biosensori

5/13/2018

biosensori-slidepdf.com

Curs BIOSENSORI Introducere Ce este un biosensor? Definitia unui biosensor Proiectarea si constructia biosenzorilor; Principiul de functionare Principiul detectiei *Detectia electrochimica Clasificare Componentele biosensorului Exemple de electrozi enzimatici din generatia a I-a Electrozi enzimatici din generatia a II-a Electrozi enzimatici bazati pe enzime FAD-dependente Electrozi enzimatici bazati pe enzime NAD-dependente

http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

1/120

5/13/2018


• Notiuni de voltametrie ciclica • Electrozi chimic modificati • Mediatori redox


2/120

5/13/2018


Ce este un biosensor?

Este un detector (instrument analitic) care converteste (transforma) semnalul biochimic intr-un semnal -electric, optic, termic sau mecanic- masurabil (cuantificabil)

Analiti

Bioreceptor Traductor (catalitic fizico-chimic afinitate)

Componenta electronica

Reprezentarea schematica a unui biosenzor http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

3/120

5/13/2018



4/120

5/13/2018


Ce au in comu n? Biosensor

Analit / bioreceptor / traductor / procesor

Nas

Molecule mici / membrana olfactorie / celule nervoase / creer

Ochi

Lumina / bare si conuri / celule nervoase / creer


5/120

5/13/2018


Principiul de constructie si functionare a unui biosenzor Un biosensor este un instrument analitic constand dintr-un component biologic imobilizat, responsabil pentruadecvat. recunoasterea selectiva a speciei de analizat, aflat in contact intim cu un traductor

Interactie “cheielacat“

Analati

METABOLITI, IONI, GAZE VAPORI ORANICI

ENZIME, ANTICORPI ORGANITE, CELULE

Etapa generarii semnalului BIOCOMPONENT

Transmiterea

semnalului

TRADUCTOR

ELECTROCHIMIC, OPTIC CALORIMETRIC PIEZOELECTRIC

Amplificare si procesare

Interactia specifica de bioafinitate (ex. “lacat-cheie”) dintre analit de determinat si elementul de recunoastere conduce la o modificare fzico-chimica, care este detectata de traductor, masurata si procesata adecvat. http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

6/120

5/13/2018


Principiul Detectiei


Masoara modificari de

masa


distributie electrica


intensitate luminoasa


caldura

7/120

5/13/2018


Sa permita o masurare selectiva a analitului de determinat in cadrul unei metode care necesita un minimum de preparare a probei

§Poate

fi reutilizabil (prezinta un raspuns reversibil)

§“Disposable”


(de unica folosinta)

8/120

5/13/2018


CLASIFICAREA BIOSENSORILOR Functie de:

Elementul de recunoastere moleculara

Tipul traductorului

Reactiile monitorizate ex. redox hidroliza

Speciile monitorizate

Monitorizare directa a

Monitorizare indirecta a

-concentratiei de analit -reactiilor in care se consuma

Inhibitorilor sau a activatorilor elementelor de recunoastere biologica

sau se produc substrate noi


9/120

5/13/2018


Diferitele categorii de biosensori


10/120

5/13/2018


TRADUCTORUL BIOMOLECULAR (asigura selectivitatea biosenzorului)

Avantaje

si

Dezavantaje

Enzime Sinzime

Selectivitate mare

activitate

Stabilitate limitata

Sisteme mutienzimatice

Cresterea posibilitatilor de imobilizare, marirea gamei de compusi detectabili

Cresterea interferentelor, probleme legate de optimizarea conditiilor de lucru

Tesut animal sau vegetal

Simplitatea constructiei biosenzorului, marirea gamei de compusi detectabili

Cresterea interferentelor si a timpului de raspuns al biosenzorului

Microorganisme

Varietate mare, simplitatea constructiei, posibilitati de regenerare

Selectivitate redusa, mare de raspuns

Selectivitate mare Relative ieftini

Cost ridicat Selectivitate limitata

selectivi

instabili

Organite celulare

timp

Anticorpi monoclonali policlonali Acizi nucleici Aptameri Receptori celulari Receptori sintetici


11/120

5/13/2018


TRADUCTORUL FIZICO-CHIMIC (asigura sensibilitatea biosenzorului)

Electrochimic

Modul de masurare (marimea masurata)

Potentiometric (potentialul)

Avantaje

Dezavantaje

Domeniu mare de raspuns; instrumentatie simpla

Variatie logaritmica a raspunsului; selectivitate limitata Posibile interferente

Amperometric (curentul) Impedimetric (impedanta)

Variatie liniara raspunsului

a

Coductometric

Conductivitatea (conductanta)

Pret de cost scazut

neselectivi

Optic/optoelectronici (absorbanta, fluorescenta, luminiscenta, unda

Optic fibre optice

Dimensiuni mici, raspuns rapid, maresc domeniul compusilor detectabili

Instrumentatie speciala, probleme in cazul solutiilor tulburi

Dimensiuni reduse

Raspuns lent

Simpli, liniar

Neselectivi, dificultati de lucru in faza gazoasa

evanescenta) Piezoelectric Termistor

Modificari de (frecventa)

masa

Calorimetric/termometric (caldura/temperatura)

raspuns

Magnetic


12/120

5/13/2018


Componentele biosensorului •

Bioreceptor care costa dintr-o biomolecula ex. enzime, anticorpi, acizi nucleici care recunoaste un analit specific;

•

Traductor care converteste etapa de recunoastere intr-un semnal masurabil;

•

Procesarea semnalului

Elementele biosensorului


13/120

5/13/2018


1. Analit (substrat)

Tipul/natura: biologic, chimic (chiar anaorganic) Microbi (antrax, E.coli, Candida, Salmonella) Molecule mici (glucoza, alcool, CO, CO2, uree, pesticide, aspirina, paracetamol, penicilina, TNT, colesterol, amino acizi)

Bio-macromolecule (AND, ARN, enzime, proteine, hormoni, virusuri)


14/120

5/13/2018


Anticorp

Acizi nucleici

Receptori proteici

FAD din Gox

Selectivittate/ stabilitate Receptori biochimici Organisme Tesuturi Cellule Organite

