Analisis Asam Nukleat - Hizba

ANALISIS ASAM NUKLEAT

HIZBA ILMI NAF’AN – 1506800312 –  1506800312 ABSTRAK

Pada asam nukleat deteksi utamanya adalah DNA dan RNA. Metode analisis ini terbagi dua yaitu, analisis kuantitatif dan analisis kualitatif. Pada analisis kuantitatif bertujuan untuk menentukan  jumlah atau kadar kada r suatu komponen dalam suatu senyawa, sedangkan sedan gkan pada analisis kualitatif bertujuan untuk mengidentifikasi keberadaan suatu senyawa kimia dalam suatu larutan atau sampel yang tidak diketahui. Analisis kuantitatif terdiri dari PCR, UV-Vis, SAGE, dan Microarray.  Analisis kualitatif terdiri dari da ri Eletroforesis, staining, sequencing, seque ncing, hibridisasi, spetrofotometri IR, blotting, mikroskop electron, x-ray diffraction dan LCR. Kata Kunci : Asam nukleat, DNA, RNA, Analisis Kuantitatif, Analisis kualitatif.

 Asam nukleat adalah makromolekul biokimia yang tersusun atas rantai nukleotida yang mengandung informasi genetik. Asam nukleat yang paling umum adalah Asam deoksiribonukleat (DNA) and Asam ribonukleat (RNA). Asam nukleat ditemukan pada semua sel hidup serta pada virus. Asam nukleat merupakan biopolimer, dan monomer penyusunnya adalah nukleotida. Setiap nukleotida terdiri dari tiga komponen, yaitu sebuah basa nitrogen heterosiklik (purin atau pirimidin), sebuah gula pentosa, dan sebuah gugus fosfat. Jenis asam nukleat dibedakan oleh jenis gula yang terdapat pada rantai asam nukleat tersebut (misalnya, DNA atau asam deoksiribonukleat mengandung 2-deoksiribosa). Selain itu, basa nitrogen yang ditemukan pada kedua jenis asam nukleat tersebut memiliki perbedaan: adenina, sitosina, dan guanina dapat ditemukan pada RNA maupun DNA, sedangkan timina dapat ditemukan hanya pada DNA dan urasil dapat ditemukan hanya pada RNA.  Analisis asam nukleat dapat da pat dilakukan dengan dua cara, c ara, yaitu analisis kuantitatif kuan titatif dan analisis kualiatif. I.

Analisis Kuantitatif

 Analisis kuantitatif merupakan merupaka n suatu proses analisis yang bertujuan untuk menentukan  jumlah atau seberapa banyak komponen suatu senyawa. senyawa . a. Spektrofotometri Spektrofotometri UV-Vis

DNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. Pita ganda pada DNA dapat menyerap cahaya UV pada λ 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada λ 280 nm. Sehingga Sehingga kita dapat mengetahui kemurnian DNA dengan menghitung nilai absorbansi λ 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi λ 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.82.0 . Serta untuk mengukur konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut : [DNA] = Å260 x 50 x faktor pengenceran [RNA] = Å260 x 40 x faktor pengenceran  Å260 = Nilai absorbansi pada λ 260 nm 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per mL 40 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 40 ug untai ganda RNA per mL b. Kuantitatif PCR / Real Time PCR

Real-time PCR merupakan teknologi terkini untuk amplifikasi DNA. Pada real-time PCR jumlah DNA yang diamplifikasi bisa langsung diamati secara seketika sehingga tidak memerlukan analisis dengan elektroforesis gel untuk mengetahui produk PCR. Real-time PCR lebih dikenal sebagai quantitative PCR karena kemampuan analisanya yang sensitif, spesifik dan reproducibility sehingga mengurangi kesalahan pada hasil. Proses amplifikasi menggunakan real-time PCR memiliki prinsip yang sama dengan proses amplifikasi PCR secara konvensional. Namun pada real-time PCR terdapat tambahan komponen PCR yaitu probe. Probe merupakan primer yang diberi label pewarna dye terdiri dari reporter dan peredam pewarna (quencher). Fluoresensi dari reporter hanya dilepaskan

