Detección de BLEE en el Laboratorio de Microbiología

Lic. TM. Javier Soto Pastrana [email protected]

Laboratorio de Microbiología Clínica Laboratorio Hospital San Bartolome

BACTERIA SENSIBLE Antibiótico β-lactamicos

BACTERIA RESISTENTE

Difusión a través de la membrana externa

Alteración de porinas Alteración Bomba de expulsión

Difusión a través del peptidoglicano

PBP

Muerte celular

Β-lactamasas

Cambios en los PBP

BACTERIA SENSIBLE Antibiótico β-lactamicos

BACTERIA RESISTENTE

Difusión a través de la membrana externa

Alteración de porinas Alteración Bomba de expulsión

Difusión a través del peptidoglicano

PBP

Muerte celular

Β-lactamasas

Cambios en los PBP

MECANISMOS DE D E RESISTENCIA RESISTENCI A BACTERIAS GRAM NEGATIV NEGATIVAS AS Cephalosporinas

Imipenem

Membrana externa (Lipopolisacarido)

OmpF

OmpC

Espacio periplasmatico

Bomba de Eflujo

Beta-lactamasas Peptidoglicano

Proteínas Fijadoras de Penicilina

PB1a

PBP2

PBP1b

PBP3

Membrana interna (fosfolipido)

Clasificación de las β-lactamasas

Bush, K. (2010). AAC. 54 (3): 969 - 976

Definición de BLEE Enzimas que tienen una actividad hidrolitica contra oximino-cefalosporinas o aztreonam mas del 10% que a bencilpenicilina. No pueden hidrolizar cefamicinas o carbapenems. Son inhibidas por inhibidores de β-lactamasa. Son enzimas de

codificación plasmidicas

Diseminación

a otros microorganismos Asociación a otros mecanismos de resistencia Asociado a impermeabilidad produce resistencia a los carbapenems Sohei Harada y col . Korean J Lab Med 2008; 28: 401-412

Origen de las BLEE En 1983 (Alemania) se descubrió la primera BLEE (SHV-2) En 1985 (Francia) se descubrió a la segunda BLEE (TEM-3) En 1989 (Alemania-Argentina) se detecto un BLEE diferente a TEM y SHV, que se denomino CTX-M.

Actualmente (2010)……… 

Mas de 160 variantes de TEM •

IRT (TEM resistente a inhibidores)

•

CMT (complejo mutantes de TEM)



Mas de 115 variantes de SHV



Mas de 80 variantes de CTX-M •

Clasificadas en 5 Grupos: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9, y CTX-M-25

Otras: PER, VEB, GES, SFO, TLA,

BEL, BES e IBC .

http://www. lahey.org/studies/.

BLEE

Β-lactamasa relacionada

Pais de origen

Especies en las que se detectaron inicialmente

Prevalencia elevada

SHV

SHV-1/LEN

Alemania (1983)

Klebsiella ozaenae

TEM

TEM-1, -2

Francia (1985)

Klebsiella pneumoniae

KLUA Kluyvera sp.

Japón(1986) Alemania(1989) Argentina(1989)

Escherichia coli, Salmonella spp

OXA-10 (PSE-2)

Turquía (1991)

Pseudomonas aeruginosa

Francia (1991)


PER (39%)

Francia (Vietnam) (1996)

Escherichia coli

SFO

AmpA S.fonticola (96%)

Japón (1988)

Enterobacter cloacae

TLA

CME-1 (50%)

México (1991)

Escherichia coli

BES

YENT (51%)

Brasil (1996)

Serratia marcescens

GES-1

YENT (36%)

Francia (Guayana francesa) (1998)

Klebsiella pneumoniae

IBC

YENT (51%)

Grecia (1999)

Enterobacter cloacae

BEL

GES-1 (50%)

Bélgica (2004)