Enzime Anticorpi Acizi nucleici Chemoreceptori

Membrane http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

15/120

5/13/2018


Membrana este un amestec de proteine si alte molecule imbibate in matricea fluida a dublului strat lipidic Glicoproteine

Fluid extracelular

Glicolipide

Fosfolipide Colesterol Proteina periferica


Citoplasma

Proteine transmembranare Filamentele citoscheletului 16/120

5/13/2018


Functiile Proteinelor Membranare Exterior Membrana plasmatica Interior

Transportor

Activitate enzimatica

Marker de suprafata Adeziune celulelor de identificare http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

Receptor celular de suprafata

Atasare de citoschelet 17/120

5/13/2018


PROBLEME LEGATE DE TRADUCTORUL BIOCHIMIC

ØStabilitate ØPret ØNecesitatea

mica a biomoleculelor

de cost ridicat pentru enzime si receptori

adaugarii unor compusi suplimentari (ex. Oxigenul, cofactori)

ØProbleme

legate de imobilizarea biocomponentilor

ØPerformante ØCompatibilitate

scazute in medii neapoase

scazuta relativa la tehnologia de microfabricare rezultind in

dificultati legate de proiectarea multisenzorilor ØDimensiunile moleculare


18/120

5/13/2018


Biosensorul ideal • Sensibilitate mare • Selectivitate mare • Timp de raspuns si revenire rapid • Pret de cost scazut • Usor de utilizat


19/120

5/13/2018


Dializa

Receptor

Traductor

® ® ®

Prima generatie

MEMBRANA

A doua generatie

Componenta electronica

SENSOR

® ® ® SENSOR MODIFICAT BIOCHIMIC

A treia generatie

® ® ® Biochip

Generatiile de biosensori. R - receptor


20/120

5/13/2018


Electrozi enzimatici


21/120

5/13/2018


BIOSENSORII au fost clasificati functie de modul de transfer de electroni dintre enzima si electrod in 3 generatii

La o valoare de potential controlata aplicata la suprafata senzorului amperometric biosenzorii genereaza un semnal analtic (curent) care este corelat direct cu concentratia compusului de analizat


22/120

5/13/2018


Domeniul optim de potential: - 200 si 0,0 mV

*curenti de baza mici, zgomot redus *nu are loc reducerea oxigenului *interferente minime datorate oxidarii acidului ascorbic acidului uric paracetamol, etc

3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004 http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

23/120

5/13/2018


Oxido- reductazele “enzimele redox” reprezinta o clasa bine cunoscuta de macromolecule chimice care sunt comercializate si folosite drept element de biorecunoastere in constructia biosenzorilor

Transfer de electroni S

Enzox

e

-

electrod P

Enzred

Ele reprezinta o provocare pentru chimistii electroanalisti acestea fiind ideal de utilizat in constructia biosenzorilor deoarece ele catalizeaza reactii de oxido-reducere ale diferitelor substrate si ar putea fi implicate in reactii cu transfer direct de electroni cu suprafata electrodului A.Heller, Electrical Connection of Enzyme Redox Centre to Electrodes, J. Phys.Chem. 96 (1992) 3579-3587


24/120

5/13/2018


Prima generatie

3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004 http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

25/120

5/13/2018


Electrod enzimatic

Solutie de analit


Strat bio- activ

Traductor ectrochimica

26/120

5/13/2018


Inventator Leland C. Clark Jr.

Electrodul de oxigen a stat la baza Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs 2, 41-48 (1956) Ann. NY Acad. Sci. 102, 29-45 (1962).

in 2005 a obtinut Premiul Fritz J. and Dolores H. Russ.Foto realizata cu aceea ocazie

“constructiei unor sensori electrochimici mai inteligenti prin fixarea unei enzime”

GOx β − D − glucoza + O2    → δ − D − glucono - lactona + H2 O2

Updike, S.J. and Hicks, J.P. Nature 214, 986-988 (1967)


27/120

5/13/2018


Biosensorul pentru glucoza

Detectia apei oxigenate folosind un electrod de Pt Reactia enzimatica Glucoza Glucozoxidaza + O2

S

Glucolactona + H 2O2

E E

H 2O2

H 2 O2

Reactia electrochimica 2 H + + O2 + 2 eE > + 0,6 V

H2O2 formata difuzeaza atit

cit si spre

in afara membranei spre solutie

suprafata unui electrod de platina unde este oxidata electrochimic FG.G. FS.J.

Guilbault, G.J. Lubrano, Anal.Chim.Acta, 60 (1972) 254

Updike, G.P. Hicks, "The Enzyme Electrode", Nature, 214, 1967


28/120

5/13/2018


Exemple de biosensori din prima generatie METABOLIT PRODUS ELECTROACTIV Reactia Substrat + O2

ENZIMA

PRODUS ELECTROACTIV

SENZOR electrochimic Enzima

VARIATIE SEMNAL ELECTRIC Produs + H2O2

(oxidaza)

Glucoza + O2

E1

acidul gluconic + H2O2

E2

Lactatul + O2

Piruvat + H2O2 hidrolaza

Urea


ureaza

-

HCO3 +

+ NH4

29/120

5/13/2018



30/120

5/13/2018


BIOSENZORI CLASICI (prima generatie) DOMENIUL CONCENTRATIILOR DE SUBSTRAT CARE POT FI DETERMINATE PRIN INTERMEDIUL DIFERITILOR SENZORI ELECTROCHIMICI

METODA

SENZOR

Dom. Conc. mol/l

Potentiometrie

H+, Na+, CN-, NH4+, I-

10-5 – 10-2

Amperometrie

Pt/H2O2

10-7 – 10-3

Sensor de gaz potentiometric

NH3, CO2

10-4 – 10-2

Sensor de gaz amperometric

Oxygen

10-5 – 10-4


31/120

5/13/2018


PANCREASUL ARTIFICIAL

POMPA ANALITICA

ANALIZA

INJECTAREA INSULINEI

COMPUTER

GLUCOZEI


32/120

5/13/2018


INJECTAREA INSULINEI

0,5 C B ) A n ( I

0,3

A ASIMILAREA GLUCOZEI 360 mg/dL

0,1 0

15

30

TIMP (minute)

