UNIFIL - CENTRO UNIVERSITÁRIO FILADÉLFIA COLEGIADO DE BIOMEDICINA BIOLOGIA MOLECULAR
APOSTILA DE NOÇÕES NOÇÕES BÁSICAS BÁSICAS EM BIOLOGIA MOLECULAR
Prof. Thiago Cezar Fujita
Londrina - PR. 2011
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INTRODUÇÃO Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido
significantemente para o entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de recombinação dos ácidos nucleicos têm permitido aos pesquisadores identificar os vários genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar os mecanismos de infecção dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação e proliferação celular (principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vem também apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas entre as espécies ou ent re os indivíduos, são extremamente extrema mente úteis para as análises análises forenses, os testes de paternidade, a identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de allelos mutantes, a identificação de gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e outros. Nesta apostila serão abordados os princípios básicos de biologia molecular, bem como serão descritas as aplicações da técnica de PCR e de outras tecnicas moleculares nos diagnósticos clínico e nos testes de identificação.
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ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA) As informações genéticas genéticas são armazenadas nos ácidos nucleicos. Há dois tipos de
ácidos nucleicos: ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O DNA é encontrado principalmente nos cromossomos no núcleo das células, enquanto RNA está presente no citoplasma, havendo muito pouco nos cromossomos. Os ácidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotídeos. nucleotídeos . Cada nucleotídeo é constituido por uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupamento de fosfato (PO4=). Há dois tipos de açúcar nos nos ácidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas são as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA contém contém A, C, G e T, enquanto que o RNA contém U em vez de de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotídeos estão ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotídica. Essa cadeia é formada por ligações entre o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotídeo e o carbono 3 do açúcar do nucleotídeo adjacente (Figura 1B). Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples, enquanto que o DNA é composto de duas cadeias polinucleotídicas pareadas, dispostas em direção contraria, sendo denominadas antiparalelas (Figura 1B). 1B).
As ligações covalentes do esqueleto de
açúcar-fosfato localizam-se na parte externa da estrutura e as bases nitrogenadas estão projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na molécula de DNA segue uma sequência em que cada base de uma cadeia é pareada com outra base na segunda cadeia, de modo que guanina em uma cadeia é pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina
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INTRODUÇÃO Os avanços nos estudos da biologia molecular em eucariotos tem contribuido
significantemente para o entendimento da etiologia das doenças humanas. As técnicas de recombinação dos ácidos nucleicos têm permitido aos pesquisadores identificar os vários genes responsáveis por doenças hereditárias, avaliar os mecanismos de infecção dos microrganismos, conhecer os processos que regulam a diferenciação e proliferação celular (principalmente nos processos neoplásicos), entre outros. A biologia molecular vem também apresentando aplicação bastante expressiva na pesquisa de marcadores genéticos úteis no diagnóstico laboratorial. Por outro lado, as diferenças nas sequências do DNA, observadas entre as espécies ou ent re os indivíduos, são extremamente extrema mente úteis para as análises análises forenses, os testes de paternidade, a identificação de antígenos de histo-compatibilidade, a identificação de allelos mutantes, a identificação de gêneros e espécies de bactérias, fungos, leveduras, vírus e outros. Nesta apostila serão abordados os princípios básicos de biologia molecular, bem como serão descritas as aplicações da técnica de PCR e de outras tecnicas moleculares nos diagnósticos clínico e nos testes de identificação.
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ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA E RNA) As informações genéticas genéticas são armazenadas nos ácidos nucleicos. Há dois tipos de
ácidos nucleicos: ácido desoxiribonucleico (DNA) e ácido ribonucleico (RNA). O DNA é encontrado principalmente nos cromossomos no núcleo das células, enquanto RNA está presente no citoplasma, havendo muito pouco nos cromossomos. Os ácidos nucleicos consistem de cadeias de nucleotídeos. nucleotídeos . Cada nucleotídeo é constituido por uma base nitrogenada, uma molécula de açúcar e um grupamento de fosfato (PO4=). Há dois tipos de açúcar nos nos ácidos nucleicos: 2-deoxiribose no DNA e ribose no RNA (Figura 1A). As bases nitrogenadas são as pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) e as purinas: adenina (A) e guanina (G). O DNA contém contém A, C, G e T, enquanto que o RNA contém U em vez de de T. Em ambos DNA e RNA, os nucleotídeos estão ligados formando uma longa cadeia cadeia polinucleotídica. Essa cadeia é formada por ligações entre o grupo fosfato do carbono 5 de um nucleotídeo e o carbono 3 do açúcar do nucleotídeo adjacente (Figura 1B). Em geral, o RNA consiste de uma cadeia polinucleotídica simples, enquanto que o DNA é composto de duas cadeias polinucleotídicas pareadas, dispostas em direção contraria, sendo denominadas antiparalelas (Figura 1B). 1B).
As ligações covalentes do esqueleto de
açúcar-fosfato localizam-se na parte externa da estrutura e as bases nitrogenadas estão projetadas para a parte interna. O arranjo das bases na molécula de DNA segue uma sequência em que cada base de uma cadeia é pareada com outra base na segunda cadeia, de modo que guanina em uma cadeia é pareada com a citosina na outra cadeia e a adenina
sempre pareia com a timina (Figura 1C). Dessa forma o DNA apresenta a estrutura tridimensional de dupla hélice, onde o ângulo e a distância entre um nucleotídeo e outro é sempre constante.
(A)
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E. CHARGAFF, em 1951, verificou que na molécula de DNA a relação entre as purinas e pirimidinas era constante na maioria das espécies animais, ou seja, a quantidade da purina, adenina, é igual a da pirimidina, timidina; da mesma forma, a quantidade da purina guanina é igual à da pirimidina citosina. Essa característica importante é definida pela propriedade fisicoquímica das moléculas com formas semelhantes se atrairem mutuamente com significante afinidade (força de atração de Van Der Waals), somada à força de atração entre os átomos de cargas opostas (ligações iônicas ou pontes de hidrogênio). Essas propriedades são bastante específicas e no caso do DNA elas operam de forma conjunta e simultânea com significante energia de interação, como se fosse um molde perfeito. Em resumo, pode-se dizer que a lei de CHARGAFF se baseia na especificidade da interação das bases puricas e pirimidicas, onde a citosina pareia apenas com a guanina e a adenina pareia apenas com a timidina ou uracila. uracila. É importante salientar que a ligação entre a A e T ou U ocorre por interação de 2 pontes de
hidrogênio, enquanto que entre a C e a G a ligação se dá por 3 pontes de hidrogênio (ligação mais forte). Devido a essa especificidade do pareamento entre as bases; a sequência de uma das cadeias polinucleotídicas do DNA é complementar a outra (cadeia complementar ). A estrutura secundária de dupla hélice (duplex) do DNA, descrita por Watson & Crick em 1953, está disposta linearmente. Entretanto, pode ser também circular como nas bactérias, plasmídeos e certos vírus, e pode ser também de fita simples como em alguns tipos de fagos. Entretanto, a disposição da molécula de DNA nos organismos superiores é de particular importância, onde a informação genética está amplamente concentrada nos cromossomas dentro do núcleo. O comprimento total dos 46 cromossomas humanos tem menos que 0,5 mm, entretanto se extendido pode atingir muitos metros. Isto se deve a que o DNA é compactado na forma super-enrolada em vários níveis: primário, duplex; secundário, ao redor das proteinas ligadas ao DNA (histonas) formando os nucleossomos; terciário, enrolado com os nucleossomas formando um cilindro ou estrutura solenoide; e finalmente quaternária, formando voltas ou ³loops´. Esta disposição super-enrolada é a forma natural do DNA.
Propriedades dos ácidos nucleicos Os ácidos nucleicos podem ser dissociados e associados por processos físicos e químicos. Em condições fisiológicas, a estrutura de dupla hélice do DNA é bastante estável. No entanto, se essa estrutura for submetida a alta temperatura (90rC a 100rC) ou a pH extremos (menor que 3,0 ou maior que 10,0), ela se separa em duas fitas simples, sofrendo o processo de dissociação, desnaturação ou ³melting´. Da mesma forma, ao submeter-se essas fitas simples a condições de associação (temperatura e a 65 rC, ou pH próximo de 7,0) por algumas horas, elas podem se reconstituir formando a dupla fita novamente, obedecendo a lei da complementariedade; ou seja a dupla fita somente se reassocia se as bases forem exatamente complementares. Esse fenômeno de associação é também denominado de renaturação, hibridização ou ³annealing´. Esses processos de desnaturação e renaturação são essenciais para manipulação dos ácidos nucleicos in vitro, principalmente do DNA, contribuindo enormemente para o isolamento, comparação e identificação desses compostos.
Outra
propriedade física muito importante dos ácidos nucleicos é a sua capacidade de absorver energia na região do ultravioleta, apresentando o pico de absorbância máxima em 260 nm. Esta propriedade é útil tanto para a quantificação quanto para avaliar a pureza dessas substâncias.
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REPLICAÇÃO, TRANSCRIÇÃO E TRADUÇÃO
Replicação Toda vez que uma célula se divide, todo o seu conteúdo de DNA é duplicado na íntegra, transmitindo em absoluto as informaç ões genéticas contidas na célula precursora, esse
processo denomina-se replicação. A replicação ocorrre de forma semi-conservativa, com as duas cadeias precursoras (DNA de dupla fita, dsDNA) servindo de molde para a síntese da nova cadeia (Figura 2). Dessa forma, para a replicação ocorrer é necessário que dupla fita precursora se abra formando 2 cadeias independentes (fita simples, ssDNA). Esse é um processo energeticamente desfavorável e ocorre com a ação conjunta de uma proteina DNAespecífica e várias enzimas; sendo as fitas simples precursoras replicadas, então, de forma independente e separada. A replicação pode ter início em vários sítios, mas cada origem de replicação é utilizada uma vez, durante um simples ciclo celular. A fita filha é sintetizada pela ação catalizadora da DNA polimerase III, enzima que utiliza como molde a cadeia precursora e incorpora os nucleotídeos de forma sequencial na nova cadeia, produzindo-a de acordo com a lei de pareamento das bases. Como essa polimerase sintetiza DNA na direção de 5' para 3', a síntese de uma das cadeias complementares é realizada de forma contínua enquanto que a outra é sintetizada discontinuamente. Os fragmentos da cadeia discontínua são ligados pela enzima DNA ligase. Muitas outras proteínas estão envolvidas na estabilização e manutenção da integridade das cadeias simples que são precursoras para a síntese da dupla fita, assim como no reconhecimento dos sítios de iniciação. As DNA polimerases possuem também, além da função de sintetizar polinucleotídeos, atividade e xonucleásica ou "a correção de leitura" na qual os nucleotídeos incorretamente incorporados são removidos. Essa propriedade é fundamental para a manutenção a integridade da sequência original.