CTX-M OXA PER VEB Prevalencia baja

Enferm Infecc Microbiol Clin. 2007; 25 Supl. 2: 2-10

Base Molecular de las BLEE Β-lactamasa TEM-1

Posición del aminoácido 19

37

102

162

203

235

236

237

261

Leu

Gln

Glu

Arg

Gln

Ala

Gly

Glu

Thr

TEM-2

Lys

TEM-3

Lys

TEM-4

Phe

Lys

Ser

Lys

Ser

TEM-5

Ser

TEM-6

Lys

TEM-7

Lys

SHV-1

Gln

Thr

Lys

His Ser

Asp

Arg

Arg

SHV-2

Ala

Gly

Glu

Leu

Ser

SHV-3

Leu

Ser

SHV-4

Leu

Ser

Lys

Gln: Glutamina, Glu: Acido glutamico, Asp: Acido aspartico, Thr: Treonina, Leu: Leucina, Phe: fenilalanina

Prevalencia de BLEE en K.pneumoniae y E. coli en Latinoamerica País

Microorganismos K. pneumoniae

Escherichia coli

β-lactamasa

Argentina

57%

5%

SHV-2, -5, CTX-M-2, PER-2

Brasil

38%

12%

CTX-M-8, SHV-5

Chile

73%

22%

SHV-5, -2

Colombia

44%

27%

SHV-5, -2, CTX-M-12

Costa Rica

32%

7%

SHV-5, -4

Ecuador

26%

27%

SHV-5, -4

Guatemala

52%

27%

SHV-5, -4

México

56%

28%

TLA-1, SHV-5, -12

*

63%

SHV-2, -5, -12

Uruguay

38%

7%

SHV-5, -2, TEM-144

Venezuela

63%

32%

SHV-5, SHV-2

Perú

Problemas en la Detección de BLEE Muchas cepas portadoras de BLEE no aparecen resistente a C2G, C3G y C4G o aztreonam en el antibiograma.  Algunos antibióticos son mejores para detectar la presencia de BLEE (p.e. ceftazidima, aztreonam, cefpodoxima).  Detección es imperativo para advertir a los clínicos que la terapia con algunos nuevos -lactamicos puede no ser exitoso 

Recomendaciones de la CLSI para la deteccion de BLEE Si se usan: OBJETIVO

Punto de corte M100-S19 (2009)

Punto de corte M100-S20 (2010)

PARA SEGUIMIENTO DEL PACIENTE

Realizar screening y confirmar BLEE

SI

NO

Cambiar “S” a “R” para las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam

SI

NO

Realizar screening y confirmar BLEE

SI

SOLO SI SE SOLICITA

Cambiar “S” a “R” para las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam

SI

NO

PARA CONTROL DE INFECCIONES

Cambios de los MICs: C3G en Enterobacterias Antibiótico

CLSI M100-S19 (2009)

CLSI M100-S20 (2010)

S

I

R

S

I

R

Cefazolina

≤8

16

≥ 32

≤1

2

≥4

Cefotaxima

≤8

16 - 32

≥ 64

≤1

2

≥4

Ceftizoxime

≤8

16 - 32

≥ 64

≤1

2

≥4

Ceftriaxona

≤8

16 - 32

≥ 64

≤1

2

≥4

Ceftazidima

≤8

16

≥ 32

≤4

8

≥16

Aztreonam

≤8

16

≥ 32

≤4

8

≥16

Interpretación basado en 1 gr. Cada 24 horas

¿Porque cambios en los breakpoints? LOS NUEVOS BREAKPOINTS DETECTARIA MAS BACTERIAS PRODUCTORAS DE BLEE Porcentajes de cepas productoras de BLEE dando resultados RESISTENTES Antimicrobiano

Nuevos Breakpoints

Antiguos Breakpoints

Cefazolina

100 %

80 %

Cefotaxima

80 %

33 %

Ceftriaxona

89 %

40 %

Ceftazidima

84%

62 %

Aztreonam

87 %

87 %

Kohner y col. 2009. Journal Clinical Microbiology 47: 2419

Detección BLEE: ¿ya no es necesario? NUEVOS TAMAÑOS DE LOS HALOS DE INHIBICION PARA TODAS LAS ENTEROBACTERIAS CLSI M100 – S21 (2011) S

