Microbiología Predictiva y su relación a la Evaluación Evaluac ión de Riesgo
Contenido Concepto y principios de la microbiología predictiva Concepto de modelo microbiológico predictivo Clasificación de modelos predictivos Empíricos vs mecanísticos Determinísticos vs estocásticos Cinéticos vs probabilísticos Primarios, secundarios y terciarios Modelos de crecimiento microbiano Modelos primarios Modelos secundarios Modelos de inactivación microbiana Modelos primarios Modelos secundarios Modelos terciarios Selección de un modelo Aplicaciones de la microbiología predictiva Evaluación de riesgo y microbiología predictiva
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Contenido Concepto y principios de la microbiología predictiva Concepto de modelo microbiológico predictivo Clasificación de modelos predictivos Empíricos vs mecanísticos Determinísticos vs estocásticos Cinéticos vs probabilísticos Primarios, secundarios y terciarios Modelos de crecimiento microbiano Modelos primarios Modelos secundarios Modelos de inactivación microbiana Modelos primarios Modelos secundarios Modelos terciarios Selección de un modelo Aplicaciones de la microbiología predictiva Evaluación de riesgo y microbiología predictiva
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Microbiología Predictiva Sub-disciplina de la Microbiología de Alimentos cuyo objetivo es predecir el comportamiento microbiano en alimentos específicos bajo condiciones definidas. Su evolución se remonta a solo 35 años, y ha sido aceptada por la industria y autoridades reguladoras como un enfoque preferible para predecir inocuidad inocuidad y tiempo de vida de los alimentos. Se basa en la premisa que las respuestas de las poblaciones microbianas a las condiciones ambientales pueden reproducirse. Convierte DATOS en CONOCIMIENTO
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Principios de la Microbiología Predictiva Los organismos incrementan (crecimiento) en número por división Bacterias atenuandas son “muertas” Todos los organismos de una población tienen las mismas características Los organismos se multiplican (y mueren) independientemente El crecimiento ocurre en condiciones adecuadas (ºT, pH, aW) y despues de un tiempo lag El crecimiento reduce debido a la disminución de nutrientes, producción de toxinas Modelos de crecimiento basados en asunciones de distribución probabilística 4
Triángulo de Seguridad Alimentaria Evaluación de riesgo (10 años)
HACCP (25-30 años) Planes HACCP usados para posibilitar esas estrategias
Estrategias para la gestión del riesgo
Microbiología predictiva (30-35 años) Sostienen la necesidad de seguridad alimentaria
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Modelo microbiológico predictivo Expresión matemática que describe el crecimiento, supervivencia, inactivación o proceso bioquímico de un microorganismo presente en un alimento.
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Fases del crecimiento microbiano Fase estacionaria
Fase de crecimiento
Fase Lag
Fase de muerte 7
Clasificación de modelos predictivos Perspectiva Causal
Empirical
Mechanistic
Efectos de variación y oportunidad
Deterministic
Stochastic
Microbiología clásica o cuántica
Kinetics
Probabilistic
Dependencias entre las variables
Primary
Secondary
Tertiary 8
Modelos cinéticos vs probabilísticos
Modelos cinéticos vs probabilísticos Modelos cinéticos El tiempo que lleva cierto crecimiento microbiano, en función de la T°, pH, Aw, Eh, composición gaseosa, HR, etc. Condiciones ambientales favorables que permiten que la poblacion microbiana crezca, y puede ser predicha con poca variabilidad
2
m 5 c / u 4 f c 0 1
g o l
3 2 1 0 0
10
20
30
40
days A
Modelos de probabilidad A medida que las condiciones ambientales se hacen más desfavorables, las poblaciones microbianas despliegan mayor variabilidad e impredecibilidad (puede q crezca, puede q no) Limites de crecimiento por tanto son difusos e inciertos
7 6
0.993
0.973 w a
0.953
0.933
0.913 5.5
5.7
5.9
6.1
6.3
6.5
10
