5. ünite BİYOREAKTÖRLER Endüs Endüstriy triyel el ölçekl ölçeklii üretim üretimler lerde de biyore biyoreakt aktör ör seçim seçimi,i, kullan kullanıla ılaca cakk mikroo mikroorga rganiz nizman manın ın özell özellikle ikleri, ri, üretim üretim kapasi kapasites tesi,i, kullan kullanılac ılacak ak hammad hammadde de ve ürünün ürünün özellik özellikler lerine ine göre göre değişiklik gösterir. Kesiklii sistem sistemle le çalışa çalışan n biyore biyoreakt aktörle örlerin rin ilk örneğ örneğii tepsili Tepsili Tepsili Biyoreaktö Biyoreaktörler: rler: Kesikl biyoreaktörlerdir (Şekil 5.1.) Bu yöntemde mikroorganizma besin ortamının yüzeyinde
Şekil 5.1. Tepsili biyoreaktör. gelişir. Sitrik asit ve penisilinin aerobik koşullarda üretilmesinde kullanılmıştır. Bu sistemde tepsiler kültür ortamı ve mikroorganizmayla doldurulduktan sonra hava akımının sisteme verilmesiy verilmesiyle le biyoreaks biyoreaksiyon iyon başlatılmış başlatılmış olur. Reaksiyo Reaksiyon n tamamlanın tamamlanınca ca ürün tepsilerde tepsilerden n alınır. Büyük miktarda ticari ürünlerin üretilmesi için uygun bir yöntem değildir. Bundan dolayı kullanıma başlandıktan kısa bir süre sonra daha yüksek hacimlerde üretime olanak veren tank tipi biyoreaktörlere yerini bırakmıştır (Şekil 5.2.)
Şekil 5.2.Tank tipi karıştırmalı biyoreaktör (Brock- Biology of microorganisms 11.ed. 2006)
Karıştırmalı Tank Tipi Biyoreaktörler: Bu reaktörler paslanmaz çelikten yapılmış tanklardır. Sıvı çözelti içinde mikroorganizmaları geliştirmek, ihtiyaç duydukları besin elementi, sıcaklık ve oksijen gibi gereksinimleri sağlamak için çözeltinin etkin bir şekilde karıştırılması gereklidir. Reaktörlerin sterilizasyonu su buharı ile yapılır. Soğutma işlemi su ceketi veya soğutucu spiraller ile yapılır (Şekil 5.3). Derin kültür yöntemi ile çalışılırken üretimde kullanılacak hammadde veya diğer tanımla besiyeri ya steril halde fermentere alınır veya fermentere alındıktan sonra çift yüzeyli silindirik gövdenin yüzeyleri arasından kızgın buhar geçirilerek sistem tümden sterilize edilir. Sonra çift yüzey arasına buhar yerine soğuk su sevk edilerek ve karıştırıcı çalıştırılarak etkin ve hızlı bir soğutma sağlanır. Aşılama sıcaklığına ulaşıldığında, önceden hazırlanmış aşılama kültürü ile aşılanıp üretime geçilir. Üretim boyunca ortamın sıcaklığı, pH’sı, çözünmüş oksijen konsantrasyonu gibi kritik bilgiler termometre ve elektronik proplarla izlenir. Köpürme köpük kırıcılar (polietilen glikol, silikon yağları, bitkisel ve hayvansal yağlar) ilave edilerek veya mekanik olarak (merkezkaç kuvveti) engellenir. Ekmek mayası, enzim, alkol, organik asitler vb. üretimi bu yöntemle gerçekleştirilir. Karıştırmalı tank tipi biyoreaktörler çok yaygındır. Çünkü oldukça
esnek işletme
koşullarına sahiptir. İşletme amacına göre modifiye edilebilir. Gelişen mikrobiyal hücrelere
gaz transferi en etkin bu tip reaktörlerde gerçekleştirilir. Bu tip reaktörlerde en büyük sorun kontaminasyon tehlikesidir. Köpük oluşumu diğer bir sorundur. Fazla köpük filtre ile dışarı alınabilir veya köpük kırıcı ilave edilebilir. Fakat bu da kontaminasyona yol açan en büyük nedenlerden birisidir. İlave edilen köpük kırıcılar hücresel bazda bazı enzimleri inhibe edebilir. Ayrıca oksijen transferini azaltıcı etki gösterir. Ürün verimini azaltır. Ayrıca köpük kırıcı ilavesi saflaştırma basamaklarını artırmaktadır. Sonuç olarak karıştırmalı tank reaktörlerde köpük kırıcı ilavesini engellemek için fermantörün üst kısmında boşluk bırakılır. Bu boşluk reaktör hacminin % 25’inin boş bırakılması ile sağlanır.
