Cooper para Tótós

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Biologia Molecular da Célula – Cooper, 4th Edition

Cooper para Totós A ideia de fazer esta sebenta partiu da necessidade de estudar para a 2º fase do exame de BMC. A meros 5 dias antes do exame da 2ª fase, e com pouco tempo para estudar, resolvi arriscar, e pedi ajuda. Alguns colegas meus ajudaram e estou grato, por hoje, na véspera do exame, termos reunido todo o material. Sem eles este projecto não teria sido possível num tão curto espaço de tempo. Fica aqui o agradecimento pela excelente e rigorosa colaboração dos meus colegas: Maria Maia (Capítulo 7), que mesmo sem necessitar de estudar, uma vez que não iria repetir o exame, resolveu ajudar. O mesmo se passou com o Miguel Guia (Capítulos 12 e 17), que se voluntariou de seguida para ajudar, sem pretender estudar. Quanto ao Ricardo Vale de Andrade (Capítulos 10 e 16), ao Marcos Mesquita (Capítulo 11), e à Sónia Cavaco (Capítulo 13), deixo aqui os agradecimentos sinceros pela colaboração. Espero que esta sebenta vos ajude, e se no futuro desejarem melhorá-lha, contactem-me por favor: [email protected]

Frederico Crisóstomo Barreto 1 de Março de 2009

Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Índice Capítulo 1 – Visão geral sobre as células ................................................................................. 10 Origem e evolução das células ............................................................................................ 10 A primeira célula ............................................................................................................. 10 Evolução do Metabolismo ............................................................................................... 11 Procariótas Actuais.......................................................................................................... 11 Eucariótas Actuais ........................................................................................................... 12 A origem dos eucariótas .................................................................................................. 12 Desenvolvimento de Organismos Multicelulares ............................................................. 12 Células como modelos experimentais ................................................................................. 13 E.coli ............................................................................................................................... 13 Leveduras........................................................................................................................ 13 Caenorhabditis elegans ................................................................................................... 13 Drosophila melanogaster ................................................................................................ 13 Vertebrados .................................................................................................................... 14 Capítulo 2 – Composição das células ....................................................................................... 15 As moléculas das células ..................................................................................................... 15 Glícidos ........................................................................................................................... 15 Lípidos ............................................................................................................................ 15 Ácidos Nucleicos ............................................................................................................. 15 Proteínas......................................................................................................................... 18 Membranas celulares .......................................................................................................... 18 Lípidos Membranares...................................................................................................... 18 Proteínas membranares .................................................................................................. 19 Transporte através de membranas celulares ................................................................... 19 Proteomics: Análise de Proteínas celulares a larga-escala.................................................... 19 Identificação de proteínas celulares ................................................................................ 20 Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Análise global da localização proteica .............................................................................. 20 Interacções proteicas ...................................................................................................... 20 Capítulo 4 – Fundamentos da Biologia Molecular .................................................................... 21 Hereditariedade, Genes e DNA ............................................................................................ 21 Genes e Cromossomas .................................................................................................... 21 Genes e Enzimas ............................................................................................................. 21 Identificação de DNA como o Material Genético ............................................................. 21 Estrutura do DNA ............................................................................................................ 22 Replicação do DNA .......................................................................................................... 23 Expressão da Informação Genética...................................................................................... 25 Colinearidade de Genes e Proteínas ................................................................................ 25 O papel do mRNA ............................................................................................................ 25 DNA recombinante.............................................................................................................. 27 Enzimas de restrição ....................................................................................................... 27 Formação de moléculas de DNA recombinante ............................................................... 28 Vectores de DNA recombinante ...................................................................................... 30 Sequenciação de DNA ..................................................................................................... 31 Expressão de genes clonados .......................................................................................... 33 Detecção de Ácidos Nucleicos e Proteínas ........................................................................... 34 Amplificação de DNA por PCR.......................................................................................... 34 Hibridação de ácidos nucleicos ........................................................................................ 34 Anticorpos como sondas para proteínas .......................................................................... 37 Função de Genes em Eucariótas .......................................................................................... 39 Transferência Genética em Plantas e Animais.................................................................. 39 Mutagénese de DNAs clonados ....................................................................................... 44 Introdução de Mutações em genes celulares ................................................................... 44 Interferindo com a Expressão Genética Celular................................................................ 44


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Capítulo 5 – Organização e Sequências dos Genomas Celulares .............................................. 45 A Complexidade dos Genomas Eucariotas ........................................................................... 45 Intrões e Exões ................................................................................................................ 45 Sequências de DNA Repetitivas ....................................................................................... 46 Duplicação de Genes e Pseudogenes ............................................................................... 47 Composição dos Genomas de Eucariótas ......................................................................... 47 Cromossomas e Cromatina.................................................................................................. 48 Cromatina ....................................................................................................................... 48 Centrómeros ................................................................................................................... 50 Telómeros ....................................................................................................................... 50 Sequências de Genoma Completos ..................................................................................... 51 O Genoma Humano - Experiência .................................................................................... 51 Capítulo 6 – Replicação, Manutenção, e Rearranjos no DNA Genómico ................................... 53 Replicação do DNA .............................................................................................................. 53 DNA polimerases............................................................................................................. 53 Forquilha de Replicação .................................................................................................. 54 Fidelidade da Replicação ................................................................................................. 58 Origens e Iniciação da Replicação .................................................................................... 60 Telómeros e Telomerase: Manutenção das extremidades de cromossomas .................... 60 Reparação de DNA .............................................................................................................. 63 Reversão directa de danos a DNA .................................................................................... 64 Reparação por excisão .................................................................................................... 64 Síntese de DNA translesão............................................................................................... 64 Reparação Recombinacional ........................................................................................... 64 Recombinação entre Sequências Homólogas de DNA .......................................................... 64 Modelos de Recombinação Homóloga............................................................................. 64 Enzimas Envolvidas na Recombinação Homóloga ............................................................ 64


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Rearranjos de DNA .............................................................................................................. 64 Recombinação Site-Specific ............................................................................................. 65 Transposição através de Intermediários de DNA.............................................................. 65 Transposição através de Intermediários de RNA .............................................................. 66 Amplificação Génica ........................................................................................................ 67 Capítulo 7 - Processamento e Síntese de RNA ......................................................................... 68 Transcrição em procariotas ................................................................................................. 68 RNA polimerase e Transcrição ......................................................................................... 68 Repressores e controlo negativo da transcrição ............................................................... 71 Controlo positivo da transcrição ...................................................................................... 72 RNA polimerases eucariótas e Factores de transcrição ........................................................ 72 RNA polimerases eucariotas ............................................................................................ 72 Factores de transcrição e Início da transcrição pela RNA polimerase II............................. 73 Transcrição pela RNA polimerase I e III ............................................................................ 73 Regulação da transcrição em Eucariotas .............................................................................. 73 Sequências Cis-acting reguladoras: Promotores e Enhancers ........................................... 73 Estrutura e funcionamento de Activadores da Transcrição .............................................. 75 Repressores eucariótas ................................................................................................... 75 Relação da estrutura da cromatina com a transcrição...................................................... 76 Regulação da transcrição por RNAs não codificantes ....................................................... 78 Metilação do DNA ........................................................................................................... 78 Processamento de RNA e turnover ...................................................................................... 79 Processamento de mRNA em Eucariótas ......................................................................... 79 Mecanismos de Splicing .................................................................................................. 80 Splicing Alternativo (Alternative splicing)......................................................................... 82 Edição de RNA ................................................................................................................. 82 Degradação de RNA ........................................................................................................ 83


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Capítulo 8 – Síntese, processamento e regulação proteica ...................................................... 84 Tradução do mRNA ............................................................................................................. 84 RNAs de transferência ..................................................................................................... 84 O Ribossoma ................................................................................................................... 85 Organização do mRNA e início da tradução ..................................................................... 85 Processo de Tradução ..................................................................................................... 86 Regulação da Tradução ................................................................................................... 87 Dobragem Proteica e Processamento .................................................................................. 88 Chaperonas e Dobragem Proteica ................................................................................... 89 Enzimas que catalisam a Dobragem Proteica ................................................................... 89 Clivagem Proteica............................................................................................................ 89 Glicolização ..................................................................................................................... 90 Ligação de Lípidos ........................................................................................................... 91 Capítulo 10 – Encaminhamento e transporte de proteínas ...................................................... 92 O retículo endoplasmático .................................................................................................. 92 O retículo endoplasmático e a secrecção de proteínas .................................................... 92 Encaminhamento de proteínas para o Retículo Endoplasmático ...................................... 92 Inserção de proteína na membrana do Retículo Endoplasmático ..................................... 94 Inserção de uma proteína na membrana do RE com uma sequência-sinal clivável e uma única stop-transfer sequence .......................................................................................... 94 Inserção de uma proteína na membrana do RE com uma sequência-sinal interna à sequência (e, portanto, não-clivável) ............................................................................... 94 Inserção de uma proteína na membrana do RE com múltiplas stop-transfer sequences (domínios transmembranares) ........................................................................................ 95 Folding e Processamento proteico no Retículo Endoplasmático ....................................... 95 Controlo de Qualidade no Retículo Endoplasmático ........................................................ 96 O retículo endoplasmático liso e a síntese de lípidos ....................................................... 96 Exportação de Lípidos e Proteínas a partir do Retículo Endoplasmático ........................... 97 O Aparelho de Golgi ............................................................................................................ 98 Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Organização do Golgi ...................................................................................................... 98 Glicosilação de proteínas no Golgi ................................................................................... 98 Metabolismo dos lípidos e dos polissacarídeos no Golgi .................................................. 99 Encaminhamento e exportação das proteínas a partir do Golgi ....................................... 99 O mecanismo do transporte de vesículas .......................................................................... 100 A experimentação e a compreensão dos mecanismos do transporte de vesículas ......... 100 Selectividade do Cargo, Proteínas Coat e Destacamento de Vesículas ........................... 100 Fusão de Vesículas ........................................................................................................ 101 Lisossomas ........................................................................................................................ 101 Hidrolases ácidas próprias dos lisossomas ..................................................................... 101 Endocitose e formação do lisossoma ............................................................................. 102 Fagocitose e Autofagia .................................................................................................. 102 Capítulo 11 –

Bioenergética e Metabolismo..................................................................... 103

Mitocôndrias..................................................................................................................... 103 Organização e Função das Mitocôndrias ........................................................................ 103 O Sistema Genético das Mitocôndrias ........................................................................... 103 Importação de Proteínas e Montagem de Mitocôndrias ................................................ 104 Peroxissomas .................................................................................................................... 107 Funções dos Peroxissomas ............................................................................................ 107 Construção de Peroxissomas ......................................................................................... 107 Capítulo 12 – O citoesqueleto e o movimento celular ........................................................... 108 Estrutura e Organização dos filamentos de actina ............................................................. 108 Montagem e Desmontagem dos Filamentos de Actina .................................................. 108 Organização dos filamentos de Actina ........................................................................... 108 Associação com a Membrana Plasmática....................................................................... 109 Projecções da Superfície Celular .................................................................................... 109 Actina, Miosina e Movimento Celular ................................................................................ 109


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Filamentos Intermédios .................................................................................................... 110 Proteínas dos Filamentos Intermédios........................................................................... 110 Montagem dos Filamentos Intermédios ........................................................................ 110 Organização Intracelular dos Filamentos Intermédios ................................................... 110 Epidermólise Bulhosa Simples ....................................................................................... 111 Microtúbulos .................................................................................................................... 111 Estrutura e organização Dinâmica dos Microtúbulos ..................................................... 111 Organização Intracelular dos Microtúbulos ................................................................... 111 Drogas que Afectam a Estabilidade dos Microtúbulos ................................................... 111 Motores Microtubulares e Movimento ............................................................................. 112 Cílios e Flagelos ............................................................................................................. 112 Resumo das Funções ............................................................................................................. 112 Capítulo 13 – Membrana Plasmática ..................................................................................... 113 Transporte de pequenas moléculas ................................................................................... 113 Medicina Molecular: Fibrose Cística (FC) ....................................................................... 113 Endocitose ........................................................................................................................ 114 Fagocitose ..................................................................................................................... 114 Endocitose Mediada por Receptor................................................................................. 115 Key Experiment: O Receptor de LDL .............................................................................. 116 Tráfego de Proteínas na Endocitose............................................................................... 118 Capítulo 15 – Sinalização Celular ........................................................................................... 120 Moléculas Sinalizadoras e os seus receptores .................................................................... 120 Modos de sinalização célula-célula ................................................................................ 120 Hormonas esteróides e a Superfamília dos receptores nucleares................................... 122 Neurotransmissores ...................................................................................................... 122 Hormonas Peptídicas e Factores de crescimento ........................................................... 123 Funções dos Receptores da Superfície Celular ................................................................... 123