ketika dua pewarna secara fisik terpisah melalui hibridisasi atau aktivitas nuclease. Standar posisi label dye, yaitu quencher berada pada 3' dan reporter pada 5' probe Instrumen real-time PCR mendeteksi amplikon dengan mengukur peningkatan pewarna (dye) fluorescent yang berpendar ketika terikat dengan double-stranded DNA. Karena sifat inilah maka pertumbuhan fragment DNA hasil amplifikasi dapat diikuti secara seketika, semakin banyak DNA yang terbentuk semakin tinggi pula intensitas fluorescent yang dihasilkan. Quantitative PCR dimungkinkan dapat mendeteksi secara akurat konsentrasi DNA hingga hitungan pikogram atau setara dengan sel tunggal karena sensitifitas dye yang sangat tinggi. Hasil peningkatan fluorescent digambarkan melalui kurva amplifikasi yang menunjukkan tiga fasa yaitu fasa awal, fasa eksponensial atau puncak dan fasa plateau atau stabil. Instrument real-time PCR memiliki tiga komponen utama yaitu thermal block cycler sebagai akurasi data, optical system sebagai deteksi data, dan software sebagai analisis data. Real-time PCR juga dapat menganalisis banyak sampel dalam waktu bersamaan menggunakan multiwell plates. II.

Analisis Kualitatif

 Analisis kualitatif merupakan suatu proses dalam mengidentifikasi keberadaan suatu senyawa kimia dalam suatu larutan atau sampel yang tidak diketahui. Analisis kualitaif digunakan untuk menentukan macam, jenis zat atau komponen-komponen bahan yang dianalisa. Dalam melakukan analisa kualitatif yang dipergunakan adalah sifat-sifat atau bahan, baik sifat fisis maupun sifat kimianya a. Lig ase Chain Reaction   (LCR) Ligase chain reaction atau reaksi berantai ligase merupakan suatu metode analisis

yang didasarkan pada kemampuan DNA ligase menghubungkan secara kovalen dua oligonukleotida berdekatan yang dihibridisasi ke cetakan (template) yang lebih panjang yang dapat mengikat kedua oligonukleotida. Misalnya, apabila empat oligonukleotida 20mer membentuk dua pasangan komplementer yang berdekatan diinkubasi bersama ligase stabi-suhu dan dikenai siklus suhu serupa dengan PCR, oligonukleotida tersebut akan menyatu untuk menghasilkan dua oligonukleotida 40-mer komplementer yang lebih panjang bergantuk pada ada tidaknya cetakan DNA yang lebih panjang dalam reaksi. Salah satu sifat LCR yang menguntungkan adalah kemampuannya membedakan cetakan yang berbeda hanya satu basa di tempat ligase. Dengan menempatkan enam oligonukleotida dalam reaksi (dua oligonukleotida yang komplementer dan umum pada salah satu sisi mutasi, ditambah dua yang cocok dengan sekuens normal dan dua yang cocok dengan sekuens muatan pada sisi yang berlawanan dengan sisi mutasi di ujung yang berdekatan dengan oligonukleotida yang akan diligasikan), maka dapat dilakukan analisis genotype terhadap mutasi basa tunggal dengan melihat ada tidaknya produk yang mencerminkan cetakan normal dan/atau muatan b. Hibridisasi

Hibridisasi asam nukleat merupakan salah satu metode yang sekarang digunakan secara luas dalam biologi molekular. Metode ini merupakan metode yang sangat peka untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA. Metode hibridisasi ini dapat diterapkan pada beberapa keperluan, mulai dari mencari informasi letak suatu fragmen DNA dalam genom, analisis transkripsi dan regulasinya, deteksi penyakit genetic dan sidik jari DNA. Proses hibridisasi ini berdasarkan pada pembentukan dupleks antara dua untai asam nukleat yang komplemen. Ada beberapa macam hibridisasi: 1. Hibridisasi Southern, lokalisasi sekuen tertentu dalam DNA genom biasanya dilakukan dengan teknik yang ditemukan oleh Southern (1975). Dalam hal ini DNA genom dipotong dengan enzim restriksi endonuclease, dan fragmen yang dihasilkan dipisahkan berdasarkan ukurannya dengan elektroforesis gel agarosa. DNA kemudian didenaturasi in situ dan dipindahkan dari gel ke membran nilon atau membrane nitroselulosa. Posisi DNA dalam gel sama dengan posisinya pada membrane. DNA yang menempel pada filter dihibridisasi dengan pelacak DNA berlabel radioaktif, dan