SEMNALUL DAT DE UN SENZOR PENTRU GLUCOZA IN TIMPUL VARIATIEI DE GLUCOZA INTR-UN SOARECE ANESTEZIAT A = MASURAREA GLUCOZEI INITIALE B = MASURAREA GLUCOZEI DUPA ASIMILAREA DE GLUCOZA C = MASURAREA GLUCOZEI IN URMA INJECTARII DE INSULINA


33/120

5/13/2018


Biosensor pentru determinarea alcoolului

El are la baza un sensor amperometric de Pt pentru H 2O2 acoperit cu o membrana continind alcool-oxidaza (Aox) imobilizata si cu o membrane hidrofoba gaz permeabila, care elimina majoritatea interferentelor posibile. Alcoolul din saliva difuzeaza prin membrane gaz permeabila si reactioneaza cu enzima conform ecuatiei:

AOx

Alcool + O2 H2O2 + Acetaldehidea Aox = alcool oxidaza H2O2 produsa este masurata de sensorul amperometric si corelata cu concentratia de alcool din saliva. Alcoolul are o presiune de vapori relativ mare ceea ce duce la eliminarea interferentelor datorate compusilor nevolatili.


34/120

5/13/2018


Etanol

Acetaldehidă

ADH

NAD+

ADH=alcool dehidrogenaza

NADH + H+

Detecţie la 340nm

Principiul determinarii spectrometrice a alcoolului

Concentraţia de NADH creşte proprorţional cu cea a etanolului. NADH-ul este determinat pe baza absorbanţei lui la 340nm


35/120

5/13/2018


• exemplu reprezentativ de steroid • component esential in membranele celulare animale •

precursor in biosinteza tuturor steroizilor, hormonilor, a vitaminei D etc.

• stocat in celule sub forma unui ester a acizilor grasi

Valori normale: colesterol liber- 1,29-2,07 mM colesterol total- 3,36-6,47 mM


36/120

5/13/2018


Reactia catalizata de enzima •

Colesterol oxidaza (COx) Colesterol

+

O2

COx

Colesterol-4-en-3-ona

+ H2O2

Reactia bioelectrochimica de detectie a colesterolului


37/120

5/13/2018


C OXIDAZE

-

acceptorul natural de e O2

Dezavataje:

solubilitate limitata a O2 H2O2 denatureaza enzima H2O2 poate reationa cu alte substante din solutie species Eappl > -600mV +

-

2OH-

O2 + 2H + 4e

C Electrodul Clark dezavanaje:

masoara scaderea semnalului (semnal de baza mare) Supra-potential Eappl > +600mV

H2O2

C dezavantaje:

O2 + 2H+ + 2e-

supra-potential raspunsul electrodului nu este stabil


38/120

5/13/2018


Prima generatie de biosensori

Oxidarea electrochimica a H2O2 la suprafata electrozilor conventionali are loc la valori de potentiale ≥ + 600 mV fata de Ag|AgCl •Sistemul este supus unor reactii de interferenta •Raspunsul nu este stabil in timp

Electrochimia O2 si H2O2 sufera de aplicarea unor valori mari de potentiale = suprapotentiale


39/120

5/13/2018


I. Probleme in electrochimia proteinelor • Existenta unor viteze mici cu transfer de electroni cu

sau in interiorul proteinelor (viteza transferului de electroni reprezinta etapa limitativa de viteza ). Ø

necesara realizarea unei orientari speciale proteina-electrod

• Adsorptia la suprafata electrodului Ø

proteinele trebuie sa fie de puritate analitica

(!!) Ambele fenomene impun necesitatea modificarii suprafatei de electrod


40/120

5/13/2018


ADSORBTIA ORIENTATA A PROTEINELOR REDOX LA SUPRAFATA ELECTRODULUI MODIFICAT CU PROMOTOR

M. J. Eddowes, H.A.O. Hill, J. Am. Chem. Soc., Chem. Commun., 771-772 (1977).


41/120

5/13/2018


TIOLI FOLOSITI CA PROMOTORI PE Au


42/120

5/13/2018


EFECTUL Promotorilor ASUPRA ENZIMEI E

cresterea stabilitatii operationale si pe termen lung a enzimei in pasta E

E

imbunatatirea cineticii enzimatice

produce legarea corecta a enzimei redox pe suprafata electrodului, facilitand transferul direct de electroni

L. Guo and H. A. O. Hill, Direct Electrochemistry of Proteins and Enzymes , Adv. Inorg. Chem., 36 (1991) 341- 375.


43/120

5/13/2018


Mono-straturi auto-asamblate (SAM) folosite in orientarea-reconstructia enzimelor

+ apo-HRP + hemina (si EDC) + diaminoalcani SAM mixte ex., Gox, GDH-PQQ

Refacerea HRP la suprafaţa unui electrod de aur modificat cu grupări tiol-heminice H. Zimmermann, A. Lindgren, W. Schuhmann, L. Gorton, Chem. Eur. J. 6 (2000) 592-599


44/120

5/13/2018


II. Probleme in electrochimia proteinelor •

Difuzia lenta a proteinei Ø

•

trebuie utilizati transportori de electroni redox activi (mediatori).

Reactiile cu transfer de electroni (ET) sunt deseori cuplate cu transferul de protoni Ø

potentialele redox sunt puternic dependente de pH.


45/120

5/13/2018


Elctrozi chimic modificati


46/120

5/13/2018


Electrozi chimic modificati

Llimitarile metodelor electrochimice în analiza şi sinteza chimica: - pasivarea electrodului datorită adsorbţiei sau depunerii pe suprafaţa acestuia a unor compuşi chimici sau a unor precipitate nedorite; - existenţa unor viteze de reacţie electrochimică mici pentru anumite specii chimice care în aceste condi ţii necesită aplicarea unui suprapotenţial pentru realizarea reacţiei.