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Receptores Acoplados a Proteínas G ............................................................................. 123 Receptores associados a tirosina-cinases....................................................................... 124 Receptores de citocinas, e Tirosinas cinases não receptoras .......................................... 125 Receptores ligados a outros tipos de enzimas................................................................ 125 Vias de transmissão de sinais intracelulares ...................................................................... 125 A via do cAMP: Mensageiros Secundários e Fosforilação de Proteínas ........................... 125 GMP cíclico ................................................................................................................... 126 Fosfolípidos e CA2+ ........................................................................................................ 126 Vias da MAP cinase ....................................................................................................... 126 Capítulo 16 – O ciclo celular .................................................................................................. 128 O ciclo celular da célula eucariota ..................................................................................... 128 Fases do ciclo celular ..................................................................................................... 128 Regulação do Ciclo Celular por Sinais de Crescimento e Sinais Extracelulares ................ 129 Checkpoints do ciclo celular .......................................................................................... 130 Restringindo a replicação do DNA a uma única vez por ciclo .......................................... 130 Reguladores da progressão do ciclo celular ....................................................................... 131 Proteínas-cinases e regulação do ciclo celular ............................................................... 131 Famílias de Ciclinas e Cinases dependentes de ciclinas .................................................. 132 Factores de crescimento e regulação das Cdk’s da fase G1 ............................................ 133 Checkpoints de verificação de erros no DNA.................................................................. 133 Capítulo 17 – Morte e Renovação Celular.............................................................................. 134 Morte Celular Programada ................................................................................................ 134 Eventos Durante a Apoptose (Fig 17.1) .......................................................................... 134 Fagocitose de Células e Fragmentos de Células Apoptóticas (Fig 17.2) ........................... 134 Caspases ....................................................................................................................... 135 Reguladores Centrais da Apoptose: A família Bcl-2 ........................................................ 135 Vias Sinalizadoras que regulam a apoptose ................................................................... 136


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Células Estaminais e a Manutenção de Tecidos Adultos..................................................... 137 Proliferação de Células Diferenciadas ............................................................................ 137 Células Estaminais ......................................................................................................... 137 Aplicações Médicas de Células Estaminais Adultas ........................................................ 137 Células Estaminais Embionárias e Clonagem Terapêutica .............................................. 137 Transferência Nuclear Somática .................................................................................... 137


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Capítulo 1 – Visão geral sobre as células Origem e evolução das células As células dividem-se em duas classes principais: células procarióticas (que não têm envelope nuclear), e células eucariotas que têm um núcleo que separa o material genético do citoplasma. Em geral os procariotas são menores e mais simples que os eucariotas, o seu genoma é menos complexo, e não contêm organelos citoplasmáticos ou citoesqueleto. Mas ambos os tipos de células governam as suas vidas com base em mecanismos moleculares semelhantes.

A primeira célula Na base do aparecimento de vida está uma teoria que postula que a formação espontânea de moléculas orgânicas conduziu à posterior formação de macromoléculas. Uma característica crucial das macromoléculas que deram origem à vida terá sido a capacidade de autoreplicação, pois só uma macromolécula capaz de direccionar a síntese de novas cópias de si mesma seria capaz de direccionar a reprodução e posterior evolução. As moléculas com a capacidade de auto-replicação são os ácidos nucleicos, cujas cadeias servem de moldes para a síntese da nova macromolécula, através do emparelhamento específico de nucleótidos complementares. Estudos descobriram as capacidades catalíticas do RNA, que consegue direccionar a síntese de uma nova cadeia de RNA através de uma cadeia molde. Consequentemente, o RNA é considerado o sistema genético inicial (RNA world). Interacções entre RNA e aminoácidos (aa) deram origem ao código genético actual, e o DNA substituiu o RNA como material genético.

Auto-Replicação de RNA

A primeira célula gerou-se supostamente pelo enclausuramento de RNA auto-replicante numa membrana composta de fosfolípidos, que são os componentes básicos de das membranas biológicas, como as membranas plasmáticas dos procariótas e eucariótas. O que permite aos fosfolípidos formar membranas é que eles são moléculas anfipáticas, ou seja, uma porção da molécula é solúvel e água e a outra não. Os fosfolípidos têm longas cadeias de carbono e hidrogénio insolúveis em água (hidrofóbicas), juntas a cabeças de fosfato solúveis em água (hidrofílicas). Quando em meio aquoso, os fosfolípidos agregam-se espontaneamente numa bicamada, em que os grupos fosfato estão em contacto com a água, e as cadeias de carbono e hidrogénio no interior em contacto umas com as outras. Esta bicamada forma uma barreira Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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estável entre dois compartimentos aquosos - por exemplo o interior e o exterior de uma célula.

Enclausuramento de RNA Auto-Replicante numa membrana de fosfolípidos

Evolução do Metabolismo As células necessitaram de desenvolver os seus próprios mecanismos de geração de energia e síntese de moléculas necessárias à replicação. Todas as células usam adenosina 5’-trifosfato (ATP) como fonte de energia para conduzir a síntese de constituintes celulares e outras actividades que implicam o gasto de energia, como o movimento celular. Os mecanismos para geração de ATP surgiram em 3 fases, a glicólise, a fotossíntese, e o metabolismo oxidativo. A glicólise é um mecanismo pelo qual a energia em moléculas orgânicas pré-formadas poderia ser convertido em ATP, que poderia ser depois usado como fonte energética para conduzir outras reacções metabólicas. O desenvolvimento da fotossíntese foi o passo evolucionário seguinte, permitindo à célula colher energia da luz solar, tornando-a independente da utilização de moléculas orgânicas pré-formadas. O uso de H2O em reacções fotossintéticas produz O2, e foi este mecanismo o responsável por tornar a atmosfera terrestre abundante em O2, que consequentemente alterou o ambiente em que as células habitavam, levando ao desenvolvimento do metabolismo oxidativo. Como o O2 é uma molécula muito reactiva, providenciou um mecanismo de geração de energia a partir de moléculas orgânicas muito mais eficiente que a simples glicólise anaeróbica.

Procariótas Actuais Os procariótas actuais dividem-se em dois grupos: archeabacteria (algumas vivem em ambientes extremos) e eubacteria, as formas comuns de bactérias da actualidade. Os procariótas mais complexos são as cianobactérias, as quais desenvolveram inicialmente a fotossíntese. A estrutura típica de uma célula procarióta é ilustrada pela E.coli, uma habitante do trato intestinal humano: é rodeada por uma parede celular rígida (porosa), abaixo da qual existe uma membrana plasmática, na qual uma bicamada fosfolipídica está associada a proteínas. O Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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seu DNA é uma molécula circular no nucleóide, não sendo separada do citoplasma, como nos eucariótas. O seu citoplasma abunda em ribossomas (locais da síntese proteica).

Eucariótas Actuais Todas são envolvidas por uma membrana plasmática e contêm ribossomas, mas são maiores e mais complexas, sendo o seu organelo mais proeminente o núcleo (local de síntese de RNA e replicação de DNA; a tradução dá-se em ribossomas, no citoplasma). Contêm outros organelos no citoplasma, que ao compartimentalizarem as diferentes actividades metabólicas da célula as tornam muito mais eficientes. As mitocôndrias (onde se dá o metabolismo oxidativo e produção de ATP) e os cloroplastos têm papéis fundamentais no metabolismo energético. Os lisossomas e peroxissomas são compartimentos metabólicos especializados na digestão de macromoléculas e reacções oxidativas, respectivamente. O retículo endoplasmático (processa e transporta proteínas e sintetiza lípidos) e o aparelho de Golgi (matura proteínas e sintetiza lípidos) dedicam-se à distribuição e transporte de proteínas destinadas à secreção, incorporação na membrana plasmática e lisossomas. As células eucariótas ainda têm uma rede de filamentos proteicos que se estende no citoplasma, o citoesqueleto, que dá estrutura à célula, determinando o seu formato, e organização geral do seu citoplasma, sendo também responsável pelo movimento celular e transporte e posicionamento de organelos numa célula.

A origem dos eucariótas Um passo crucial na evolução das células eucarióticas foi a aquisição de organelos, que lhes permitiu tornarem-se mais complexas. Estes organelos surgiram supostamente por endossimbiose (uma célula a viver dentro de outra), em que células procariótas viviam nas células que deram origem às eucariótas. Esta hipótese é bem suportada por estudos de mitocôndrias e cloroplastos, que se pensam ter evoluído de eubacterias a viver em células maiores, pois tanto as mitocôndrias como os cloroplastos contêm o seu próprio DNA, que codifica alguns dos seus componentes. Assim, pensa-se que as mitocôndrias surgiram de eubacterias aeróbias.

Desenvolvimento de Organismos Multicelulares Os seres multicelulares evoluíram de seres unicelulares que formavam agregados multicelulares. Por exemplo, alguns tipos de células de algas associam-se umas às outras para formar colónias multicelulares. A progressiva especialização celular levou à transição de agregados coloniais a seres multicelulares. O corpo humano é composto por mais de 200 tipos de células diferentes, que são considerados componentes de 5 tipos principais de tecido: epitelial (cobrem as superfícies do corpo e órgãos internos), conjuntivo (osso, cartilagem, tecido adiposo), sanguíneo (contém glóbulos vermelhos e brancos), nervoso (neurónios) e muscular (produção de força – movimento).


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Células como modelos experimentais Porque as propriedades fundamentais das células têm sido conservadas durante a evolução, os princípios básicos retirados de experiências com uma célula geralmente são aplicáveis a outras.

E.coli Os procariótas são os seres de eleição para o estudo de aspectos fundamentais da bioquímica e da biologia molecular, devido à sua simplicidade, quando comparados a outros seres. A E.coli é a espécie de bactéria mais estudada, pois é relativamente simples, e fácil de propagar e estudar em laboratório. O seu pequeno genoma (4.6 milhões de pb e 4300 genes), aliado à sua rápida proliferação laboratorial, confere-lhe vantagens na análise genética. Além disso, uma população clone de E.coli, na qual todas as células derivam da mesma célula original, pode ser facilmente isolada num meio de cultura com agar, permitindo tornar a escolha de espécies resistentes a antibióticos rápida e fácil. As misturas de nutrientes na qual a E.coli se divide mais rapidamente (20 minutos) inclui glicose, sais, compostos orgânicos (aa, vitaminas e precursores de ácidos nucleicos). Também pode ser cultivada num meio mais pobre, contendo apenas amónia e glicose, sendo contudo o crescimento mais lento.

Leveduras As leveduras, os eucariotas mais simples, têm vantagens experimentais semelhantes à E.coli, sendo o modelo da biologia celular dos eucariontes. A espécie mais estudada é a s.cerevisiae, contendo um genoma com aproximadamente 6000 genes. Apesar da sua simplicidade, exibe as características típicas das células eucariótas: núcleo rodeado por uma membrana nuclear, DNA organizado em cromossomas, e o citoplasma contém citoesqueleto e organelos. Em condições óptimas dividem-se a cada 2 horas, sendo ideais para manipulações genéticas semelhantes àquelas realizadas em bactérias.

Caenorhabditis elegans As leveduras unicelulares são modelos muito importantes para o estudo de células eucariótas, mas a compreensão de seres multicelulares requer o uso de plantas ou de animais, organismos mais complexos. A c.elegans permite o estudo do desenvolvimento animal e da diferenciação celular. O seu genoma é bem maior e mais complexo do que o de eucariontes unicelulares mas bem mais simples e manuseável que o da maioria dos outros animais, sendo facilmente sujeitado a manipulação genética. Os indivíduos adultos são compostos por apenas 959 células somáticas, e entre 1000 e 2000 células da linha germinativa.

Drosophila melanogaster Esta mosca da fruta tem sido um modelo crucial no estudo da biologia do desenvolvimento, e apesar de conter mais pb no seu genoma, contém menos genes que a c.elegans, sendo também fácil de manter e reproduzir laboratorialmente (tem um ciclo reprodutivo curto – duas semanas). A análise genética realizada na Drosophila permitiu a identificação de inúmeros genes que controlam o desenvolvimento e a diferenciação.