autoradiografi digunakan untuk menentukan letak pita yang komplemen dengan pelacak. 2. Hibridisasi Nothern, merupakan modifikasi dari metode Southern dengan target RNA yang telah dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa dengan menggunakan pelacak DNA berlabel 3. Hibridisasi dot, targer asam nukleat (DNA atau RNA) dititilkan pada membrane dan keberadaan target dilacak dengan pelacak DNA atau RNA berlabel 4. Hibridisasi in situ, merupakan hibridisasi antara pelacak DNA atau RNA dengan target DNA atau RNA pada preparat sitologis. Prinsip kerja sistem ini adalah terjadinya pasangan secara tepat antara dua untai DNA yang komplemen. Cara hibridisasi asam nukleat dapat dilakukan sebagai berikut: 1. Pengikatan DNA untai tunggal (target) pada membrane. 2. Penambahan DNA pelacak untai tunggal yang telah berlabel pada kondisi tertentu (suhu dan konsentrasi ion) supaya terjadi pasangan antara DNA targer dan pelacak. 3. Pencucian untuk menghilangkan kelebihan pelacak yang tidak menempel pada DNA target yang spesifik. Deteksi adanya hybrid antara DNA target dan pelacak c. Elektroforesis

Metoda standar yang digunakan untuk identifikasi, separasi dan purifikasi fragmen DNA adalah menggunakan elektroforesis gel agarosa. Migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa dipengaruhi oleh faktor ukuran dan konformasi molekul DNA, konsentrasi agarosa, arus listrik dan temperatur. Pewarna Ethidium Bromide (EtBr) digunakan untuk alat identifikasi dan mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang terseparasi dalam gel. EtBr ini akan terikat diantara dua untai ganda DNA, sehingga band/pita DNA dalam gel agarosa akan berpendar, karena pewarna ini mengandung zat fluoresence. EtBr dapat diberikan pada setiap sampel yang akan dimasukkan ke sumuran gel atau dicampurkan ke gel agarosa sebelum gel dicetak dalam cetakan gel. Intensitas fluoresence dapat diukur dengan menggunakan DNA marker standar, sehingga dapat diperkirakan kuantitas DNAnya, misal antara 0.50 sampai 20 ug/mL. Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan makromolekul berdasarkan laju perpindahannya melewati suatu gel dibawah pengaruh medan listrik. Campuran asam nukleat atau protein ditempatkan di dalam sumur di dekat satu ujung lempeng tipis gel polimerik. Gel ini ditahan oleh pelat kaca dan direndam dalam larutan aqueous (dengan pelarut air). Elektroe dilekatkan pada kedua ujung dan diberi tegangan. Setiap makromolekul kemudian bermigrasi ke arah electrode yang bermuatan berlawanan pada laju yang sebagian besar ditentukan oleh muatan dan ukuran molekulnya. Biasanya beberapa sampel yang berbeda, masing-masing merupakan campuran molekul, dimasukkan secara bersamaan ke dalam lajur majemuk pada gel lempeng. Untuk asam nukleat, laju migrasi-berapa jauh yang ditempuh molekul itu ketika diberi arus-berbanding terbalik dengan ukuran molekulnya. Asam nukleat membawa muatan negative (pada gugus fosfat) yang proporsional dengan panjangnya, tetapi belukar serat polimer di dalam gel lebih menghambat fragmen yang lebih panjang daripada yang lebih pendek. Kecepatan migrasi DNA ditentukan oleh beberapa faktor di antaranya: 1. Ukuran molekul DNA Migrasi molekul DNA berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul berukuran kecil. 2. Konsentrasi agarosa Migrasi molekul DNA pada gel berkonsentrasi lebih rendah lebih cepat daripada migrasi molekul DNA yang sama pada gel berkonsentrasi tinggi. Oleh karena itu, penentuan konsentrasi agarosa dalam membuat gel harus memperhatikan ukuran molekul DNA yang akan dianalisis. 3. Konformasi DNA Konformasi atau bentuk rangkaian molekul DNA berukuran sama akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda.