I

R

Cefotaxima

≥ 26

23 - 25

≤ 22

Ceftizoxime

≥ 25

22 - 24

≤ 21

Ceftriaxona

≥ 23

20 - 22

≤ 19

Ceftazidima

≥ 21

18 - 20

≤ 17

Aztreonam

≥ 21

18 - 20

≤ 17

ANTIMICROBIANOS

Ventaja de los cambios de los breakpoints (CLSI2010) es que bacterias como Enterobacter spp. los cuales no son considerados en las guías de la CLSI para detectar BLEE, serian considerados

Recomendaciones del INEI - Argentina Se sugiere seguir informando las cepas productoras de BLEEs como BLEE positiva e informar todas las penicilinas,

cefalosporinas y monobactamicos como resistentes, pero acompañado de una llamada aclaratoria para cada una de las drogas que presentara resultado de aparente sensibilidad cuando se aplican los puntos de corte del 2011, citando: "De acuerdo a CLSI M100-S20 2011, Ceftazidima y/o Cefotaxima y/o Cefepima y/o Aztreonam, sería(n) sensible(s) en base a parámetros PK/PD. Sin embargo, no se disponen de suficientes datos clínicos que aseguren la eficacia de esta(s) droga(s) en aislamientos con este mecanismo de resistencia (BLEE)"

Servicio Antimicrobianos - INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

INEI: ejemplo de Informe de BLEE CULTIVO: Klebsiella pneumoniae Antibiótico

Halo de inhibición

Cefotaxima

12 mm

R

Cefatzidima

22 mm

R (*)

Aztreonam

21 mm

R (*)

Cefepima

15 mm

R (*)

Sinergismo entre AMC-CTX: positivo

Informe

BLEE POSITIVO

(*) “De acuerdo a CLSI M100-S20 2010, CAZ y AZT serían sensible y FEP intermedio en base a parámetros PK/PD. Sin embargo, no se disponen de suficientes datos clínicos que aseguren la eficacia de estas drogas en aislamientos con este mecanismo de resistencia (BLEE)” Servicio Antimicrobianos - INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

RECOMENDACIONES INEI ESTUDIO DE BLEE ENTEROBACTERIAS Continuar con la búsqueda reporte e informe de

BLEE en las pruebas de rutina. Usar tabla suplementaria 2A-S1 de CLSI M100-S21 (2011). BLEE positivo: informar R a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactamicos independientemente de las zonas de inhibición o MIC obtenidas. BLEE negativo: informar según punto de corte actualizado CLSI 2011

DISTRIBUCION DE LOS HALOS DE INHIBICION DE CEFTAZIDIME DE 254 CEPAS DE Escherichia coli productoras de BLEE HOSPITAL SAN BARTOLOME 2005 - 2010

Punto de corte antiguo

Punto de corte nuevo

CLSI 2009: S ≥ 18 mm; R ≤ 14 mm CLSI 2010: S ≥ 21 mm; R ≤ 17 mm

Tamizaje de BLEE: ≤ 22 mm

DISTRIBUCION DE LOS HALOS DE INHIBICION DE CEFTRIAXONA DE 254 CEPAS DE Escherichia coli productoras de BLEE HOSPITAL SAN BARTOLOME 2005 - 2010

Punto de corte antiguo

Punto de corte nuevo

CLSI 2009: S ≥ 21 mm; R ≤ 13 mm CLSI 2010: S ≥ 23 mm; R ≤ 19 mm

Tamizaje de BLEE: ≤ 22 mm

Pacientes que Fallaron al Tratamiento con C3G en Infecciones Graves por Bacterias Productoras de BLEE % (No/total) de pacientes quienes: MIC (µg/ml)

8 4 2 1 Total

Experimentan falla Tto con Cefalosporina

100 67 33 27

(6/6) (2/3) (1/3) (3/11)

Muerte en los 14 dias de bacteremia

33 0 0 18

(2/6) (0/3) (0/3) (2/11)

