TUJUAN
1. Mahasiswa dapat mengoperasikan kromatografi HPLC dengan baik sesuai dengan SOP 2. Memahami cara kerja instrumen HPLC untuk analisis kuantitatif. 3. Dapat melakukan preparasi dengan tepat dan akurat, serta dapat mengikuti manual pengoperasian HPLC. DASAR TEORI
Kromatografi
Cair
Berperforma
Tinggi (high
performance
liquid
chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik t eknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya
untuk
memisahkan molekul memisahkan molekul berdasarkan berdasarkan
perbedaan afinitasnya perbedaan afinitasnya terhadap
zat padat zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa. HPLC adalah alat untuk mengalisa kandungan bahan kimia, baik secara kualitatif maupun secara secar a kuantitatif. HPLC sendiri singkatan dari High Performance Per formance Liquid Chromatography. Mulanya HPLC digunakan untuk mengidentifikasi kandungan antibiotik pada susu dan daging udang, terutama kroramfenikol. Tetapi HPLC kini digunakan pula untuk kegiatan perikanan lainnya. Kromatografi cair HPLC) Metode
kinerja
pemisahannya
tinggi
(High
didasarkan
Performance
pada
perbedaan
Liquid
Chromatography,
keseimbangan
distribusi
komponen sampel antara dua fasa: diam (kolom) dan gerak (sistem pelarut yang mengalir). Tekanan tinggi diperoleh dari pompa, meningkatkan mobilitas eluant. Tipe-tipenya adalah absorpsi, partisi, pertukaran ion dan permeasi gel. Deteksi yang digunakan al. spektrofotometr ik ik (absorpsi sinar UV atau “tampak”, fluorometri, penggunaan senyawa pendar/fluoresen, senyawa elektrokhemis yang dapat teroksidasi atau tereduksi)
Prinsip kerja HPLC
Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya, solute-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.
Kromatografi HPLC ini digunakan untuk mengidentifikasi
suatu sampel secara
kualitatif dan dihitung berapa konsentrasi dari masing-masing komponen tersebut secara kuantitatif.
Penentuan Kualitatif HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar.
Penentuan Kuantitatif Beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah:
1. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel 2. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama 3. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. 4. Berdasarkan area kromatogram 5. Berdasarkan tinggi puncak kromatogram Umumnya hasil analisis HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Instrumen alat
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :
a. Fasa gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Selain berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan.
Persyaratan fasa gerak HPLC: 1. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. 2. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi. 3. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. 4. Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar, dan tidak beracun. 5. Zat air tidak kental. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0,5 cP (centi Poise). 6. Sesuai dengan detector. Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak: a) HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak non-polar. Fasa diam yang digunakan seperti silica, alumina, atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana atau i-propileter. b) HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam non-polar dan fasa gerak polar. Fasa gerak yang digunakan seperti air, methanol, atau asetinitri l. Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k‟ pada rentang yang sesuai. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen, sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k‟ antara 2-5. b. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC: 1. Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in 2) 2. Keluaran bebas pulsa 3. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 ml/menit 4. Bahan tahan korosi Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC: a) Pompa reciprocating Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.
b) Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. c) Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
c. Injector Sample Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal. Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom) kromatografi adalah penyuntik loop. Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi bila tidak diisi penuh akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan ketergantungan presisi tersebut kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik. Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle) penyuntik diputar dari posisi load (“pengisap”) ke posisi inject (“suntik”). Karena sampel akan mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik
harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus diputar cepat agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan posisi penyuntikan (inject) berlangsung cepat. Yang menjadi faktor ketidak tepatan pengukuran HPLC salah satunya terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan memasukan cuplikan kedalam kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karen itu cuplikan yang dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut :
1. Injeksi syringe Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek. 2. Injeksi „stop-flow‟ Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. 3. Kran cuplikan Jenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: a) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”, cupli kan masih berada dalam loop b) Kran diputar untuk mengubah posisi “load” menjadi posisi “injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom. d. Kolom dan Fase diam Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni: a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).
b) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagenreagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan alkilklorosilana (reaksi silanisasi) : CH
Si
OH
+
Cl
CH3
3
Si
R
Si
O
CH3
Si
CH
R
+ HCl
3
Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan.
e. Detektor
Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka terhadap golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor yang peka terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara detektor yang digunakan dalam KCKT adalah a)
Detektor Universal Detektor Ultra Violet – Visible (Sinar Tampak)
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik. Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang diukur. Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang di analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm, dan ada yang panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan antara 190-600 nm. Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang dilengkapi alat untuk memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan drode erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat melakukan pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang.
Detektor Indeks Bias Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun, termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat tidak merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10 -6 g) dan umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam kromatografi eklusi dan dalam analisis karbohidrat. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :
Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga homogen dan bebaskan dari gas terlarutnya.
Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan sampai detektor stabil.
Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka tempatkanlah detektor indeks bias pada urutan terakhir.
Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam (inner diameter) yang besar tapi pendek.
Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tet ap.
Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.
Sel pembanding harus diisi dengan pelarut yang telah dilewatkan melalui kolom,
Detektor Spektrometer Massa
Detektor Spektrometer Inframerah
b) Detektor Selektif
Detektor Fluoresensi Didasarkan kepada prinsip bahwa molekul-molekul tertentu dapat menyerap energi
pada panjang gelombang yang lebih pendek membentuk suatu keadaan tereksitasi dan kemudian secara hampi bersamaan turun kembali ke keadaan dasar (ground state) dengan memancarkan energi pada panjang gelombang yang lebih panjang.
Detektor Konduktivitas Listrik Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik (konduktometri) dan
polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya digunakan untuk mendeteksi solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks baik senyawa organik maupun anorganik. Adapun persyaratan detektor yaitu: cukup sensitif, stabilitas, dan keterulangan tinggi, tidak erusak cuplikan, respon linier terhadap solut, reliabilitas tinggi dan mudah digunakan. Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut : 1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibel 2. Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar sangat
kecil 3. Stabil dalam pengoperasiannya 4. Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita 5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi s olut pada kisaran yang luas 6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fasa gerak
f.
Rekorder Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa kumpulan
puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen. Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi (r t) analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak dengan metode standar kalibrasi.