47/120

5/13/2018


ELECTROZI CHIMIC MODIFICATI (CME)

Un electrod chimic modificat poate fi definit ca reprezentând o modificare raţionala intentionată a structurii moleculare a suprafe ţei electrozilor convenţionali în scopul utilizării lor în cadrul unor aplicaţii specifice

Electrozii chimic modificaţi (CMEs) se bazează pe fixarea unui centru redox (mediator) pe suprafaţa electrodului. Acesta funcţionează ca un mediator pentru transferul rapid de electroni Spre molecula de substrat, care in lipsa mediatorului este oxidat sau redus lent (sau deloc în unele cazuri) la suprafaţa unui electrod convenţional.


48/120

5/13/2018


(Bio)compozite / Integrate electroanalitice (bio)sisteme (Bio)sensori amperometrici bazati pe particule conductoare (bio)compozite

Electrozii chimic mo dificati (Chemosensori) Electrozii modificati biologic (Biosensori)

R

R R

R

TT

R

R

R

R

R Mo dificarea suprafetei R

Modificatori Electrocatalizatori Enzime Anticorpi ADN

T

Carbon Aur Platina

R

R

R

R R

R R

R

R R

Modificarea in masa “Bu lk” Biocompozite • moi/rigide

Compozite

S. Alegret, A. Merkoçi, M.I. Pividori, and M. del Valle. Electrochemical biosensors based on rigid conducting carbonpolymer composites. Encyclopedia of Sensors, vol. 3 (2006) pp 23-44


49/120

5/13/2018


Medred

SUBSTRATox

-

e

SOLUŢIE SUBSTRATred

Medox SUPRAFAŢA ELECTRODULUI

la interfaţa electrod modificat/soluţie

Mox +

Mred - ne-

Sred

La elctrod

Sox+Mred

Mox

Reprezentarea schematică a unui CME si a reacţiei de electrod


50/120

5/13/2018


Reactiile chimice si electrochimice

Reactie omogena

Substrat Substrat Mediator Mediator oxidat oxidat

Produs Produs Mediator Mediator redus redus

Reactie heterogena

Electrod M. Sadakane, E. Stechkhan, Chem. Rev ., 98 (1998) 219.


51/120

5/13/2018


Necesitatea unei astfel de medieri apare ori de câte ori viteza directă a transferului de electroni este mică şi

la nivelul unui electrod convenţional este necesară aplicarea unui suprapotenţial


52/120

5/13/2018


Caracteristicile unui electrod chimic modificat ideal pentru aplicaţii analitice: -stabilitate mecanică şi chimică atât ale electrodului de bază cât şi ale grupării modificatoare, precum şi a legăturii dintre electrod şi acesta din urmă;

- stabilitate în timp a activităţii grupării modificatoare faţă de compusul de analizat;

- un domeniu larg de linearitate a răspunsului;

- curenţi de bază mici şi stabili pe domeniul de potenţial utilizat;

- compatibilitate cu o gamă largă de solvenţi apoşi şi organici;


53/120

5/13/2018

PROPRIETATILE MEDIATORILOR FOLOSITI IN CONSTRUCTIA BIOSENSORILOR biosensori-slidepdf.com

CPotentialul

formal apropiat de al biomoleculei, posibil in domeniul potentialului optim Si independent de pH; Celectrochimie CReactie

reversibila

rapida cu enzima redox

Cstoichiometrie CStabili CSa

a reactiei cu transfer de electroni bine definita (1 sau 2 electroni)

atit in stare oxidata cit si in cea redusa

nu se autooxideze

CSuficient de

solubili pentru a permite un mecanism de transfer (mediatori difuzionali)

sau CSolubilitate mica

in mediul inconjurator (mediatori imobilizati)

P. N. Bartlett, P. Tebbutt, R. G. Whitaker, "Kinetic Aspects Of The Use Of Modified Electrodes And Mediators In Bioelectrochemistry ", Progress in Reaction Kinetics, l6 (2), 1991


54/120

5/13/2018


Ralph Buzz Adams (1924 – 2002)

Electrod PC picurator


Hidrofilizarea suprafetei de electrod realizata prin pretratarea oxidativa a suprafetei CPE

55/120

5/13/2018

De ce pasta de carbune? Ø Ø


Domeniu de potential de lucru extins Valori mai scazute ale curentului de fond si ale zgomotului

Fmodificarea chimica

simplu de efectuat Fieftina

Fsuprafata electrodului usor reinnoibila Fposibilitatea fabricarii usoare de ultramicroelectrozi


56/120

5/13/2018


Pasta de carbune

Nanotuburi de Carbon -straturi cilindrice de grafit bi-dimensional

Structura grafitului

formate din hexagoane de atomi de carbon

SWNT Grupari functionale chinonice care pot fi prezente pe suprafata carbonului.


MWNT

S. Iijima, Nature 354, 56 (1991) – MWNT S. Iijima, T. Ichihashi, Nature 363, 603 (1993) – SWNT

57/120

5/13/2018

DIFFERITE POSIBILITATI DE SCADERE A SUPRAPOTENTIALULUI biosensori-slidepdf.com

a) depunerea unor metale nobile pe suprafata electrozilor de carbon Pt sau Pd/Au pe suprafata electrozilor de carbon •Electrozi de carbon platinizati •Depunere sub vid a Pd, Au pe grafit •Depunerea electrochimica a Pt, Rh pe carbon

Micsoreaza potentialul cu aprox. ≈200-300 mV

b) Folosirea altor materiale de electrod pentru oxidarea H2O2 Ni SnO2 TiO2

Stabilizeaza raspunsul fata de oxidarea H2O2 Micsoreaza suprapotentialul pentru oxidare al H2O2

F


58/120

5/13/2018

DIFFERITE POSIBILITATI DE SCADERE A SUPRAPOTENTIALULUI biosensori-slidepdf.com

c)Inlocuirea oxigenului O2 cu un alt acceptor de e- (mediatori); ex. FEROCENUL

d)folosirea unor electro-catalizatori ex.metalo-ftalocianinele e) folosirea electrozilor modificati cu peroxidaza


59/120

5/13/2018

Electrozii chimic modificati bazati pe enzime biosensori-slidepdf.com

Combina trei etape selective Øenzima Ømediatorul ØPotentialul aplicat

Imobilizarea atit a enzimei redox cit si a mediatorului pe/in suprafata de electrod

Adaugarea doar a substratului UN SENSOR “REAGENTLESS” http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

60/120

5/13/2018


Voltametrie ciclică • Voltametria ciclică reprezintă o tehnică electrochimică fundamentală. Principial, aceasta constă în măsurarea curenţilor de electroliză în timpul baleajului ciclic al potenţialului electrodului de lucru faţă de un electrod de referinţă nepolarizabil, care operează la curent nul, în timp ce curentul de electroliză se scurge spre un contra-electrod.