54 (15/28)

(NCCLS breakpoint S =

8 g/ml)

Paterson et al. J Clin Microbiol 2001;39:2206 –2212

Métodos de Detección de BLEE Rol del laboratorio de Microbiología “Cada laboratorio deberia tener un Microbiólogo con el tiempo, el interés, y la experiencia para liderar en pruebas de resistencia a los antibióticos. Esta persona leería publicaciones relevantes, se relacionaria con otros laboratorios, y evaluaría pruebas potencialmente útiles para detectar nuevas formas de resistencia antes que las nuevas pruebas recomendadas por la CLSI sean disponibles” Ken Thomson, Emerging Infect. Dis., 2001

Método de Screening para BLEE Antibiótico

Disco difusión (mm)

MIC (μg/ml)

Cefpodoxima

(≤ 22) ≤ 17 (≤

≥ 4 (≥ 1)

Ceftazidima

≤ 22 (≤ (≤ 22 )

≥ 1 (≥ 1)

Aztreonam

≤ 27

≥1

Cefotaxima

≤ 27 (≤ (≤ 27)

≥ 1 (≥ 1)

Ceftriaxona

≤ 25

≥1

Screening para E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca y Proteus mirabilis. (

) zona zona de inhibición y MIC para el screening de BLEE en Proteus Proteus mirabilis mirabilis M100-S21 (2011)

Método de Screening para BLEE Antibiótico

Disco difusión (mm)

Cefpodoxima

≤ 17

Ceftazidima

≤ 22

Aztreonam

≤ 27

Cefotaxima

≤ 27

Ceftriaxona

≤ 25

M100-S21 (2011)

Método Confirmatorio de BLEE



E. Coli productora de BLEE y alto nivel de AmpC

Klebsiella pneumoniae productora de CTX-M-9 y CMY-2

E. cloacae con AmpC Cromosomal inducible y BLEE

E. cloacae mutante con AmpC Cromosomal desreprimida y BLEE

S. marcescens con AmpC Cromosomal y BLEE

Métodos de Detección de BLEE E. Coli CTX-M

Jarlier V. et al. Rev Infec Dis 1988; 10:867-878

Métodos de Detección de BLEE

Prueba de difusión del doble disco

Prueba de disco sobre disco o del reemplazo del disco


Vercauteren E. et al. J Clin Microbiol 1997 ;35:2191 –2197


Prueba Tridimensional Thomson K, Sander C. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36:1877-1882

Detección de BLEE en Proteus mirabilis •

Proteus mirabilis - prueba BLEE 2005

•

Búsqueda de rutina no es recomendado Realizar prueba BLEE cuando sea clínicamente relevante (bacteremia)

•

–

–

•

Consultar a un medico para determinar cuando probar. Un enfoque practico, probar aislamientos de sitios corporales estériles.

Usar prueba fenotípica confirmatoria estándar disco difusión o MIC sin modificación (CLSI)

P. mirabilis con BLEE

K. oxytoca con hiperproduccion -lactamasa K1

La SFM recomienda informar al clínico como cepa con sensibilidad intermedia de aquellos antibióticos que presenten sinergia, independientemente de la sensibilidad

K. oxytoca con hiperproduccion -lactamasa K1

E. coli with CTX-M ESBL

Detección de BLEE: Efecto Inoculo MICs (g/ml): Citrobacter freundii productora SHV-3 Inoculo

Cefotaxima

Ceftazidima

Aztreonam

Cefepime

2

1

0.5

0.5

CFU/ml 5 x 105

(CLSI breakpoint 2009 Sensible:

8 g/ml) KS Thomson and ES Moland, Creighton University

Detección de BLEE: Efecto Inoculo MICs (g/ml): Citrobacter freundii productora SHV-3 Inoculo

Cefotaxima

Ceftazidima

Aztreonam

Cefepime

5 x 105

2

1

0.5

0.5

5 x 107

256

32

32

>1024

CFU/ml

(CLSI breakpoint 2009 Sensible:

8 g/ml) KS Thomson and ES Moland, Creighton University

Detección de BLEE: E-test

CEFOTAXIMA CEFOTAXIMA + ACIDO CLAVULANICO

Detección de BLEE: ViteK ESBL cards

Advanced Expert System™

DETECCION DE BLEE: FEP: 1 μg/ml CTX: 0.5 μg/ml CAZ: 0.5 μg/ml

FEP/CA: 1/10 μg/ml CTX/CA: 0.5/4 μg/ml CAZ/CA: 0.5/4 μg/ml

AST-GN24

CARACTERISTICAS DE LOS PACIENTES EN LAS SALAS DE LA UCI NEONATAL

ANALISIS DE ISOELECTROENFOQUE

Se identificaron 7 cepas de K. pneumoniae y 3 cepas de E. cloacae .

PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO

CAZ

AZT

AMC CTX FOX

IMP

TRANSFERENCIA DE RESISTENCIA (CONJUGACION BACTERIANA)

ANALISIS DE PATRON DE BANDA PLASMIDICA

GENOTIPIA DE LOS AISLAMIENTOS K. pneumoniae y E. coli

Gerhard F. 2003 AAC. 47: 2385-2392

METODO CONFIRMATORIO CLSI

METODO DE JARLIER

Brote por Klebsiella pneumoniae Lisina Descarboxilasa Negativa productora de ß-Lactamasa de Espectro Extendido en una Unidad de Cuidados Intensivo Neonatal Nazario Silva, Javier Soto, Socorro Torres, Juan Carlos Riveros , Rosa Sacsaquispe, Víctor Suarez HONADOMANI San Bartolome , Instituto Nacional de Salud , Lima, Perú, 2007

XI CONGRESO PERUANO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y TROPICALES 2009

Muestras Clínicas Paciente

H.C.

Cod. Lab. Edad Servicio Fecha

Cultivo

Bacteria

Biotipo API

BLEE

Ayala Lorenzo RN.

616819

07D-2075

4 días

UCI

01/09/07

Sangre

K. pneumoniae

1215773

si

Ayala Lorenzo RN.

616819

07D-2086

6 días

UCI

03/09/07

Sangre

K. pneumoniae

1215773

si

Requena Saucedo RN. 618226 Jiménez Valverde RN. 618197

07D-2126

4 días

UCI

07/09/07

Sangre

K. pneumoniae

1215773

si

07D-2133

3 días

UCI

10/09/07

Sangre

K. pneumoniae

1215773

si

Alamo Sanchez RN.

617751

07D-2135

3 días

UCI

10/09/07

Sangre

K. pneumoniae

1215773

si

Requena Saucedo RN. 618226 Alamo Sanchez RN. 617751

07D-2157

11 días

UCI

11/09/07

Sangre

K. pneumoniae

1215773

si

07D-2156

6 días

UCI

11/09/07

Sangre

K. pneumoniae

1215773

si

Requena Saucedo RN. 618226

07C-1597

10 días

UCI

14/09/07

Cateter

K. pneumoniae

1215773

si

Estudio de Portadores (3/7) Paciente Lopez Sanches RN Alamo Sanchez RN. Llano Meneses RN.

H.C.

Cod. Lab. Edad Servicio Fecha

Bacteria

Biotipo API BLEE

618350

P-01

5 días

UCI

11/09/07 K. pneumoniae

1215773

si

617751

P-05

6 días

UCI


1215773

si

612990

P-07

10 dias

UCI


1215773

Estudio Ambiental (1/14) Muestra Leche Materna (Alamo Sanches RN)

Cod. Lab. Servicio Fecha M-12

UCI

Bacteria


Biotipo API BLEE 1215773

si

si

CARACTERÍSTICAS DE FALLECIDOS CON CULTIVO POSITIVO A KLEBSIELLA PNEUMONIAE UCIN HONADOMANI SB. SETIEMBRE 2007

PACIENTES Fecha de nacimiento Catéter Umbilical Ventilación Mecánica Peso al nacer Edad Gestacional Edad Materna CPN T' hosp materna (horas) Tipo de parto Infecc Materna RPM Fecha de Dx de Infección Fecha de Hemocultivo (KP) SDR, EMH Depresion Severa ASFIXIA