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Vertebrados Os animais mais complexos são os vertebrados, que incluem os humanos, mamíferos, entre outros. O genoma humano tem aproximadamente 3 mil milhões de pb, contém 20 000 a 25 000 genes, e mais de 200 tipos diferentes de células especializadas. Esta complexidade torna os vertebrados difíceis de estudar do ponto de vista da biologia molecular. Uma abordagem para o estudo de seres humanos e outros mamíferos é o crescimento de células isoladas em cultura, onde podem ser manipuladas, sob condições laboratoriais. O uso de células em cultura permitiu elucidar os mecanismos da replicação de DNA, expressão genética, síntese proteica, processamento, e divisão celular. Além do mais, as propriedades de algumas células altamente especializadas (neurónios, células musculares), tornam-nas modelos importantes para o estudo de aspectos particulares da biologia celular. Por exemplo, os neurónios são excelentes modelos para o estudo do transporte de iões através da membrana. Entre os mamíferos, o rato é o modelo mais adequado para análise genética, que é facilitada pela disponibilidade do seu genoma completo. A adequação do rato como modelo para o desenvolvimento humano é indicada não só pela semelhança entre os genomas humano e do rato, como também pelo facto de mutações em genes homólogos provocarem o desenvolvimento de defeitos em ambas as espécies.


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Capítulo 2 – Composição das células As moléculas das células As células são compostas por água (muito abundante), iões inorgânicos e moléculas orgânicas (substâncias que contêm carbono e hidrogénio). A interacção entre a água e os outros constituintes celulares é de grande importância, e como a água é uma molécula polar (atómos de hidrogénio têm uma carga ligeiramente positiva e os de oxigénio uma ligeiramente negativa) , pode formar pontes de hidrogénio com outras moléculas de água, bem como interagir com iões carregados positiva ou negativamente. Assim, iões e moléculas polares dissolvem-se em água (hidrofílicas), e as moléculas apolares são pouco solúveis em água (hidrofóbicas), tendendo assim a minimizar o seu contacto com a água, associando-se umas com as outras. Os iões inorgânicos celulares (sódio, potássio, cloro, cálcio, magnésio, fosfato, bicarbonato), estão envolvidos em aspectos metabólicos. Os compostos orgânicos dividem-se em 4 classes moleculares: glícidos, lípidos, proteínas e ácidos nucleicos. As proteínas, ácidos nucleicos, e a maioria dos glícidos (polissacáridos) são macromoléculas formadas pela polimerização (junção) de vários precursores moleculares: aminoácidos (aa), nucleótidos e monossacáridos, respectivamente.

Glícidos Incluem açúcares simples (monossacáridos), bem como polissacáridos. Os monossacáridos (como a glicose) são os principais nutrientes de uma célula, e a sua degradação é a fonte de energia celular e de precursores para a biossíntese de componentes celulares. Os polissacáridos são a forma de armazenamento de açúcares e formam os componentes estruturais das células, servindo também como marcadores em processos de reconhecimento celular.

Lípidos São os principais componentes das membranas celulares, sendo também uma forma de armazenamento energético muito importante, além de funcionarem como moléculas sinalizadoras e hormonas esteróides (estrogénios, testosterona, etc).

Ácidos Nucleicos Os ácidos nucleicos – DNA e RNA – são as molécula de armazenamento de informação da célula. O DNA tem como função servir de material genético, sendo que nãos eucariontes se localiza no núcleo. Existem diferentes tipos de RNA: mRNA (mensageiro), que transporta informação do DNA para os ribossomas, servindo como molde para a síntese proteica; o rRNA e o tRNA estão envolvidos na síntese proteica. O RNA além de transportar informação, é capaz de catalizar algumas reacções químicas (de síntese proteica e processamento de RNA). O RNA e o DNA são polímeros de nucleótidos, que consistem em bases: purinas (dois anéis), como a Adenina (A) e a Guanina (G); ou pirimidinas (um anel), como a Citosina (C), a Timina (T) e o Uracilo (U).


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O DNA consiste em duas purinas (A e G), e duas pirimidinas (C e T). O RNA contém Uracilo em vez de Timina, como no DNA.

Componentes dos Ácidos Nucleicos

As bases (purinas e pirimidinas) estão ligadas a glícidos, no caso do DNA – desoxirribose; no caso do RNA – ribose, formando assim nucleósidos. Os nucleósidos ligam-se a um ou mais grupos fosfato no carbono 5’, formando os nucleótidos.


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A polimerização de nucleótidos para formar ácidos nucleicos envolve a formação de ligações fosfodiéster, entre o fosfato 5’ de um nucleótido e o grupo hidroxilo 3’ de outro. Oligonucleótidos são pequenos polímeros de nucleótidos, enquanto que os maiores polímeros se chamam polinucleótidos. Os polinucleótidos são sempre sintetizados de 5’->3’, com a adição de um nucleótido livre na extremidade 3’ da cadeia em crescimento (ligação ao grupo hidroxilo). Assim, por convenção, as sequências de bases escrevem-se no sentido 5’->3’. A informação está contida no DNA e no RNA através da ordem das bases (A, T, G, C e U) na cadeia de polinucleótidos. O DNA é uma molécula de dupla cadeia, cujas duas cadeias de polinucleótidos “correm” em sentidos opostos. As bases ficam no interior da molécula, e as duas cadeias são juntas por pontes de hidrogénio entre bases complementares: A emparelha com T (A Ξ T) por 3 pontes, e G emparelha com C (G = C) por duas pontes. Esta complementaridade de bases permite que uma cadeia de DNA ou RNA sirva de molde para a síntese da cadeia complementar. A informação carregada no DNA e no RNA direcciona, entre outras coisas, a síntese de proteínas específicas, que controlam as actividades celulares. Os nucleótidos também participam noutros processos celulares. Por exemplo, o ATP (adenosina 5’-trifosfato), que é um nucleótido, é a principal forma de energia química das células, existindo também outros nucleótidos com estas funções. Além disso, alguns nucleótidos (como o cAMP) são importantes moléculas intracelulares sinalizadoras. A diferença entre uma ribose e uma desoxirribose é no carbono 2’ sendo que a ribose a este carbono tem ligado um grupo hidroxilo (HO) enquanto a desoxirribose tem apenas ligado um hidrogénio (H). O grupo fosfato dos nucleótidos tem tendência a reagir com o HO do carbono 2’ atacando-o. Ora quando isto acontece a molécula de RNA torna-se instável e é degradada. Como o DNA não tem o grupo hidroxilo este não reage com o grupo fosfato e por isso esta molécula é mais estável. É por esta razão que a nossa informação genética é codificada por DNA e não por RNA (Exame 1º Fase, 2008/2009).


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Proteínas As proteínas executam as tarefas implícitas pela informação genética, sendo as macromoléculas mais diversas, e realizando uma grande variedade de funções: componentes estruturais das células, transporte e armazenamento de pequenas moléculas (hemoglobina armazena O2), transmissão de informações entre células (hormonas), e defesa imunológica (anticorpos). A sua propriedade fundamental é a capacidade de actuarem como enzimas, que catalizam praticamente todas as reacções químicas dos sistemas biológicos. São polímeros de 20 tipos de aa, que se distinguem pelas diferenças nas cadeias laterais. Os aa são ligados por ligações peptídicas, entre o grupo α-amina de um aa e o grupo α-carboxilo de outro aa. Os polipéptidos são cadeias lineares de centenas ou milhares de aa, que têm duas extremidades: N-terminus, ou terminal amina; C-terminus, ou terminal carboxilo. Os polipéptidos são sintetizados do N-terminus para o C-terminus, e a sequência de aa num polipéptido é escrita na mesma ordem. Cada proteína consiste numa sequência de aa específica, que define a estrutura de uma proteína. A conformação tridimensional de uma proteína corresponde ao seu estádio termodinâmico mais estável, que depende das interacções entre os diferentes aa. Logo, a sequência de DNA que dá origem à proteína também determina a sua estrutura.

Membranas celulares A estrutura e função das células depende em muito das membranas, que para além de separarem os ambientes intracelular do extracelular, definem compartimentos internos nas células eucariótas, delimitando o núcleo e os organelos celulares. As membranas biológicas são bicamadas de fosfolípidos associadas a proteínas, que são responsáveis por diversas funções especializadas: receptores de sinais externos; transporte selectivo de moléculas através da membrana; transporte de electrões de fosforilação oxidativa. Além disso, as proteínas membranares controlam as interacções entre as células de seres multicelulares.

Lípidos Membranares Os constituintes essenciais das membranas celulares são os fosfolípidos, que são moléculas anfipáticas, que consistem de duas cadeias hidrofóbicas de ácidos gordos ligadas a uma extremidade polar hidrofílica que contém um grupo fosfato. Como as cadeias de ácidos gordos são pouco solúveis em água, os fosfolípidos tendem a formar bicamadas em meio aquoso (efeito entrópico e ligações Van der Waals), gerando uma barreira estável entre dois compartimentos aquosos. As bicamadas lipídicas funcionam como fluidos bi-dimensionais, nos quais moléculas individuais (lípidos e proteínas), podem rodar e mover-se em direcções laterais. Esta fluidez é uma característica crucial das membranas, e depende da temperatura e da composição da lipídica da membrana. Por exemplo, as interacções entre cadeias curtas de ácidos gordos são mais fracas que entre cadeias longas, logo membranas com ácidos gordos curtos são menos rígidas e mantêm-se fluidas a temperaturas mais baixas. Lípidos compostos por cadeias insaturadas também aumentam a fluidez da membrana, pois a presença de ligações duplas dificulta o “empacotamento” dos lípidos.


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O colesterol possui anéis de hidrocarbonetos que são rígidos, e interagem com as cadeias de ácidos gordos dos outros lípidos, diminuindo a mobilidade dos ácidos gordos, tornando a membrana mais rígida. Por outro lado , a inserção do colesterol interfere com as interacções entre as cadeis de ácidos gordos, mantendo a fluidez a baixas temperaturas. Assim, o colesterol funciona como um tampão de fluidez da membrana.

Proteínas membranares As proteínas são os constituintes principais das membranas celulares, estando inseridas numa bicamada lipídica, segundo o modelo do mosaico fluido. As proteínas dividem-se em duas classes principais: proteínas intrínsecas (inseridas directamente na bicamada), e proteínas extrínsecas (associadas indirectamente à membrana, geralmente interagindo com proteínas intrínsecas). A maioria das proteínas intrínsecas são transmembranares, pois cruzam a bicamada lipídica, tendo porções expostas a ambos os lados da membrana. As porções transmembranares são geralmente α-hélices, formadas por resíduos apolares, que interagem com a porção hidrofóbica da membrana. A membrana pode também ser atravessada por uma estrutura em β-barril. As proteínas transmembranares são moléculas anfipáticas, pelo que as suas porções hidrofílicas estão expostas ao ambiente aquoso. As proteínas também podem ser ancoradas a membranas por lípidos ligados covalentemente a cadeias polipeptídicas, e as diferentes modificações lipídicas ditam a que face da membrana as proteínas ficam ancoradas.

Transporte através de membranas celulares Apenas pequenas moléculas sem carga (H2O, O2 e CO2) se conseguem difundir livremente através das membranas. Moléculas maiores, mesmo que apolares (glicose) não conseguem difundir-se livremente pela membrana, bem como iões. Assim, é necessário que a passagem destas moléculas e iões seja mediada por proteínas transmembranares, que podem assim, determinar a permeabilidade selectiva de membranas celulares. Há duas classes de proteínas transportadoras: canais proteicos, que formam poros através da membrana, permitindo a livre passagem de moléculas com tamanho apropriado, podendo ser selectivamente abertos ou fechados; proteínas carregadoras, que se ligam selectivamente e transportam moléculas específicas, como a glicose. Quando o movimento das moléculas é a favor do gradiente, o transporte é denominado difusão passiva. Quando o transporte é contra gradiente e é acoplado à hidrólise de uma fonte energética, o processo denomina-se transporte activo.

Proteomics: Análise de Proteínas celulares a larga-escala Genomics é a análise sistemática de genomas celulares. Proteomics é o estudo em larga escala das proteínas celulares. Proteome é a identificação e quantificação de todas as proteínas expressas numa célula, bem como a identificação das suas redes de interacção.


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Identificação de proteínas celulares O nº de espécies diferentes de proteínas de uma célula é maior que o número de genes, pois um gene pode corresponder a mais do que uma proteína, devido a fenómenos de splicing alternativo e de modificações proteicas. O primeiro método desenvolvido para estudos de proteomics é a electroforese em gel de proteínas, que pode separar centenas de proteínas. A espectofotometria de massa é outro método, que permite identificar proteínas, separadas por electroforese ou não.

Análise global da localização proteica Organelos subcelulares isolados podem ser analisados por espectofotometria de massa, para determinar os seus constituintes proteicos. Grande porção das proteínas das leveduras pode ser marcada por proteínas fluorescentes verdes para estudos globais da sua localização.

Interacções proteicas Várias abordagens a larga-escala têm sido aplicadas para identificar interacções entre proteínas e complexos, com o objectivo de elucidar as redes complexas das interacções proteicas que regulam o comportamento celular.