Şekil 5.3. Karıştırmalı tank tipi biyoreaktör içinde bulunan soğutucu spiraller.
Tank Tipi Karıştırmalı Biyoreaktörün Bölümleri Paslanmaz çelik yapı Paslanmaz çelik gövde, biyoreaktöre düz sert ve korozyona dirençli aynı zamanda buharla veya kimyasal malzemeyle kolay temizlenebilir bir iç yüzey sağlamaktadır.
Kanatçık Bunlar tankın ortasında bir şafta bağlanmakta, şaftın bir elektrik motoru ile dönmesiyle birlikte kanatçıklar hareket ederek biyoreaktör de bulunan içeriğin daha iyi karışmasını sağlamaktadır. Biyoreaktörde mikroorganizmalar çoğaldıkça substrat vizkositesi artmaya ve hücreler kanatçıklara ve tankın iç çeperlerine yapışmaya başlamaktadır. Bundan dolayı iç yüzeyin bu yapışmayı önleyecek materyalden yapılması gerekmektedir.
Biyoprosesin özelliğine göre geliştirilmiş hem kanat sayısı hem de kanat konfigürasyonu farklı olan bir çok pervane sistemi geliştirilmiştir (Şekil 5.4).
Şekil 5.4. Karıştırmalı tank tipi biyoreaktörlerde kullanılan pervene örnekleri
Dağıtıcı Aerobik mikroorganizma kültürlerinde, oksijen en önemli sınırlayıcı faktörlerden bir tanesidir. Biyoreaktör boyutu arttıkça, saf oksijen veya daha çok filtre edilmiş havanın sisteme pompalanması gerekmektedir. Substratta daha fazla oksijenin çözülmesi için hava, küçük deliklere sahip disk şeklinde dağıtıcılara pompalanmaktadır. Bu işlem küçük hava kabarcıklarının sisteme verilmesi böylece yüzey/hacim oranının artmasına neden olmaktadır.
Saptırıcılar Saptırıcılar fermantörün iç kısımlarına aşağıda görüldüğü gibi yerleştirilirler. Saptırıcılar tank içinde türbülans oluştururlar. Bu oksijenin sıvı içinde daha iyi çözünmesine olanak sağlar.
Saptırıcı plakalar
Şekil 5.5. Tank tipi karıştırmalı biyoreaktörlerde türbülans oluşturan saptırıcı plakalar.
Elektronik problar Bu problar sıcaklık, pH, çözünmüş oksijen konsantrasyonu, köpük oluşumu gibi parametrelerin fermantasyon süresince izlenmesine olanak sağlar. Tank içinde bu parametrelerin ölçülebilmesi için prob girişleri olmalıdır.
Köpük önleyici ajanlar Aerobik fermantörlerde potansiyel problemlerden biriside oksijenin küçük kabarcıklar şeklinde verilmesi ve karıştırma sonucu oluşan köpüktür. Bu problem fermantörün üst kısmının köpükle dolmasına neden olur. Bazı ticari fermantörlerde bu olayı görebilme ve izleyebilmek için küçük pencereler konmuştur. Daha da önemlisi köpük sistemden hava ile beraber çıkarak fermantör hacminin azalmasına ve kontaminasyona yol açabilir. Köpük önleyici ajanlar kimyasal maddeler olup köpük düzeyini kontrol ederler (kabarcıkların patlamasına neden olurlar)
Su ceketi Su ceketi fermantörün etrafını çevirir içinden geçen soğuk su sayesinde fermantör soğutulmuş olur. Su ceketi gereklidir, çünkü fermantasyon sonucu ısı üretilir ve sıcaklık yükselir. Su ceketi olmazsa aşırı ısınmadan dolayı hücreler ölebilir.
Hava filtresi Biyoreaktöre hava verilmesi gerektiği zaman hava kaynaklı mikroorganizmaların kültürü kontamine etmesini engellemek için hava girişine mutlaka filtre takılmalıdır. Aksi taktirde sisteme giren yabancı mikroorganizmalar istenmeyen ürünlerin oluşmasına neden olabilir
Basınç ayar vanaları Mikrorganizmalar fermentör içinde gaz üretiyorsa bu sistemde iç basıncın artmasına neden olur. Bundan dolayı sistemin iç basıncı takip edilmeli ve gerektiğinde uygun düzeye ayarlanmalıdır.
Güvenlik valfleri Eğer basınç patlamaya neden olacak kadar çok yüksek bir seviyeye ulaşacak olursa güvenlik valfleri devreye girer ve açılarak tanktan gazın çıkmasına olanak vererek basıncın düşmesini sağlar.
