → glukonolakton + GODR + 2H+
GODR + 2Fc+ → GODOx + 2Fc
2Fc – 2e- → 2Fc+
Dobri medijatori bi trebalo da:
*
brzo reaguju sa enzimima
*
reverzibilno izvode transfer elektrona
*
imaju mali nadpotencijal pri regeneraciji
*
nezavisni su od pH vrednosti
*
stabilni su i u oksidovanom i u redukovanom obliku
*
ne reaguju s kiseonikom
*
nisu otrovni
Ferocen zadovoljava sve uslove
Primeri medijatora koji se obično koriste:
* Ferocen (nerastvoran) * Ferocen dikarbonska kiselina (rastvoren) * Dihloro-indofenol (DCIP) * Tetrametil-fenilenediamin (TMPD) * Fericijanid * Rutenium hlorid * Metilen Plavo (MB)
Primeri uobičajeno upotrebljavanih polimera:
* polipirol
* politiofen * polianilin * diaminobenzen * polifenol Treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima Neophodan je da medijator bude ugrađen zajedno sa enzimom u elektrodu
Nema redukcije ili oksidacije enzima direktno na elektrodi da bi se sprečila denaturacija na površini elektrode i gubitak enzimsku aktivnost