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Capítulo 4 – Fundamentos da Biologia Molecular Hereditariedade, Genes e DNA A propriedade mais fundamental de todos os seres vivos é a sua capacidade para se reproduzirem. Todos os organismos herdam a informação genética, que especifica a sua estrutura e função, dos seus pais. Todas as células derivam de células preexistentes, por isso o material genético tem que ser replicado e passado das células pais para a descendência a cada divisão genética.

Genes e Cromossomas Cada característica de um ser é determinada por um par de factores herdados, que se chamam genes. Uma cópia de um gene (alelo) que especifica uma característica é herdada de cada progenitor. Quando mais de que um alelo diferente está presente num ser, aquele que se manifesta é dito alelo dominante, e o outro recessivo. O genótipo é a composição genética de um organismo, enquanto o fenótipo são as características observáveis, que resultam da expressão dos genes de um organismo. Os genes são transportados pelos cromossomas, sendo que a maioria dos animais e plantas apresentam duas cópias de cada cromossoma: são diplóides. Durante a formação das células da linha germinativa, dá-se a meiose (tipo de divisão celular), na qual apenas um cromossoma do par de cromossomas é transmitido à descendência. Assim, o oócito e o espermatozóide são haplóides, contendo apenas uma cópia de cada cromossoma. A união destas duas células haplóides durante a fecundação cria um novo ser diplóide, contendo agora cada par de cromossomas, derivado um do pai e outro da mãe. O comportamento dos pares de cromossomas é semelhante ao dos genes, levando à conclusão que os genes são transportados pelos cromossomas.

Genes e Enzimas Um gene especifica a sequência de aa de uma cadeia polipeptídica.

Identificação de DNA como o Material Genético Os cromossomas são compostos por DNA e proteínas. A experiência que ditou inicialmente que o DNA seria o material genético e não as proteínas deriva de estudos com a bactéria que causa a pneumonia, pneumococcus. A estirpe patogénica do pneumococcus é envolvida por uma cápsula de polissacáridos que protege as bactérias de um ataque por parte do sistema imunitário do hospedeiro. A estirpe encapsulada é a estirpe S (“smooth”) e a estirpe mutante que perdeu a capacidade de gerar a cápsula é a estirpe R (“rough”), que não tendo cápsula, não é patogénica quando inoculada em ratos. Experimentalmente verificou-se que, ratos inoculados com bactérias R mais bactérias S mortas por calor desenvolviam pneumonia e morriam. Quando extraídas bactérias dos ratos mortos, verificavam-se que estas eram da estirpe S. Denotou-se que extractos de bactérias S eram também capazes de converter a bactéria R para uma bactéria S. Assim, uma substância no extracto da bactéria S eram responsável pela indução da transformação genética de uma bactéria R (não patogénica) para uma S (patogénica).


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Transferência da informação genética pelo DNA

Outra experiências vieram demonstrar que era o DNA, e não proteínas o material genético. Foi provada que a actividade do extracto transformador (como no caso dos pneumococcus) era abolida quando se procedia a digestão enzimática de DNA e não de proteínas. Foi também demonstrado que quando um vírus (bacteriófago) infecta uma célula, é necessário que o DNA viral entre na bactéria, e não o proteína viral, de forma a que o vírus se replique. Além disto, é o DNA viral que se transmite às partículas virais descendentes.

Estrutura do DNA A molécula de DNA é uma hélice que dá uma volta a cada 3,4 nm, sendo que a cada volta existem 10 bases. Esta dupla hélice possui um “backbone” (coluna) de açúcar e fosfato do lado de fora, contendo na porção interna bases, orientadas para formarem pontes de hidrogénio entre as purinas e as pirimidinas de cadeias opostas. Para justificar que A emparelha com T e G com C, estão os resultados de experiências que demonstram que a quantidade de adenina é sempre igual à de timina, e que a quantidade de guanina é sempre igual à de citosina. Assim, devido a esta complementaridade de bases, as duas cadeias de DNA são complementares. Logo, cada cadeia contém a informação necessária para especificar a sequência das bases da outra.


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A estrutura do DNA

Replicação do DNA As duas cadeias de DNA podem-se separar e servir como moldes para a síntese de novas cadeias complementares, cuja sequência seria ditada pelo emparelhamento específico de bases complementares. Este processo denomina-se replicação semiconservativa, pois cada cadeia de DNA pai é conservada, constituindo metade da nova cadeia sintetizada (apenas metade da dupla hélice é sintetizada, sendo a outra herdada).


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Replicação semi-conservativa do DNA

A experiência por detrás da teoria da replicação semiconservativa foi realizada marcando o DNA com isótopos de diferentes densidades. E.coli foram cultivadas durante várias gerações num meio contendo o isótopo de azoto pesado (15N) no lugar do isótopo normal de azoto leve (14N). O DNA destas bactérias continha, consequentemente, 15N e era mais pesado que o das bactérias cultivadas num meio com 14N. Depois as bactérias seriam transportadas de volta para o meio contendo 14N e cresceriam durante apenas uma geração adicional. O DNA extraído destas bactérias e analisado por ultracentrifugação numa solução com CsCl formaria bandas segundo as densidades das moléculas de DNA. O DNA da bactéria transferida do meio com 15N para o meio com 14N durante uma geração gerava bandas com uma densidade intermédia entre a densidade do DNA de 15N e o DNA de 14N, indicando que esta densidade representa uma molécula híbrida com uma cadeia leve e outra pesada.


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A capacidade do DNA servir como molde da sua própria replicação foi demonstrada pois, a DNA polimerase (enzima da E.coli) consegue catalisar a replicação de DNA in vitro, apenas na presença de um molde de DNA, ao incorporar directamente os nucleótidos numa molécula de DNA complementar.

Demonstração experimental da replicação semi-conservativa

Expressão da Informação Genética Os genes determinam a estrutura das proteínas, que são responsáveis por direccionar o metabolismo celular, funcionando como enzimas. As proteínas são polímeros de 20 aa diferentes, cuja sequência determina a sua função e estrutura.

Colinearidade de Genes e Proteínas A ordem dos nucleótidos no DNA especifica a ordem dos aa numa proteína. Mutações num gene correspondem a alterações no DNA, que podem resultar na adição ou delecção de nucleótidos, que poderiam levam à alteração da sequência de aa da proteína codificada pelo gene em questão.

O papel do mRNA Apesar da sequência de nucleótidos no DNA especificar a ordem dos aa nas proteínas, não é o próprio DNA que intervém directamente na síntese proteica. Como nos eucariontes, o DNA se encontra no núcleo e a síntese proteica se dá no citosol, terá que existir outra molécula que transporte a informação genética para os locais de síntese (ribossomas). Assim, o mRNA é o intermediário da síntese proteica, sendo sintetizado a partir de um molde de DNA.


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O RNA difere do DNA, pois: é constituído por uma cadeia simples (o DNA é uma cadeia dupla); o seu componente glicídico é a ribose e não a desoxirribose (no carbono 2’ de uma ribose liga-se o grupo OH (hidroxilo) e de uma desoxirribose um H); e a sua base pirimidínica Uracilo (U) substituí a Timina (T) do DNA. Como o RNA se localiza principalmente no citoplasma, aparece como sendo o intermediário lógico da passagem de informação do DNA para os ribossomas. Com estes dados surgiu o dogma central: DNA → RNA → Proteínas. As moléculas de RNA são sintetizadas a partir de um molde de DNA (transcrição) e as proteínas são sintetizadas de moldes de RNA (tradução). As moléculas de RNA que servem como moldes para a síntese proteica chamam-se de mRNAs: RNAs mensageiros. São transcritos pela enzima RNA polimerase, que catalisa a síntese de RNA a partir de um molde de DNA. Existem mais 2 tipos de RNA importantes para a síntese proteica: RNA ribossomal (rRNA) que é um componente dos ribossomas e o RNA de transferência (tRNA) que serve como molécula adaptadora dos aminoácidos ao longo do mRNA.

Código Genético Devido à não complementaridade entre os aminoácidos e o mRNA, existem tRNAs que servem de adaptadores durante a tradução. Cada aminoácido diferente é ligado, por uma enzima específica, ao tRNA apropriado. O emparelhamento entre as bases de mRNA e tRNA dirige o aminoácido que lhe está ligado para o local correcto do molde de mRNA. A partir de sequências das quatro bases nucleotídicas do DNA - adenina (A), timina (T), citosina (C) e guanina (G) - é possível formar exactamente 64 palavras código de três letras diferentes, tripletos ou codões, pois 43=64. Estes tripletos são a unidade da mensagem genética que vai codificar a ordenação de séries de aminoácidos que caracterizam diversas proteínas. Das 64 palavras possíveis, 3 são sinais de paragem (codões STOP), indicando se chegou ao fim do código de uma proteína. Os restantes tripletos codificam os 20 aminoácidos, por isso mais que um tripleto pode codificar o mesmo aminoácido (degenerescência do código genético). A leitura dos nucleótidos começa num local fixo, gerando um quadro de leitura (reading frame), que é o conjunto sucessivo de 3 bases que


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forma codões sucessivos. Uma alteração no quadro de leitura (frameshift) causa a mudança da sequência de codões, de uma mesma cadeia de DNA. No caso de mutações por adição ou remoção de 1 ou 2 nucleótidos, esta causa uma mudança no quadro de leitura, fazendo com que todos os aa subsequentes sejam alterados. Adições ou remoções de 3 nucleótidos alteram apenas um aa, sendo que o quadro de leitura do resto do gene se mantém normal. O código genético tem características muito importantes: Universalidade, que postula uma linguagem comum a praticamente todas as células. As excepções existem em certos protozoários e no DNA mitocondrial. Redundância ou degenerescência do código genético, é o resultado da existência de 61 codões a indicar a síntese de proteínas, e apenas existirem 20 aa diferentes. Assim, vários codões codificam o mesmo aa. Não ambiguidade, o mesmo codão não codifica aa diferentes. Pouca especificidade do 3º codão, vários codões que sintetizam o mesmo aa têm o 3º codão igual, pelo que o 3º codão é menos específico, e o 1º é o mais específico. O tripleto AUG tem duas funções, codificando a metionina e representando o codão de iniciação da tradução (síntese proteica). Os tripletos UAA, UAG e UGA são codões de finalização, não codificando aa, e sinalizando o fim da síntese proteica.

Vírus de RNA e Transcrição Reversa Certos vírus contém RNA em vez de DNA, como material genético. Apesar de alguns replicarem directamente o seu RNA através do RNA original, este mecanismo não era utilizado por certos vírus animais (vírus de RNA tumorais), que eram capazes de causar cancro às células animais infectadas. Apesar de conterem RNA como material genético, a sua replicação exige a síntese de DNA, o DNA provírus, a partir de um molde de DNA. Esta capacidade de sintetizar DNA a partir de um molde de RNA denomina-se transcrição reversa, e parte da actividade da enzima transcriptase reversa. A transcriptase reversa também existe noutras células, permitindo a transposição de uma sequência de DNA de uma cromossoma para outro, e o estudo do mRNA de células, permitindo o estudo das transcrições que nelas ocorrem.

DNA recombinante Até à década de 1970 parecia impossível o isolamento e manipulação de genes. Este obstáculo foi superado pelo desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante, que possibilitou aos cientistas isolar, sequenciar e manipular genes individuais.

Enzimas de restrição O primeiro passo no desenvolvimento da tecnologia de DNA recombinante foi a caracterização de enzimas de restrição, que clivam o DNA em sequências específicas. São o “bisturi” que Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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permite cortar o DNA, fazendo parte do grupo das nucleases, enzimas responsáveis por clivar as ligações fosfodiéster entre nucleótidos adjacentes. Estas enzimas foram identificadas em bactérias, onde servem como método de defesa contra a entrada de DNA estranho (provindo de vírus, etc) na célula. As enzimas de restrição reconhecem de 4 a 8 pb, sendo estas sequências específicas, que originam fragmentos de DNA. Porque é que o DNA da bactéria não é digerido pelas suas próprias endonucleases (enzimas de restrição)? As enzimas de restrição não funcionam sozinhas numa bactéria, trabalhando em conjunto com enzimas que modificam o DNA bacteriano, tornando-o irreconhecível pelas endonucleases. Este sistema permite que apenas DNA estranho-não modificado seja digerido por endonucleases. Os fragmentos gerados pela clivagem de uma endonuclease podem ser separados, identificados e purificados numa electroforese de DNA em gel, consoante o comportamento dos fragmentos de DNA num campo eléctrico. O gel pode ser de agarose ou poliacrilamida, sendo fundido na presença de um tampão. A solução é deitada num molde e deixada solidificar, formando uma matriz cuja densidade depende da agarose. Ao ser aplicado um campo eléctrico através do gel, o DNA carregado negativamente (grupos fosfato) migra em direcção ao ânodo, o eléctrodo positivo. A velocidade de migração depende: tamanho da molécula, concentração de agarose, intensidade do campo eléctrico. O gel funciona como um filtro, retardando o movimento das moléculas maiores. Para a separação de moléculas leves, usa-se um gel com maior concentração de agarose. Para se visualizar o gel de agarose utiliza-se o corante brometo de etídio, que possui grupos químicos que se intercalam com as bases do DNA, sendo que o corante ligado ao DNA fluoresce com mais intensidade que o corante livre, quando irradiado com UV. À área do gel perpendicular ao poço denomina-se pista. Os fragmentos de DNA com o mesmo tamanho migram a mesma distância gerando bandas. Os locais de restrição para diferentes endonucleases de restrição gera mapas de restrição de moléculas de DNA.