Figura 2. Representação da molécula de DNA durante a replicação: as duas cadeias precursoras são separadas e as cadeias complementares que são sintetizadas.
Transcrição A síntese protéica não é resultante da leitura direta da sequência nucleotídica do DNA. Sabemos que o DNA está localizado no cromossoma do núcleo da célula e a síntese protéica ocorre quase que na sua totalidade nos ribossomas, localizados no citoplasma. As informações
genéticas contidas na sequência nucleotídica do DNA têm que ser transferidas para uma molécula intermediária que pode mover-se para o citoplasma, o RNA mensageiro ( mRNA), e que ordena, então, a síntese da proteina. O processo de síntese de mRNA é conhecido por transcrição e o tamanho da molécula de mRNA é definido pela sequência de aminoácidos que o ácido nucleico codifica. Apenas uma das fitas do DNA é transcrita dando origem a uma única sequência de mRNA para cada gene. A indicação de qual fita do DNA deve ser transcrita é orientada por uma sequência específica denominada promotor , localizada antes (³upstream´) da sequência a ser transcrita, que é reconhecida pela RNA polimerase (enzima sintetisadora de mRNA). Como a RNA polimerase adiciona sequencialmente monofosfatos de ribonucleosídeo à extremidade 3¶ da cadeia de RNA em crescimento, a polimerização ocorre na direção 5¶ - 3¶. Isto significa que cada molécula de mRNA será identica à sequência nucleotídica da fita de DNA que não é transcrita. O mRNA transcrito é transportado para os ribossomos (RNA ribossômico, rRNA) no citoplasma, onde ocorre a síntese protéica. O material genético de certos virus (retrovirus) é o RNA e a informação genética segue, portanto, a direção reversa (de RNA para DNA). Este processo é conhecido por transcrição reversa, na qual a sintese de DNA é dirigida pelo RNA e a enzima responsável é denominada transcriptase reversa. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos retrovírus.
Figura 3. Representação da molécula de DNA e RNA durante a transcrição: Apenas uma das fitas de DNA serve de moldo para síntese da fita de RNA.
Tradução A relação entre a sequência de nucleotídeos do DNA e a sequência de aminoácidos da proteina correspondente é denominada código genético. Esse código é universal e é encontrado em todos os organismos vivos. O código genético é lido em grupos de três
nucleotídeos, cada um codificando um aminoácido (Tabela 1). Cada sequência de trinucleotídeo é denominada codon e a sequência de condons que codifica um polipeptídeo específico é denominada cistron.
Tabela 1. O código genético 1a.base(5¶) U U Phe Phe Leu Leu C Leu Leu Leu Leu A Isoleu Isoleu Isoleu Met* G Val Val Val Val * codon de iniciação
C Ser Ser Ser Ser Pro Pro Pro Pro Treo Treo Treo Treo Ala Ala Ala Ala
2a. base A Tir Tir Terminação Terminação His His Glu Glu Asp Asp Lis Lis AcAsp AcAsp AcGlu AcGlu
3a.base (3¶) G Cis Cis Terminação Trip Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gli Gli Gli Gli
U C A G U C A G U C A G U C A G
O processo de decodificação pelo qual a informação genética presente na molécula de mRNA dirige a síntese proteica é denominado tradução. Esse processo envolve o mRNA, o rRNA e o RNA de transferência ou tRNA, encontrado no citoplasma. Cada tRNA tem 70-90 nucleotídeos em comprimento e é de fita simples, mas devido ao pareamento de bases dentro da molécula, adquire a forma de uma folha de trevo. Dentro dessa estrutura, um trinucleotídeo de sequência variável forma o anti-codon que pode parear com um codon da molécula de mRNA. Na outra extremidade da molécula de tRNA está uma sequência para ligação a um aminoácido específico. Portanto, um codon particular no mRNA é relacionado através de um tRNA a um dado aminoácido. Na tradução, o ribossoma liga-se primeiramente a um sítio específico na molécula de mRNA (codon de iniciação, ATG) que ajusta a fase de leitura ("reading frame"). O ribossoma, então, se movimenta ao longo da molécula de mRNA, traduzindo um codon de cada vez usando tRNAs para adicionar aminoácios ao final da cadeia polipeptídica em alongamento. A tradução é finalizada quando o ribossoma reconhece na fita de mRNA o codon de terminação ("stop codon"). A direção da leitura é de 5¶-3¶, sendo que a sequência de nucleotídeos da fita de DNA corresponde à sequência de aminoácidos da proteina traduzida na direção do N-terminal para o C-terminal. Em princípio as sequências de bases nos ácidos nucleicos devem ser traduzidas em qualquer fase de leitura diferente, dependendo onde o processo de decodificação se inicia. Para uma dada sequência UUAGCAAAGCUGCGAAUG, as três fases de leitura possíveis são :
UUA GCA AAG CUG CGA A UAG CAA AGC UGC GAA U AGC AAA GCU GCG AAU G Entretanto, o código genético não se sobrepõe, pois a fase de leitura é ditada pelas sequências de iniciação e de terminação da tradução presentes na molécula de mRNA. A fase de leitura pode ser alterada por mutações que removem ou inserem bases na sequência nucleotídica. Esse tipo de alteração é conhecido como descolamento de fase ("frameshift") e pode causar a perda total da função da proteina produzida.
F lu x o d a in fo r m a ç ã o g e n é tic a in tr a c elu la r
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ORGANIZAÇÃO DO GENOMA DE EUCARIOTOS, PROCARIOTOS E VIRAL
Estrutura Gênica Os cromossomas constituem-se de uma longa e ininterrupta sequência de nucleotídeos na qual estão dispostos muitos genes.
O gene é uma unidade de herança
constituida por uma sequência nucleotídeos que carrega as informações necessárias para a síntese de um dado polipeptídeo. O gene é uma entidade estável mas pode sofrer mutações, sendo que a nova forma do gene é herdada de m odo estável, exatamente como a f orma que lhe deu origem. Um gene pode existir em formas alternativas, denominadas alelos, que determinam a expressão de alguma característica particular. Embora todos genes funcionais sejam transcritos, a maioria do DNA genômico não é totalmente transcrito. A quantidade total de DNA nuclear no genoma haplóide (gamético) humano compreende 3 x 106 kb. Como a maioria dos genes tem 1 a 20 kb em comprimento, deveria haver 1 milhão de genes, mas somente 3000 locos de doença foram identificados. Mesmo considerando todos os outros genes que conferem as características normais como altura e inteligência, uma grande porção do DNA genômico não tem função definida. Entretanto, mais e mais tem se observado que este DNA tem funções importantes, incluindo o controle de ação gênica.
Genes que são responsáveis pela síntese de enzimas específicas ou peptídeos são denominados de genes estruturais, enquanto que os genes reguladores modificam os efeitos dos genes estruturais.
Controle da expressão gênica Nas células existem mecanismos moleculares que controlam o número e a quantidade das proteinas produzidas. As diferenças na síntese proteica resultam de sinais moleculares que controlam as taxas em que as moléculas de mRNA são transcritas a partir do DNA ( controle transcricional) ou traduzidas (controle traducional)
Processamento pós-transcricional do mRNA A transcrição e a tradução nos procariotos são processos concomitantes mas nos eucariotos são processos temporal e espacialmente desconectados. Como vimos, nos eucariotos a transcrição ocorre no núcleo e a tradução no citoplasma. Durante a passagem do núcleo para o citoplasma, o mRNA transcrito (denominado pre-mRNA) deve ser processado para que seja obtido o mRNA maduro. Nos procariotos, a sequência de nucleotídeos do gene é colinear com a sequência de aminoácidos de uma dada proteína, entretanto, nos eucariotos a sequência codificante é geralmente interrompida por sequências adicionais. A maioria dos genes dos eucariotos são compostos por regiões codificadoras denominadas exons e regiões não-codificadoras denominadas introns. Estes introns são sequências posteriormente removidas durante o processamento do transcrito primário. Esse processo é denominado processamento do RNA ou ³RNA splicing´. Após a remoção dos introns, a RNA polimerase II adiciona uma sequência AAUAAA extremidade 3¶ do mRNA, conhecida como poli-A. A maioria dos mRNAs eucarióticos possuem 100 a 200 resíduos de adeninas ligadas à extremidade 3', denominada cauda de poli-A, adicionada pela enzima poliA polimerase. Antes que ocorra a remoção dos introns, o mRNA sofre a adição de resíduos de 7-metil-guanosina (Caps) na extremidade 5¶, denominada metilação Cap. Esse processamento sofrido pelo mRNA torna a molécula mais estável e facilita o seu deslocamento para o citoplasma.
Entretanto, mutações que ocorrem nas regiões de junção dos exons podem
modificar o mRNA processado, produzindo um mRNA maduro que codifica para uma proteína diferente da original. Alguns genes complexos tem moléculas de mRNA muito grandes, que são processadas de diferentes formas para produzir diferentes mRNA maduros que são traduzidos em polipeptídeos diferentes. Esse processo é denominado processamento alternativo (³alternative splicing´) e ocorre no mesmo tecido mas em diferentes estágios de desenvolvimento e diferenciação e pode também ocorrer em diferentes tecidos.