Modelos empíricos vs mecanísticos
Modelos empíricos vs mecanísticos Modelos empíricos Describe las observaciones con una función matemática pero sin un fundamento teórico Funciones polinómicas (80‟s-), redes neurales artificiales (2000-), PCA Modelos mecanísticos Intentan relacionar las respuestas observadas a principios fisicoquimicos y/o biológicos. Son preferibles a los modelos empíricos porque pueden ser extrapolados 12
Ejemplo de modelo empírico N t Exp A DExp Exp B(t M ) Modelo Gompertz modificado
7
t i s n 6 e d n a e m s m5 s i n a g r o ( 0 1 g 4 o L
Describe la curva de crecimiento pero los parámetros no tienen interpretación biológica
B =0.5 M =5 B =1 M =5 B =0.5 M =10 B =1 M =10
3 0
5
10
15
20
Time
A,D are fixed at 6.9, 9
13
Ejemplo de modelo mecanístico max op t CM 2 (T )CM 1 ( pH ) SR1 (aw)SR( Lac) (T , pH , aw, Lac) pH pH min 0, pH pH min pH pH max CM ( pH ) , pH pH pH pH pH pH pH pH pH min pH pH max op t op t op t min max min
Modelo de parámetros cardinales Velocidad de crecimiento=f(variables ambientales) Parámetros con interpretación biológica: μopt, pHmin, pHmax, pHopt…. 14
Modelos determinísticos vs estocásticos Modelos determinísticos Predice a nivel poblacional (en forma promediada). La tamaño de la población microbiana se describe mediante un conjunto único (determinístico) de parámetros Ej: μmax=0.25 log cfu/hr Modelos estocásticos Considera la variabilidad biológica, y/o variabilidad entre celulas individuales. Por tanto, los parámetros del modelo son representados por distribuciones estadísticas. Ej: μmax ~ Normal (0.25,0.08) log cfu/hr
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Ejemplo de modelo determinístico N t Exp A DExp Exp B(t M )
Modelo Gompertz modificado es tambien un modelo determinístico!
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t i s n 6 e d n a e m s m5 s i n a g r o ( 0 1 g 4 o L
B =0.5 M =5 B =1 M =5 B =0.5 M =10 B =1 M =10
3 0
5
10
15
20
Time
A,D are fixed at 6.9, 9
Para cada „t‟ solo existe un „N‟ lo cual representa un crecimiento promedio de la 16 poblacion
Ejemplo de modelo estocástico
Modelo de crecimiento de Yule
nt NegBin n0 , e t n0 Se asume que las bacterias crecen independientemente por division con un proceso de Poisson Para cada „t‟ existe un rango de valores de „Nt‟ lo cual representa la variabilidad entre celulas
60000 50000 ) g 40000 / s l l e 30000 c ( t N20000
10000 0 0
5
10
15
Time (hr)
17
Ejemplo de modelo estocástico
Modelo de crecimiento de Yule
nt NegBin n0 , e t n0 Se asume que las bacterias crecen independientemente por division con un proceso de Poisson Para cada „t‟ existe un rango de valores de „Nt‟ lo cual representa la variabilidad entre celulas
50000 40000
) g / s 30000 l l e c ( t 20000 N
10000 0 0
5
10
15
Time (hr)
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Ejemplo de modelo estocástico
Modelo de crecimiento de Yule
nt NegBin n0 , e t n0 Se asume que las bacterias crecen independientemente por division con un proceso de Poisson Para cada „t‟ existe un rango de valores de „Nt‟ lo cual representa la variabilidad entre celulas
60000 50000 ) g 40000 / s l l e 30000 c ( t N20000
10000 0 0
5
10
15
Time (hr)
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Modelos primarios, secundarios y terciarios
Modelos primarios Describen crecimiento, inactivación o supervivencia microbiana usando densidad celular (log cells/g) versus tiempo bajo condiciones ambientales constantes Definido (por lo menos) por dos parametros: Fase lag (λ ) y velocidad max de crecimiento (k, μmax) Temp constante
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Modelos secundarios Describen uno o más parametros del modelo primario (fase lag (λ ) y velocidad max de crecimiento ( μmax)) en función de las condiciones ambientales (i.e., Temperatura, pH, Aw, Eh, etc.)
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Modelos terciarios Combina un modelo primario N=f(t) y un secundario λ ,μmax=f(T, pH, Aw…) para predecir la población microbiana bajo condiciones dinámicas.