Formação de moléculas de DNA recombinante A estratégia básica de clonagem molecular é a inserção de um fragmento de DNA de interesse (ex: segmento de DNA humano) numa molécula de DNA (vector) que seja capaz de se replicar numa célula hospedeira. O resultado é uma molécula recombinante ou clone molecular, composto pelo pedaço de DNA de interesse ligado ao DNA do vector. A replicação apropriada da molécula recombinante no hospedeiro permite obter grandes quantidades do DNA de interesse. O plasmídeo é um exemplo de um vector, sendo uma molécula de DNA circular que se replica de forma independente, sem estar associada a DNA cromossomal numa bactéria. Plasmídeos recombinantes transportando o DNA de interesse podem ser introduzidos em E.coli, onde se podem replicar, gerando milhões de cópias do DNA plasmídeo. O DNA destes plasmídeos pode então ser isolado, constituindo uma fonte enorme de moléculas recombinantes que contêm um fragmento de DNA humano clonado. O fragmento pode isolado do resto do vector através de enzimas de restrição, permitindo a análise e manipulação de um fragmento de DNA humano puro.


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Junção de moléculas de DNA


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Os fragmentos de DNA gerados para criar moléculas recombinantes são normalmente digeridos por enzimas de restrição. Estas clivam nos locais de restrição deixando extremidades com cadeias simples soltas, que se podem associar umas com as outras por complementaridade de bases, sendo que as ligações entre nucleótidos adjacentes são catalisadas por DNA ligases. Assim, dois fragmentos de DNA digeridos pela mesma endonuclease pode ser ligados criando uma molécula de DNA recombinante. Em certos casos, podem-se sintetizar DNA “linkers” (oligonucleótidos, que contêm os locais de restrição), e adicioná-los às extremidades do DNA de interesse, e posteriormente inseri-lo no vector.

Vectores de DNA recombinante Os vectores são moléculas de DNA que têm como função transportar o DNA de interesse para a célula hospedeira. As características mais importantes de um vector de clonagem são: Origem de replicação (ORI), que permite que o vector (molécula de DNA recombinante), se mantenha na célula e seja transmitida à descendência, ao permitir a sua replicação. Marca de selecção - a maioria dos vectores possui um gene que confere resistência a um antibiótico. Assim, apenas as bactérias que possuem o DNA recombinante sobrevivem quando crescidas em presença desse antibiótico. Local de policlonagem (MCS): pequena sequência de DNA que contém locais de corte únicos para várias enzimas de restrição. É neste local que é introduzido o fragmento de DNA que se pretende clonar. Promotor: presente apenas em vectores de expressão (sintetizam proteínas recombinantes) e localizado a montante (antes) do local de policlonagem. A maquinaria de transcrição genética identifica a sequência do promotor e transcreve a partir desse local.


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Clonagem através de vectores plasmídicos

Sequenciação de DNA A sequenciação é uma técnica que permite: inferir a sequência de aa sintetizados por um gene específico, ao sabermos a sequência de nucleótidos desse gene; estudar as propriedades de sequencias de DNA que regulam a expressão do gene. Processo de sequenciação 1. Desnaturação do DNA a sequenciar 2. Incubação do DNA com um primer (sequência de DNA complementar essencial para começar a replicação do DNA), na presença de DNA polimerase e dos quatro desoxinucleótidos (dATP, dCTP, dTTP, e dCTP), um dos quais é radioactivo.


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3. O produto desta reacção é depois dividido por quatro tubos, a cada um dos quais se junta um didesoxiribonucleosido-trifosfato (ddATP, ddCTP, ddTTP, e ddCTP), que são nucleótidos modificados, desprovidos de grupo hidroxilo no carbono 3’, e, portanto, impedem o alongamento das cadeias de DNA em que são incorporados. 4. Como em cada tubo existem milhões de moléculas de DNA, originam-se fragmentos de diversos tamanhos consoante a posição de cada nucleótido na sequência original. 5. O DNA de cada tubo é desnaturado e colocado num gel de acrilamida com ureia (para evitar a renaturação do DNA durante a electroforese). 6. No final, o gel é seco e autoradiografado. 7. Os nucleótidos radioactivos incorporados dão origem a uma série de bandas que indicam o tamanho dos fragmentos de DNA produzidos em cada tubo de reacção. 8. Ao contrário dos géis de agarose, os géis de acrilamida permitem resolver moléculas de DNA cujo comprimento difere apenas num nucleótido. 9.

Como a síntese de DNA ocorre de 5’ para 3’, os fragmentos menores resultam de uma incorporação do dNTP mais próxima da extremidade 5’.

10. Em consequência, a leitura do gel de baixo para cima indica a sequência de nucleótidos da cadeia 5’-3’. Para iniciar a reacção de sequenciação é necessário um primer, logo o DNA desconhecido tem de ser “enquadrado” numa sequência conhecida, para a qual o primer será complementar.


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Sequênciação de DNA automática

A sequenciação automática permite acelerar e mecanizar a maior parte do processo de análise dos resultados. Os diferentes produtos de reacção (G; A; T; C) têm incorporados nucleótidos fluorescentes em vez de nucleótidos radioactivos, cada um deles com uma cor diferente, num total de 4 cores. A leitura do sinal fluorescente é feita por um scanner apropriado que, estando acoplado ao aparelho de electroforese, faz a leitura directamente do gel enquanto a electroforese decorre. A leitura é feita em simultâneo com a migração dos fragmentos através do gel: sempre que no local do scanner passa uma banda que fluoresce numa cor é representado um pico no gráfico dos resultados e o software atribui-lhe a letra correspondente à cor detectada.

Expressão de genes clonados Muitas proteínas de interesse estão presentes nas células apenas em pequenas quantidades, não podendo ser purificadas por métodos convencionais. Assim, a criação de vectores de expressão (permitem a síntese de proteínas), veio colmatar esta dificuldade. O cDNA de interesse é clonado num vector de expressão que contém as sequências de expressão que permiter a transcrição de tradução do gene de interesse em células bacterianas. Por vezes o vector é inserido em eucariontes, de forma a assegurar uma correcta maturação proteica, uma vez que os procariontes não têm os organelos necessários (RE e Golgi).


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Detecção de Ácidos Nucleicos e Proteínas Amplificação de DNA por PCR A clonagem molecular de DNA permite o isolamento de grandes quantidades do DNA de interesse, sendo contudo necessária a existência de seres onde inserir os vectores para que estes sejam clonados. A técnica de PCR (polymerase chain reaction) apresenta-se como um método alternativo de amplificação de DNA, permitindo obter grandes quantidades de uma molécula de DNA de sequência definida. É apenas necessário o conhecimento das sequências que ladeiam o fragmento a amplificar. Para uma reacção PCR são necessários os seguintes componentes: DNA molde; primers (ligamse às extremidades que se pretendem ladear e permitem a adição de nucleótidos por parte da polimerase); DNA polimerase (taq polimerase, termoestável, polimeriza de 5→3); nucleótidos dNTP; tampão de reacção; termocycler, que assegura ciclos rápidos de aquecimento e arrefecimento. Processo de amplificação – a região de DNA a amplificar é flanqueada por 2 primers que permitem a síntese de DNA. A cadeia dupla inicial é aquecida e separada. Depois as duas cadeias simples são arrefecidas, permitindo a sua hibridação com os primers, que se ligam a cada cadeia de DNA. A taq polimerase é usada para sintetizar as novas cadeias de DNA partindo dos primers, resultado na formação de 2 moléculas de DNA, ao partir de uma original. Este processo pode ser repetido por inúmeros ciclos, resultando numa amplificação de DNA na ordem de 2n. A única molécula de DNA de uma mistura que será amplificada é aquela que é complementar aos primers adicionados ao sistema, sendo que o PCR é uma forma selectiva de amplificação.

Hibridação de ácidos nucleicos A chave para detectar sequências especificas de ácidos nucleicos é o emparelhamento de bases complementares de cadeias de DNA e RNA. A altas temperaturas as cadeias complementares de DNA separam-se (desnaturam-se) originando cadeias simples de DNA, que se forem incubadas nas condições ideais, renaturam pela complementaridade de bases – hibridação de ácidos nucleicos. Podem-se formar híbridos com 2 cadeias de DNA, 2 de RNA ou uma de cada. A hibridação de ácidos nucleicos permite detectar sequências de DNA ou RNA complementares de um ácido nucleico isolado, como um genoma viral ou sequência de DNA clonado. O DNA clonado é marcado radioactivamente ou por fluorescência, sendo sintetizado na presença de


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nucleótidos radioactivos ou fluorescentes. DNA radioactivo é usado como sonda para hibridação com sequências complementares de DNA e RNA, detectados devido à radioactividade dos híbridos resultantes de 2 cadeias. O Southern Blotting permite a análise de fragmentos genéticos de grandes dimensões e não exige o conhecimento prévio da sequência de nucleótidos da região de interesse. A técnica envolve: 1. Separação de DNA por electroforese em gel de agarose; 2. Transferência das moléculas separadas para um suporte sólido (membrana ou filtro de nitrocelulose) e hibridação com uma sonda marcada (radioactivamente ou por fluorescência); 3. Detecção do sinal da sonda (por autoradiografia ou UV). Devido às grandes dimensões do DNA genómico, para que se possa proceder à sua separação, é necessário tratá-lo com uma enzima de restrição. Esta enzima vai cortar o DNA de forma previsível, dando origem a milhares de fragmentos diferentes que cobrem um leque vasto de tamanhos, produzindo um aspecto típico de mancha arrastada (smear) após a electroforese. As dimensões dos fragmentos genómicos formados vão ser característicos de cada indivíduo, já que são consequência da existência de um local de restrição da enzima usada em determinada posição do genoma e, portanto, reflectem a sequência do genoma.


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Southern blotting

Aplicações da Southern blotting: Estudo de variações polimórficas da sequência do genoma: STRs – short tandem repeats; VNTRs - variable number of tandem repeats; SNPs - single nucleotide polymorphisms As mutações podem causar diferenças no tamanho dos fragmentos de restrição observados numa população (RFLPs - restriction fragment length polymorfisms): por destruição ou criação de locais de restrição; por aumento ou redução do número de nucleótidos situado entre dois locais de restrição (são diferenças de dimensão facilmente detectáveis por esta técnica).

O Northern Blotting permite analisar o RNA, da mesma forma que o Southern para DNA , e como o RNA já é fragmentado o passo da digestão com enzimas não é necessário. Esta técnica dá-nos a informação da expressão de um gene.


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A Hibridação in situ (FISH) de ácidos nucleicos pode ser usada para detectar sequências de DNA ou RNA homólogas em cromossomas ou células intactas , sendo os resultados analisados por examinação microscópica de fluorescência. Esta técnica pode ser utilizada para detectar o locus do gene no cromossoma, e mRNAs específicos em células do mesmo tecido.

Anticorpos como sondas para proteínas Os anticorpos reagem selectivamente com proteínas únicas, sendo proteínas produzidas pelo sistema imunitário (linfócitos B) que reagem contra moléculas (antigénios) presentes em substâncias estranhas, identificando-as. O sistema imunitário produz milhões de anticorpos que identificam antigénios específicos, que podem ser proteínas, hidratos de carbono, etc. Um linfócito apenas produz um tipo de antigénio. Os anticorpos podem ser produzidos pela inoculação de um animal com qualquer proteína estranha. Os anticorpos podem ser criados contra proteínas purificadas de células, tal como outros materiais que podem ser utilizados para imunização. Os anticorpos podem também servir para reconhecer proteínas recombinantes. Existem anticorpos que reconhecem péptidos de 10 a 15 aminoácidos, por isso, conhecendo apenas o inicio do gene que se pretende clonar, é possível produzir anticorpos que reagem contra a proteína inteira. No Western Blotting ou Imunoblot as proteínas extraídas das células são separadas por electroforese em gel de poliacrilamida-SDS, devido aos diferentes tamanhos e carga eléctrica. As proteínas são colocadas numa solução de SDS, um detergente carregado negativamente que se liga às proteínas desnaturando-as (passam a ter uma estrutura linear), ficando também carregadas negativamente. Passam depois para um filtro que permite a reacção com os anticorpos contra a proteína de interesse.


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Western blotting

Na Imunoprecipitação as células são incubadas com aminoácidos radioactivos que vão marcar as suas proteínas. Os extractos celulares marcados são incubados com anticorpos que se ligam com o seu antigénio-alvo. Os complexos anticorpo-antigénio obtidos são isolados e sujeitos a electroforese permitindo a detecção dos antigénios radioactivos por autoradiografia.

Imunoprecipitação

Função de Genes em Eucariótas O estudo da função dos genes requer a sua análise em células ou seres intactos, e não simplesmente de clones moleculares em bactérias. É possível investigar a função de um gene clonado através da sua reintrodução em células eucariótas. Esta abordagem acoplada à capacidade de gerar mutações in vitro, permitiu o uso de DNA recombinante no estudo funcional de genes dos eucariontes mais complexos.

Transferência Genética em Plantas e Animais A função de genes pode ser estudada em seres mais complexos através da introdução de um DNA clonado em células animais – método de transferência genética. A metodologia de introdução de DNA em células animais foi inicialmente desenvolvida para DNAs virais, chamando-se transfecção (transformação+infecção). O DNA pode ser introduzido em células animais por diversos métodos: microinjecção no núcleo celular; coprecipitação de DNA com fosfato de cálcio, formando pequenas partículas que são absorvidas pelas células; incorporação de DNA em vesículas lipídicas (lipossomas), que se fundem com a membrana plasmática, e a exposição temporária de células a um pulso eléctrico que cria poros (electroporação). Grande parte do DNA aborvido pelas células é transportado pelo núcleo onde pode ser transcrito vários dias (expressão passageira). Numa pequena porção de células, o DNA é completamente integrado no genoma e transferido para células da descendência. Se


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o vector possuir um marcador de selecção, pode-se escolher as células correctamente transformadas, cultivando-as num meio que inibe o crescimento de células normais.

Introdução de DNA em células animais

Os retrovírus podem também ser usados como vectores para a inserção de um gene de interesse numa célula animal. Eles são particularmente úteis, uma vez que o seu ciclo de vida envolve a integração estável do DNA viral no genoma da célula infectada.


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Vectores retrovirais

Genes clonados podem também ser introduzidos na linha germinativa de seres multicelulares, permitindo o seu estudo no contexto de um animal intacto, em vez de apenas células em cultura. Um método utilizado para gerar ratos que transportam o gene de interesse (ratos transgénicos) é a microinjecção directa de DNA clonado no pronúcleo de um ovo fertilizado. Os ovos injectados são então transferidos para mães de aluguer, e desenvolvem-se. Uma fracção da descendência terá integrado o DNA de interesse no seu genoma, sendo que este está presente em todas as células do animal. Como o DNa está presente tanto nas somáticas, Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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como nas células da linha germinativa, o DNA de interesse é transferido cruzando a descendência.

Produção de ratos transgénicos

As propriedades de células estaminais embrionárias (ES) providenciam um meio alternativo para a introdução de genes clonados em ratos. As células ES podem ser cultivadas a partir de embriões de ratos precoces, podendo depois ser reintroduzidos na mãe e desenvolver um novo ser. É por isso também possível introduzir o DNA clonado em células ES em cultura, seleccionar as células transformadas de forma estável, e introduzi-las de volta num embrião de rato. Estes embriões originam uma descendência quimérica, na qual algumas células derivam das células embrionárias normais, e outras das células ES transformadas. Em alguns ratos, as células ES são incorporadas na linha germinativa, e o cruzamento destes ratos com outros permite que a descendência herde o gene de interesse.


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Introdução de genes em ratos via células estaminais embrionárias


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Mutagénese de DNAs clonados Em estudos, os genes mutantes são detectados pois resultam em alterações fenotípicas observáveis. Contudo, agora já é possível a introdução de qualquer modificação desejável num gene clonado, e determinar o efeito da mutação na função do gene. A capacidade de introduzir mutações específicas em DNAs clonados (mutagénese) é uma ferramente para o estudo da expressão e função de genes eucariótas. Genes podem ser alterados por procedimentos de mutagénese in vitro, que levam à introdução de delecções, inserções, e alterações de nucleótidos. Um dos métodos consiste na utilização de um oligonucleótido sintético (que carrega a mutação desejada) como primer para a síntese de DNA. As cadeias de DNA sintetizadas a partir deste primer passarão a conter a mutação, e podem ser estudadas: aa específicos de uma proteína podem ser alterados para caracterizar o seu papel na função da proteína.

Introdução de Mutações em genes celulares Geralmente as células usadas como receptoras dos genes clonados têm cópias normais desse gene, nos seus DNAs cromossomais, e estes genes normais continuam a desempenhar as suas funções na célula. Determinar a função biológica de um gene requer a eliminação da actividade celular dos genes normais. Mutação de genes cromossomais baseia-se na habilidade de um gene introduzido numa célula sofrer recombinação homóloga com a sua cópia cromossomal. Na recombinação homóloga, o gene clonado substitui o alelo normal, e por isso, as mutações introduzidas no gene clonado in vitro são incorporadas na cópia cromossomal do gene.

Interferindo com a Expressão Genética Celular Um método utilizado para inibir a expressão de um gene de interesse é a introdução de ácidos nucleicos “antisense”, que são cadeias de RNA ou DNA (de cadeia simples), complementares com o mRNA do gene de interesse, que hibridam com o mRNA e bloqueiam a sua tradução. Os RNAs de interferência (iRNAs) são moléculas de RNA de cadeia dupla, que são clivadas pela enzima DIcer em RNAs de interferência curtos (siRNAs). Estes siRNAs associam-se a complexos (RISC) e são desdobrados em cadeias simples, que ao se hibridarem com o mRNA complementar, induz a sua clivagem por parte do complexo, que depois fica livre para clivar outros mRNAs. A inibição directa da função proteica pode ser conseguida pela: microinjecção de anticorpos que se ligam às proteínas dentro das células, inibindo a sua normal função; adição de proteínas mutantes que interferem com a função das proteínas normais, podendo competir com elas por moléculas alvo.


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Capítulo 5 – Organização e Sequências dos Genomas Celulares A Complexidade dos Genomas Eucariotas O Genoma Eucariótico é muito maior e mais complexo que o procariótico. Contudo o tamanho do genoma de muitos eucariótas não está directamente relacionado com o grau de complexidade genética destes seres. Isto ocorre pois o genoma eucarióta contém não só genes funcionais, mas também grande quantidade de DNA que não codifica proteínas. Assim, da 9

totalidade do genoma humano (6x10 bp) só cerca de 1,5% é que contribuem para a codificação de proteínas

Intrões e Exões Em termos moleculares, gene é um segmento de DNA que é expresso num produto funcional (RNA ou proteína). Muito do DNA eucariótico consiste em sequências entre genes (spacer sequences). Mas dentro do próprio gene também podem existir: Exões (sequências codificantes) e Intrões (sequências não codificantes). O gene é totalmente transcrito a RNA que posteriormente sofre splicing (processamento) - remoção dos intrões, ficando apenas os exões de modo a formar um mRNA maduro.

A estrutura dos genes eucariótas

A quantidade de DNA em intrões é muito maior que em exões, sendo que na maioria dos genes humanos a percentagem de intrões é de aproximadamente 90% do material genético. Os intrões estão presentes na maioria dos genes eucarióticos, excepto nalguns seres mais simples (leveduras) e em alguns procariótas. Todavia, intrões aparecem em genes raros de alguns procariótas. Logo, a presença ou ausência de intrões não permite uma distinção absoluta entre genes procariótas e eucariótas (apesar de prevalecerem principalmente em eucariótas mais complexos). Pensa-se que os intrões representam sequências que foram importantes no inicio da evolução, ou que a facilitaram, permitindo a recombinação de exões de alguns genes. O desaparecimento de intrões em alguns procariótas deve-se à selecção natural por rápida


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replicação (genoma sem intrões é menor e replica-se mais rapidamente), que não foi tão relevante para os eucariótas, que assim mantiveram os seus intrões. Os intrões têm um papel no controlo da expressão genética: a presença de intrões permite que os exões de um gene sejam combinados de formas diferentes, resultando na síntese de diferentes proteínas. Este processo denomina-se splicing alternativo, e é responsável por estender o reportório funcional de 20 a 25 mil genes do genoma humano (por isso é que são sintetizados mais tipos diferentes de proteínas que o número de genes diferentes existente). Os intrões podem também ter ajudado a evolução, facilitando a recombinação entre exões de diferentes genes – exon shuffling. Isto é suportado pelo facto de alguns genes serem quimeras de exões derivados de vários outros genes.

Sequências de DNA Repetitivas Os intrões contribuem muito para o grande tamanho dos genomas eucariótas, constituindo aproximadamente 20% do genoma humano. Porém, uma porção ainda maior do genoma de eucariótas complexos consiste um sequências de DNA não codificantes altamente repetidas. A sua existência foi demonstrada durante estudos dos rácios de reassociação de fragmentos de DNA celular desnaturados. As cadeias de DNA desnaturado hibridam umas com as outras (reassociam-se), voltando a formar moléculas de cadeia dupla. Como a reassociação de DNA é uma reacção bimolecular (duas cadeias separadas de DNA desnaturado devem colidir para hibridarem), o rácio de reassociação depende da concentração das cadeias de DNA. Quando fragmentos do DNA de E.coli eram desnaturados e hibridados, seria esperado que todos hibridassem ao mesmo ritmo, no caso de cada sequência (fragmento) surgir uma vez apenas no genoma. Contudo, estudos demonstraram que, aproximadamente 50% dos fragmentos de DNA reassociavam ao ritmo esperado (caso cada sequência estivesse presente apenas uma vez no genoma), mas os restantes fragmentos reassociavam muito mais rapidamente que o esperado. Isto acontece pois algumas sequências estavam presentes no genoma um um´ltiplas cópias e, consequentemente, reassociavam-se mais rapidamente que as sequências que ocorriam apenas uma vez no genoma. Descobriu-se que aproximadamente 50% do DNA dos mamíferos é composto por sequências altamente repetitivas.

Tipos de sequências repetitivas Repetições de sequências simples são múltiplas cópias de pequena sequências de DNA, que podem ser separadas do resto do genoma por uma centrifugação de equilíbrio em gradiente de densidade de CsCl. As sequências ricas em A=T são menos densas que as ricas em G≡C. As sequências repetitivas aparecem como bandas afastadas da banda principal de DNA, denominando-se de DNAs satélite. Estas sequências não são transcritas, nem contêm informação genética, podendo desempenhas um papel importante na estrutura dos cromossomas. SINEs e LINEs são respectivamente elementos curtos dispersos e elementos longos dispersos, que fazem parte do conjunto de elementos repetitivos de DNA dispersos, que contribuem para aproximadamente 45% do tamanho do genoma. Alguns SINEs e LINEs são transcritos e até codificam proteínas, mas não têm função fisiológica a nível celular. Ambos são exemplos de Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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elementos do tipo transposão, mais especificamente retrotransposões (capítulo 6), o que significa que a sua transposição é mediada pela transcriptase reversa. Uma terceira classe de elementos dispersos são os elementos tipo-retrovírus (8% do DNA humano), que também se movem no DNA como retrotransposões. Uma quarta classe de elementos dispersos, os Transposões de DNA (3% do DNA humano), movem-se ao longo do genoma, sendo copiados e reinseridos como sequências de DNA, em vez de se moverem por meio da transcrição reversa. Assim, praticamente metade do genoma humano consiste em elementos repetitivos dispersos, que se replicaram e moveram ao longo do genoma, por meio de intermediários de DNA ou RNA. Assim, 40% do genoma humano deve-se à transcrição reversa. Algumas destas sequências ajudam a regular a expressão genica, mas a maioria parece não ter contribuição para a célula, representando “selfish DNA elements”, que foram seleccionados, pela sua capacidade de se replicarem no genoma do hospedeiro, mais do que por lhe conferirem uma vantagem selectiva.

Duplicação de Genes e Pseudogenes Outro factor que contribui para o tamanho do genoma de eucariótas é que muitos genes estão presentes em múltiplas cópias, algumas das quais não são funcionais. Nalguns casos, cópias múltiplas de genes são necessárias para produzir RNAs ou proteínas em grandes quantidades (rRNAs e histonas). Noutros casos, membros distintos de um grupo de genes relacionados (família de genes) podem ser transcritos em tecidos diferentes ou em diferentes fases do desenvolvimento. As famílias de genes surgiram possivelmente pela duplicação de um gene ancestral original, com os diferentes membros da família a divergirem como consequência de mutações durante a evolução, e esta divergência levou à evolução de proteínas relacionadas que são optimizadas para funcionarem em diferentes tecidos ou fazes do desenvolvimento. Contudo, nem todas as mutações aumentam a funcionalidade de um gene, e algumas cópias de genes podem ter sofrido mutações que resultaram na perda da sua capacidade de gerar um produto funcional. Estes genes não funcionais, os pseudogenes, são relíquias da evolução que aumentam o tamanho dos genoma eucarióticos. As duplicações de genes surgem por dois mecanismos: 1. Duplicação de um segmento de DNA → Transferência de um bloco de DNA para uma nova localização no genoma – Representam 5% do genoma 2. Transcrição reversa de um mRNA → integração do cDNA num novo local do genoma – gera cópias que não contêm intrões e não contem as sequências cromossomais que induzem a transcrição do gene a mRNA. Assim, a duplicação de um gene por transcripção reversa normalmente gera uma cópia inactiva do gene, chamada pseudogene processado (2/3 dos pseudogenes do genoma humano).

Composição dos Genomas de Eucariótas Genoma da E.coli Contém aproximadamente 4 000 genes, sendo 90% do genoma sequências que codificam proteínas.


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Genoma da levedura Só 4% do seu genoma contém intrões, sendo 70% do genoma sequências que codificam um total de 6 000 proteínas. Genomas de C.elegans e Drosophila São 10 vezes maiores que o da levedura, mas contêm apenas 2 a 3 vezes mais genes, contendo mais intrões. Genoma de seres humanos É 20 a 30 vezes maiores que o da C.elegans e Drosophila mas contém apenas 20 000 a 25 000 genes. Apenas 1,2% do genoma humano codifica proteínas, sendo 20% constituído por intrões, e mais de 60% constituído por vários tipos de sequências repetitivas ou duplicações de DNA, sendo que o restante corresponde a pseudogenes, e exões que estão presentes nas extremidades 5’ e 3’ dos mRNAs mas não são traduzidos a proteínas. Concluindo, o tamanho aumentado dos genomas de eucariótas superiores deve-se muito mais à presença de grandes quantidade de sequências repetitivas e intrões do que ao aumento no número de genes.

Cromossomas e Cromatina O genoma de procariótas contém cromossomas únicos, que são normalmente moléculas de DNA circular, enquanto que o genoma de eucariótas é composto por vários cromossomas, contendo cada um uma molécula de DNA linear. O DNA de células eucariótas está ligado a pequenas proteínas (histonas) que compactam o DNA de forma ordenada no núcleo.

Cromatina Chama-se cromatina ao complexo formado pelo DNA e as proteínas. As proteínas mais abundantes são as histonas que contêm uma proporção alta de aminoácidos básicos que facilitam a ligação à molécula de DNA carregada negativamente. Existem outras proteínas para além das histonas (nonhistone chromossomal proteins) que participam em vários processos como a replicação de DNA e a expressão genética.


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A organizção de cromatina em nucleossomas

O nucleossoma é a unidade estrutural básica da cromatina, que consiste em DNA enrolado num núcleo de histonas. O cromatossoma a subunidade da cromatina que consiste numa sequência de 166 pb enroladas à volta do núcleo das histonas. O empacotamento do DNA com as histonas compõem uma fibra de cromatina composta por cromatossomas separados por segmentos de DNA ligante (DNA linker).

Estrutura de um cromatossoma

A condensação da cromatina varia durante o ciclo celular: Em Interfase a maior parte da cromatina está relativamente descondensada (eucromatina) e distribuída ao longo do núcleo. Em interfase os genes são expressos e o DNA é replicado (preparação para a divisão celular). Os genes que são mais expressos estão num estado mais descondensado para facilitar o acesso da maquinaria de transcrição. Todavia, 10% da cromatina em interfase está altamente condensada (heterocromatina) e estando inactiva para transcrição, contendo também muitas sequências repetitivas. Durante a Mitose os cromossomas estão muito condensados e não podem servir de molde para a síntese de RNA, pelo que a transcrição cessa.


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Centrómeros O centrómero é uma região especializada do cromossoma que assegura a distribuição correcta dos cromossomas duplicados pelas células filhas, durante a mitose. 1. O DNA é replicado durante a interfase, resultando na formação de 2 cópias de cada cromossoma; 2. Assim que a célula entra em mitose, a condensação da cromatina leva à formação de cromossoma que consistem em 2 cromatídeos idênticos, que estão ligados na região do centrómero; 3. Os microtúbulos do fuso acromático ligam-se ao centrómero e os 2 cromatídeos separam-se e movem-se para pólos opostos. 4. No fim da mitose, a membrana nuclear é reposta e os cromossomas descondensam Assim, os centrómeros servem de locais de associação entre os cromatídeos e os microtúbulos, consistindo em sequências especificas de DNA à qual proteínas (centromere-associated proteínas) se ligam, formando uma estrutura especializada: “kinetochore” ou cinetocoro. É a ligação dos microtúbulos ao cinetocoro que medeia a junção dos cromossomas ao fuso acromático. As proteínas associadas aos centrómeros actuam como motores moleculares que conduzem o movimento dos cromossomas ao longo das fibras

O centrómero de um cromossoma em metáfase

Telómeros Os telómeros são sequências no final dos cromossomas eucariótas que são importantes para a replicação e manutenção. Consistem em sequencias simples de DNA repetidas, contendo Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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resíduos G numa cadeia. Estas sequências são repetidas milhares de vezes terminando com uma cadeia simples de DNA. As sequências repetidas do telómero formam loops no final dos cromossomas aos quais se juntam proteínas que protegem a terminação do cromossoma da degradação. Os telómeros são importantes para a replicação do final das moléculas de DNA linear. A DNA polimerase é capaz de estender uma cadeia de DNA em crescimento, mas não é capaz de iniciar a síntese na extremidade 5’ de uma cadeia de DNA linear (é nesta extremidade que se liga o primer para a replicação, pelo que a extremidade 5’ não é replicada). Assim, as extremidades dos cromossomas não podem ser replicados pela acção normal da DNA polimerase. A manutenção dos telómeros parece determinar a capacidade reprodutiva das células. Esta manutenção é realizada pela Telomerase, que é uma proteína capaz de produzir telómeros e de os associar à molécula que está a ser replicada para continuar a replicação. É uma transcriptase reversa da classe das DNA polimerases que sintetiza DNA a partir do RNA. Ela carrega consigo o RNA que lhe serve de molde e que é complementar às sequências repetidas que sintetiza – os telómeros.

Estrutura de um telómero

Sequências de Genoma Completos O Genoma Humano - Experiência As Experiências Dois grupos de cientistas abordaram a questão de sequenciar o genoma humano de formas diferentes. A equipa liderada por Eric Lander sequenciou fragmentos de DNA a partir de clones BAC (Bacterial Artificial Chromossome), que tinham sido mapeados para cromossomas humanos previamente. Em contraste a equipa de Craig Venter usou um método no qual fragmentos de DNA eram sequenciados ao acaso, e a sobreposição de fragmentos era utilizada para montar o genoma completo. Contudo, ambas as técnicas apenas cobriam as porções de eucromatina, deixando a heterocromatina por sequenciar. Estas experiências iniciais


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funcionaram como esboços para que com esforços subsequentes se completasse a sequenciação do genoma. O Impacto Descobriu-se que o número de genes humanos eram muito pequeno (20 a 25 mil genes), e ao que parece, o splicing alternativo é muito comum no genoma humano, pelo que muitos genes codificam mais que uma proteína. Além disso, os intrões representam 20 % do genoma humano, e as sequências repetitivas aproximadamente 60%. É de realçar ainda que 40% do genoma humano é composto por sequências que derivaram da transcrição reversa.


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Capítulo 6 – Replicação, Manutenção, e Rearranjos no DNA Genómico Replicação do DNA A enzima central envolvida na replicação de DNA é a DNA polimerase, que catalisa a junção de desoxiribonucleósidos 5’-trifosfato (dNTPs) para formar a cadeia de DNA em crescimento. Mas outras proteínas estão também envolvidas, bem como mecanismos de proofreading. Proteínas e sequências de DNA específicas são ainda necessárias para iniciar a replicação, como para copiar as extremidades de cromossomas eucariótas.

DNA polimerases A polimerase I descoberta na E.coli é a principal responsável na reparação de DNA danificado. As células eucariótas e procariótas contêm DNA polimerase diferentes, que têm funções diferentes, como replicação e reparação. Nos procarionte, a DNA polimerase III é a polimerase responsável pela replicação do DNA. Em eucariontes, existem 3 DNA polimerases (α, δ e ε) responsáveis pela replicação do DNA. Finalmente, a DNA polimerase γ está localizada na mitocôndria e é responsável pela replicação do DNA mitocondrial. Todas as DNAs polimerase tem 2 características fundamentais: 1. Todas sintetizam apenas na direcção 5’→3’, adicionando um dNTP ao grupo hidroxilo do carbono 3’ da cadeia em crescimento. 2. Apenas conseguem adicionar dNTPs a uma cadeia primer pré-formada, não são capazes de iniciar a síntese de DNA de novo, ao catalisar a polimerização de dNTPs livres. As RNA polimerases por outro lado, conseguem iniciar a síntese de uma nova cadeia de RNA na ausência de um primer. Estas características das DNA polimerases atribuem um alto grau de fidelidade à replicação.


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Reacção catalisada pela DNA polimerase

Forquilha de Replicação As forquilhas de replicação são regiões de síntese de DNA activa. Em cada forquilha, as cadeias pais de DNA separam-se e as duas novas cadeias filhas são sintetizadas. Mas, se as duas cadeias da dupla hélice são antiparalelas (correm em sentidos opostos), a síntese contínua das duas cadeias na forquilha de replicação requereria que uma cadeia fosse sintetizada no sentido 5’→3’ e a outra no sentido 3’→5’. Mas as DNA polimerases apenas adicionando dNTPs no sentido 5’→3’. Como pode então a outra cadeia ser sintetizada? Estudos demonstram que apenas uma cadeia é sintetizada de uma forma contínua na direcção global da replicação de DNA, sendo que a outra é formada de curtos pedaços de DNA sintetizados no sentido contrário ao do movimento da forquilha de replicação. Estes pedaços, fragmentos de Okazaki, são juntos pela acção da DNA ligase, formando uma nova cadeia de DNA intacta. A cadeia sintetizada continuamente é chamada de leading strand, enquanto que a outra cadeia (dos fragmentos de Okazaki) se denomina lagging strand.


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Síntese da leading e da lagging strads de DNA

Como é então iniciada a síntese dos fragmentos de Okazaki? Pequenos fragmentos de RNA servem como primers para a replicação de DNA. A síntese de RNA pode iniciar-se de novo, através da enzima primase, que sintetiza pequenos fragmentos de RNA, complementares à lagging strand, na forquilha de replicação. Os fragmentos de Okazaki são depois sintetizados estendendo estes primers de RNA através da actividade da DNA polimerase.

Iniciação dos fragmentos Okazaki com primers de RNA

Para se formar uma lagging strand contínua de DNA, os primers de RNA devem ser removidos e substituídos por DNA. Em procariontes a DNA polimerase I encarrega-se de remover os primers de RNA, funcionando também como uma exonuclease, que hidrolisa DNA ou RNA em ambas a direcções. A acção de exonuclease da DNA polimerase I no sentido 5’→3’ remove os ribonucleótidos das extremidades 5’ dos fragmentos de Okazaki, permitindo que estes sejam substituídos por dNTPs, gerando fragmentos constituídos apenas por DNA. Em eucariontes, os primers de RNA são removidos pela actividade conjunta de RNase H (degrada o RNA de híbridos RNA-DNA) e exonucleases 5’→3’. Os espaços são preenchidos pela DNA polimerase δ e os fragmentos de DNA são ligados pela DNA ligase, gerando uma lagging strand intacta. Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Remoção dos primers de RNA e junção dos fragmentos de Okazaki

Funções das DNAs polimerases E.coli

Células de Mamífero

Síntese da leading strand

pol III

pol δ/ε

Síntese da lagging strand

Primase + pol III

pol α/primase + pol δ/ε

Existem outras proteínas que actuam ao nível da forquilha de replicação. Uma classe de proteínas liga-se às DNAs polimerases e mantém-nas ligadas ao molde de DNA, para que continuem a síntese da nova cadeia de DNA. Estas proteínas formam complexos com as DNA polimerases responsáveis pela polimerização das cadeias, reconhecendo e ligando-se à porção de DNA entre o primer de RNA e o molde de DNA. O anel formado por este complexo mantém a associação necessária entre a DNA polimerase e o molde de DNA, para que a replicação proceda, permitindo a síntese ininterrupta de milhares de nucleótidos de DNA.