4. Voltase yang digunakan Dalam voltase, kecepatan migrasi DNA sebanding dengan tingginya voltase yang digunakan. Akan tetapi apabila penggunaan voltase dinaikkan, mobilitas molekul DNA meningkat secara tajam. Ini mengakibatkan pemisahan molekul DNA di dalam gel menurun dengan meningkatnya voltase yang digunakan. Penggunaan voltase yang ideal untuk mendapatkan separasi molekul DNA berukuran lebih besar 2 kb adalah tidak lebih dari 5 Volt per cm. 5. Keberadaan etidium bromida di dalam gel Hal ini mengakibatkan pengurangan tingkat kecepatan migrasi molekul DNA linear sebesar 15%. d. Spektrofotometri IR

Berkas-berkas absorbansi dari molekul-molekul asam nukleat digunakan sebagai penanda. Spektrum asam-asam nukleat (DNA dan RNA) dibentuk oleh unsur-unsur konstruktif: N-basa, karbohidrat (desoksiribosa/ribosa), gugus fosfat. Basa (Adenin, Guanin, Timin, Urasil, Sitosin) memiliki berkas karakteristik dalam kisaran 1800-1500 cm-1 dan berkas-berkas ini merupakan penanda sensitif untuk penggabungan basa dan penataan basa. Berkas-berkas pada 1500-1250 cm-1 ditranskripsi untuk kombinasi vibrasi antara basa dan karbohidrat yang relevan, dimana pada 1250-1000 cm-1 terkait dengan vibrasi karbohidrat-posfat. Berkas-berkas ini menjamin informasi untuk konformasi asam nukleat. Pada kisaran 1000-800 cm-1 diamati vibrasi karbohidrat/karbohidrat-fosfat. e. Blotting

Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi.RNA Blotting dan DNA Blotting umumnya disebut dengan istilah Northern Blotting dan Southern Blotting . 1. Northern Blotting Northern Blotting digunakan untuk menganalisis urutan RNA (RNA sequence)

tertentu diantara kumpulan molekul RNA. Pada dasarnya metode ini adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining. Dalam proses ini RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan, namun hasil yang paling dalam penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas bandband ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Langkah pertama dari metode ini adalah denaturasi atau pemisahan RNA di dalam sampel menjadi rantai tunggal. Hal ini memastikan bahwa rantai RNA tidak dalam posisi terlipat dan tidak terdapat ikatan diantara rantai molekul. Selanjutnya molekul RNA dipisahkan berdasarkan ukuran melalui metode gel elektroforesis. Setelah pemisahan, RNA ditransfer dari gel ke blot membran. Setelah itu membran dilalui proses probe, DNA atau RNA yang digunakan pada proses ini dipastikan harus memiliki urutan yang sesuai dengan urutan sampel. Dengan begitu, probe dapat terhibridisasi atau terikat pada pecahan RNA di membran. Setelah hibridisasi, probe mengizinkan molekul RNA yang diinginkan dapat terdeteksi diantara molekul RNA 2. Southern Blotting Southern Blotting adalah metode untuk menganalisis urutan DNA tertentu dalam

sampel DNA. DNA sampel sebelum atau setelah pencernaan enzim restriksi dipisahkan dengan elektroforesis gel dan kemudian ditransfer ke membran dengan blotting melalui aksi kapiler. Membran tersebut kemudian dikenakan probe DNA berlabel yang memiliki urutan basa pelengkap untuk urutan DNA sampel. Metode ini digunakan untuk memindahkan protein DNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan, dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel elektroforesis. Southern blot berkombinasi dengan elektroforesis gel agarosa untuk separasi ukuran DNA.

Southern blotting  digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA, evolusi dan

studi pengembangan, forensik dan diagnostik. Dalam tingkat genetik untuk memodifikasi pada organisme. blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan danuntuk mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang mengalami perubahan f.

