ty t t h a Práctica No. 3: Prueba de alcaloides en H y g r o p h y l a ty Daniel Felipe Victoria Muñoz 125355, Aida Johanna Rivera Hurtado 125336
Fitoquímica y Farmacognosia, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias Universidad Nacional de Colombia _________________________________________________ ____________________ Objetivo general
Determinar la presencia de alcaloides en Hygrophyla tyttha
Objetivos específicos
Comparar los métodos de identificación de alcaloides. Determinar en las semillas de Malus domestica la presencia de glicósidos cianogenicos.
Marco teórico
No existe una definición exacta para los alcaloides, pero se ha llego al consenso de que son compuestos orgánicos de origen natural, nitrogenado, encontrándose generalmente intraciclico, derivados de los aminoácidos, de carácter más o menos básico, de distribución restringida, con propiedades farmacológicas importantes a dosis bajas que responden a reacciones comunes de precipitación 1. De acuerdo a las características de esta definición, algunos autores han divido a los alcaloides en cuatro clases: 1. Alcaloides Verdaderos: Cumplen estrictamente con las características de la
definición de alcaloides: son formados de aminoácidos, tienen siempre un nitrógeno intraciclico, son de carácter básico y existen en la naturaleza normalmente en estado de sal. 2. Protoalcaloides: Son aminas simples con nitrógeno extraciclico, de carácter
básico y son pero son productos del metabolismo de los aminoácidos. 3. Pseudoalcaloides: Presentan algunas de las características de la definición de
alcaloide, pero son derivados de aminoácidos. 4. Alacaloides Imperfectos: Son derivados de bases puricas, no precipitan con los
reactivos específicos para alcaloides.
No son alcaloides aminoácidos, las betalainas, los péptidos, los aminoaucares, las vitaminas nitrogenadas, porfirinas, algunas bases como la tiamina ampliamente distribuida en los seres vivos y los alkil aminas de bajo peso molecular, en la siguiente tabla se muestra la ruta sintética de las clases de alcaloides:
Fig 1. Ruta sintética de los alcaloides 1 La función de los alcaloides en las plantas no es aun clara, existen algunas sugerencias sobre el papel que poseen estos compuestos en las sustancias vegetales como:
Desecho o almacenamiento del nitrógeno sobrante en la planta Sirven como transporte del nitrógeno no metabolizado dentro de la planta Cumplen funciones de protección de la planta, por el mal sabor que poseen estos Reguladores del crecimiento en la planta
Se ha demostrado que la perdida de los alcaloides no impide el desarrollo de la planta, lo cual sugiere que los alcaloides no son esenciales para la vida de la planta, sin embargo estos deben participar en secuencias metabólicas y no son solamente producto de desecho del metabolismo. La propiedades fisicoquímicas varían dependiendo del alcaloide de que se esté hablando, las masas de estos pueden varían entre 100 y 900 (coniína C 8H17N=127, vincristina C46H56N4O10=824), la mayoría son incoloros a excepción de los altamente conjugados como la berberina (amarillo), la sanguinarina (rojo), la urabaina (verde) y las oxoaporfinas que van de amarillo a rojo, son normalmente solidos a temperatura ambiente, solo las bases no oxigenadas como la o la coniína, la nicotina y la esparteina que son líquidas 2.
Las técnicas de reconocimiento están basadas en la capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal, que pueden ser fácilmente precipitados con reactivos de yodo, metales pesados como el bismuto, mercurio, tungsteno, etc., los principales reactivos de precipitación se describen a continuación 3: REACTIVO
COMPOSCION
COLOR DE PRECIPITADO
Mayer
HgCl2 + KI
Crema
Hager
C6H3N3O7 (acido pícrico)
Amarillo
Valser
HgI2 + KI
Crema
Ácido Tanico
C76H52O46
Amarillo
Bouchardat
I 2 + KI
Rojo Pardo
Dragendorff
Bi(NO3) + HNO3 + KI
Anaranjado
Reineckato de amonio
NH4[Cr(NH3)2(SCN)4].H2O
Crema o Blanco
Tabla 1: reactivos de precipitación 3 Los reactivos de precipitación utilizados en esta práctica fueron Dragendorff, Mayer, Valser, Reineckato de amonio, los reactivos yodados (Dragendorff, Mayer, Valser) precipitan a los alcaloides como poliyodatos complejos, mientras que los reactivos organonitrados (Reineckato de amonio) forman precipitados cristalinos que se descomponen por alcalisis. Su preparación se describe a continucacion 3
Reactivo de Dragendorff: se prepara mezclando 8g de nitrato de bismuto
pentahidratado en 20 ml de acido nítrico al 30% con una solución de 27.2g de yoduro de potasio en 50ml de agua, se deja reposar durante 24 h, se decanta y se afora a 100ml.