Estrutura gênica dos procariotos Existem regiões específicas no DNA, denominadas promotores que identificam o sítio de início da transcrição do RNA (região na qual a RNA polimerase se liga para iniciar a transcrição). Nos procariotos, os genes que codificam as enzimas pertencentes a uma mesma via metabólica são adjacentes uns aos outros e agrupados ("cluster") ao longo do cromossomos junto com sequências regulatórias. Este conjunto é denominado operon, sendo que a sequência que regula a expressão desses genes é denominada operador. O operador encontra-se antes (³upstream´) da sequência do promotor, nas posições de -35 a -10 antes do início da sequencia codificante. Nos procariotos, a regulação destes operons obedece a condições nutricionais ou ambientais. O estímulo da expressão de uma enzima em resposta à presença de um substrato particular é denominada indução. A lactose, por exemplo, pode servir como fonte de carbono e energia para a Escheri chia c oli . O metabolismo deste substrato depende da hidrólise de seus componentes, glicose e galactose, pela enzima F-galactosidase. A presença de lactose (indutor ) induz a síntese de F-galactosidase por ativação do operon da lactose (operon lac), aumentando a taxa de ligação da RNA polimerase ao DNA e a taxa de síntese do mRNA da F-galactosidase. Na ausência do indutor o operon é reprimido pela ação do repressor . O repressor liga-se a uma sequência especifica no operador, bloqueando a ligação da mRNA polimerase ao promotor, inibindo assim a síntese de mRNA que codifica para a F galactosidase.
Estrutura gênica dos eucariotos Os promotores dos eucariotos são elementos que sinalizam o sítio onde a transcrição deve iniciar-se e, possivelmente, controlam o nível de expressão do gene associado. Geralmente estão localizados cerca de 30 bases ³upstream´ do codon de iniciação (ATG) e ompreendemsêquencias denominadas ³boxes´ ou ³motifs´. As mais frequentes são as TATA, CAT e CG ³boxes. Além dos promotores, os genes dos eucariotos possuem sequências regulatórias adicionais conhecidas como amplificadores ("enhancers"), que podem estar muito distantes do promotor (antes ou d epois, ³upstream´ ou ³downstream´) e que potenciam a taxa de transcrição. É importante salientar que estes amplificadores não são específicos e potenciam a transcrição de qualquer promotor que estiver na sua vizinhança. A eficiência da expressão de um gene em um tecido específico depende da adequada combinação e integração dos amplificadores, dos promotores e das sequencias adjacent es. O genoma dos eucariotos pode apresentam os pseudogenes que são replicas de genes ativos mas não produzem um produto reconhecível, geralmente ocorrem devido a mutações acumuladas no gene.
Transposons são elementos genéticos móveis que se deslocam de uma região para outra do genoma e, enzimaticamente, se integram a estes locais. Desta forma, a localização destes segmentos de DNA no genoma é instável. Estes transposons contém os genes que codificam para as enzimas necessárias à sua inserção e para remobilização para outro sítio. Geralmente, a inserção de um transposon produz mutação ou rearranjo cromossômico variável que abole a função do gene que recebe esse elemento móvel. Polimorfismo de DNA A análise do DNA humano progrediu na medida em que se conheceu a variabilidade de sequências entre os indivíduos. Mini e microsatélites são sequências curtas, repetidas consecutivamente, que estão distribuidas ao longo dos cromossomas humanos, representando cerca de 40% do DNA. Sua natureza repetitiva faz com que sejam instáveis durante a replicação do DNA de geração para geração. A consequência é que o número de repetições dentro de uma sequência varia largamente entre os indivíduos. Em função dessa variabilidade (polimorfismo de DNA), cada indivíduo, exceto gêmeos idênticos, terá um padrão ou perfil de DNA pessoal (³Fingerprinting´). Esses perfis são usados para estabelecer a identidade dos indivíduos em diversas situações. As sequências de microsatélites mais comuns no DNA humano são CA ou GT, dependendo de qual das fitas de DNA está sendo lida, pois há milhares dessas sequências espalhadas no DNA humano. O tamanho da repetição pode ser muito variável e pode fornecer excelentes marcadores genéticos para estudar o comportamento fenotípido das famílias. A maioria dessas sequências repetitivas não produz efeito deletério, entretanto foi demonstrado que uma forma de retardo mental em homens, a síndrome do X frágil, é causada pela expansão de um triplete (CGG) contendo 6 a 54 repetições.
Verificou-se também que
disturbios neurológicos na distrofia miotônica e na doença de Huntington, estão associados a alterações no tamanho dos microsatétiles. Esta descoberta forneceu a base científica para o fenômeno de antecipação no qual os disturbios genéticos tornam-se mais severos nas gerações subsequentes.
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IMPORTÂNCIA DAS ENZIMAS NA BIOLOGIA MOLECULAR Muitas enzimas que atuam na replicação e transcrição tem sido purificadas e a sua
atividade biológica usada in vitro para reações moleculares específicas diretas. A maioria dessas enzimas é isolada de bactérias, fungos, leveduras ou virus. Essas enzimas são utilizadas das mais diversas formas, a saber: clonagem e amplificação de genes de interesse, preparo de sondas de ácidos nuclei cos, ensaios de hibridização, entre outras aplicações. As nucleases representam uma categoria de enzimas específicas de ácidos nucleicos que hidrolizam as ligações fosfo-diester dos polímeros de ácidos nucleicos, uma de cada vez.
As nucleases podem requerer um grupamento hidroxil terminal livre (exonucleases), com especificidade de 3' para 5', ou podem atuar somente em ligações internas ( endonucleases). As nucleases podem ser específicas para DNA ou RNA. As nucleases DNA-específicas podem catalizar apenas cadeias únicas (por e xemplo, a S1 nuclease) ou cadeias duplas (DNAse I). As endonucleases de restrição são nucleases encontradas naturalmente em bactérias e são denominadas enzimas de restrição porque restringem sua atividade a DNA estranhos. O DNA do hospedeiro não é atacado porque os sítios vulneráveis a suas próprias enzimas são protegidos por um processo denominado metilação do DNA. Cada enzima é designada de acordo com o organismo do qual é derivada. A
Ec oRI,
por exemplo, é uma
enzima obtida de Escheri chia c oli cepa R e foi a primeira enzima desse tipo isolada. A maioria das enzimas de restrição reconhecem sequências de 4, 5 ou 6 nucletídeos. Muito poucas reconhecem sequências maiores. Algumas são denominadas isosquisomeros, por clivar em diferentes sítios dentro de uma mesma sequência (Ex.
XmaI
e S maI) e por clivar o mesmo sítio
mesmo sendo obtidas de diferentes microorganismos (Ex. Hind III e H suI). Outras enzimas reconhecem diferentes sequências com o mesmo sítio interno (Ex. BamH I e Sau3A). Para cada região da molécula de DNA onde a sequência específica ocorre, a enzima de restrição corta ambas as cadeias de forma reprodutível, formando extremidades assimétricas ou coesivas (³stick-end´) ou simétricas ou cegas (³blunted-end´). Estas enzimas são utilissímas para cortar duplas fitas de grande tamanho em fragmentos reprodutíveis e para preparar DNA de diferentes fontes utilizado em procedimentos de clonagem. As Ligases, como a DNA-ligase usada durante a replicação, catalizam a formação de ligações fosfo-diester entre dois segmentos de ácidos nucleicos. As DNA ligases requerem a presença de um molde complementar, no entanto, as RNA ligases não tem essa exigência para o processamento do mRNA. As Polimerases catalizam a síntese do polímero de ácido nucleico complementar usando uma cadeia precursora como molde. Essas enzimas são fundamentais para a clonagem e ampificação de genes. A T aq DNA polimerase, por exemplo, é uma enzima extremamente útil para a amplificação do DNA in vitro pela reação de polimerização em cadeia (PCR). A transcriptase reversa, presente apenas nos retrovírus, cataliza a síntese de DNA a partir de moldes de RNA ou DNA. Essa enzima tem importante função no ciclo vital dos vírus, mas pode ser usada in vitro para procedimentos de clonagem e para o preparo de sondas de DNA a partir de mRNA. A transcrição reversa constitui-se um método útil para produzir uma copia complementar de um gene (denominado cDNA) a partir do mRNA. Dessa forma, o genoma dos retrovirus pode ser identificado em amostras biológicas utilizando esse método.
PRINCÍPIOS DE ELETROFORESE y
INTRODUÇÃO Eletroforese é uma técnica de separação que envolve o movimento de partículas com
cargas em solução, sob ação de um campo elétrico. Portanto, qualquer partícula ou molécula carregada pode se mover nessas condições, e consequentemente podem ser separadas, desde que tenham diferentes cargas. A separação eletroforética das partículas pode ser realizada em meio líquido(eletroforese livre de Tisellius) ou em um suporte inerte. A carga eletrica aplicada sob a solução é realizada através de eletrodos que são colocadas na solução. Um ion migra através da solução na direção ao eletrodo de carga oposta. Portanto, uma partícula carregada positivamente(catiosn) migra para o polo negativo (catodo), enquanto as partículas negativas(anions) migram para o polo positivo(anodo).
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PRINCÍPIOS BÁSICOS DA ELETROFORESE
Terminologia: ânion: partícula carregada negativamente ou íon cátion: partícula carregada positivamente tampão: Uma mistura de substâncias que doam e aceitam proton com a função de manter a concentração do proton (pH) constante ou dentro de um valor próximo. Um tampão pode ser feito com uma mistura de um ácido fraco com o respectivo sal. Ex: ácido acético e acetato de sódio. Condutividade: a propriedade de uma substância conduzir a corrente elétrica. Numa solução iônica, a soma do produto da concentração da carga e a mobilidade da mesma. eletrodos: substâncias em contato com um condutor. A substância estão conectadas a fonte elétrica. Fonte elétrica: Equipamento que transforma corrente alternada em corrente contínua, que possa ser controlada por um potenciometro, que permite variar a tensão, a corrente, a carga elétrica que se quer aplicar no sistema. Esse equipamento, pode medir a tensão elétrica (em Volts), a corrente elétrica(Amperagem), e a potência elétrica (Watts). eletro-osmose; tendência da solução se mover em relação a uma substâncias estacionária adjacente, quando uma diferença de potencial é aplicada. força iônica: É a soma da concentração de todos ions na solução, medido pelo quadrado de suas cargas. mobilidade: a velocidade de uma partícula ou ion que é dado pela voltagem aplicada. Uma medida relativa de quanto rápido um i ons se movimenta em um campo el étrico.