Pseudomonas in poultry 23
Modelos de crecimiento microbiano Modelos primarios Modelos secundarios
Modelos primarios (Condiciones ambientales constantes) Exponencial Logistico Gompertz, Modificado-Gompertz Baranyi y Roberts
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Modelo exponencial y logístico Crecimiento exponencial, cinética de primer orden (log-lineal) Velocidad de crecimiento µ α N N = Número o densidad de microorganismos k = Tasa de crecimiento Tiempo - lag determinados a partir de datos Sin limitaciones medioambientales
N kN t
N N 0 e
kt
N
t
En realidad, el crecimiento se deteriora: Dismninución de nutrientes, producción de toxinas production
Inhibicion en la fase estationaria
N N kN 1 t N
6.0 5.5 w d 5.0 g / u 4.5 f c g o 4.0 l
N t
3.5 3.0 5
105
205
305
405
505
605
hours
Listeria durante la maduración de queso de
N 0 N N 0 N N 0 exp kt 26
Modelos de Gompertz y Gompertz modificado Modelo de Gompertz (curva sigmoidal)
N t N exp exp B(t M ) La densidad bacterial usualmentemodela en log Nuevos modelos fueron creados usando modelos funcionales similares a la forma del modelo Gompertz :
N t Exp A DExp Exp B(t M )
Nt = densidad al tiempo t D = log(N¥) – log(N-¥) M = tiempo al cual la tasa de crecimiento absoluto es máximo B se relaciona con pendiente st: BD/e = pendiente de la tangente en el tiempo M A es un parámetro de localización, sin equivalente en la realidad , = log(N-¥), not log(N0)
Gompertz modificado es la más exitosa función sigmoidal A diferencia de Gompertz, sin embargo, no tiene base teórica, convirtiéndose en ejercicio de ajuste sin ningún aprendizaje (modelo empírico) 27
Modelo de Baranyi & Roberts Modelo mecanístico que considera la historia de crecimiento celular a través de un parámetro. Las ecuaciones diferenciales permiten el modelado en ambientes dinámicos resultantes de perfiles de temp no isotérmicos Puede usarse para crecimiento e inactivación Definido por 4 parámetros: N 0, q0, Nmax and μm Función de ajuste A(t) predice la duración de la fase lag La popularidad de este modelo ha sido facilitada por la disponibilidad de 2 softwares: DMFit y MicroFit.
exp m m At 1 LnN t LnN 0 m At ln 1 m exp mln N max ln N 0 1
At t
exp vt q0 v 1 q0
1
ln
29
Modelo de Baranyi & Roberts
Crecimiento de Listeria monocytogenes a 5ºC 30
Modelos secundarios (Parámetros en función de las condiciones ambientales) Tipo Bĕlehrádek o raíz cuadrada Concepto Gamma Parámetros Cardinales
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Modelos de tipo Belehradek ( k = a(T-T 0 )d ) En su forma simple, son modelos que describen la velocidad de crecimiento en función de la temperatura
k b(T T min ) Extendida para cubrir el rango completo biocinético de temperatura (Ratkowsky et al., 1983): k b(T T min )1 exp cT T max Los parámetros se usan para clasificar microorganismos como psicrófilos, mesófilos o termófilos. Belehradek es el mejor modelo de temperatura pero existen otros: Modelo de Arrhenius a partir de las reacciones químicas; polinomial (puramente empírico) 32
Modelos de tipo Belehradek ( k = a(T-T 0 )d ) k b(T T min ) 1.0
Raw bratwurst
0.9
Broth pH=5.9, Aw=0.97
) h / 0.8 U F C 0.7 g o l ( 0.6 0.5
R2 =0.77 0.4 0.3 10
15
20
25
30
35
40
45
50
Temperature (°C)
Velocidad de crecimiento de Salmonella spp. en salchichas crudas de cerdo 33
Concepto Gamma Los factores que afectan la velocidad de crecimiento microbiano actúan independientemente El efecto de los factores ambientales es multiplicativo f Temperatur e f Aw f pH f ácidosorgani cos f otros ....