Staining

Metode staining digunakan untuk visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel elektroforesis.Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan keperluan ini, beberapa diantaranya adalah etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, dan Eva Green. 1. Etidium Bromida

Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum digunakan untuk memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan penyangga elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini menempel pada rantai DNA dan bersifat fluoresens dia bawah cahaya UV. Namun etidium bromida bersifat karsinogen, karena itu penggunaannya harus ditangani dengan baik 2. SYBR Gold

Pewarna SYBR Gold dye digunakan untuk DNA rantai tunggal, rantai ganda, atau RNA. SYBR Gold merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai lebih sensitif daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens pewarna SYBR Gold di bawah sinar UV 1000 kali lebih tinggi daripada etidium bromida saat berikatan dengan asam nukleat. Pewarna ini dapat juga digunakan pada gel formaldehida 3. SYBR Green

Pewarna SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan berpotensial sebagai mutagen, karena itu pewarna ini harus ditangani dengan hati-hati. SYBR Green I lebih cocok untuk digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green II lebih cocok digunakan untuk DNA rantai tunggal or RNA 4. SYBR Safe

SYBR Safe merupakan pewarna yang dirancang agar menjadi pewarna yang lebih aman daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ni tidak bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem pembuangan limbah. Pewarna SYBR Safe dapat digunakan dengan blue-light transillluminator yang mengakibatkan lebih sedikit kerusakan terhadap DNA yang diamati dan lebih efisien untuk proses kloning selanjutnya 5. Eva Green

Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang digunakan pada PCR (Polymerase Chain Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel yang memiliki titik leleh yang rendah. Pewarna Eve Green bersifat sangat stabil di dalam suhu tinggi dan memiliki tingkat fluoresens yang tinggi saat berikatan dengan DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki tingkat toksisitas yang rendah g. Sequencing

Metode sequencing merupakan metode penentuan urutan nukleotida suatu fragmen DNA tertentu (gen) atau genom. Prinsip dasar dari metode DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction ). DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGTnya dijadikan sebagai cetakan (template ) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing . Beberapa metode dalam sequencing : 1. Sequencing dye terminator

Cara lain pelabelan primer adalah dengan melabel pemutus rantainya, lazim disebut metode sekuensing dye terminator. Keunggulan cara ini adalah bahwa seluruh proses sekuensing dapat dilakukan dalam satu reaksi, dibandingkan dengan empat reaksi terpisah yang diperlukan pada penggunaan primer berlabel. Pada cara tersebut, masing-masing dideoksinukleotida pemutus rantai ditandai dengan pewarna fluoresens, yang berpendar pada panjang gelombang yang berbeda-beda. Cara ini lebih mudah

dan lebih cepat dibandingkan penggunaan primer berwarna, namun dapat menimbulkan ketidaksamaan tinggi kurva atau puncak (peak) yang disebabkan oleh ketidaksamaan penggabungan pemutus rantai berwarna berukuran besar pada pertumbuhan DNA (ketidaksamaan tersebut bergantung pada DNA cetakan). Masalah tersebut telah dapat dikurangi secara nyata dengan penggunaan macam-macam enzim dan pewarna baru yang meminimalkan perbedaan dalam penggabungan.

Prinsip Sanger Method dengan dye dideoxy terminator (Sumber: appliedbiosystems.com)

Metode ini kini digunakan pada sebagian besar usaha reaksi sekuensing karena lebih sederhana dan lebih murah. Primer-primer yang digunakan tidak perlu dilabel secara terpisah (yang bisa jadi cukup mahal untuk primer yang dibuat untuk sekali pakai), walaupun hal tersebut tidak terlalu bermasalah dalam penggunaan universal primer. Hasil pembacaan

h. RT-PCR

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan reaksi berantai dengan memanfaatkan aktivitas enzim polymerase. Teknik ini digunakan untuk replikasi (memperbanyak) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme sehingga menghasilkan DNA dalam jumlah besar dengan waktu yang singkat. Jumlah sampel yang dibutuhkan hanya sedikit.