A. J. Bard, L. R. Faulkner, Electrochemical Methods; Fundamentals and Applications , Wiley Interscience Publications, 2000.


61/120

5/13/2018


Celula electrochimica

Cconstructie: -sticla pyrex - dimensiune variabila functie de volumul utilizat 2550 cm3 ; in cazul folosirii enzimelor volumul celulei este de 1cm3 -Orificiu barbotare gaz inert (ex. azot, argon, heliu)

Electrozi: Indicator (de lucru): metale nobile sau materiale carbonice Referinta (Ag/AgCl) Auxiliar (Pt)


62/120

5/13/2018


Instrumentatie

(BAS inc., USA)

Masuratorile electroanalitice sunt realizate cu potetiostate controlate prin intermediul unui calculator incluzand un software adecvat.


63/120

5/13/2018

Tehnici electroanalitice de interogare abiosensori suprafetei-slidepdf.com de electrod Voltametria ciclica – informatii electroanalitice

Voltamograma ciclica redand parametrii de pic importanti

Parametrii importanti ai unei voltamograme ciclice sunt picurile de potential Ep si picurile de curenti ip.


64/120

5/13/2018

Parametrii care caracterizează voltamograma ciclică a unui proces redox reversibil biosensori-slidepdf.com

•

separarea dintre potenţialele corespunzatoare picurilor anodice si catodice (Epa - Epc) este egală cu 0,059/n (mV) pentru toate vitezele de baleaj unde n este num ărul electronilor echivalenţi transferaţi în timpul procesului redox: ∆E=Epa -Epc =0.059/n (mV)

•

Prin experiente de voltametrie ciclica se poate determina valoarea potentialului formal de oxido-reducere(Ef) pentru un cuplu redox reversibil : Ef=(Epa+Epc)/2

•

raportul curenţilor de pic (ipa/ipc) este egal cu 1 pentru toate vitezele de baleaj. ipa /ipc =1

•

funcţia curentului de pic creşte liniar cu rădăcina pătrată a v (viteza de baleaj) – pentru un proces limitat de difuziune;


65/120

5/13/2018


Dependenta picurilor de curenti si de potential de viteza de baleaj poate fi redata prin graficul ip vs . (viteza de scanare)1/2 Un proces cvasi-reversibil este caracterizat de o ΔEp > 58/n mV, valoarea crescand cu cresterea n.


66/120

5/13/2018


Transferul de electroni din cadrul biosensorilor Generatia a doua


67/120

5/13/2018


Transferul mediat de electroni intre o enzima redox si un electrod (pentru o reactie de oxidare)

3rd Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004 3 Rom.Int.Conf. on Anal.Chem. 2004


68/120

Cei mai folositi mediatori ferrocenulbiosensori si derivatii-slidepdf.com acestuia

5/13/2018

S

Oxidaseox

Medred electrode -

P

Oxidasered

e

Medox

Biosensorul va opera la potentialul formal redox al mediatorului MECHANISMUL DE REACTIE β-D-Glucoza + E-FAD (Goxox)

E-FADH2

+

2Fe (Cp)2 R+

E-FADH2 + gluconic acid (Goxred)

E-FAD + 2Fe (Cp)2 R + 2H+

220mV vs Ag /AgCl 2Fe (Cp)2 R


2 Fe(Cp) R+ + 2e-

69/120

5/13/2018


Voltamograma ciclica pentru hidroxi-ferocen proces redox cu transfer de un electron conform schemei:


70/120

5/13/2018



71/120

5/13/2018


2Fc

2Fc2+

FAD

FADH2

glucoza

gluconolactona

volti Schema medierii in mediu omogen a reactiei de oxidare a glucoz oxidazei prin intermediul ferocenului. In figura se prezinta voltamogramele ciclice ale sistemului in prezenta unor concentratii crescatoare de glucoza. Datele au fost inregistrate la nivelul unui electrod de carbune sticlos. a) fara glucoza, b) 0,5 mmol dm-3 glucoza, c) 2,5 mmol dm-3 glucoza.


72/120

5/13/2018


DEHIDROGENAZE NAD+-dependente S

NAD+

MEDre

P

NADH

MEDox


73/120

Dehidrogenazele NAD+ dependente

5/13/2018


reprezinta unele din putinele enzime care transfera direct electronii prin intermediul moleculei de cofactor (NADH)

(!)Problema: regenerarea cofactorului in urma transferului de electroni Realizata prin folosirea mediatorilor,fara degradarea cofactorului


74/120

5/13/2018

MEDIATORI SELECTIVI FOLOSITI PENTRU MICSORAREA SUPRAPOTENTIALULUI DE OXIDARE A NADH-ului biosensori-slidepdf.com

O functionalitate de baza utilizata ca mediator

parafenilendiimina – prezinta o sarcina electrica

R-N

N

+

R R

++ prezinta viteze mari de reactie cu NAD(P)H nNu

este stabila redox

nGreu nE0'pH 7.0

de imobilizat

= + 200 mV vs SCE este destul de mare


75/120

5/13/2018

OXIDAREA ELECTROCHIMICA A NADH-ului LA SUPRAFATA UNUI ELECTROD CHIMIC MODIFICAT biosensori-slidepdf.com

0’