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Concepto Gamma Staphylococcus xylosus y Halobacterium spp., respectivamente en pescado seco salado
k bT T min Aw Aw min
k bT T min pH pH min
Yersinia enterocolitica
k bT T min Aw Aw min
Pediococci spp. en productos de carne fermentada
pH pH min
k b Aw Aw min pH pH min pH pH max T T min
2
k bT T min Aw Aw min 1 10
pH min pH
1 [ LAC ] Dmin 1 10
pK a pH
1 [ LAC ] U 1 10
pH pK a
min
Lactobacillus curvatus
Lactobacillus
c
k bT T min 1 exp cT T max Aw Aw min 1 exp d Aw Aw max 1 10
pH min pH
1 10 pH pH
max
1 [ LAC ] U 1 10
pH pK a
min
1 [ LAC ] D 1 10
pK a pH
min
Lactobacillus
e
35
Modelo de los parámetros cardinales
Basado en el Concepto Gamma
Los CMPs consisten de un término para cada factor ambiental. Cada término expresado como la velocidad de crecimiento relativa a aquélla cuando el factor es óptimo (i.e., cada término tiene un valor entre 0 y 1). A condiciones óptimas de crecimiento, todos los términos tienen un valor de 1 y así μmax = μopt. n
c
m op t CM 2 T CM 2 Aw CM 1 pH
i
i 1 CM n
X X min 0, n X X max X X min , X min X X max n 1 X X X X X X X X n 1 X X nX min op t min op t op t max op t min op t X X max 0, 36
Modelo de los parámetros cardinales
También la duración de la fase lag puede expresarse en función de las condiciones ambientales con CPM.
λ tiene un valor mínimo (λ min) cuando la velocidad de crecimiento es óptima (μopt)
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Modelos de inactivación microbiana Modelos primarios Modelos secundarios
Modelos primarios (Condiciones ambientales constantes) Exponential Gompertz Modelo Geraaerd’s Weibull
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Exponential and Gompertz model N(t)=100Exp(-0.1t)
Modelo Exponencial (loglineal):
N t N 0e kt
120 100 80 60 40 20 0
Modelo de Gompertz:
0
10
20
30
40
50
N t N 0 E Ex xp aExp ( E Ex xp (b ct )) aExp ( E Ex xp (b)) Empirical a,b, c are just fit parameters Used for Listeria for Listeria during during heat processes The effect of combined combined high pressure and mild heat on the inactivation of Escherichia coli and coli and Staphylococcus aureus in aureus in milk and poultry Inhibition of Enterobacteriaceae and clostridia during sausage curing Gompertz model is inappropriate to describe the survival curves without a tail phase.
40
Geraaerd’s model
Geeraerd et al. (2000) extended log-linear model to account for shoulder and tail with several transition functions or adjustment factors
Y log log 10
Y 0
exp exp k d S 10Y exp k d t 10Y . exp exp k d S 1 exp exp k d t 1 exp res
res
Survival of Salmonella enterica and Listeria and Listeria monocytogenes (Greenacre monocytogenes (Greenacre et al., 2003); mild temperature inactivation of Escherichia of Escherichia coli K12 coli K12 (Valdramidis et al., 2005); Listeria 2005); Listeria monocytogenes on monocytogenes on the surface of smear ripened cheese; etc.. 41
Weibull model
Basado en la asunción que los eventos letales son probabilísticos en lugar de determinísticos Weibull Distribución de tiempos de inactivación (β: shape parameter; χ: scale parameter)
Log S t
t log(10) 1
β<1 indica que las células supervivientes en cualquier punto del tiempo en la curva de inactivación tienen la capacidad de adaptarse a la tensión aplicada (curvas cóncavas)
β>1 indica que las células restantes incrementan su deterioro (curvas convexas)
Ventajas: simplicidad y la capacidad de modelar curvas de supervivencia lineal, así como aquellos que contienen regiones de hombro y/o cola
Clostridium botulinum, botulinum, esporas de Bacillus de Bacillus stearothermophilus, stearothermophilus, Salmonella Typhimurium, Typhimurium, Listeria monocytogenes, monocytogenes, Bacillus cereus spores, cereus spores, esporas de Bacillus de Bacillus pumilus, pumilus, Yersinia enterocolitica. enterocolitica. Listeria monocytogenes mediante monocytogenes mediante la aplicación simultánea de alta presión y el calor suave; inactivación de alta presión de una variedad de Vibrio spp. Vibrio spp. En ostras; inactivación en alta de presión de Yersinia enterocolitica en leche leche entera UHT, etc. 42
Modelos secundarios (Parámetros en función de las condiciones ambientales) Arrhenius Arrenhius Modificado
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Modelo de Arrhenius
Derivada empíricamente de consideraciones termodinámicas, para describir la relación entre velocidad de inactivación/crecimiento en función de la E A temperatura.