Reactivo de Mayer: se prepara mezclando 1.3g de bicloruro de mercurio en 60ml
de agua y 5g de yoduro de potasio, luego se afora a 100ml.
Reactivo de Valser: se prepara mezclando 50ml de una solución al 10% de
yoduro de potasio a la que se le añade 10g de yoduro de mercurio, luego se afora a 100ml
Reineckato de Amonio: una solución acuosa al 4% de reineckato de amonio se
acidula ligeramente con HCl y se trata con 0.1% p/v de clorhidrato de hidroxilamina. Es muy común utilizar también cromatografías en capa delgada, para realizar la identificación de los alcaloides, en estas también se utilizan los reactivos de precipitación,
principalmente el reactivo de Dragendorff o uno organonitrado, ya que estos generan una coloración que nos permite indicar la presencia de cualquiera estos. En la Brugmansia spp
podemos identificar alcaloides de tipo tropanico como la
hiocsiamina, atropina, apoescopolamina y 6β hidroxi 3α tigloiloxitropano 4, estos alcaloides se encuentran principalmente en las flores y poseen las mismas propiedades farmacológicas, aunque generalmente la hiosciamina es entre 10 y 50 veces más activa que la atropina, pero esta es mucho más estable; sus efectos están dados principalmente en el sistema nervioso, tanto en el central como en el autónomo, generando síntomas como: midriasis, una aceleración a nivel del corazón, vasocontriccion de los vasos capilares, relajamiento del peristaltismo y una acción espasmolitica neurotopica, todo esto debido a su acción antagonista sobre la acetilcolina. Los glucósidos cianogénicos son cianohidrinas unidas a un azúcar cuya hidrólisis enzimática libera cianuro; este actúa inhibiendo al citocromo oxidasa, enzima de la cadena respiratoria, que impide la respiración celular, ellos se encuentran ampliamente distribuidos en los vegetales, pero también los podemos encontrar en hongos, bacterias y animales, en plantas se encuentran los glucósidos cianogénicos en la raíz de mandioca principalmente; aunque también en semillas de Malus domestica (manzana), almendras, duraznos, cerezas, ciruelas, etc., pero en concentraciones muy bajas 5 La prueba de identificación más utilizada para los glucósidos cianogenicos es la reacción de Guinard (para ácido cianhídrico), la cual consiste en que el HCN gaseoso se encuentre con una tira de papel absorbente impregnada con ácido pícrico y carbonato de sodio, si se llegase a presentar un viraje desde el color amarillo original a un color rojo ladrillo podemos indicar la presencia de los glucósidos, entre más fuerte sea el color rojo ladrillo más cantidad de ácido cianhídrico liberado por lo tanto hay una mayor cantidad de glucósidos cianogenicos 6. Resultados
En las tablas 2 y 3, se observa las pruebas de tubo, que se realizaron con los reactivos de Dragendorff, Valser, Meyer y Reinekato de sodio a los extractos de Hygrophila Tytta y Brugmansia spp. Cada imagen tiene dos tubos de ensayo a la izquierda e extracto sin
ninguna prueba. Con esta imagen se realiza la comparación entre antes de la prueba y después de la misma.
Reactivo
Pruebas de tubo en comparacion con patron
Resultado
Dragendorff
No precipitado NEGATIVO
Valser
No precipitado NEGATIVO
Meyer
No precipitado NEGATIVO
Reinekato de sodio
No precipitado NEGATIVO
Tabla 2: Pruebas de tubo y resultado del pre cipitado del extracto de Brugmansia spp
Reactivo
Pruebas de tubo en comparacion con patron
Resultado
Dragendorff
No precipitado NEGATIVO
Valser
No precipitado NEGATIVO
Meyer
No precipitado NEGATIVO
Reinekato de sodio
No precipitado NEGATIVO
Tabla 3: Pruebas de tubo y resultado del precipitado del extracto de Hygrophila Tytta.
Tabla 4 se observa imágenes de la CCD una revelada con reactivo de dragendorff y otra vista a luz UV, con el reactivo de dragendorff se evidencia la presencia de alcaloides es la Brugmansia spp.
