Diseño de un Sistema de Medición de Bioimpedancia para la Detección de Microorganismos Jesús Sánchez Fernández1 , Luis Zurita Landaeta 2 , Mervis Villanueva Isaba 3 Maestría Informática Industrial y Automatización Instituto Universitario Universitario de Tecnología Cumaná, Cumaná , Cumaná, Estado Sucre, Venezuela Instituto Superior Politécnico José Antonio Echeverría, La Habana, Cuba 1
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Resumen.-La
Microbiología de Impedancia se ha convertido en una técnica de detección y cuantificación de microorganismos patógenos notablemente ventajosa con respecto a métodos clásicos como el contaje en placas. Este estudio plantea el diseño de un sistema electrónico de medida capaz de determinar la impedancia en un medio de cultivo inoculado, con la finalidad de detectar el crecimiento de microorganismos. microorganismos. El diseño abarca las etapas de captura, acondicionamiento de la señal, conversión análogodigital (fron-end) y la unidad de procesamiento basada en microcontroladores PIC de la familia 16, que incluye el programa en diagramas de flujo. Para demostrar el funcionamiento del sistema de medición se hace uso de un software de simulación de circuitos electrónicos. Palabras clave: impedancia, microcontroladores, microbiología
I. INTRODUCCIÓN Cuando las bacterias patógenas crecen en alimentos y en el medio, como parte de un proceso metabólico normal rompen proteínas, grasas y otras moléculas relativamente largas para convertirlas en aminoácidos, ácidos grasos y otros químicos más pequeños. El aumento en estas cargas químicas incrementa la capacidad del medio de conducir cargas eléctricas. Como resultado, conforme los microorganismos crecen, ocurren cambios importantes en la impedancia eléctrica [2]. Con la finalidad de determinar la presencia y crecimiento de microorganismos se han diseñado instrumentos para medir exactamente los cambios por minuto en la impedancia y conductancia en intervalos regulares de tiempo, registrando automáticamente el tiempo requerido para cambios significativos en la impedancia. El diseño de estos instrumentos está basado en diferentes métodos de medición que se han venido utilizando desde los inicios de las investigaciones de Microbiología de Impedancia. Los métodos más comunes son el análisis de redes, la medida en puente, la medida de I-V, el puente autobalanceado, la resonancia [3] y reflectometría [4].
Estas técnicas de medición de impedancia han ido evolucionando gracias al desarrollo de potentes sistemas electrónicos de procesamiento digital, como es el caso de los microcontroladores que permiten realizar miles de millones de operaciones por segundo. II. ESPECTROSCOPÍA DE IMPEDANCIA El procedimiento experimental utilizado en espectroscopía de impedancia es el de aplicar una pequeña señal eléctrica senoidal a un electrodo y medir su respuesta a diferentes frecuencias obteniendo como resultado un valor de impedancia para cada Frecuencia (espectro de impedancia) [1][7].(Ver Figura 1) Se utilizan bajas densidades de corriente para evitar daños a los tejidos, principalmente debido a los efectos de calentamiento (entre 10 µA a 1 mA).
Fig.1 Medida de impedancia
Los productos metabólicos creados durante el crecimiento de microorganismos modifican la composición del medio, cambiando el contenido iónico, lo cual a la vez origina un cambio de la conductividad del medio de cultivo. Estos cambios son registrados en el tiempo al producirse variaciones en la interfaz electrodo-electrolito-muestra. Tales modificaciones son proporcionales a la concentración de microorganismos vivos, que puede ser registrada mediante técnicas impedimétricas [10]. Debido a las componentes capacitivas de los materiales se produce un desfase ϕ entre las señales, siendo por tanto la impedancia un valor complejo (Ecuación 1).
A. Muestra – Electrodo
Desde el punto de vista estructural, el principal componente de una muestra biológica son las células. Las células a su vez están formadas por una membrana que separa el medio intracelular del extracelular (ambos electrolíticos), actúa como una interfase dieléctrica similar al modelo de las placas de un condensador, dando características dieléctricas a la célula, permitiendo así realizar la medición de impedancia, donde además se debe considerar el efecto de los electrodos. El electrodo es la interfase entre el sistema electrónico y el sistema físico (tejido biológico, disolución, etc.) que permite aplicar y registrar un estímulo eléctrico sobre una muestra. Debe diseñarse con materiales lo más inertes posibles que minimicen su deterioro, ya que si éste llegase a producirse liberaría sustancias al medio produciendo alteración en la composición de la muestra [6], de aquí la necesidad de que los electrodos sean biocompatibles, generalmente fabricados con platino, acero inoxidable, plata, clorato de plata, entre otros. Cuando se introduce un electrodo, sin aplicar ningún estímulo sobre él, sólo por el hecho de entrar en contacto el metal y los iones, se produce una reordenación de las cargas. Éstas se distribuyen de forma que en el perímetro del electrodo se posicionan todas las cargas negativas y en la superficie contigua a él se orientan las cargas positivas presentes en el electrolito. Cuando se estimula eléctricamente, se produce una transferencia de carga de la superficie del electrodo al electrolito [6]. La existencia de este proceso hace que pueda establecerse una semejanza entre el sistema electrodoelectrolito y un modelo eléctrico equivalente configurado por dos componentes: Capacidad (Cd), proveniente de la doble capa eléctrica, y resistencia en paralelo (Rd) denominada impedancia farádica (Figura 2). Este modelo está estrechamente relacionado con la geometría de los electrodos y la naturaleza de la muestra (impedancia del electrolito (Re)) [6].
utilizados, el modelo de Fricke. Consiste en una resistencia para simular el comportamiento del medio extracelular (Re), otra para el medio intracelular (Ri) y una capacidad para la membrana (Cm) [6].
Fig. 3 Elementos capacitivos y resistivos en una suspensión celular simplificada.
III. ARQUITECTURA BÁSICA DE UN SISTEMA ELECTRÓNICO DE MEDICIÓN Un sistema de medición es el conjunto de dispositivos electrónicos que permiten captar, acondicionar, transmitir, filtrar, y procesar el valor de una determinada variable dentro de un proceso. Las diferentes etapas que caracterizan a estos sistemas de medición y sus funciones se pueden apreciar en la Figura 4.
Fig. 4 Sistema de Medición Electrónico
III. SISTEMA ELECTRÓNICO DISEÑADO El sistema de medida diseñado consta de varias etapas a saber, cuya función va desde la generación de las señales, filtrado, amplificación, retención y muestreo, hasta la visualización, todas necesarias para lograr el objetivo del circuito. A. Generación de la Señal de Corriente Alterna
En esta etapa se utilizó un PIC16F84A para generar las máscara que se ingresará al convertidor digital – analógico, cuyos voltajes de referencia + y -, están conectados a dos baterías de 1,5 vdc. La máscara posee 35 valores que sirven de base para la señal senoidal a inyectarse a la muestra.
Fig. 2 Esquema equivalente del sistema electrodo-electrolito.
De forma aproximada se puede modelar la impedancia mediante circuitos eléctricos denominados modelos de parámetros concentrados. En la Figura 3 se puede observar uno de los circuitos eléctricos más
Fig. 5 Generación de señal alterna de 1,5 vp con 1 kHz de frecuencia.
enormemente la obtención de un modelo fiable para el conjunto electrodo-muestra. Por lo que en el diseño se La señal que se genera desde el DAC posee rampas no trabaja con una aproximación de la impedancia, deseadas que deben ser filtradas para obtener una señal representada sólo por la variación de una resistencia. DE alterna más adecuada para a los requerimientos. Para esta esta etapa se obtiene las señales de entrada de corriente y tarea se eligió un filtro Sallen – Key de 2do orden con una voltaje de la muestra en estudio que serán frecuencia de corte= 2Fin. La Figura 6 muestra la señal acondicionadas por los amplificadores de antes del filtrado (amarilla) y después del filtrado instrumentación en las siguientes etapas. (magenta).
B. Filtrado de la Señal de Corriente
Fig. 7 Circuito Equivalente del Conjunto electrodo-Muestra. Fig. 5 Circuito Electrónico para Filtrar la Señal de Corriente Alterna.
E. Acondicionamiento de las Señales de Voltaje y Corriente
En esta etapa, se utilizó un amplificador de instrumentación de ganancia 1000, así como un sumador de voltaje que permitió aplicar un voltaje de offset de 2,5 vdc para desplazar la señal ac a valores positivos del voltaje de la muestra, adecuándose para el convertidor analógico digital intrínseco en el microcontrolador PIC16F877.
Fig. 5 Señal de Corriente sin Filtrar y luego del Filtrado.
C. Fuente de Corriente Howland
La fuente de corriente Howland permite entregar una corriente constante, independientemente de la carga, lo cual se adapta a las exigencias del presente diseño, que se estimó en 10 μA , cumpliendo así con los parámetros establecidos en cuanto a niveles de corriente. Fig. 8 Acondicionamiento de la Señal de Voltaje de la Muestra.
De manera similar, se acondicionó el voltaje equivalente a la corriente proveniente de la muestra, el cual, necesitó de un amplificador adicional no inversor de ganancia 1000, motivado al bajo voltaje presente (μV).
Fig. 7 Circuito Howland.
D. Captura de señal (Electrodos)
Esta etapa abarca al sensor instalado en el proceso, para el caso se refiere a los electrodos y la muestra donde se desea medir impedancia. Cabe destacar que en Microbiología de Impedancia no está claro qué tipo de teorías emplear para modelar la interfase electrodoelectrolito [9], ya que tanto la geometría de los electrodos como la naturaleza de las muestras dificultan
Fig. 8 Circuito de Acondicionamiento de la Señal de Voltaje equivalente a la Corriente de la Muestra.
se debe considerar las características de los electrodos y la naturaleza de la muestra. Una vez que las señales de voltaje y corriente El material de los electrodos debe ser biocompatibles provenientes de la muestra son acondicionadas, es para que no se produzcan reacciones químicas necesario sincronizar el muestreo mediante un circuito indeseadas que deterioren la muestra y hasta el mismo Sample&Hold. El control es realizado desde un pin electrodo. (RB0) del puerto B para tomar las muestras de voltajes Se debe realizar la medida de impedancia utilizando sin que se produzca un desfasaje pronunciado entre valores pequeños de corriente ( µA), para garantizar que ellas. no se altere la composición de la muestra, ya que esto podría originar resultados inciertos. La toma de los datos de corriente y voltaje para el cálculo de la impedancia introduce una fuente de error debida a la pérdida de sincronismo. Esto puede corregirse aplicando un algoritmo optimizado de muestreo tomando un mayor número de datos. El diseño adecuado de un medidor de impedancia como el que se plantea en la propuesta, supone una Fig. 8 Circuito Sample & Hold. reducción de costos con respecto a un equipo comercial E. Visualización de los Datos Se utilizó un PIC16F877 como unidad de con características similares. procesamiento de datos, cuya función es la convertir las REFERENCIAS señales de corriente y voltaje, provenientes de la muestra [1] J. R. Macdonald, E. Barsoukov. Impedance Spectroscopy. Theory, en estudio, para su posterior análisis matemático en Experiment and Applications. 2nd Edition, John Wiley & Sons, Inc. 2005. función de la impedancia equivalente y su visualización [2] Nuevos métodos rápidos para detectar patógenos y alérgenos para en una pantalla LCD. mantener la seguridad de productos lácteos. [ D. Retención y Muestreo
http://www.infoleche.com/nota.php?ID=719] [3] Agilent Technology. Impedance measurement handbook. A guide to measurement technology and techniques 4th Edition. 2009. [4] Paco Bogonez Franco. Medidas de Bioimpedancia para la Detección del Estado de los Órganos. Universidad Politécnica de Catalunya, Dpto. Ingeniería Electrónica. 2006. [http://www.jcee.upc.es/JCEE2006/pdf_ponencies/PPTs/Mesura%20bioimpe dancies___JCEE-2006%20-%20Bogonez.pdf] [5] Uwe Pliquett. Bioimpedance: A Review for Food Processing. 2010. [http://www.springerlink.com/content/1061g61277142gt3/fulltext.pdf]
Fig. 8 Circuito para la visualización de la información
V. RESULTADOS Los resultados obtenidos son satisfactorios tomando en consideración las limitantes de tiempo e información disponible referente al tema de investigación. Para determinar el voltaje máximo de la señal alterna se aplicó un algoritmo de tres muestras, lo que introduce un margen de error mayor al esperado. Se aplicó un circuito sample & Hold buscando mejorar el sincronismo en el muestreo, sin embargo los resultados fueron similares a los obtenidos antes de incluirlo. VI. CONCLUSIONES El diseño o elección de los electrodos es uno de los puntos más críticos en este tipo de experiencias, ya que
[6] Rafael Masot Peris. Desarrollo de un Sistema de Medida Basado en Espectroscopía de Impedancia para la Determinación de Parámetros Fisicoquímicos en Alimentos. Universidad Politécnica de Valencia, Dpto. Ingeniería Electrónica. 2010. [http://riunet.upv.es/bitstream/handle/10251/8502/tesisUPV3356.pdf] [7] A. J. Bard, L. R. Faulkner. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, Inc. 2001. [8] G. P. Drago, S. Ridella. Evaluation of electrical fields inside a biological structure. Br. J. Cancer 45 (1982) 215. [9] Felipe J. Carmelo. Microbiología de Impedancia tp(Extracto de Tesis Doctoral) [http://www.herrera.unt.edu.ar/bioingenieria/Temas_inves/MZ/mz.htm] [10] Ramírez Nardo, Regueiro Angel, Arias Olimpia, Contreras Rolando. Espectroscopía de impedancia electroquímica, herramienta eficaz para el diagnóstico rápido microbiológico. [http://elfosscientiae.cigb.edu.cu/PDFs/BA/2009/26/1/BA002601EN065071.pdf] [11] González Humberto. "Señales Biomédicas." [http://www.angelfire.com/un/biomedicafime/CLASE_5.pdf]
2009.