k k 0 e RT
Usado extensivamente para calcular tiempo de vida en anaquel
Desventaja: Se puede ajustar solo sobre un rango limitado de temperaturas 6.0 5.0
2
R =0.983
4.0
) 3.0 n i m ( 2.0 D g o L 1.0 0.0 -1.0 -2.0 0.00288
0.00292
0.00296
0.00300
0.00304
0.00308
-1
1/Temperature (K )
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Modelos modificados de Arrhenius
Todas las modificaciones son empíricas.
Davey (1989): Efecto de Temp y Aw
Davey (1990): Efecto de Temp y pH (Yersinia enterocolitica)
Davey & Daughtry (1995): Efecto de Temp, Aw y sal ( Salmonella spp)
Koutsoumanis (2000): Efecto de Temp y CO 2 ( Pseudomonas en pescado empacado en atmósfera modificada)
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Modelos terciarios (Modelo primario + secundario)
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Modelo terciario Temp, Aw cambia en el tiempo. Ex: T(t) Encontrar μ(T(t)) en intervalos infinitesimales 16 Encontrar N(t)
h0
Nmax
N0
b
Tmin
5.6426
18.4207
4.24467
0.017
-5.0129
14
) C ° ( e r u t a r e p m e T
12
) g 10 / U F 8 C n L ( 6 Y 4 2 0 0.00
50.00
100.00
150.00
200.00
Time (h)
Salmonella typhimurium en salchicha de cerdo
Modelo terciario h0
Nmax
N0
b
Tmin
5.6426
18.4207
4.24467
0.017
-5.0129
18
16
16
14
14
12 ) C ° 10 ( e r u t 8 a r e 6 p m e 4 T
) 12 g / U10 F C 8 n L ( 6 Y 4
2
2 0 0.00
0 50.00
100.00
150.00
200.00
Time (h)
Salmonella typhimurium en salchicha de cerdo 48
Modelo terciario Los modelos terciarios hacen de la microbiología predictiva una herramienta poderosa para todas las areas de la industria alimentaria e investigación. Tienen la capacidad de predecir realísticamente el crecimiento y la sobrevivencia de los microorganismos bajo condiciones ambientales dinámicas Por eso se han incorporado en simulaciones de evaluación cuantitativa de riesgo. Pero, los modelos terciarios no son tan fáciles de simular…
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Modelos terciarios ‘enlatados’ y base de datos disponibles Name
Brief description
Source
Pathogen Modeling Program (PMP)
Package of models that can be used to predict the growth and inactivation of food-borne bacteria, primarily pathogens, under various environmental conditions.
USDA-Agricultural Research Centre and Eastern Regional Research Centre (USA) http://portal.arserrc.gov/PMIP Home.aspx
MicroFit
Software that estimates growth rate, doubling time and lag time from challenge test data. Fits Baranyi models
Institute of Food Research (UK) http://www.ifr.ac.uk/microfit/
DMFit
Excel add-in that fits log counts versus time data and extract parameters such as growth/death rate and lag time/shoulders. Fits Baranyi models
Institute of Food Research (UK) http://www.ifr.ac.uk/safety/D MFit/
Growth Predictor and Perfringens Predictor
Set of models for predicting growth as a function of temperature, pH, Aw, and in some cases, concentration of carbon dioxide or acid acetic. A web-based version of this programme is included in the ComBase Modelling Toolbox.