Mobilidade efetiva: A real mobilidade de uma substância sob certas condições. Geralmente é menor que a mobilidade devido a menor carga, ou resistência do suporte ou meio. poder de resolução: E¶ a habilidade de separar substâncias que migram muito próximas. gel: É uma malha de fibras, ou de polímeros que é sólida, mas retém uma grande quantidade de solventes nos poros ou nos canai s internos das malhas.
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FATORES QUE INFLUENCIAM NA SEPARAÇÃO E MOBILIDADE ELETROFORÉTICA
A aplicação de um campo elétrico a uma solução que contém partículas carregadas pode separá-los. A separação depende de vários fatores que influenciam e que podem ser resumidas em: Força aplicada nas partículas (voltagem), carga da partícula, pH do meio, condutividade do meio, resistência da matrix, conformação da partícula, força iônica do meio, temperatura, eletroendosmose, etc 1. Força na partícula A força exercida em uma partícula carregada depende do campo elétrico, voltagem ou volts por centímetro, e a carga da partícula, Q. A força sob a partícula carregada é o produto:
Feletrica=QV A força elétrica, F eletrica, quando exercida na partícula, causará o seu movimento. No entanto, o movimento da partícula no solvente será também influenciado pela resistência, devido a viscosidade, a resistência, a qual exerce uma força é proporcional a velocidade:
Fresistência= fv A constante de proporcionalidade, f é chamada de coeficiente de fricção (medida de resistência de uma partícula oferece quando em movimento em um solvente). 2. Coeficiente de fricção depende da viscosidade do solvente e do tamanho, e forma da partícula Quanto maior a viscosidade, menor o movimento. Quanto maior ou mais assimétrica a partícula, menor seu movimento através do solvente. O coeficiente de fricção de uma grande partícula tais como proteinas é uma propriedade característica de cada elemento. 3. Mobilidade da partícula Quando um campo elétrico é aplicado em uma partícula carregada, ela inicia a migração. A força eletroforética e a fricçional se opõe uma a outra, e a velocidade dessa aumenta até as forças se igualarem (Feletrico = Fresistencia ). A velocidade, v, que uma particula alcança em um campo elétrico, V, é determinado por duas propriedade s das partículas - sua carga e seu coeficiente de fricção. Consequentemente, o valor de v/V é também uma propriedade característica das partículas e é importante o suficiente para receber o seu próprio nome: mobilidade. 4. Efeito do pH do meio
Cada íon possui sua carga e mobilidade muito particular. No entanto, quando a solução contém uma substância a qual o pK é próximo do pH do meio, esta substância ocorre em ambas as formas: a carregada e a não carregada. A fração com uma carga será dependente do pK da substância e o pH da solução. Quando o pH é igual ao pK de um ácido fraco, somente 50% das partículas estarão carregadas. Uma unidade de pH abaixo da pKa, 90% das partículas estarão sob a forma carregada. Desde que a carga efetiva de uma substância varia com o pH, a sua mobilidade efetiva também varia com o pH. O pH da solução é escolhido de tal forma, que a partícula a ser separada pela eletroforese, se mantenha em um estado máximo de carga, para sua máxima separação. Os tampões são substâncias iônicas por si, portanto, exercem a função de manterem o pH o mais próximo possível da ideal e fazem parte do processo. 5. Condutividade e movimento dos íons Em qualquer sistema elétrico, a corrente produzida é proporcional a voltagem aplicada;
V = resistência X Corrente
ou
V =
corrente___ condutividade
Na eletroforese, a corrente é um fluxo de íons(em ambas direções). A condutividade é a soma das concentrações multiplicado pela mobilidade efetiva de todos os ions presentes. Um íon com maior mobilidade efetiva carreia uma mai or fração da corrente A voltagem, condutividade, e a corrente portanto estão todos relacionados. Se a condutividade está aumentada pelo aumento da concentração salina a corrente se mantém constante, a voltagem deve decrescer. Se decresce a voltagem reduz a força elétrica, Feletrica, nas partículas carregadas, diminuindo o movimento das macromoléculas. O aumento do tempo seria necessário para uma separação, e a resolução diminui devido ao aumento da difusão. Se a condutividade está aumentada numa voltagem fixa, a corrente deve aumentar, portanto aumentando o calor elétrico gerado pelo sistema, desde que o aquecimento é proporcional ao quadrado da corrente. O excesso do aquecimento produz distúrbios convectivo nas soluções, a qual distorce o padrão eletroforético e pode também desnaturar as macromoléculas. Desde que o aumento da condutividade mesmo em voltagem fixa ou corrente tenha efeito deletério, resultados ótimos podem ocorrer quando se conserva a concentração dos ions e portanto a condutividade em valores moderados. 6. Carga e conformação Como já se discutiu, o que determina a migração eletroforética é a carga da partícula que se quer separar. Muitas vezes, a distribuição das cargas não estão desvinculadas a sua conformação estérica, portanto, pode-se alterar a carga de uma partícula dependendo de sua conformação, principalmente em se tratando de macromoléculas. As macromoléculas, em seu estado relaxado, tendem a apresentar alguns eletrólitos ligados fortemente, portanto levando a uma alteração na sua mobilidade. 7. Atmosfera iônica e o potencial zeta Contra-íons, ou íons de carga oposta, naturalmente tendem a circundar próximos a grupos carregados das macromoléculas. No entanto, eles não chegam a neutralizar as cargas
das macromolécuals mas, por sua vez estão localizados próximos dos grupos carregados das macromoléculas, formando uma dupla camada de carga em torno dessas, denominadas de atmosfera iônica. As macromoléculas movem-se com a camada de hidratação e com os contra ions. Esses reduzem a carga efetiva das macromoléculas, a um nível dado pelo potencial zeta. Esse potencial significa a energia produzida pela carga efetiva das macromoléculas na superfície de contato, que é a região limite do complexo macromolecular na solução e o material que o está envolvendo. 8.
Suportes A grande meta da eletroforese é a separação de uma mistura heterogênea de substâncias iônicas seja ela macromoléculas ou íons simples, em zonas completamente identificáveis. Os suporte devem permitir a penetração do material a ser separado o máximo possível e ainda delimitar o fluxo de volume (eletroforese convencional). A maioria dos suportes oferecem esse princípio determinando o tamanho do poro para o movimento eletroforético das macromoléculas. O tubo capilar também exerce esse ef eito. 9. Eletroendosmose O suporte não deve interagir com as moléculas a ser separadas, isso poderia impedir ou inibir a separação. Uma interação comum que pode ocorrer, não é a adsorção usual do material. Mais comumente é o efeito dos grupos carre gados que estão ligados ao suporte, que resulta em eletro-endosmose. Como exemplo típico temos o suporte ágar, que é muito utilizado na eletroforese. O ágar é uma mistura de agarose e agaropectina. A agaropectina tem um número relativamente grande de grupos carboxil, que em pH neutro tem contra-íons. Se o campo elétrico for aplicado, os contra-íons irão se mover, mas o grupo carboxil ligados a matrix (agar) não migrarão. Os contra-íons carreia solvente o suficiente para que produza um fluxo significativo nesta direção, esse fenomeno denomina-se de eletro-osmose, que as vezes é denominado de endosmose.
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TIPOS DE SUPORTE
Os tipo de suporte podem variar desde uma solução de sacarose até em substância pouco solúveis como fibras de celulose. Os suportes de meio contínuo mais comuns são: agar, agarose, poliacrilamida e amido. A porosidade ou a média do tamanho do poro em alguns suportes é fixo. Entretanto, em alguns suportes podem ser controlados. Como exemplo, a mudança da concentração do gel de agarose, agar e amido, pode m udar o tamanho do poro. O tamanho dos poros do gel de poliacrilamida mais utilizados para macromoléculas está em torno de 5% a 10%, que separam proteínas de 15.000 a 250.000 Daltons. Esse tipo de suporte separa tanto pelo tamanho do poro como por carga elétrica.
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TIPOS DE ELETROFORESE.