Gambar 1. Proses Polymerase Chain Reaction

Terdapat tiga tahap PCR, yakni 1. Denaturasi

Pada proses ini double stranded DNA akan berubah menjadi single starnded. Double stranded DNA diberikan suhu yang tinggi sekitar 90 – 95 oC yang menyebabkan putusnya ikatan hidrogen diantara basa nitrogen yang komplemen. Tahap ini berlangsung 1 hingga 2 menit 2. Annealing (penempelan primer)

Primer merupakan DNA berukuran pendek yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa. Pada annealing primer akan menempel pada untai DNA target yang telah dipisahkan sebelumnya pada proses denaturasi. Primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen dengan urutan primer. Diperlukan waktu 1-2 menit unutk proses ini dengan suhu sebesar 50 – 60oC. 3. Extension (pemanjangan)

Setelah primer menempel pada DNA target, enzim DNA polymerase akan memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antar primer, DNA cetakan, dan nukleotida. Dilakukan pada suhu 72oC selama 1 menit. Setelah proses polimerisasi, proses diulang kembali ke denaturasi, annealing, dan pemanjangan DNA membentuk DNA yang baru. Pengulangan ini akan menghasilkan DNA cetakan baru secara eksponensial. Setelah pengulangan 20 – 50 kali akan diperoleh jumlah fragmen DNA yang cukup banyak sehingga dapat dideteksi dengan elektroforesis. Selanjutnya pita-pita DNA dai hasil elektroforesis dibandingkan dengan marker DNA.

Gambar 2. Hasil PCR

Terdapat beberapa macam PCR, salah satunya ada yang dapat digunakan untuk analisa kuantitatif DN yang disebut Real-Time PCR RT PCR atau dikenal juga sebagai Q-PCR (Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction)   ialah teknik amplifikasi (memperbanyak) sekaligus kuantifikasi (menghitung)  jumlah target molekul DNA hasil perbanyakan tersebut. Kuantitas yang didapat berupa  jumlah DNA hasil perbanyakan dari proses PCR atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen pernormal yang ditambahkan.. Pada PCR konvensional, deteksi keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan DNA hasil amplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proses elektroforesis. Sedangkan pada Real Time PCR, pengamatan keberadaan DNA tersebut dapat dilakukan secara bersamaan pada saat reaksi berlangsung. Keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang muncul sebagai hasil fluoresensi dari probe (penanda). Pada RT PCR tidak ada tahap elektroforesis sehingga lebih aman karena tidak lagi digunakan gel agarose dan pemakaian senyawa karsinogenik seperti Etidium Bromida (EtBr). Prinsip kerja RT PCR ialah menghitung DNA yang telah diamplifikasi setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesaat sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Metode kuantifikasi yang umumnya digunakan ialah 1. Penggunaan zat perwarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda (dsDNA). Contohnya SyBr Green 2. Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen. Contohnya probe FRET (hibridisasi) dan probe TaqMan. Pada pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional saat siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan

Kesimpulan

 Analisis pada DNA dan RNA dapat dilakukan secara kuantitatif dan kualitatif, disesuaikan dengan kebutuhan. Analisis kuantitatif dilakukan untuk menentukan jumlah atau kadar komponen dalam suatu zat, sedangkan analisis kualitatif dilakukan untuk menentukan keberadaan komponen dalam suatu zat.  Analisis kuantitatif ada metode PCR-RT (Real-time PCR) merupakan teknologi terkini untuk amplifikasi DNA dan metode spektrofotometri dengan menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin.  Analisis Kualitatif ada metode LCR yang didasarkan pada kemampuan DNA ligase menghubungkan secara kovalen dua oligonukleotida berdekatan yang dihibridisasi ke cetakan (template) yang lebih panjang yang dapat mengikat kedua oligonukleotida, metode hibridisasi yang sangat peka untuk menganalisis maupun menentukan karakter suatu fragmen DNA, metode elektroforesis dengan memanfaatkan migrasi elektroforesis DNA melalui gel agarosa, metode spektrofotometri IR dengan memanfaatkan absorbansi, metode blotting dengan memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi, metode staining dengan visualisasi DNA setelah diseparasi oleh gel elektroforesis, metode sequencing dengan penentuan urutan nukleotida suatu fragmen DNA tertentu (gen) atau genom, dan metode RT-PCR dengan memanfaatkan aktivitas enzim polymerase.

Daftar Pustaka

 Anonim 2007, [online] Ligase Chain Reaction,

available

at:

 Anonim, Detection and Indentification . [online] available at: http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciencesus/applications/AlternativeProductStructure_11756/  Anonim. Northern Blotting. [online] available at: Campbell, N. (2002). Biologi . Penerjemah Rahayu L. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology