Uji Silang Serasi ( Crossmatch ) Dr JUNAEDI WIBAWA MSi Med SpPK
Uji Silang Serasi Merupakan suatu seri pemeriksaan yang dilakukan pretransfusi untuk menjamin kecocokan darah yang akan ditransfusikan bagi resipien dan mendeteksi kemungkinan adanya Ab yang tidak diharapkan dalam serum resipien yang dapat mengurangi umur hidup atau menghancurkan eritrosit donor
Tujuan 1.Mencegah terjadinya reaksi transfusi 2.Memberi keyakinan akan manfaat transfusi yang maksimal untuk penderita ( Menaikkan kesempatan hidup sel darah donor dalam tubuh pasien )
Macam Uji Silang Serasi 1.Mayor Crossmatch -Sel darah donor dicampur dicampur dengan serum resipien -Bila dalam serum resipien terdapat Ab terhadap sel donor maka terjadi destruksi sel donor 2.Minor Crossmatch -Serum donor dicampur dicampur dengan sel darah resipien -Bila dalam serum donor terdapat Ab terhadap sel resipien, maka terjadi destruksi sel resipien
APLIKASI KLINIS UJI SILANG SERASI • Mendeteksi ada tidaknya antibodi , baik antibodi komplet (IgM) maupun antibodi inkomplet (IgG) yang terdapat dalam serum / plasma pasien maupun dalam plasma donor yang mempunyai arti klinis yang dapat menyebabkan kerusakan sel darah merah • Memastikan bahwa transfusi darah yang diberikan sesuai /kompatibel dan tidak menimbulkan reaksi apapun pada pasien serta sel-sel darah dapat mencapai masa hidup maksimum setelah diberikan • Cek akhir uji kecocokan golongan darah ABO
Catatan -Tes ini tidak akan menemukan kesalahan pada Rh typing Misalnya : Jika darah donor Rh + tapi salah diperiksa sebagai Rh – Rh – maka bila diadakan Crossmatch dengan darah resipien yang Rh – Rh – akan akan menghasilkan tes yang cocok (compatible), kecuali bila dalam serum resipien terdapat anti-Rh -Sedangkan penggolongan ABO yang salah dari penderita atau donor biasanya akan menghasilk menghasilkan an crossmatch yang tidak cocok (incompatible (incompatible))
METODE
-KONVENSIONAL ( Tube Test ) -Gel Test
PRINSIP DASAR UJI SILANG SERASI • REAKSI ANTIGEN ANTIBODI • DILAKUKAN DALAM FASE DAN MEDIUM BERBEDA . MENGAPA ?
MENGAPA DILAKUKAN PADA FASE /MEDIUM YANG BERBEDA? • Reaksi antigen antibodi yang dilakukan pada fase dan medium yang berbeda karena jenis2 antibodi golongan darah mempunyai karakter yang berbeda • Antibodi seperti anti M,N,P, Lua ,Lub bereaksi baik dalam medium saline di suhu kamar, tapi kurang baik reaksinya dalam medium albumin • Antibodi sistim Rhesus bereaksi baik dalam medium albumin tetapi tidak dalam medium saline( kecuali anti E) • Anti Kell, Duffy, Kidd baru tampak reaksinya dengan antiglobulin
Fase Suhu Kamar (20 – (20 – 25 25 °C )
TAB I Albumin
Tab II Saline
A1 M P1 I-H Lea D-E-e
A1 M P1 I-H Lea
Fase Inkubasi ( 37 °C) Fase Antiglobulin
HUBUNGAN ANTARA SUHU & MEDIUM UNTUK DETEKSI ANTIBODI SPESIFIK PADA TES COMPATIBILITA COMPATIBILITAS S
D-E-c Lea-Leb
E Lea
D-E-c K Fya Jka S Lea-Leb
D-E-c K Fya Jka S Lea-Leb