Institute of Food Research (UK) http://www.ifr.ac.uk/safety/gr owthpredictor/
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Modelos terciarios ‘enlatados’ y base de datos disponibles Name
Brief description
Source
ComBase
Database consists of thousands of microbial growth and survival curves that have been collated in research establishments and from publications
Food Standards Agency and Institute of Food Research (UK), http://www.combase.cc
Seafood Spoilage Software package that predicts shelf-life and National Institute of and Safety growth of bacteria in different fresh and Aquatic Resources, Predictor lightly preserved seafood Technical University (SSSP) of Denmark http://sssp.dtuaqua.dk/ GInaFit
A Microsoft® Excel add-in freeware created to Department of Chemical assist with the fitting of data to inactivation Engineering, models. Fits nine types of inactivation Katholieke models Universiteit Leuven http://cit.kuleuven.be/biot ec/
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Consideraciones para la selección de modelos Estimación de parámetros: Método requerido para estimar parámetros. Si el modelo es no-estocásticos, es usual transformar y aplicar regresión, pero esto supone errores normalmente distribuidos. Asunción estocástica: Para una pequeña cantidad bacteriana puede ser muy importante. Los modelos son generalmente no-estocásticos, pero existen. Significado de los parámetros: Son preferibles los modelos donde los parámetros tienen una interpretación física. Parsimonia: No utilizar modelos complejos cuando funciona uno simple. Interpolación: Es significativa? 52
Consideraciones para la selección de modelos d a d i j e l p m o C
estocástico, mecanístico Determinístico, mecanístico Determinístico, empírico Datos específicos, modelos sofisticados Números genéricos, modelo(s) simple
Necesisdades de recursos
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Aplicaciones de la Microbiología Predictiva Los modelos microbiológicos proveen información de forma rápida. HACCP MP asiste en el análisis preliminar de peligros, identificación de PCC y acciones correctivas. MP ayuda a entender las interacciones entre variables como Temp y Aw, lo cual es importante para la aplicación de HACCP en el procesamiento de alimentos. La combinación de MP y HACCP ofrece un enfoque sistemático a la resolución de problemas, con cálculos cuantitativos cuando sea necesario. 54
Aplicaciones de la Microbiología Predictiva Objetivo Inocuidad de los alimentos (FSO)
Para alcanzar un nivel de 100g en el punto de consumo
Criterios de rendimiento (PC)
Criterio de proceso Calor 2 min @ 70°C Z=7.5°C
Reducción 6D
UHP 7.5 min @ 500 MPa Radiación Ionizante 2.6 kGy @ 0°C 4.6 kGy @ 5°C
HACCP
55
Aplicaciones de la Microbiología Predictiva Estudios de vida en anaquel de alimentos MP predice los efectos de almacenamiento variable y condiciones de abuso que un producto pueda experimentar. Debe considerar todas las etapas de producción de un alimento incluyendo la carga microbiana en las materias primas.
Diseño de experimentos Investigación y desarrollo de productos Evaluar las consecuencias de cambios en la formulación o proceso. Diseño inocuo/estable de un nuevo producto 56
Aplicaciones de la Microbiología Predictiva Concepto barrera
Crecimiento y no-crecimiento dominante para Listeria monocytogenes usando modelos probabilísticos
Los alimentos pueden permanecer estable y seguro incluso sin refrigeración y son aceptables organolépticamente y nutricionalmente debido al suave proceso funcional barreras tradicionales: calor suave, ambiente ácido, sal y modificado Tecnologías de nueva generación: irradiación, procesamiento de alta presión 57
Aplicaciones de la Microbiología Predictiva Evaluación cuantitativa de riesgo microbiológico (QMRA) MP permite entender la cinética microbiana a lo largo de la cadena En la evaluación de la exposición, MP permite estimar los cambios en concentración microbiana, y permite determinar la exposición del consumidor a un patógeno particular: Ej: 2.5 UFC/porción de chorizo cocido
Los modelos predictivos están integrados en los modelos de QMRA 58
QMRA y Microbiología Predictiva Chacra
Beneficio
Procesamiento
Venta por menor
Inicio
Para estimar el nivel de un peligro, se construye un modelo de exposición de toda la cadena de alimentos hasta el consumo. El nivel de exposición humana depende de varios factores como: la contaminación inicial de la materia prima, características del proceso de alimentos, supervivencia de los MO, multiplicación o muerte durante almacenamiento, condiciones de almacenamiento y preparación antes del consumo. 59
QMRA y Microbiología Predictiva
60
Comunicación de riesgos Interacción
Evaluación de riesgo
Aportes científicos
Gestión de riesgo
Decisión política y valores
61
