Cuantificación de proteínas

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Laboratorio de Investigación Formativa III

PRACTICA 5

CUANTIFICACIÓN CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD

PROFESORA: Biol Re!nalda Roldan P "B#C I$

%r&'o ()5*

E+,IPO ( #art-ne. /ern0nde. Carolina Pe1a Fabi0n Cla&dia Rodr-g&e. Rodr-g&e. /a!leen S0nc2e. Ló'e. Ed&ardo Ignacio S0nc2e. S0nc2e. Lorena L orena 3anessa

CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR EL MÉTODO DE BRADFORD INTRODUCCIÓN 

Las 'rote-nas son 'ol-meros de &nidades conocidas como amino0cidos Son macromol4c&las de elevado 'eso molec&lar 6ormadas 'or cadenas lineales donde los amino0cidos est0n &nidos 'or enlaces 'e't-dicos tales enlaces se 'resentan entre &n gr&'o amino del carbono al6a de &n amino0cido ! el gr&'o carbo7ilo del carbono al6a de otro amino0cido Los amino0cidos est0n 6ormados 'or &n carbono asim4trico al c&al est0n &nidos de manera covalente &n gr&'o amino &n gr&'o carbo7ilo &n 2idrógeno ! el gr&'o R el c&al es &na cadena lateral de longit&d variable c&!as 'ro'iedades 8&-micas son variables E7isten (9 amino0cidos con6ormaciones: •

•

•

•

'rinci'ales

los

c&ales

'odemos

encontrar

en

di6erentes

Primaria: Cadena de m0s de 59 amino0cidos &nidos 'or enlaces de ti'o 'e't-dico se denominan 'oli'4'tidos Sec&ndaria: Plegamiento de la cadena 'oli'e't-dica gracias a la 6ormación de '&entes de 2idrógeno entre los 0tomos 8&e 6orman el enlace 'e't-dico 6ormando &na cadena en es'iral Terciaria: de'ende del ordenamiento tridimensional de toda la sec&encia lineal &nto con las con6ormaciones sec&ndarias Los 'legamientos se ven 6avorecidos 'or  interacciones de a6inidad entre las regiones 'olares 'or &n lado ! de las no 'olares 'or  otro la estr&ct&ra se estabili.a 'or enlaces covalentes C&aternaria: ,nión de 'rote-nas "cadenas 'oli'e't-dicas$ a trav4s de interacciones mediadas 'or gr&'os 'rost4ticos &niones de a6inidad ! '&entes de dis&l6&ro

Clasi6icación ; ; ;


F&nción Las 'rote-nas desarrollan &n sin6-n de acciones ! actividades dentro de n&estro organismo S&s 6&nciones 'rinci'ales son: estr&ct&rales trans'orte catal-ticas com&nicación intracel&lar  ! e7tracel&lar contracción ! movimiento coag&lación sang&-nea 'rotección inm&nológica reserva energ4tica entre otras

FUNDAMENTO 

El m4todo de c&anti6icación de 'rote-nas invol&cra las 'ro'iedades colorim4tricas ! de absorción de las 'rote-nas ! '&esto 8&e la reacción de Brad6ord no 'rod&ce inter6erencia con com'&estos no 'roteicos inmisc&idos en el 'lasma de est&dio Por lo 8&e la absorbancia a 5>5nm Es directamente relacionada con la concentración 'roteica del 'lasma est&diado

#4todo de Brad6ord: invol&cra la &nión del colorante a.&l brillante de Coomassie %;(59 a las 'rote-nas El colorante 'resenta tres estados de carga el4ctrica con di6erente es'ectro de absorción de la l&. C&ando este colorante es dis&elto en &na sol&ción 0cida el colorante se enc&entra libre "sin &nirse a la 'rote-na$ en 6orma de catión ! es de color roi.o con &na m07ima absorción a ?@5nm Sin embargo c&ando es dis&elto en &na sol&ción ne&tra el colorante se enc&entra en &n estado ne&tro ! libre e7'resando &na coloración verde C&ando el a.&l de Coomassie se enc&entra &nido a &na 'rote-na cambia a &n estado anionico desarrollando &n color a.&l con &na m07ima absorción a 5>5nm La &nión en &n 'roceso r0'ido "a'ro7 ( min&tos$ ! el com'leo colorante;'rote-na se mantiene estable 2asta &na 2ora des'&4s de 'rod&cido OBJETIVO 

C&anti6icar la cantidad de 'rote-na total de &na m&estra de 'lasma 2&mano

Material y E!i"#$ ; ; ; ; ; ;

( 'i'etas de cinco ml ) 'i'eta de * ml ** t&bos de ensa!e * vaso de *99 ml * gradilla * es'ectro6otómetro

Rea%ti&#' ; ; ;

aCl 9 mg Alb&mina ( mg Reactivo de Brad6ord *5 ml

Material (i#l)*i%# ;

5ml de 'lasma 2&mano PROCEDIMIENTO 

Sol&ción salina: Pesar ?) mg
Eti8&etar @ t&bos de ensa!e n&m4ricamente ! &n s4'timo con la eti8&eta de blanco "servir0 'ara calibrar el es'ectro6otómetro$ Reali.ar &na dil&sión seriada:

 Agregar ?5 ml de sol&ción salina &nto con 5 ml de sol&ción 'atrón ! me.clar bien ! colocarlos en el 'rimer t&vo E7traer (5 ml de la sol&ción obtenida ! agregarlos en el seg&ndo t&bo &nto con (5 ml de sol&ción salina Re'etir la o'eración 2asta llegar al t&bo n=mero @

Prea'aracin de la m&estra: tomar &n t&bo de ensa!e lim'io ! agregar 5 ml de 'lasma 2&mano ! ?5 ml de sol&ción salina 5 nm Leer la absorbancia de la c&rva 'atrón ! de las m&estras

RESULTADOS 


G de Absorbancia

Blanco

999

*

99@>

(

99@)

)

99)@

?

99)9

5

99(9

@

999>

Res<ados de sol&ciones 'roblema

E8&i'o

#&estra *

#&estra (

*

99>@

99?

(

9*9H

995

)

9*@(

9*H9

?

9*9@

9*)@

5

99>@

999

 ANALISIS DE RESULTADOS  0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03

Absorbancia

0.02 0.01 0

Curva Patrón

Concentración

CONCLUSIONES 


BIBLIOGRAFÍA

 Alberts B A o2nson  LeJis # Ra66 K Roberts ! P alter (99? Biolog-a molec&lar de la -  cel&la )M Edición Omega Es'a1a ;