a. Dependendo da matrix
Eletroforese livre de Tiselius Eletroforese em acetato de celulose Eletroforese em gel de agar Eletroforese em gel de agarose Eletroforese capilar b. pH de separação pH ácido pH neutro pH alcalino
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APLICAÇÕES DA ELETROFORESE NAS TÉCNICAS MOLECULARES
1. Gel de Agarose Um dos métodos eletroforéticos mais comuns utilizados na prática diária em biologia molecular é a de gel em agarose. Essa técnica muito simples, rápida, prática e apresenta boa resolução na separação dos fragmentos de DNA, se comparados com outras bem mais demoradas como a separação por ultracentrifugação em gradiente de densidade de sacarose. Uma boa separação eletroforética do DNA utilizando gel de agarose depende de vários f atores: 1.1. Tamanho molecular do DNA. As moléculas lineares, dupla fita de DNA migram inversamente proporcional ao log10 do peso molecular através do gel de agarose. 1.2. concentração da agarose. O fragmento do DNA migra em diferentes proporção at ravés do gel contendo diferentes concentraçào da agarose. Existe uma relação linear entre a mobilidade logaritimica do DNA e a concentração do gel que é baseada numa equação matemática(Helling e cols , 1974) figura 1. LogQ=log Qo- Kr X Onde Qo é a mobilidade eletroforética livre e Kr é o coeficiente de retardamento, X = a constante que é relacionada as propriedades do gel e o tamanho e a forma da molécula em migração. Baseada nessa correlação podemos separar várias moléculas de DNA (de variado tamanho) nas diferentes concentrações de agarose. Porcentagem de agarose 0,3%
intervalo da efficiência da separação da molécula de DNA em Kb 5 a 60
0,6% 0,7% 0,9% 1,2% 1,5% 2,0%
1 a 20 0,8 a 10 0,5 a 7 0,4 a 6 0,2 a 4 0,1 a 3
1.3. Conformação do DNA A forma circular (forma I), forma circular contorcida(forma II) e forma linear (forma III) do DNA com a mesmo peso molecular migra através do gel de agarose em diferentes posições (Thorne, 1966, 1967). A mobilidade relativa das 3 formas s ão dependentes primariamente da concentração do gel, mas são também influenciados pela corrente aplicada, força iônica do tampão e da densidade superhelicoidal da torção na forma I do DNA (Johnsom and Grossman , 1977). Em algumas condiçoes, a forma I do DNA migra mais rápido que a forma III, em outras condições pode ser de ordem inversa. Um método geral para identificar as diferentes conformações do DNA é utilizar na corrida eletroforética em agarose diferentes concentrações de brometo de etídio(concentração crescente). Quanto mais brometo de etidio mais se liga ao DNA. As torções superhelicoidal negativas da a forma I do DNA vão sendo progressivamente removida e seu índice de migração diminui. Numa concentraçao crítica do corante livre, onde não permanece a forma superhelicoidal, o índice de migração da forma I do DNA esta no seu mínimo valor. Se ainda mais brometo de etídio for adicionado, torções superhelicoidais positivas são gerados e a mobilidade da forma I do DNA aumenta rapidamente. Simultaneamente, as mobilidades das formas II e formas III do DNA são diferentemente diminuidas como consequência da neutralização da carga e da maior tenacidade é dada ao DNA pelo brometo de etídio. Para a maioria das formas I de DNA, a concentração critica do brometo de etídio livre é de 0,1 a 0,5 Qg/ml A corre nte aplicada: A baixa voltagem, a razão da migração dos fragmentos de DNA linear é proporcional a da voltagem aplicada. Entretanto, a medida que a carga elétrica aumenta, a mobilidade dos fragmentos de DNA de alto peso molecular aumenta diferentemente. Dessa maneira o intervalo efetivo da separação do gel de agarose decresce a medida que a voltagem aumenta. Para obter a máxima resolução dos fragmentos de DNA, o gel deve ser submetido a uma corrente de no máximo 5V/cm Composição das bases e temperatura: O comportamento eletroforético do DNA em gel de agarose não é significantemente afetado pela composição das bases do DNA ou pela temperatura do gel na corrida. Dessa forma, os geis de agarose e a mobilidade eletroforética dos fragmentos de DNA de diferentes tamanhos não muda entre 40C a 300C. Em geral, os geis
de agarose são submetidos a corrida em temperatura ambiente. No entanto, em concentrações muito baixas (0,5%) os géis são pouco consistentes, sendo convenientes trabalhar em baixas temperaturas, pois esses géis ganham mais firmeza, da mesma forma os géis de agarose de baixo ponto de fusão(³low melting´ agarose).
1.4. Tampões utilizados Existem uma variedade de tampões que podem ser utilizados para separação eletroforética de DNA.
TAMPÕES
CONCENTRAÇÃO
FORMULAÇÃO
Tris-acetato (TAE)
0,04M Tris acetato 0,01M EDTA
Tris-fosfato (TPE)
0,08M Tris-fosfato 0,002M EDTA
Tris-borato (TBE)
0,089M Tris borato 0,089M ac. bórico 0,002M EDTA
50X 242g tris base 57,1 ml ácido acético 100ml EDTA 0,5M(pH8,0) 10X 108 g Tris Base 15,5ml de ac. fosfórico 85% 40ml EDTA 0,5M (pH8,0) 5X 54g Tris-base 27,5g ác. bórico 20 ml EDTA 0,5M (pH8,0)
1.5. Tipos de Agarose Muitos tipos de agarose estão disponíveis, o que se recomenda para uso diário é o tipo II, baixa eletroendosmose. O inconveniente desta agarose é que possue contaminantes de polissacárides sulfatados que inibem enzimas, como ligases, polimerases, e endonucleases. No entanto, a sua utilização é muito difundida, pois o DNA pode ser purificado e ser utilizado com sucesso nas clonagens e como substratos de reações com essas enzimas 1.6. Coloração do DNA em gel agarose O método mais conveniente para visualizar o DNA no gel de agarose é a coloração por brometo de etidio, que fluoresce sob luz ultra violeta. Esse composto contém um grupo planar, que intercala entre as bases do DNA. A posição fixa do grupo e sua proximidade às bases causa uma ligação do corante com o DNA, que se destaca com um aumento da fluorescência comparada com o corante em solução sob a forma livre. A radiação UV absorvida pelo DNA a 260 nm é transmitida para o corante, ou a irradiação absorvida a 300 nm e 360 nm pelo corante ligado propriamente dito, é emitido a 590nm na região da cor vermelho alaranjada, do espectro visível.
O brometo de etídio pode detectar tanto os ácidos nucleicos de simples ou de dupla fita. No entanto, a afinidade do corante pela fita simples é relativamente baixa, e a fluorescência emitida é fraca. Geralmente o brometo de etídio é incorporado no tampão de corrida e no gel a 0,5ug/ml. Nesse caso devemos considerar que a mobilidade linear das fitas duplas está reduzida na presença do corante em aproximadamente 15%. Uma vantagem deste procedimento é a possibilidade de visualizar o gel durante a separação eletroforética, sem a necessidade de remover o gel do suporte e da cuba, simplesmente incidindo a luz UV sob o gel. Mas, se houver necessidade da coloração posterior basta imergir o gel numa solução de brometo de etídio, no próprio tampão de corrida, po r 45 minutos a temperatura ambiente. A descoloração normalmente é dispensada, exceto se houver excesso de corante. Quando a quantidade de DNA é muito reduzida, a pouca fluorescência do brometo de etídio pode interferir na visuallização da banda de DNA. Neste caso recomenda-se imergir o gel em uma solução de sulfato de magnésio a 1mM por uma hora, a temperatura ambiente 1.7. Documentação: O gel de agarose é facilmente documentado, utilizando um sistema de fotografia instantânea ou sistema automatizado de captura de imagem. O filme mais sensível para essa finalidade é fornecida pela Polaroid, tipo 57 ou 667, asa 3000.
Sob a luz UV de no mínimo
2500uW/cm2 e uma boa máquina , utilizando filtro laranja, expõe-se por alguns segundos. Recomenda-se para a máquina Polaroid modelo DS 34 uma abertura de 5,6 ou 8 e uma velocidade de 4 ou 8 segundos, mas pode variar com a intensidade das bandas e do tamanho do gel. Para padronização tente vários tempos de exposição com várias aberturas.
2. Gel de poliacrilamida O gel de poliacrilamida é um suporte bastante utilizado em biologia molecular para separação e caracterização de fragmentos de tamanho menores de DNA, que se tem dificudade por geis de agarose. Descrito por Raymond & Weintrab em 1959. O produto de polimerização da acrilamida, que é o monômero, com a N.N'metilenobisacrilamida, que realiza a reação de "cross linking" ou reação cruzada, gera o suporte de poliacrilamida. A polimerização ocorre por ligação vinílica, sob ação de catalisadores, o perssulfato de amônia, cuja fonte de radicais livres é o N,N,N'N' tetrametilenodiamina(TEMED). Portanto, o oxigênio é um inibidor da reação. O polímero formado são cadeias lineares de poliacrilamida, cuja reação cruzada entre elas é dada pela bisacrilamida. O comprimento médio das cadeias é determinado pela concentração relativa da acrilamida e a quantidade de bisacrilamida. Portanto a relação entre a quantidade de acrilamida e bisacrilamida determina as propriedades físicas do gel, que darão subsídios para separação nesse tipo de gel.
O gel de poliacrilamida é utilizado para os fragmentos menores que 1kb. Eles podem ser preparados em uma variada concentração (3,5% a 20%), dependendo do tamanho do fragmento de interesse para a separação e i dentificação. ACRILAMIDA (%)
INTERVALO DE SEPARAÇÃO (NUCLEOTÍDEOS)
3,5 5,0 8,0 12,0 20,0
10-1000 80-500 60-400 40-200 10-100
Os géis de poliacrilamida devem ser preparados entre duas placas de vidro, pois necessita de um ambiente isento de oxigêncio para se pol imerizar. O tamanho do gel pode variar de 10cm de altura por 10cm de largura até 20 a 30cm de largura por 40 a 100 cm de altura dependendo da necessidade do sistema; de espessura normalmente para DNA utiliza-se 0,75 a 1,5 mm.
REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR)
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PRINCÍPIOS DA REAÇÃO DE PCR A reação de polimerização em cadeia (³Polimerase chain reaction´, PCR) é a técnica
que permite a amplificação do DNA ou RNA in vitro, utilizando-se basicamente de uma reação enzimática catalizada pela poli merase (enzima termoestável) cuj a atividade depende de ions Mg++, e ocorre em 3 etapas: ³Melting´(ou desnaturação que consiste na separação da dupla fita do DNA a ser amplificado), ³annealing´( anelamento ou hibridização- ligação do iniciador ou ³primer´ ao DNA a ser amplificado) e ³extension´(extensão ou seja a polimerização propriamente dita) Metodologicamente a técnica de PCR requer três passos (SAIKI et al., 1.988): 1. Desnaturação - Inicialmente é necessário que as duas fitas de DNA a ser amplificado sejam separadas. A elevação da temperatura entre 90 a 95 ºC promove a separação da fita dupla de DNA em duas fitas simples. Este procedimento é chamado ³Desnaturação´ ou ³melting´, e muitas vezes a temperatura de desnaturação é determinada empiricamente e depende de alguns fatores como a quantidade de guanina e citosina (GC) do fragmento DNA alvo ou de interesse. 2. Anelamento - A polimerase para assumir suas funções, isto é, anexar as bases complementares, transformando as fitas simples em fitas duplas, necessita de um fragmento de DNA já ligado na região previamente escolhida. A solução, então, é demarcar as extremidades do DNA-procurado ou de interesse
nas duas longas fitas simples,
tornando-as duplas, apenas nesse intervalo. Para isso adicionam-se, à solução, os ³primers´ ou iniciadores que são pequenos fragmentos sintéticos de DNA de fita simples, oligonucleotídeos de 20 a 30 bases nitrogenadas de comprimento, que são sintetizados in vitro
baseado na sequência do DNA a ser amplificado sendo eles complementares à
seqüência do segmento de DNA de interesse. O conhecimento da seqüência procurada é naturalmente pré-requisito para a síntese dos ³primers´. Os ³primers´ perseguem na reação as regiões, as quais foram escolhidas, para hibridizar-se às seqüências complementares nas duas fitas simples (usualmente 5¶). Nas duas fitas surgem, assim, um pequeno fragmento de DNA de dupla fita intacta. A hibridização dos ³primers´ descrito
como
³Annealing´ (do inglês), deve ser feito a uma tempertura inferior à da desnaturação (45 a 60 rC).