SEBELUM MELAKUKAN UJI SILANG SERASI Lakukan tes validasi reagensia / alat: • Anti serum A • Anti Serum B • Anti D • Coomb‟s serum • Bovine Albumin 22 %
Uji Silang Serasi • Harus dilakukan 3 fase, mayor, minor dan auto • Untuk permintaan lebih dari satu kantong, tidak boleh dilakukan metoda pooling, baik pada uji cocok serasi mayor maupun minor. • Ada instruksi kerja / SOP SOP , lembar kerja/lembar pemeriksaan • Hasil terdokumentasi dengan baik
BAHAN PEMERIKSAAN • CONTOH DARAH PASIEN : darah tanpa anti koagulan / darah dengan antikoagulan yang berumur kurang dari 48 jam • CONTOH DARAH DONOR : darah dalam antikoagulan yang diambil dari slang kantong darah • REAGENSIA : Saline / NaCl 0,9 % Bovine Albumin 22 % Coomb‟s serum Coomb‟s serum Coombs Control Cell ( CCC)
PERALATAN • Tabung gelas ukuran 12 X 75 mm • Inkubator ( waterbath ) 37ºC • Serofuge • Objekglass • Mikroskop
BOVINE ALBUMIN 22 % • menurunkan zeta potensial • menyebabkan sel yang coated antibodi berdekatan satu sama lain
dengan
(BOVINE ALBUMIN 22 %
MENURUNKAN ZETAPOTENSIAL )
ZETA POTENSIAL
PERSIAPAN UJI SILANG SERASI • SERUM RESIPIEN : jernih bebas dari SDM • SUSPENSI S.D.M. RESIPIEN SALINE , setelah sel dicuci
3-5% DALAM
• PLASMA DONOR yang jernih bebas dari sel2 darah • SUSPENSI S.D.M. DONOR SALINE , setelah sel dicuci
3-5%
DALAM
TEKNIK UJI SILANG SERASI FASE I ( FASE SUHU KAMAR ) 1 tts sel donor susp 5 %
1 tts sel pasien susp 5 %
2 tts serum pasien 2 tts plasma donor
I ( MAYOR ) TABUNG I & II
II ( MINOR )
2 tts serum pasien
III AC
KOCOK-KOCOK CENTRIFUGASI 3000 rpm/15” atau 1000 rpm/ 1 menit BACA REAKSI ---Hemolisis / agglutinasi . Bila tidak t idak ada reaksi--lanjut fase II
TEKNIK UJI SILANG SERASI FASE II ( FASE INKUBASI 37 º C) 2 TTS BOVINE ALB 22 %
I (MA (MAYOR) YOR)
II (MINOR (MINOR))
III AC
KOCOK-KOCOK INKUBASI 37 ° C SELAMA 15 MENIT CENTRIFUGASI 3000 rpm / 15” atau 1000 rpm / 1 menit BACA REAKSI ------Bila tidak ada reaksi ----lanjut ----lanjut fase III
TEKNIK UJI SILANG SERASI FASE III ( FASE ANTIGLOBULIN )
TABUNG I& II CUCI DENGAN SALINE 3 X 2 TTS COOMB’S SERUM
I (MA (MAYOR) YOR)
II (MINOR (MINOR))
III AC
KOCOK KOCOK CENTRIFUGASI 3000 rpm/15 “ atau 1000 rpm/ 1 menit Bila tidak tidak ada reaksi , hasil kompatibel
• Tambahkan 1 tetes CCC 1 tetes CCC
I ( MAYOR )
II (MINOR)
III AC
Putar 3000 rpm15 ‘’ Baca bila aglutinasi pemeriksaan benar
TUJUAN PENAMBAHAN ANTIHUMAN GLOBULIN ( COOMB‟S SERUM ) • • •
1/3 dari semua antibodi yang dapat menyebabkan reaksi transfusi hanya dapat dideteksi dengan teknik antiglobulin Reagen harus mampu bereaksi dgn antibodi/ komplemen yang diikat ag-ab tertentu Contoh reaksi:
Agglutinasi ( CM POSITIP)
AGLUTINASII AGLUTINAS
IgG
ANTI HUMAN GLOBULIN
AGLUTINASI COMPLEMENT
ANTI HUMAN GLOBULIN
COOMB‟S CONTROL CELLS ( CCC) • Sel eritrosit normal yang dibuat coated oleh suatu antibodi inkomplet • CCC umumnya dibuat dari sel normal golongan O Rh positip, dengan anti D inkomplet.