İnokulasyon ve örnekleme delikleri Başlangıçta fermantöre steril besinin ve starter kültürün ilave edilmesi aseptik koşullarda yapılmalıdır. Benzer şekilde, fermentasyon sırasında örnek alınması (kontaminasyon
kontrolü/üremenin kontrolü/ürün kontrolü) kontaminasyona neden olmayacak şekilde yapılmalıdır. İnokulasyon ve örnekleme işlemi genellikle buhar vanalarının yardımıyla sterilize edilen paslanmaz çelikten yapılmış borularla yapılır.
Ürün tahliyesi Fermantörde, ürünün toplanması ve sistemden alınması için sistemden tahliyesine olanak verecek şekilde tasarlanmış borular bulunur.
Şekil 5.6. Karıştırmalı tank tipi biyoreaktörün bölümleri.
Hava Kaldırmalı Biyoreaktörler: Bunlar yüksekliği fazla çapı dar silindirik tanklardır. Uygun mikroorganizma aşılanan ortama kule dibinden sürekli taze hammadde verilir. Gerekirse hava da verilir. Sıvı ve hava hareketi ile hücreler sıvı içinde yüzer duruma kalır. Reaktörün üzerinden ürün ve substrat alınırken, alt kısmına da taze hammadde verilir. Günümüzde birçok çeşidi kullanılmaktadır. Hava kaldırmalı biyoreaktörlerde hava dağıtıcılar tarafından reaktörün alt tabanından verilir. Havanın reaktör içinde dolaşma şekline göre, internal çevrime sahip olan ve eksternal çevrime sahip olanlar olmak üzere iki tiptir. İnternal çevrime sahip olan hava kaldırmalı reaktörlerde, hava reaktör içindeki
tüplerden dolaşırken reaktöre hava verilir. Karıştırma hava ile yapılır. (Şekil 5.7). Eksternal çevrimli olanlarda ise hava bir dış çeper içinde dolaşır Şekil 5.8.)
Şekil 5.7. İnternal çevrime sahip hava kaldırmalı biyoreaktör Hava kaldırmalı biyoreaktörde alttan verilen ve tüplerden geçen hava yukarı doğru çıkarken oluşan ürün aşağı doğru iner ve tankın tabanından alınır. Hava kaldırmalı reaktörler günümüzde büyük ölçekli reaktörlerde kullanılmaktadır. Karıştırmanın hava ile yapıldığı bu reaktörlerde mekanik bir karıştırma olmadığı için enerji tasarrufu gerçekleşmekte ayrıca anaerobik mikroorganizmalar içinde bu reaktörler kullanılmakta ve reaktörün içine giren ilave bir karıştırma mekanizması olmadığı için kontaminasyon riski azalmaktadır. Ayrıca mekanik karıştırmalı reaktörlere göre hava ile karıştırılan reaktörlerde kesici kuvvet oluşumu daha azdır. Özellikle genetiği değiştirilmiş mikroorganizmalar kesici kuvvetlere maruz kaldıkları zaman lizize daha uyarlı olmaktadırlar. Çünkü organizmanın yabancı proteini sentezlemek için ekstra enerji üretmesi hücre çeperinde bir zayıflama meydana getirmektedir. Kesici kuvvetlerle karşılaşan mikroorganizmalarda bir hücresel tepki olarak protein sentezinde bir yavaşlama meydana geldiği bilinmektedir.
Şekil 5.8. Eksternal çevrime sahip hava kaldırmalı biyoreaktörler
Şekil 5.9. Hava kaldırmalı biyoreaktör. Reaktör kurulurken dikey pozisyona getirilecektir.
Dolgulu Yatak Tipi Reaktörler: Dolgulu yatak tipi reaktörleri atık su arıtımında, sirke ve enzim eldesinde kullanılır. Sisteme yüzey artırıcı dolgu materyali konmuştur. Mikroorganizmalar bu alanlara tutunur. Fermantasyon sıvısı bu alandan geçerken, mikroorganizma tarafından kullanılır ve ürün oluşur (Şekil 5.9)
Şekil 5.9. Dolgulu yatak tipi biyoreaktörler
Tapa Akışlı Reaktörler: Tapa akışlı reaktörlerde uygun mikroorganizma ile aşılanan çözelti boru içinde sürekli olarak ilerler. Reaktörün her kesiti ayrı bir reaktör gibi çalışır. Bir yandan ürün alınırken bir yandan da sisteme sürekli taze besin ortamı ve kültür verilir.
Kabarcıklı Kolon Reaktörleri: Mekanik karıştırıcılar yoktur. Alttan gaz girişi ile kabarcıklar oluşur. Bu şekilde karıştırma yapılır. Hava kabarcıklı reaktörlerde kabarcıklar alttan yukarıya doğru çıktıkça büyür. Bu istenmeyen bir durumdur. Alttan sıkıştırılmış hava verildiği için üstte köpük oluşur. Sonuç olarak bu tür fermantörlerin kullanımı sınırlıdır.