Para-fenilendiimina

prezentand sarcina +

domeniul optim de potentiale 0 and -100 mV vs SCE ≈

++ viteza de reactie mare cu NAD(P)H Interferente minime


76/120

5/13/2018


Mediatorii incarcati pozitiv par a fi utili (necesari) ØEi

prezinta viteze mari de reactie cu NADH ØNu

ØConduc ØSe

conduc la reactii secundare

la molecule de NAD+ enzimatic active

formeaza un complex cu transfer de sarcina intre NADH si mediator

ØCeea ce pare a fi o singura etapa cu transfer de


H- e un proces mult mai complicat

77/120

5/13/2018


MEDIATORI FOLOSITI PENTRU SCADEREA SUPRAPOTENTIALULUI DE OXIDARE A NADH-ului • MEDIATORI ORGANICI (neselectivi) • MEDIATORI SELECTIVI • NOI MEDIATORI ARTIFICIALI • PROTEINELE REDOX – MEDIATORI NATURALI


78/120

5/13/2018

I. MEDIATORI ORGANICI - neselectivi biosensori-slidepdf.com (structurile de baza pentru multi mediatori)

NMP + = N-metilfenazinium


TCNQ = tetracianochinodimetanide

79/120

5/13/2018

PARAMETERII CARE DETERMINA VITEZA DE REACTIE A MEDIATORULUI (constanta de viteza de ordinul II, k) CU ENZIMA biosensori-slidepdf.com

ØE0'

(potentialul formal)

log k ~ ∆E0' (in acord cu teoria lui Marcus) ∆E0' = (E0'mediator – E0'enzima)

Ønatura

mediatorului

(acceptor de 1e- sau de 2e- (H+))

Øsarcina

(ex. centrul activ al glucoz oxidazei este incarcat negativ)

Ødimensiunea

(mediatorul trebuie sa se potriveasca la dimensiunile si structura centrului activ)


80/120

5/13/2018


OXIDAZELE SI DEHIDROGENAZELE CU COFACTORI LEGATI (FAD, FMN, PQQ, Cu) ambele pot utiliza mediatori care transfera 1 si 2 e- - (ne-acceptori de protoni si acceptori de protoni) = = = > transmiterea de 2 e- de la cofactorul legat redus spre mediator poate decurge sevential

Dehidrogenazele NAD(P)+ dependente (oxidarea NAD(P)H-ului) In cazul lor functioneaza numai acceptorii de 2 e- (si proton) care prezinta viteze mari de reactie = = = > ceea ce sustine ideea unei etape cu transfer a unui H- de la NAD(P)H la molecula acceptoare

PEROXIDAZELE functioneaza “orice" agent reducator (donor de e-)


81/120

5/13/2018

MEDIATORI CHIMICI UTILIZATI IN BIOELECTROCHIMIE biosensori-slidepdf.com

aceptori/donori 1 e-


vs

aceptori/donori 2 e--H+

82/120

5/13/2018


Diferente intre mediatorii acceptori/donori de 1 e- si 2 e-

acceptori/donori de 1 e-

acceptori/donori 2 e--H+

+E°’ nu variaza cu pH-ul

-E°’ variaza cu pH-ul

ionii H+ nu participa

participa 1-2 ioni de H+

+nu exista intermediari radicalici

-prezinta intermediari radicalici

reactie redox stabila

reactie redox instabila

-(!)viteze de reactie mici cu NADH

+ viteze de reactie mari cu NADH

-viteze de reactie moderate cu

+ viteze de reactie mari cu

peroxidazele

peroxidazele


83/120

5/13/2018


Generatia a III-a de biosensori

PEROXIDAZELE PQQ-DEHIDROGENAZELE http://slidepdf.com/reader/full/biosensori

84/120

5/13/2018

ENZIME CU COFACTORI micsti

PEROXIDAZE


Peroxidaze din plante

CHINOHEMOPROTEINE FLAVOHEMOPROTEINE

HRP, tutun, boabe de soia

Hemul

chinohemoproteine, PQQ

Peroxidaze din fungii Arthromyces ramosus cloroperoxidaze

Peroxidaze din drojdii citocrom c peroxidaze

Microperoxidaze

Plante Bacterii Ciuperci Tesuturi animale


- fructoz dehidrogenaza - alcool dehidrogenaza PQQ sau FAD

Hemul

flavohemoproteine, FAD - flavocitocromul b 2 - lactat dehidrogenaza - flavocitocromul c 552 - sulfit oxidaza - celobioz dehidrogenaza

85/120

5/13/2018



86/120

5/13/2018



87/120

5/13/2018

EXEMPLE DE ENZIME IMPLICATE ÎN BIOELECTROCATALIZĂ biosensori-slidepdf.com

PEROXIDAZA LACAZA CELOBIOZ DEHIDROGENAZA


88/120

5/13/2018


1980 Yaropolov şi colab., au demonstrat capacitatea HRP de a cataliza reacţia de electro-reducere H2O2 F în

HRP +

-

H2O2 + 2H + 2e

2H2O

POD-ale prezinta activitate catalitică oxidând un număr mare de: Øpolifenoli Øpoliamine

şi

aromatice A.I.Yaropolov et al., Doklady Phys.Chem ., 249 (1980) 1077


89/120

Peroxidazele ≈ 40 enzime

enzime din clasa oxido-reductazelor

5/13/2018


care contin feriprotoporfirina drept cofactor Cofactor Ü hemul COO

-

OOC

H2C

CH

CH2

H2C H3C

-

CH3

N

N Fe

H2C

N

C H

N CH3

H3C

C H

CH2

Feriprotoporfirina IX


PEROXIDAZELE

≈ 40 enzime

90/120

PEROXIDAZELE 5/13/2018


3+

HRP=este nativa in stare ferica in (Fe ), oxidata, compusul I enzima si II=intermediari de reactie stare SH2 =substrat donor de electroni (sau mediatorul), SH* =radical liber care este produsul reactiei de oxidare a substratului, k1, k2 si k3=constatele de viteza ale reactiei.