TUJUAN PENAMBAHAN CCC • Untuk mengontrol Coomb‟s Coomb‟s serum apakah reagen Coomb‟s Coomb‟s serum masih baik /layak digunakan • Menguji semua hasil pemeriksaan yang negatip, apakah hasil valid/ invalid
CCC
CCC
CCC
CARA MEMBUAT CCC Bahan ; • Sel O Rhesus positip • Anti D modified ( IgG) yang sudah diketahui diketahui titernya • Saline 0,9 %
CARA MEMBUAT CCC Mengukur titer anti D slide test • Siapkan suspensi sel O Rh pos 5 % dalam saline sesudah dicuci 3X • Sediakan 10 tabung untuk pengenceran anti D • Isi masing2 tabung dengan 2 tetes saline • Isi 2 tetes anti D kedalam tabung ke 1 yang sudah berisi saline, selanjutnya buat enceran berganda kedalam tabung2 berikutnya sampai tabung ke 10 • Teteskan suspensi sel O Rh pos 5% kedalam semua tabung yang sudah berisi masing2 2 tetes enceran anti -D
lanjutan • Kocok2 semua tabung dan inkubasi 37 ºC / 30 menit • Putar semua tabung 3000 rpm/ 15 “, “, baca baca dan catat reaksinya. • Pada semua tabung yang belum tampak reaksi aglutinasi , selnya dicuci dengan saline (3X) • Tambahkan 2 tetes Coomb‟s Coomb‟s serum kepada sediment sel yang sudah dicuci • Kocok2 dan centrifugasi 3000 rpm / 15 “ • Baca reaksinya
37ºC/30 „
Coomb’s Test
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2
4
8
16
32
64
128
256
512
1
2
2+ +
3
4
5
6
7
(+)
-
-
-
-
8 -
4+ 3+ 2+ 2+ +
1 1024
9 -
10 -
(+) -
Titer Anti-D incomplet = 512 Enceran Anti –D modified yang bereaksi sensitasi ( Coated ) dan memberikan hasil Coomb’s Coomb’s test 2+ pada enceran 128 X
lanjutan • Dari Dari per perco coba baan an dia diata tas s has hasilil 2+ Coo Coomb mb‟s ‟s Test jatuh pada enceran 128X • Untuk membuat CCC dimodifikasi : Sel susp 5 % : enceran 128 X Sel susp 10%:
64X
Sel susp 20% :
32X
Sel susp 40% :
16X
• Selanjutnya :
CONTOH 1.Buatlah suspensi sel O Rhesus positip yang sudah dicuci 3 X, 40 % dalam saline 2.Ambil 1 tetes anti-D, encerkan dengan saline 15 tetes (volume menjadi 16 tetes ) 3.Tambahkan suspensi sel O Rh positip 40 % sebanyak 8 tetes 4.Inkubasi 37 º C selama 30 menit (coated) 5.Putar , kemudian supernatan dibuang 6.Cuci selnya dengan saline ( 3X) 7.Endapan sel jadikan suspensi 5% ( 40%5% , akan diperoleh 64 tetes CCC 5 % )
1 tetes anti-D diencerkan saline 15 tts ( 16 tetes) Suspensi sel O 40% 8 tetes
Buang Supernatant
Inkubasi 37ºC 30 ‘ Putar
Cuci sel dg Saline 3X
Buat Suspensi 5%
Endapan sel
Suspensi sel 5% ( 64 tts)
INTERPRETASI HASIL UJI SILANG SERASI • Bila Mayor dan Minor fase 1 sampai sampai fase 3 tidak tidak menunjukkan reaksi aglutinasi dan atau hemolisis , hasil diinterpretasikan kompatibel (cocok) darah dapat keluar • Bila Mayor dan Minor fase 1 sampai fase 3 menunjukkan adanya reaksi aglutinasi dan atau hemolisis , hasil diinterpretasikan inkompatibel (tidak cocok) darah tidak dapat keluar
REAKSI TRANSFUSI
TAB I Albumin
Fase Suhu Kamar (20 – (20 – 25 25 °C ) Fase Inkubasi ( 37 °C) Fase Antiglobulin
A1 M P1 I-H Lea D-E-e
D-E-c Lea-Leb
D-E-c K Fya Jka S Lea-Leb
Tab II Saline
A1 M P1 I-H Lea
E Lea
D-E-c K Fya Jka S Lea-Leb
ANTIBODI PADA PADA FASE UJI SILANG SERASI FASE I : Fase suhu kamar dengan medium saline • Fase ini dapat mendeteksi : 1. Antibodi yang komplet ( IgM / Cold antibodi ) misalnya terdapat pada ketidak cocokan pada penetapan golongan darah ABO 2. Adanya Alloantibodi (antibodi komplet )seperti : anti M, anti Lewis, anti N, anti P1, anti A1 3. Adanya auto antibodi : anti-H, anti-I
• FASE II : Fase inkubasi 37ºC didalam medium Bovine Albumin • Fase ini dapat mendeteksi : beberapa antibodi sistim Rhesus seperti : anti D, anti E, anti c a b a antibodi inkomplet lain :anti- K, Fy , Fy ,Jk , S, Lea, Leb Mengapa 37ºC ? Memberi kesempatan kepada antibodi untuk coated pada sel
• FASE III : Fase antiglobulin . • Pada fase ini akan terdeteksi aglutinasi antibodi inkomplet : anti D, anti E, anti C, anti Duffy, anti Kell, anti Kidd, anti S dll.