Revelado
Imagen de Cromatografía de capa delgada
Brugmansia spp
Luz UV 365nm
Banisteriopsis Caapi (yage) Hygrophila Tytta
Brugmansia spp
Reactivo de dragendorff
Banisteriopsis Caapi (yage) Hygrophila Tytta
Tabla 4: Cromatografía de capa delgada de los extractos de Hygrophila Tytta, Brugmansia spp y Banisteriopsis Caapi como patrón. La capa es revelada con luz UV y reactivo de dragendorff.
En la figura 2 se observa papel de ácido pícrico con viraje naranja, lo cual evidencia la presencia de glicósidos cianogenicos en las semillas de Malus domestica (manzana).
Fig 2. Observación de ácido pícrico en presencia de glicósidos cianogenicos de las semillas de Malus domestica (manzana).
Discusión de resultados
En las pruebas de tubo para identificación de alcaloides que utilizan los reactivos de Dragendorff, Mayer, Valser y Reineckato de amonio no se genero el precipitado en el extracto de Brugmansia spp; en el caso del reineckato de amonio es esperado que no de un precipitado ya que este reactivo sirve para la identificación de nitrógenos cuaternarios o N-oxidos5, y según Molina e.t en la Brugmansia spp encontramos alcaloides derivados del tropano, los que están caracterizados por tener el nitrógeno metilado lo que impide la formación de un N-oxido y se dificulta su cuaternizacion por el impedimento estérico. En la CCD revelada con reactivo de Dragendorff se observa manchas naranjas en la muestra patrón Banisteriopsis Caapi (yage) y en el extracto de Brugmansia spp lo que demuestra la presencia de alcaloides. Contrastado con las pruebas de tubo, que dieron un resultado negativo para alcaloides. Esta diferencia entre los métodos de identificación puede ser explicada por la siguiente hipótesis, en al cual se plantea que los reactivos utilizados en la práctica pudieron estar alterados o contaminados, ya que son de uso común por todos los integrantes del laboratorio. Se observa para Hygrophyla tyttha en la CCD la ausencia de alcaloides, lo que es confirmado con las pruebas tubo, aunque en la CCD revelada a la luz UV de longitud de 365 nm, se identifica una mancha de color rojo (Tabla 4) la cual se cree que es un compuesto cromóforo el cual no necesariamente es un alcaloide ya que las pruebas anteriores dieron negativas. Los RFs obtenidos en la CCD revelada con reactivo de Dragendorff son diferentes para los extractos de Brugmansia spp y de Banisteriopsis Caapi, aunque las dos muestran manchas que nos indican la presencia de alcaloides, esta diferencia de RFs es generada a que no son los mismos tipos de alcaloides. El viraje de un color amarillo inicial a un color naranja en la tira de papel absorvente con ácido pícrico, después de 24 horas, nos indica la presencia de glucósidos cianogenicos, aunque por ser de color naranja no existe una gran cantidad de estos glucósidos en las semillas de Malus doméstica, estos resultados tienen correlación con los resultado mostrados en la literatura 6.
Conclusiones
En Hygrophyla tyttha se evidencio la ausencia de alcaloides, estos fue confirmado por las diferentes pruebas de tubo y por la CCD revelada con Dragendorff y luz UV
El método de identificación de CCD es menos susceptible a errores por parte del experimentador, aunque las pruebas de tubo resultan ser mas útiles a la hora de identificar la estructura de un alcaloide, es importante tener cuidado en la pureza de los reactivos requeridos.
En Malus doméstica se evidencio la presencia de glucósidos cianogenicos, en bajas concentraciones, en concordancia con la reacción de Guinard.
Bibliografía
1. Arango G., alcaloides y compuestos nitrogenados, prácticas de laboratorio de farmacognosia, Universidad de Antioquia, Facultad de Química Farmacéutica. 2008, pp.1-8. 2. Universidad Nacional de la Patagonia San Juan Bosco. Facultad de ciencias naturales. Departamento de farmacia. Cátedra de farmacognosia. Libro de trabajo practico N°8 alcaloides. pp. 110-115 3. Marcanno D., Hasegawa M.; Fitoquimica Organica, 2ª ediccion, Editorial Torinio, Caracas, 2002, pp. 384-385 4. Molina Y., Estudio etnobotánico y etnofarmacológico de plantas medicinales de Tambopata, Madre de Dios, Perú, journal of medecine, 1995. 5. Valle P., Florentino B., Toxicología de Alimentos, Instituto Nacional de Salud Pública, Mexico, D.F.,2000, pp 73-75 6. Cuello J., Didáctica de la Genetica, 1ª edición, publicacions edicions universitat de Barcelona, Barcelona, 1983, pp 150-151