3. Extensão - Quando os ³primers´ encontram e ligam-se aos segmentos complementares, a DNA-Polimerase pode assumir sua função. Inicia-se a partir dos pequenos fragmentos de DNA de fita dupla (resultado do anelamento do ³primer´), incorporando um a um os nucleotídeos correspondentes, isto é, as bases juntamente com as moléculas de açúcar e fosfato. A DNA-Polimerase liga os nucleotídeos entre si, completando assim as fitas simples
e tornando-as duplas (extensão). A DNA-Polimerase não reconhece apenas o bloco de início como também consegue diferenciar as duas extremidades dos ³primers´ (3¶ e 5¶). Ela inicia a reação sempre pela extremidade 3¶ do ³primer´, completando a fita simples daí em diante, portanto, sempre na direção do f ragmento procurado. Os fragmentos de DNA recém-formados fornecem mais moldes para a montagem de novas fitas nos ciclos subseqüentes, no entanto, com região já determinada, resumindo, temos uma reação em cadeia. Após cada ciclo, o número de fragmentos se duplica: de um formandose 2, e então novamente 4, 8, 16, 32, 64, 128...
de tal forma que pode ser definida
matematicamente por: N = N o 2n v
N = número de moléculas amplificadas No = número de moléculas iniciais n = número de ciclos de amplificação O modelo teórico considera que a eficiência do processo de amplificação corresponde a 100%, o que não é observado na prática. Experimentalmente, a eficiência da reação está abaixo da ideal e gira entorno de 78% a 97%, dependendo do gene amplificado. Teoricamente após 20 ciclos têm-se cerca de um milhão; após 30 ciclos, cerca de um bilhão de cópias do fragmento de DNA de interesse. Automação da PCR O procedimento da PCR foi tão aperfeiçoada desde a sua primeira descrição, que na atualidade transcorre de forma totalmente automática. Uma importante condição para isto foi a substituição da DNA-Polimerase originalmente utilizada (extraída de Polimerase termoestável extraída da bactéria
T her mus
aquati cus
E. c oli )
por uma DNA-
(Taq-polimerase).
Desta
forma, os vários ciclos transcorrem, seguidamente, em um único tubo de ensaio, sem necessidade de interrrupção para a adição de nova DNA-Polimerase ativa. Todos os reagentes necessários (o DNA-template, os ³primers´, a DNA-Polimerase, e os dNTPs) são misturados com uma solução tampão que ajusta o pH ótimo da reação. Um aparelho de PCR ou um termociclo repete o correspondente programa de temperaturas. O operador deve apenas programar e dar início para que transcorra a amplificação. Um ciclo dura em média três minutos. Assim, em uma hora, podem ser produzidas cerca de um milhão de cópias e, em menos de duas horas, cerca de um bilhão de cópias da seqüência de DNA de interesse. O produto amplificado pode alcançar aproximadamente 106 cópias em 30 ciclos e pode ser realizado em 2 horas.
A PCR é uma ferramenta na biologia molecular tão poderosa quanto a descrição das enzimas de restrição e o Southern blot. Anunciado na Conferência da Sociedade Americana de Genética Humana de 1985, a técnica de PCR tem sido utilizada de forma multidisciplinar com um número crescente de publicações por ano(exemplo de 1985 a 1990 mais de 600). Técnicamente muitas mudanças tem sido introduzidas melhorando cada vez mais e ampliando a sua utilização. No entanto, é preciso salientar que para cada situação experimental, novas modificações têm de ser introduzidas, de tal forma que é muito difícil descrever um único procedimento para um uso generalizado. Por outro lado, é fundamental o conhecimento básico das etapas envolvidas na técnica, para um desenho experimental com sucesso. A utilização de PCR é tão ampla que podem ser editados compêndios sobre a metodologia de PCR em cada especialidade diagnóstica. Na aplicação diagnóstica e, particularmente, na Microbiologia a atuação da biologia molecular é muito ampla, apesar de estar ainda no cunho de afirmação e de uso restrito à pesquisa e ao ensino. Porém, muitas doenças infecciosas dependem de um diagnóstico rápido e seguro, que com certeza a única solução está na PCR. A liberação para uso rotineiro no laboratório clínico ainda não é permitido para toda as possíveis aplicações, no entanto, a necessidade de meios mais sensíveis e precisos farão com que a técnica de PCR se torne uma ferramenta impressindível e quase obrigatória no diagnóstico precoce de várias doenças, apesar do custo ainda estar um pouco elevado. A técnica de PCR é tão sensível que é capaz de amplificar uma simples molécula de DNA e tal é a sua especificidade, que uma simples cópia de gene pode ser extraida de uma mistura complexa da sequência genômica de forma rotineira e visualizada como uma simples banda no gel de Agarose. Como se pode notar, a sensibilidade e a especificidade que o método pode oferecer é algo singular. A PCR utilizando DNA polimerases termoestáveis foi descrita pela primeira vez por Kary Mullis e patenteada nos EUA sob o n r 4.683.195, em julho de 1987 e nr 4.683.202. Saiki e cols, 1985, Mullis e cols,1986, Mullis e Faloona 1987 introduziram as diversas aplicações do PCR para a comunidade científica e atualmente é inesgotável a sua aplicação prática tanto na pesquisa básica como na aplicada. Em termos práticos, podemos di zer que um protocolo geral pode ser seguido, mas com a ressalva da necessidade da optimização para cada tipo de aplicação. Os principais problemas citados na literatura para a padronização pode-se assim resumir: Não detecção do produto, baixo rendimento do produto desejado, presença de bandas não específicas devido a ³mispriming´ ou ³misextension´ dos ³primers´, formação de dímeros dos ³primers´ que competem pela amplificação com o produto desejado, mutação ou heterogeneicidade devido a erro de incorporação.
Primer : é um seguimento de DNA ou RNA de 15 a 40 bases, geralmente baseado na sequência já conhecida do ácido nucleico, geralmente sintetizado quimicamente por instrumentos automáticos, que podem ser adquiridos no comércio para fins já definidos ou se escolhe a região desejada do DNA ou RNA a ser amplificada. Sonda (probe): É um segmento de DNA ou RNA que foi marcado seja com enzimas, substratos antigenicos, substâncias quimioluminescentes ou radioativas, que podem ligar-se com alta especificidade a uma sequência complementar do ácido nucleico alvo (escolhido).
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PROTOCOLO GERAL PARA PCR
1. A reação pode ser realizada no volume de 100Ql ou 50Ql. Escolha o volume a ser usado. 2. Para o volume de 100Ql, colocar em um tubo de 0,5 ml com tampa com fechamento hermético. 2.1. DNA a ser amplificado 10 5 a 106 moléculas(³target DNA´ ou ³Template´) 2.2. 20 pmol de cada ³primer´ (ou iniciadores,Tm>55rC é preferido) 2.3. 20 mM Tris-HCl (pH8,3, 20 rC) 2.4. MgCl 2 1,5 mM 2.5. Kcl 25 mM 2.6. Tween 20 a 0,05% 2.7. 100Qg/ml de gelatina autoclavada ou albumina bovina livre de nuclease 2.8. 50 QM de cada dNTP(dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 2.9. 0,2 a 2 unidades de Taq polimerase 3. Pré-incubar (se for DNA genômico) 10 minutos a 94o C 4. Programar o termociclo em: Desnaturação: 96 rC (pode variar de 94 a 96 rC), por 15 segundos a 2 minutos Hibridização (Primer Annealing): 55 rC (pode variar de 45 a 62 rC), por 30 segundos a2 minutos Polimerização (Extension): 72rC(pode variar de 55 a 72rC) por 1,5 minutos Extensão final do programa : de 25 a 30 ciclos, de 72rC por 5 a 10 minutos
Estabilização e parada de reação: 4rC ou adição de 10 mM de EDTA.