P+ reprezinta un radical cationic localizat pe inelul porfirinic sau pe catena polipeptidica


MECANISMUL DE RE-REDUCERE A PEROXIDAZEI

91/120

MECANISMUL DE RE REDUCERE A PEROXIDAZEI (revenire la starea nativa) POATE FI REALIZAT PRIN INTERMEDIUL

5/13/2018


ELECTROZILOR (DET) SI/SAU AL MEDIATORILOR (MET)

k s -

+

3+

HRP (Fe ) + H2O (DET)

Compus I + 2e + 2H

(d)

Eappl (detectia H2O2) = 0,01 V vs. Ag/AgCl k s, m -

+

2 SH* + 2 e + 2 H

(MET)

2 SH2

(e)

k 1

3+

HRP (Fe ) + H2O2

IV

+

compus I (Fe =O, P •)+ H2O

(a)

k 2 IV

+

IV

Compus I (Fe =O, P •)+ SH2 → compus II (Fe =O)+ SH k 3 3+ * Compus –II (Fe =O)+ SH2 → HRP (Fe ) + SH + H2O IV


*

(b) (c)

92/120

5/13/2018

Ciclul reactiei bioelectrocatalitice de reducere a H2O2 catalizata de HRP si de inactivare a acesteia biosensori-slidepdf.com

-

1e H2O2

-

forma nativa

-

2e

H2O

compusul – II

compusul – I

e

uzual neselectiv

-

1e

e d r o n o d a c l u d o r t c e l E

compousul – III (forma inactiva) exces de H2O2) selectiv

Enzima schimba direct electroni cu electrodul (electrodul substituie substratele donoare de electroni din ciclul obisnuit de reactie al HRP).

E. Csoregi si colab. J. Biotechnol. 30 (1993) 315


Potentialul aplicat pentru detectia H 2O2 Eappl. = 0,01 V fata de Ag/AgCl la pH = 7,0; •Curenti de baza mici •Oxigenul molecular nu este redus •Interferente minime

93/120

MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI 5/13/2018


uzual neselectiv

2H+ +

Pinelul reprezinta un sau radical cationicpolipeptidica localizat pe porfirinic pe catena

compusul I si II=intermediari de reactie in stare oxidata,

*ELECTROCHIMIC NU SE POATE FACE DIFERENTA INTRE COMPUSUL I SI II


94/120

MECANISMUL TRANSFERULUI DIRECT DE ELECTRONI 5/13/2018


reactie electrochimca (b)

H2 O 2

H2 O

POD

k1

ks 2e-

H2 O

electrod

Cmp

0,0 mV / Ag/AgCl

2H+

reactie chimica (a)

experimental, observandu-se numai reactiile (a si b) redate schematic mai sus ks = viteza transferului de electroni dintre RDE si formele oxidate ale enzimei (avand unitatile s-1).


95/120

MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI 5/13/2018


HRP (Fe3+) + H2O2

compus I (FeIV=O, P+•)+ H2O k 2 IV + IV * Compus I (Fe =O, P •)+ SH2 → compus II (Fe =O)+ SH k 3 IV 3+ * Compus –II (Fe =O)+ SH2 → HRP (Fe ) + SH + H2O

(a) (b) (c)

Compusi donori de electroni anilina

OH

NH2

fenolul OH

OH

NH2

NH2

OH

NH2

o-fenilendiamina

o-aminofenolul catecolul

p- fenilendiamina

NH2

OH

NH2

OH

I3

-

OH

p-aminofenolul

Fe(CN)6

NH2

4-

Mred si Mox sunt formele reduse si respectiv oxidate ale mediatorului


96/120

MECANISMUL TRANSFERULUI MEDIAT DE ELECTRONI 5/13/2018


Mediatorul (SH 2 ) transporta electronii intre enzima si electrod. Donorul oxidat enzimatic (SH•) este redus de catre electrod.


97/120

5/13/2018


BIOSENSORI PE ADN PENTRU BAZATI DETECTIA AGENTILOR TOXICI


98/120

5/13/2018


In ultimii ani, acizii nucleici (ADN sau ARN) au fost din ce in ce mai utilizati

in recunoasterea si monitorizarea multor compusi de importanta analitica (poluanti, substante toxice, medicamente anticancer, secvente patogene de acizi nucleici etc.) datorita, in principal: stabilitatii

si

mari

variabilitatii

foarte mari

a secventelor de acizi nucleici.


Structura ADN-ului

99/120

compozitia chimica 5/13/2018


vADN-ul

consta din: Capat 5’ terminal

4 baze azotate: Adenina (A), Guanina (G), Timina (T), si Citozina (C)

Legǎturi de hidrogen

Capat 3’terminal

Un rest de zahar (deoxiriboza) Grupare fosfat

T

A

S c h e l e t u l d e o x i r i b o z a f o s f a t

Capat 3’terminal

G purine

C pirimidine

Structura ADN-ului: dublu helix


Capat 5’ terminal

Baze purinice: A,G Baze pirimidinice: C, T

100/120

5/13/2018

(complementar)


ADN-ul prezinta o structura de elice dublu catenare cnstand din doua catene polinucleotidice care “merg” ele in directii opuse si care sunt mentinute impreuna prin legaturile de hidrogen dintre baze.

capatul 5’

capatul 3’ Dublul helix al ADN este constant datorită orientării bazelor spre interior şi a legăturilor de hidrogen dintre ele

Stabilitatea ADN-ului este data de


101/120

5/13/2018

biosensori -slidepdf.com Legaturile de hidrogen dintre bazele pereche care apar la intervale regulate de-a lugul axei ADN-ului;

Interactiile dintre bazele existente de-a lungul axei dublu elice Continutul, dimensiunea si ordinea bazelor; (cu cit continutul in G si C este mai mare cu atit molecula este mai stabilacresterea constantei de asociere)

Specificitatea ADN-ului este data de capacitatea nucleotidelor de a forma numai anumite perechi A-T si C-G


102/120

Structura ADN-ului: dublu helix (complementar) 5/13/2018


Bazele sunt bine legate una deasupra alteia in asa fel incat santurile se intind pe intreaga suprafata a helixului.