YANG PERLU DIPERHATIKAN • Suhu inkubasi 37 º C • Lama inkubasi minimal 15 menit, jika waktu dikurangi maka antibodi inkomplet tidak akan coated dengan sempurna sehingga akan lepas pada waktu pencucian • Cara pencucian sel untuk menghilangkan sisa globulin yang bebas harus sempurna. Karena sisa glubulin yang tertinggal akan dapat menetralisir anti globulin serum ( Coomb‟s serum )
CONTOH AHG YANG MENETRALISIR ANTIBODI BEBAS BEBAS
NEGATIP PALSU
AGAR REAKSI SILANG TIDAK MEMBERIKAN HASIL NEGATIP PALSU • Saline harus bersih, jernih, tidak berwarna, tidak terkontaminasii serum terkontaminas • Suhu inkubator harus tepat • Lama inkubasi harus tepat • Pencucia Pencucian n sel darah merah harus bersih • Hasil negatip harus dikontrol dengan menggunakan CCC
CROSSMATCHING DENGAN METODE GEL
METODA GEL Ditemukan
oleh Dr Yves Lapierre dari Perancis
tahun 1985 3 tahun R+D di DiaMed, Switzerland Pertama kali digunakan untuk pemeriksaan rutin pada tahun 1988 di Eropa Sederhana, mudah dan cepat Hasil reaksi stabil dapat disimpan / foto copy “No “No--washing step” Sampel yang diperlukan sedikit Pembacaan reaksi makroskopis Mengurangi limbah
MATERIAL • ID Dispensor • Autopipette 10, 25, 50 ul •
Pipette tips
•
Test tubes
•
Working table
•
Incubator 37ºC
•
ID-centrifuge
•
Pen marker
Reagents •
LISS/Coombs card
•
ID Diluent 2 (modified LISS)
Prinsip Teknologi Gel Test Material
gel dengan “Sephadex”
Aglutinasi
yang berukuran besar besar akan berada pada permukaan gel
Aglutinasi
yang lebih kecil kecil ukurannya dapat lewat pori-pori gel, tergantung ukurannya
Sel
yang tidak beraglutinasi akan langsung mengendap di dasar
PRINSIP GEL TEST
PEMBUATAN SUSPENSI SEL 1%
Ambil ID Diluent 2 : 1 ml
Pipet 10 ul sel donor (PRC) kedalam tabung yang berisi 1 ml ID Diluent 2
Campur sel donor 1% dan ambil 50 ul masukkan kedalam microtube
50 μl suspensi sel 1%
25 μl serum/plasma
TEKNIK PEMIPETAN GEL TEST
Inkubasi 37ºC 15 menit
Sentrifus selama 10 menit
HASIL REAKSI METODA GEL
A 4+ B 3+ C 2+ D 1+ E Negatip
KEGUNAAN GEL TEST Penetapan
golongan darah ABO/Rh
Penetapan
golongan darah lain
Skrining
dan identifikasi antibodi
Crossmatching. Partial
D