Fermentasyon Verimine Etki Eden Faktörler Kültürlerin
Havalandırılması
ve
Karıştırılması: Aerob
mikroorganizmalar
ile
gerçekleştirilen tüm üretimlerde havalandırma üretimi belirleyici en önemli etkendir. Oksijen gazının 25°C’de çözünürlüğü litrede 0,00849 gramdır. Bu yüzden oksijenin kültür ortamına devamlı verilmesi gerekir. Kabarcıklar büyük olursa oksijen transferi azalmaktadır. Bu nedenle fermantasyon etkinliğinin artırılmasında en önemli nokta kültürün çözünmüş oksijen seviyesinin ayarlanmasıdır. Yüzey kültür yönteminde havalandırma doğal olarak gerçekleşir ve çoğu kez yeterli düzeydedir. Ancak derin kültür yöntemlerinde bunun yapay olarak gerçekleştirilmesi gerekmektedir. Örneğin asetik asit bakterilerinin etil alkolü Asetik Asite, küflerin şekerleri sitrik asite okside edebilmesi,
mayaların biyolojik artışı sağlayabilmesi ve bazı bakterilerin enzim üretebilmesi yeterli havalandırma ile mümkündür. Mikroorganizmaların oksijene duyarlılığı farklıdır. Örneğin S. cerevisiae
hücresel artış için üretilmek istenir ve oksijen yeterli değilse hemen alkol
fermantasyonuna yönelir ve verim düşer. Buna karşın Acetobacter ’lerde oksijenin yeterli olmaması yalnızca verimin düşmesiyle kalmaz, mikroorganizmanın ölümüne de yol açar. Bu nedenle üretim sırasında bir an için havanın azalması tüm işlemi olumsuz etkiler. Ortamdaki çözünmüş oksijen düzeyi ayarlanırken şu etkenler dikkate alınmak zorundadır. •
Genç hücreler yaşlı hücrelere göre daha fazla oksijen tüketirler.
•
Rekombinant genler için konakçı olarak kullanılan mikroorganizma hücreleri, diğerlerine göre(yabani tipler) daha fazla oksijene ihtiyaç duyarlar.
•
Çoğu uygulamada oksijen ihtiyacı logaritmik üreme döneminde en yüksek düzeydedir.
•
Oksijen ihtiyacında hücrenin şekli belirleyici etkiye sahiptir. Yüksek hücre yoğunluğunda oksijen tüketimi artar.
•
Misel varlığında oksijen alımı düşer
Biyoreaktörlerde önemli işlemlerden biride karıştırmadır. Fermantörün uygun bir şekilde karıştırılması ile besin maddeleri homojen bir şekilde dağılmakta, mikroorganizmalar tarafından oluşturulan toksik maddeler homojen bir şekilde dağılmaktadır. Karıştırma homojen yapılmazsa toksik maddeler belirli bölgelerde birikerek verimi azaltabilir. Ayrıca karıştırma ısının homojen bir şekilde dağılmasını sağlar. İlave edilen besin maddeleri, köpük kırıcılar, asit ve bazların homojen karışımı için iyi bir karıştırma şarttır. Küçük ölçekli biyoreaktörlerde karıştırmada sorun yaşanmaz. Ancak büyük ölçekli reaktörlerde bir takım sorunlar karşımıza çıkabilir. Fermantasyon sıvısının karıştırma ile çalkalanması gaz kabarcıklarından oksijenin sıvı ortama transfer oranını etkilemekte, aynı şekilde ortamdaki besin maddelerinin hücrelere transferini de artırmaktadır. Fakat aşırı karıştırma da hücreler üzerinde hidromekanik strese yol açarak büyük mikrobiyal hücrelerde ve memeli hücrelerinde ölüme neden olabilir.
pH: Mikroorganizmaların çoğu
optimum 5,5- 8,0 pH değerleri arasında hücresel
metabolitlerini sentezler. pH’nın tüm fermentasyon boyuca takip edilemsi ve pH değişikliklerine karşı asit veya baz ilavesi ile önlem alınması son derece önemlidir.
Sıcaklık: Mikroorganizmalar eğer optimum büyüme sıcaklığının altında tutulursa büyüme de yavaşlama olur. Verimlilik azalır. Veya sıcaklık optimum değerlerinin üzerine çıkarsa hedef proteinin repressiyonunun indüksiyonu vaktinden önce meydana gelir. Veya ısı şoku proteinleri üretilebilir.