Aceste caracteristici structurale, alaturi de complementaritatea perechilor de baze, au permis cercetatorilor sa realizeze o varietate de metode, de la simple la elegante pentru a determina cantitatea de ADN continuta intr-o anumita proba.


103/120

5/13/2018


Coloranti: Bromura de etidiu Medicamente: Daunomicina , Adriamicina , Cloramfenicolul ,,, Poluanti: Proflavina , Antraciclina … Proteine: tirozina …

Proprietati ale ADN-ului: reactia de hibridizare


104/120

5/13/2018


ADN-ul hibridizează prin împerecherea bazelor azotate

Recunoasterea intre secvente complementare este dependenta de formarea unor legaturi de hidrogen stabile intre cele 2 catene.

M.I. Pividori et al., Biosensors & Bioelectronics 15 (2000) 291.


105/120

5/13/2018


In cardrul reactiei de hibridizare legaturile de hidrogen apar la intervale regulate de lungul structurii ADN-ului, in timp ce legaturile Ag:Ac apar la nivelul unor centre specifice

Diferenta majora fata de reactia Ac-Ag – unde apar interactii de tip ionic, hidrfob si de hidrogen.

TEHNOLOGIA GENOSENSORILOR ARE APLICATII


106/120

5/13/2018

FUNDAMENTALE biosensori -slidepdf.com in INTELEGEREA BAZEI MOLECULARE A VIETII PRACTICE In MAPAREA GENETICA-ANALIZA SECVENTELOR DE GENE-la diferite organisme domeniu care contribuie la:

Evidentierea mutatiilor genetice cu rol in - identificarea unor organisme modificate genetic - identificarea unor agenti patogeni (bacterii, virusuri)

Elucidarea organizarii genomului uman

- stabilirea unor diagnosticari prenatale - identificarea unor gene asociate unor posibile boli (de inima, cancer, etc)

Elaborarea unor diagnosticari clinice timpurii si a unor terapii bazate pe modificarea genelor asociate diferitelor boli ereditare sau nu Detectia prezentei organismelor patogene/ infectioase in diferite medii (aer, apa,sol, alimente, plante, animale, tesuturi umane, etc) Modificarea genetica a diferitelor organisme Realizarea unor noi medicamente


107/120

5/13/2018

Detectia agentilor patogeni din alimente, mediu si de interes medical biosensori-slidepdf.com

Agentii patogeni responsabili pentru diferite maladii sau boli precum bacteriile si virusurile, sunt detectabili datorita secventei lor unice a ADN-ului

21 de familii de virusuri ce infecteazǎ oamenii

Intr-un gram de sol se gasesc approx. 108 bacterii, numarul de specii bacteriene fiind de peste 10.000. Numarul de specii bacteriene din lume este estimat a fi mai mare ca 1000 de milioane.

Principiul care sta la baza functionarii unui Genosensor


108/120

5/13/2018

Secveta “genei tinta” (cADN-ul saubiosensori ADN-ul de detectat) este indentificata prin -slidepdf.com intermediul unei “gene receptoare” (ssDNA) care impreuna formeaza un hibrid dublu catenar (dsDNA).

Reactia de hibridizare este Eficienta Specifica are loc in prezenta unui amestec foarte diferit de molecule de ADN necomplementare E. Palecek, Talanta 56 (2002) 809-819


109/120

5/13/2018

Semnalul de oxidare al bazelor din ADN biosensori-slidepdf.com

Guanina, Adenina


Inozina, Adenina

110/120

5/13/2018



111/120

5/13/2018



112/120

5/13/2018

Inozina este un analog electro-inactiv al guaninei, care se poate lega de citozina prin doua legaturi de hidrogen.



113/120

5/13/2018


lead

electrod screen-printed


114/120

5/13/2018


Adaugarea substratului enzimatic pentru

Masurarea Electrochimica Tub magnetic


115/120

5/13/2018


Determinarea secventelor specifice de ADN asigura baza detectiei pentru o mare varietate de infectii si boli ereditare.


116/120

5/13/2018


In functionarea biosensorilor bazati pe ADN trebuiesc indeplinite doua criterii importante:

-Sensibilitate mare in detectia unei secvente de nucleotide -Specificitate mare: incluzind detectia unei sinure neimperechere intre baze, sau o singura mutatie a unei baze

IN PRACTICA sunt necesare metode de punere in evidenta a diferentelor dintre o gena salbatica si una mutanta, precum si a mutatiilor genetice


117/120

5/13/2018

la nivelul unei singure baze azotate.


Gena sălbatică – A – T – T – C – G – A – C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C – T – G – A – C – A – T – G – C – Tranziţie (AT este înlocuită cu GC) – A – T – T – C – G – G – C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C – C – G – A – C – A – T – G – C – Transversie (AT este înlocuită cu TA) – A – T – T – C – G – T – C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C – A – G – A – C – A – T – G – C – Inserţie (GC este inserată) – A – T – T – C – G – A – G – C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C – T – C – G – A – C – A – T – G – C – Deleţie (AT este eliminată) – A – T – T – C – G –– C – T – G – T – A – C – G – – T – A – A – G – C –– G – A – C – A – T – G – C –

Mutatii posibile la nivelul unei singure baze azotate “single point mutation”

Detectia electrochimica a reactiei de hibridizare a permis identificarea a unei singure necomplementaritati la nivelul bazelor azotate


118/120

5/13/2018

Patogeni de interes biosensori-slidepdf.com

• Bacterii • Bacillus anthracis • E. coli O157:H7 • Salmonella Typhimurium, si S. Enteritidis • Helicobacter pylori • Mycobacterium avium paratuberculosis (MAP)

• Virusuri • Virusul viral de diaree bovina • Adenovirusurile (HAdV 40/41) • Virusul gripei aviare


119/120

5/13/2018


Virusul gripal care apartine familiei orto-mixovirusurilor este o cauza majora a infectiei respiratorii. Acest virus are diferite tipuri de antigeni ca A, B si C care sunt grupati in functie de diferentele in matricea lor de proteine. Tipul A cauzeaza aviara, tipurile B si C gripa sunt cauzele epidemiilor umane.


120/120

biosensori

Recommend Documents