1 (AL)

2 (RS)

3 (JV)

4 (AS)

27/08/07 Si Si 840 34 Inadec PV 10 días 03/09/07 03/09/07 Si No

03/09/07 si si 1320 32 27 1 1 Cesárea no no 04/09/07 08/09/07 NO SI

05/09/07 si si 785 26 24 1 120 Cesárea no no 07/09/07 08/09/07 SI SI

05/09/07 si si 860 28 31 0 168 P.V no 7 días 07/09/07 10/09/07 Si si

N° Biotipo 3043 N° Biotipo 1215773

Klebsiella pneumoniae Productora de BLEE

Para comparar genéticamente las cepas se realizó la prueba molecular ERIC-PCR, la cual amplifica regiones repetitivas de enterobacterias mediante PCR. MP SB-A SB-B SB-C SB-D SB-E SB-F SB-G SB-H SB-I CS

MP: Marcador de peso molecular 1 Kb ladder Fermentas; SB-A: cepa K. pneumoniae 2126.: SB-B: cepa K. pneumoniae 2133; SB-C: cepa E. coli 196-07 (cepario del INS); SB-D: cepa K. pneumoniae 2135;S B-E: cepa K. pneumoniae 206-07 (cepario del INS); SB-F: cepa K. pneumoniae 2086;S B-G: cepa K. pneumoniae 1; SB-H: cepa K. pneumoniae 12; SB-I: cepa K. pneumoniae 223-07 (cepario del INS);

INFORME DEL INS: Los resultados moleculares muestra que las cepas de K. pneumoniae aisladas e identificadas por laboratorio de Microbiología del Hospital San Bartolomé están genéticamente relacionadas.

•

•

Campos F, Soto J, Torres S, Bazan C, Silva N. Klebsiella pneumoniae productora de -lactamasa de espectro extendido (BLEE) en una Unidad de Cuidado Intensivo Neonatal. Lima .Dic 2003 XXIII Congreso Peruano de Pediatría, Oct 12-15, Trujillo Perú 2003

•

Aranda M, J Campos F, Torres S, Soto J, Silva N .

•

Primer Brote de Escherichia coli productora de -lactamasa de espectro extendido (BLEE) en la Unidad de Cirugía Neonatal del Hospital San Bartolome. V Congreso Panamericano de Control de Infecciones y Epidemiología Hospitalaria; 2004 Oct 7-10, Lima, Peru. Rev Peru Enferm Infecc y Trop 2004; 3:34

DETECCIÓN FENOTÍPICA DE LOS MECANISMOS DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS BETALACTAMICOS EN E. coli CAUSANTE DE INFECCIONES URINARIAS EN EL HOSPITAL NACIONAL DOCENTE MADRE NIÑO SAN BARTOLOMÉ - 2011 Autor: Blgo. Oscar Jhian Gibran Rios Rios N° MUESTRAS

SCREENING(CLSI)

BLEE CONFIRMADOS(SFM)

389

76

60

ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO EN MUESTRAS DE HECES DE PACIENTES AMBULATORIOS EN EL HOSPITAL “SAN BARTOLOMÉ” - 2011. Autor: Blga. María del Carmen Molina Carpio Pacientes de la UCPTD n: 273 muestras de heces Medio utilizado: Agar karmali (cefoperazona) Prevalencia de bacterias productoras de BLEE: 28.9 %

ESPECIES

BLEE + BLEE -

TOTAL

65

11

76

K. pneumoniae

6

2

8

P. mirabilis

4

0

4

E. cloacae

2

2

4

P. vulgaris

1

0

1

S. sonnei

1

1

2

K. oxytoca

0

1

1

A. caviae

0

1

1

79

17

96

E. coli

TOTAL

Detección de BLEE en el Laboratorio de Microbiología

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