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FATORES QUE INFLUENCIAM A PCR 1. Atividade enzimática da Taq polimerase Se os outros componentes da reação estiverem optimizados, de 1 a 2,5 U são
suficientes para uma boa amplificação em 100 Ql de volume total. Quando em etapa de optimização, as quantidades da enzima a serem utilizadas coompreendem o intervalo maior entre 0,5 a 5 U/100Ql. Obs: A quantidade de enzima necessária varia com as características do ³templ ate´ e do ³primer.´ Se a concentração de enzima for muito alta, ocorre o aparecimento de produtos inespecíficos que podem se acumular; e ao contrário, se baixo, a quantidade de produto desejado será insuficiente. A origem comercial da Taq polimerase é um importante fator, se a aquisição for de vários fornecedores, pode-se obter resultados diferentes, devido as diferentes formulações, diferentes condições de ensaio e pode diferir na definição da unidade. 2. Deoxinucleotídeo trifosfato: Se a solução de uso for preparada a partir de solução estoque é necessário neutralizar para pH 7,0, seguida de determinação espectrofotométrica da concentração. A solução primária deve ser preparada a 10mM, distribuida em alíquotas e estocada a -20 rC. A solução de trabalho recomendada é de 1mM de cada dNTP. A estabilidade dos dNTPs após os vários ciclos de amplificação permanece em aproximadamente 50% da concentração inicial. Na reação, a concentração recomendada varia de 20 a 200QM para um resultado com boa especificidade e reprodutibilidade. Deve-se utilizar as mesmas concentrações de dNTP ou valores equivalentes, isto minimiza os erros de incorporação. Quanto menor a concentração de dNTPs menor o risco de ³mispriming´ ou erro de incorporação de nucleotídeos. A quantidade mínima recomendada é de 20QM de cada dNTP para 100Ql de reação, quantidade suficiente para sintetizar 2,6 Qg de DNA ou 10pmol de uma sequência de 400bp. Ultimamente se estabeleceu que 2QM foi capaz de dar uma alta sensibilidade de detecção e amplificação de pontos de mutação do gene ras. De qualquer modo, para cada experimento deve-se encontrar uma quantidade ótima. 3. Concentração de Magnésio. A concentração de magnésio é bastante importante, pois afeta a hibridização(³annealing´), a temperatura de separação do DNA alvo (³melting´), o produto de PCR, a especificidade do produto, a atividade da enzima Taq, leva à formação de dimerização
de ³primer´, prejudicando a fidelidade do experimento. A concentração dos ions Mg++ deve estar entre 0,5 a 2,5 mM acima da concentração total do dNTPs. Sempre deve-se considerar a concentração de EDTA na amostra que pode interferir na concentração dos íons Mg++ . 4. Outros componentes O tampão recomendado para o PCR é o TRIS-HCl na concentração de 10 a 50 mM com pH entre 8,3 a 8,8 medido a 20 rC. Este tampão dipolar tem um pKa de 8,3 a 20rC e um pKa de -0,0021/rC, portanto, o pH verdadeiro de 20mM de TRIS pH 8,3 a 20 rC varia de 7,8 e 6,8 durante as condições de termociclagem. Pode-se adicionar cerca de 50mM de KCl na mistura de reação para facilitar a hibridaçào dos ³primer´. O Cloreto de sódio a 50 mM, ou KCl abaixo de 50 mM inibe a atividade da Taq polimerase. O DMSO (dimetilsulfoxido) é util para a reação de amplificação com Klenow fragmento de E. coli DNA polimerase I; 10% de DMSO inibe a atividade da Taq polimerase em 50%, apesar de Chamberlain e cols. o recomendarem para amplificação de sequências multiplas, na mesma reação. A gelatina, a proteína (albumina bovina, 100(g/ml) e o detergente não iônico como o Tween 20(0,05-0,1%) podem ser utilizados para estabilizar as enzimas, mas muitos protocolos tem dispensado a sua utilização.
5. HIbridação dos iniciadores (³Primer Annealing´) A temperatura e tempo requerido para o hibridação de ³primer ´ depende da composição em bases, do comprimento e da concentração. A temperatura básica aplicável seria de 5rC abaixo da Tm verdadeira dos primers. Devido a Taq DNA polimerase ser ativa abaixo do intervalo de temperaturas, a extensão dos primers ocorrerá em baixas temperaturas, incluindo a etapa de hibridação. O intervalo de ação da atividade enzimática varia na ordem de 2 vezes a magnitude entre 20 a 85rC. A temperatura de ³annealing´ no intervalo de 55 a 72rC, geralmente dá melhor resultado. Numa concentração típica de primers(0,2QM), o ³annealing´ só requer poucos segundos. O aumento da temperatura de ³annealing´ aumenta a discriminação contra os erros de hibridização dos primers ³mispriming´, reduzindo a extensão ou polimerização dos nucleotídeos incorretos no final 3¶ dos ³primers´. Portanto, as temperaturas de ³annealing´ mais estringentes, especialmante nos primeiros ciclos poderá aumentar a especificidade. Para se obter uma especificidade máxima, no início dos ciclos aumenta-se a temperatura de ³annealing´ e adiciona-se a Taq polimerase após a primeira etapa de desnaturação e ³annealing´ do primer.
Baixas temperaturas de etapas de ³extension´ com altas concentrações de dNTPs favorecem os erros de polimerização, ou seja, os nucleotídeos são incorporados erroneamente, motivo pelo qual alguns autores recomendam a utilização de ³primers´ mais longos e de 2 temperaturas para o PCR. As temperaturas são de 55 a 75 rC para ³annealing´ e ³extension´ e 94 a 97rC para desnaturação e separação de cadeias. 6. Extensão (ou polimerização) O tempo de polimerização ou ³extension´ também depende de alguns fatores como a concentração e o comprimento do DNA a ser amplificado. A extensão dos ³primers´ tradicionalmente é realizada a 72 rC, porque esta temperatura é próxima do ótimo para extensão de ³primers´ no modelo de DNA do M13. A média de incorporação dos nucleotídeos a 72rC varia de 35 a 100 nucleotídeos por seg-1 dependendo do tampão, pH, concentração salina e natureza do DNA alvo. O tempo de 1 minuto a 72rC é considerado suficiente para a extensão de produtos de até 2kb. No entanto, tempos mais prolongados podem ser úteis em casos de poucos ciclos e se a concentração do substrato for muito baixa e também em ciclos prolongados quando a concentração do produto ultrapassa a concentração da enzima. 7. Tempo e temperatura de desnaturação A maioria das causas de insucesso do PCR é a incompleta desnaturação do DNA a ser amplificado ou do produto de PCR. Uma temperatura típica de desnaturação é 95rC por 30 segundos, ou 97rC por 15 segundos, porém, temperaturas mais altas podem ser apropriadas especialmente para DNA ricos em G+C. Apenas alguns segundos são necessários para desnaturar e separar as cadeias de DNA, porém, um maior tempo é necessário para se atingir a temperatura dentro do tubo de reação. Seria desejável a monitoração da temperatura dentro do tubo de reação utilizando uma sonda térmica de medida exata. A desnaturação incompleta reduz a possibilidade hibridização entre o DNA alvo e os ³primers´, diminuindo o rendimento do produto do PCR. Por outro lado, a desnaturação por longo tempo ou alta temperatura leva a perda de atividade da Taq polimerase, que é maior que 2 horas, 40 minutos e 5 minutos nas temperaturas de 92,5; 95 e 97,5rC, respectivamente. 8.
Número de ciclos. O número de ciclos dependerá da quantidade de DNA inicial, quando todos os
parâmetros estão optimizados. Um erro comum que se comete é um excesso de número de ciclos. Segundo Kary Mullis ³Se você tem que ir mais que 40 ciclos para amplificar uma simples cópia de gene, existe alguma coisa seriamente errada com o seu PCR´. Muitos ciclos pode aumentar a quantidade e a complexidade de produtos não específicos. Obviamente, um número muito baixo dará um baixo rendimento do produto desejado.
9. Iniciadores (³Primers´) A concentração dos ³primers´ entre 0,1 a 0,5 mM são, na maioria das vezes, satisfatórios. Concentrações maiores podem promover ³mispriming´ e acúmulo de produtos não específicos e podem aumentar a probabilidade de gerar um artefato independente do ³template´ denominado de ³primer-dimer´(dimerização de primer). Produtos não específicos e dimerização de ³primer´ são por si só substratos para o PCR e competem com o produto desejado pela enzima, dNTPs, e os primers, resultando em baixo rendimento do produto desejado. Algumas das regras gerais para um bom desenho de primers eficientes seriam: de 18 a 28 nucleotídeos em comprimento, tendo cerca de 50 a 60% de G+C na sua composição. A temperatura de ³melting´ (Tm) dos pares de primers deve ser adequada. Para esse propósito, pode-se usar a regra da prática de 2rC para o A ou T e 4rC para o G ou C. Dependendo da aplicação, o Tm entre 55rC e 80rC são os recomendados. Deve também evitar a complementaridade na porção 3¶ do par de "primers", pois isso pode promover a formação de artefatos de dimerização de primers e reduzir a produção do produto desejado. Outra observação é evitar três ou mais C+G na porção 3¶ dos primers que pode promover ³mispriming´ na sequência rica em G+C. Deve-se evitar, quando possível, a presença de sequências palindrômicas dentro dos primers. Se ainda, depois desses cuidados, continuar a falhar, é salutar então tentar outro par de primers. Uma razão menos óbvia para alguns primers falharem é a presença de estrutura secundária no DNA ³template´. Neste caso, substituir com 7-deasa-2¶deoxiGTP o dGTP e avaliar. O desenho de primers para propósitos especiais também podem ser elaborados tais como a adição de sítios de enzimas de restrição, mutação in vitro, ATG ³start codon´, e outros. 10. Efeito Plateau O termo efeito plateau é usado para descrever a atenuação exponencial da taxa de formação de produto de PCR, que pode ocorrer durante a fase tardia do PCR concomitantemente com o acúmulo de 0,3 a 1 pmol do produto desejado. Dependendo das condições da reação e da ciclagem térmica, um ou mais parametros podem ser af etados: 1)utilização dos substratos (dNTP ou ³primers´), 2)estabilidade dos reagentes(dNTP ou enzimas), 3)inibição por produto formado(pirofosfato,DNA duplex), 4)competição por reagentes pelos produtos inespecíficos ou dimerização de primers, 5) ³reannealing´ de produto específico na concentração acima de 10-8 (pode diminuir a eficiência da extensão ou o processamento da Taq DNA polimerase ou causar subdivisão na migração das cadeias e deslocamento de primers) e
6) incompleta desnaturação dos ³templates´ ou DNAs formados ou separação do produto em alta concentração. Um importante fator que determina o aparecimento do efeito plateau é a presença inicial de bai xas concentração de produtos desejado com presença de produtos não específicos resultantes de eventos de ³mispriming´ que podem continuar a ser amplificados preferencialmente. A optimização do número de ciclos de amplificação é a melhor maneira de evitar a amplificação de produtos indesejáveis.
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ESCOLHA DOS INICADORES PARA PCR
A. Protocolo básico para desenhar um iniciador (³primer´) 5¶para 3¶( sense) Regras gerais: Determinar a prioridade da utilização(clonar, PCR, hibridizar, outros) Se for para clonar: analisar a sequência do cDNA estudando as enzimas de restrição do DNA alvo e seguir o protocolo a seguir: 1. Copiar a sequência e região desejada do cDNA de interesse (não mais que 6 aminoácidos ou 18 bp) 2.Adicione no início 6 bases aleatórias 3.Adicione a sequência a enzima de restrição desejada (Hind III, EcoRI, etc) 4. Acrescentar a sequência que codifica o início da síntese de aminoácido(metionina ATG) 5. Checar a sequência em voz alta e verificar a porcentagem de Base C+G, que não deve ultrapassar 50% Caso o primer for utilizado para outras finalidades como: hibridização, PCR diagnóstico etc, omita as etapas 2, 3, 4. e acrescente mais pares de base para ajustar a relação C+G se necessário(não > 30). Ex 5¶ AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3¶ GAT ATG CAT ATG AAA AAT CTA AAA TCT CCT 3¶ random NdeI+iniciador
B. Protocolo básico para desenhar um iniciador (³primer´) 3¶para 5¶ (anti -sense) Regras gerais: Determinar a prioridade da utilização
Se for para clonagem seguir os m esmos critérios acima para o ³sense primer´ 1. Copiar a sequencia da região desejada do cDNA de interesse( não mais que 6 aminoácidos ou 18 bp) 2. Adicione a sequência que codifica o ³stop codon´ no final da sequência(TAG TAA) 3. Adicione a sequênicia da enzima de restrição 4. Adicione 6 bases aleatoriamente(acertar a relação C+G) 5. Faça a complementar dessa sequência 6.Copie a sequencia complementar em direção oposta ou seja do 5¶ para o 3¶(pois o sintetizador sempre iniciado 5¶) 7. Checar a sequência em voz alta, calcular a relação C+G, não deixando ultrapassar 50% (aceite com as base aleatórias acrescidas). 8. Se não usar para clonagem apenas copie a sequencia desejada, faça a complementariedade e copie a sequencia inversa, checando a sequencia em voz alta. Ex. 5¶ CGC AAA GCT CAG ATT GGT 3¶ 5¶CGC AAA GCT CAG ATT GGT TAG TAA AAG CTT AGA AGC STOPSTOPHindIII bases aleatórias 3¶ GCG TTT CGA GTC TAA CCA ATC ATT TTA GAA TCT TCG 5¶ 5¶GCT TCT AAG ATT TTA CTA ACC AAT CTG AGC TTT GCG 3¶ Recomenda-se avaliar o primer desenhado em um programa de computador, para avalia-los adequadamente antes de requerer a síntese.
TRANSCRIPTASE REVERSA
A Transcriptase reversa (RT, do inglês R ev er se transc riptase, também conhecida como DNA polimerase RNA-dependente), é uma enzima que como o seu nome indica, realiza um processo de transcrição ao contrário em relação ao padrão celular. Essa enzima polimeriza moléculas de DNA a partir de moléculas de RNA, exatamente o oposto do que geralmente ocorre nas células, nas quais é produzido RNA a partir de DNA. MECANISMO DE AÇÃO Por possuir essa enzima, que atua "ao reverso", que o HIV e outros vírus semelhantes são chamados de retrovírus. Após a entrada do retrovírus na célula hospedeira, a transcriptase reversa utiliza os nucleotídeos presentes no citoplasma para montar uma fita de DNA senso negativo a partir de sua fita de RNA senso positivo, utilizando comoprimer um tRNA presente no nucleocapsídeo,
associado
ao genoma. Após
a
síntese
do
duplex
RNA/DNA,
uma ribonuclease (RNAse H) é incumbida de degradar a fita de RNA viral por hidrólise, a partir da extremidade 3', deixando a fita simples de (-) DNA solta nocitoplasma. A transcriptase reversa completa essa fita de DNA, tornando-a uma dupla hélice de deoxinucleotídeos. Esta dupla fita de DNA viral, denominada provírus, poderá ser integrada ao DNA da célula hospedeira com auxílio da enzima integrase. O processo de cópia do genoma do HIV, que envolve transcrição reversa, está sujeito a uma frequência de mutação equivalente a um erro a cada 104 bases adicionadas. Tento em vista que o HIV possui um genoma de aproximadamente 104 bases, isso representa um erro a cada transcrição reversa do genoma, ou seja, é um processo impreciso, que gera um grande número de mutações, benéficas ou maléficas aos vírus. O isolamento desta enzima permitiu a adaptação da tecnologia da PCR, que é destinada a amplificação a partir de moldes de DNA, para permitir a amplificação a partir de moldes de RNA, chamada RT-PCR (transcrição reversa - PCR)
RT-PCR (transcrição Reversa) O RT-PCR é uma reação da transcriptase reversa, seguida de reação em cadeia da polimerase . Não utiliza o DNA de cadeia dupla como molde e sim RNA de cadeia simples. A partir do RNA, a enzima transcriptase reversa sintetiza uma cadeia de DNA complementar (chamado agora de cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.
É necessária ligação ao RNA e a ligação da transcriptase reversa a uma "cadeia" de poli T , pois sempre ao final da cadei a de mRNA existe uma "cauda" de poli A. A técnica de RT-PCR é amplamente utilizada para verificar a expressão gênica, uma vez que analisa o RNA responsável pela síntese de proteínas. Se há uma proteína específica, é porque há DNA sendo expresso e originando mRNA para tal proteína. A expressão para produção de diferentes proteínas varia conforme a localização da célula dentro do organismo: células cardíacas expressam proteínas diferentes de células musculares, por exemplo.
SEQUENCIAMENTO DE DNA Antes de 1975, pensar em tentar seqüenciar cromossomos era praticamente inconcebível. Na melhor das hipóteses, era uma tarefa trabalhosa requerendo muitos anos de trabalho. No final de 1976, o cromossomo inteiro do fago X174, de 5.387 nucleotídeos tinha sido seqüenciado. Hoje é possível obter as seqüências de nucleotídeos de genes de cromossomos eucarióticos inteiros, e estes dados são armazenados em bancos de dados em computadores para referência posterior. Foi desenvolvido nesta época, quase que simultaneamente, duas técnicas que promoveram uma revolução na "arte" de seqüenciar DNA. O desenvolvimento de outras técnicas, como a descoberta de enzimas de restrição (uso na preparação de segmentos específicos de cromossomos); o aperfeiçoamento da eletroforese em gel até o ponto em que fragmentos de DNA que diferem em comprimento por um único nucleotídeo pudessem ser resolvidos, e o desenvolvimento de técnicas de clonagem de genes (preparação de grande s quantidades de um determinado gene ou seqüência de DNA de interesse) viabilizaram o seqüenciamento. Em 1975, F. Sanger e colaboradores desenvolveram um método enzimático com terminadores de cadeia específicos, para gerar quatro populações de f ragmentos queterminam em As,Gs, Cs e Ts, respectivamente. O método de Sanger utiliza de terminadores de cadeia chamados de 2'3'didesoxinucleotídeos trifosfatos. As DNA polimerases necessitam de um OH- 3' livre na fita de DNA iniciadora. Se um 2' 3' didesoxinucleotídeo é adicionado à extremidade de uma cadeia, ele irá bloquear a extensão sub seqüente desta cadeia, uma vez que os 2' 3' dideoxinucleotídeos possuem um grupo OH- 3' trocado por um H. O seqüenciamento é feito da seguinte maneira: Quatro reações são feitas em paralelo, cada uma delas contendo um dos quatro terminadores de cadeia 2', 3'-didesoxi: ddGTP,ddATP, ddCTP e ddTTP. As quatro reações contêm: uma fita molde (simples fita), a seqüência de nucleotídeos a ser determinada, uma fita iniciadora com uma hidroxila 3¶ livre (normalmente obtida por síntese química), os quatro precursores de DNA: dGTP, dATP, dTTP e dCTP, um deles pelo menos radioativo (32P -dCTP ), e o "fragmento Klenow"da DNA polimerase I de
E.
C oli .
O "fragmento Klenow"representa 2/3 DNA polimerásica I de E.C oli produzido por clivagem
com enzima proteolítica tripsina. O fragmento possui as atividades polimerásica 5'
3' e
exonucleásica 3' 5' da DNA polimerase I, mas não possui atividade exonucleásica 5' 3'. Esta atividade exonucleásica 5' 3' é critica para a técnica, pois se esta atividade estiver presente, ela irá reduzir a fita iniciadora a partir da extremidade 5'. O importante nesta técnica de seqüenciamento é usar a relação correta do didesoxirribonucleosídeo trifosfato normal (por exemplo, dGTP na reação 1) e de didesoxirribonucleosídeo trifosfato terminador (por exemplo ddGTP na reação 1),de modo a obter uma população de cadeias nascentes terminando em todas as posições de nucleotídeos possíveis (por exemplo,em todos os Cs de fita-molde na reação 1). A relação de 100 desoxirribonucleosídeos trifosfatos para 1 didesoxirribonucleosídeo trifosfato normalmente dá a frequência de terminação desejada em cada sítio potencial de terminação. Os produtos das quatro reações são então separados por eletroforese em gel de poliacrilamida e as posições dos produtos de reação radiativos (cadeias nascentes de DNA) são determinadas por autorradiografia. Uma vez que as cadeias menores migram distâncias maiores no gel, a seqüência de nucleotídeos definida pelas cadeias nascentes é dada pela leitura na direção 5¶ 3¶ , a partir da parte de baixo (anodo) até o topo (catodo) do gel. Atualmente não são utilizados nucleotídeos radioativos. Os didesoxinucleotídeos são marcados com substâncias fluorescentes que emitem em comprimentos de onda diferentes. Desta forma, os fragmentos que incorporam estes nucleotídeos podem ser identificados após excitação com laser e identificação de cada fluorescência. Isso possibilita que a reação seja feita em um único tubo. Além disso, são utilizadas enzimas termoestáveis em substituição à Klenow e à T7 DNA polimerase. A reação, que não é uma amplificação, apenas extensão, é realizada de forma cíclica. Isso faz com que possam ser obtidas seqüências a partir de uma quantidade menor de DNA e também auxilia no seqüenciamento de regiões que possuem estruturas que, em temperaturas mais baixas, impedem a ação das polimerases. A utilização de temperaturas mais altas (70oC) evita este problema. Atualmente são utilizados sequenciadores automáticos que permi tem a realização de seqüências em larga escala.