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Proteínas acessórias da polimerase

Outras proteínas desdobram o molde de DNA e estabilizam as regiões de cadeia simples. As helicases são enzimas que catalisam o desdobramento do DNA pai (acoplado com a hidrólise de ATP) a jusante da forquilha de replicação. Depois o DNA desdobrado é estabilizado por proteínas de ligação ao DNA de cadeia simples, que mantêm o molde de DNA desdobrado e estendido numa cadeia simples, para que possa ser copiado pela polimerase. O desdobramento da cadeia de DNA na forquilha de replicação causa o enrolamento do DNA sobre si próprio, que é evitado pela acção de topoisomerases. A síntese simultânea da leading e da lagging strand na forquilha de replicação é conseguida através da formação de dímeros de DNAs polimerases, auxiliadas pelas proteínas acessórias. Em eucariontes, as histonas ligadas à cromatina do DNA pai são divididas pelas cadeias de DNA filhas, e novas histonas são depois adicionadas.


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Modelo da forquilha de replicação da E.coli

Fidelidade da Replicação A precisão na replicação de DNA é crítica para a reprodução de uma célula. A frequência de erros durante a replicação corresponde à incorporação de uma base incorrecta por cada 108 a 109 nucleótidos incorporados. A selecção de uma base simplesmente pela sua ligação por hidrogénio à base complementar resultaria numa frequência de erros na ordem de uma base incorrecta a cada 100 a 1000 nucleótidos incorporados. Assim, o elevado grau de fidelidade atingido resulta em grande parte das actividades da DNA polimerase. A DNA polimerase não catalisa a incorporação de qualquer nucleótido que se ligue por pontes de hidrogénio à cadeia molde. Em vez disso, discrimina activamente a incorporação de bases não correspondentes. Além disto, existe outro mecanismo responsável pela precisão da replicação de DNA, que é a actividade de proofreading da DNA polimerase. As DNA polimerases replicativas têm actividade de exonuclease na direcção 3’→5’. Esta exonuclease remove selectivamente bases incorrectamente emparelhadas incorporadas na extremidade da cadeia em crescimento, aumentando a precisão da replicação.


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Proofreading pela DNA polimerase

Quando o DNA é sintetizado na direcção 5’→3’, a energia requerida para a polimerização deriva da hidrólise do grupo trifosfato 5’ de um dNTP livre aquando da sua reacção com o grupo hidroxilo 3’ da cadeia em crescimento. Se o DNA se estendesse no sentido 3’→5’, a energia para a polimerização derivaria da hidrólise do grupo trifosfato 5’ do nucleótido terminal já incorporado na cadeia. Este arranjo eliminaria a possibilidade de proofreading, pois a remoção de um nucleótido terminal mal emparelhado eliminaria também o grupo trifosfato 5’ necessário como fonte de energia para a elongação posterior da cadeia. Assim, como a síntese do DNA se dá no sentido 5’→3’ pode-se assegurar uma maior precisão no processo de replicação.


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Existem ainda mecanismos adicionais (Reparação de DNA) que permitem a remoção de bases incorrectamente incorporadas na nova cadeia de DNA, contribuindo também para a correcta replicação da informação genética.

Origens e Iniciação da Replicação A replicação do DNA, tanto de procariontes como de eucariontes, começa em locais chamados Origens de Replicação, que servem de locais de ligação para as proteínas que iniciam o processo de replicação. Origem de Replicação em E.coli Em E.coli, a replicação inicia-se num local único do cromossoma, designado origem (ori). O primeiro acontecimento é a ligação de uma proteína iniciadora à ori do DNA, que leva ao desdobramento parcial do DNA. O restante desdobramento é efectuado pela helicase e assegurado pelas proteínas de ligação ao DNA de cadeia simples. Depois primers de RNA são sintetizados pela primase. Surgem assim duas forquilhas de replicação na origem, que se movem em direcções opostas ao longo da molécula de DNA circular.

Apesar de origens de replicação únicas serem suficientes para replicar os genomas virais e bacterianos, múltiplas origens são necessárias para replicar os genomas muito maiores dos eucariontes durante um período de tempo razoável. Nas leveduras as origens de replicação denominam-se ARS (autonomuosly replicating sequences), e são os locais de ligação dum complexo proteico, o ORC (origin recognition complex), que é necessário para a iniciação da replicação de DNA em origens de leveduras. Este complexo ORC recruta outras proteínas (helicases, etc) para a origem, levando à iniciação da replicação. A função das proteínas do complexo ORC é a mesma para todos os eucariontes, das leveduras aos mamíferos. Contudo, para eucariótas mais complexos, a iniciação da replicação pode ser determinada por aspectos como a estrutura da cromatina.

Telómeros e Telomerase: Manutenção das extremidades de cromossomas Como as polimerases apenas estendem primers no sentido 5’→3’, são incapazes de copiar a extremidade 5’ de moléculas de DNA lineares. São necessários mecanismos para replicar as sequências lineares terminais (telómeros) dos cromossomas eucariótas. Os telómeros consistem em sequências de repetições simples de DNA, e são mantidos pela actividade da enzima telomerase, que catalisa a síntese de telómeros na ausência de um molde de DNA. A telomerase é uma transcriptase reversa, uma classe de DNA polimerases que sintetizam o DNA a partir de um molde de RNA. A telomerase transporta consigo o seu próprio molde de RNA, que é complementar às sequências repetitivas do telómero, como parte do seu complexo enzimático. O uso deste molde de RNA permite à telomerase gerar múltiplas cópias das


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sequências repetitivas dos telómeros, mantendo-os na ausência de um molde de DNA para dirigir a sua síntese.

Acção da telomerase O DNA dos telómeros é uma sequência de repetições simples, com uma extremidade 3’ de cadeia simples, na leading strand. A telomerase transporta a sua própria molécula de RNA, que é complementar ao DNA dos telómeros. A extremidade 3’ de cadeia simples emparelha com o RNA da telomerase, que serve de molde para a extensão da leading strand por uma unidade de repetição. A lagging strand de DNA telomérico pode então ser elongada por priming de RNA convencional e actividade da DNA polimerase. Defeitos na telomerase e a normal manutenção dos telómeros estão associados a inúmeras doenças humanas. A actividade da telomerase é regulada em células em divisão de forma a manter o tamanho dos telómeros. Apesar de nas células embrionárias o tamanho dos telómeros não ser afectado, nas células somáticas a actividade da telomerase não é suficiente para manter o tamanho dos telómeros por um número indefinido de divisões. Assim, os telómeros encurtam gradualmente com a idade, levando à morte celular. Muitos síndromas de envelhecimento precoce estão ligados à perda anormal e elevada de telómeros. Por outro lado, células cancerosas exprimem elevados níveis de telomerase, permitindo-lhes continuar a dividir indefinidamente.


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Acção da Telomerase


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Reparação de DNA O DNA pode sofrer mutações durante a replicação, através da incorporação incorrecta de bases. Pode também sofrer mudanças químicas espontâneas ou como resultado da exposição a químicos ou radiações. Tais danos ao DNA podem bloquear a replicação ou transcrição. Para manter a integridade dos genomas, as células desenvolveram mecanismos de reparação de DNA, que se didivem em duas classes: reversão directa da reação química responsável pelos danos; remoção das bases danificadas seguida da subsitituição por novos nucleótidos. Quando a reparação de DNA falha, outros mecanismos celulares entram em acção. Existem duas formas de danificação espontânea do DNA: desaminação (perda da amina – NH2) da adenina, citosina e guanina; e depurinação (perda das bases de purinas), que resulta da quebra da ligação entre as bases de purina e a desoxirribose.

Danificação espontânea do DNA


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Reversão directa de danos a DNA A luz UV é uma das maiores fontes de danos para o DNA, e geralmente induz a formação de dímeros de pirimidinas, nos quais pirimidinas adjacentes na mesma cadeia de DNA se juntam através da formação de um anel. A formação destes dímeros distorce a estrutura do DNA e bloqueia a transcrição ou replicação a jusante do local danificado. Um mecanismo de reparação é a reversão directa desta dimerização, chamado fotoreactivação, pois a energia derivada da luz visível é utilizada para quebrar a estrutura do anel.

Reparação por excisão A maioria dos DNAs é reparada por excisão do DNA danificado. O intervalo é então preenchido pela síntese de novo DNA, recorrendo à cadeia complementar como molde. Na reparação por excisão, certos tipos de bases podem ser removidas nuns casos, e noutros, grupos de nucleótidos podem ser removidos, sendo detectados por distorções na estrutura do DNA.

Síntese de DNA translesão Existem DNA polimerases (pol V) especializadas na replicação de DNA através de uma zona de DNA danificado, apesar da sua actividade possuir uma alta taxa de incorporação incorrecta de bases.

Reparação Recombinacional O DNA danificado pode ser substituído pela recombinação com uma molécula íntegra. Este mecanismo é muito importante em casos de reparação de DNA durante a replicação, e de quebras de DNA em ambas as cadeias.

Recombinação entre Sequências Homólogas de DNA É importante a precisão da replicação e reparação do DNA de modo a manter a informação genética, no entanto é igualmente importante a recombinação de forma a que genes sejam rearranjados de diferentes formas, contribuindo para a diversidade genética das espécies.

Modelos de Recombinação Homóloga A recombinação envolve a quebra e rejunção das moléculas de DNA. O alinhamento entre moléculas de DNA homólogas é feito através do emparelhamento de bases complementares. Moléculas de DNA com quebras numa das cadeias (nicks), geram porções livres que invadem a outra molécula de DNA homóloga, formando uma junção cruzada, a junção Holiday. Moléculas recombinantes são então formadas pela clivagem e religação dessas cadeias cruzadas.

Enzimas Envolvidas na Recombinação Homóloga As enzimas envolvidas na recombinação catalisam não só a troca de cadeias entre DNAs homólogos, mas também a formação de nicks e o desdobramento dos DNAs e e formação das junções Holiday.

Rearranjos de DNA A recombinação homóloga rearranja os cromossomas homólogos, mas não produz alterações nas posições dos genes ao longo do genoma. Estes fenómenos de rearranjo que movem os Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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genes ao longo do genoma são importantes tanto para a regulação génica, como para a evolução de geração de biodiversidade.

Recombinação Site-Specific Com ampla homologia entre as sequências, a recombinação site-specific ocorre entre sequências especificas do DNA, normalmente homólogas em apenas uma pequena parte do DNA. Esta interacção é mediada por proteínas e não por complementaridade de bases. Um exemplo desta recombinação é a integração e remoção do DNA viral aquando da infecção da E.Coli pelo bacteriófagoγ. Esta recombinação é ainda importante para os rearranjos programados que ocorrem nos genomas celulares, como é o caso do desenvolvimento do sistema imunológico. Os anticorpos são resultado deste tipo de recombinação entre os genes para as imunoglobulinas (linfócitos B) e os receptores de células T, o que lhes permite identificar um grande número de antigénios. As RAG 1 e RAG 2 estão envolvidas em processos de clivagem e junção na recombinação site-specific para a formação de anticorpos.

A recombinação VDJ

Transposição através de Intermediários de DNA A transposição é o movimento de sequências através do genoma, e não requer homologia. Os transposões são os elementos transponíveis, podendo ser de dois tipos: através de intermediários de DNA ou RNA. Os transposões são sequências de inserção, flaqueados por sequências repetitivas, ou outros genes, e que se movem como uma unidade. Geralmente as sequências de inserção movem-se de um local no cromossoma para outro, mas existem certos tipos de transposões que sofrem


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replicação e integração num novo local, ficando a sequêncoa de inserção original no seu local inicial.

Transposão via um DNA intermediário

Transposição através de Intermediários de RNA Muitos transposões em eucariótas movem-se através de intermediários de RNA (retrotransposões) em vez de DNA, sendo o seu mecanismo de transposição similar à replicação dos retrovírus. Os LTRs são sequências repetitivas de várias centenas de nucleótideos em ambas as extremidades do DNA viral. Os retrotransposões de classe I são idênticos a retrovírus e possuem LTRs, enquanto retrotransposões classe II não possuem LTRs. Nos mamíferos a principal classe desses retrotranspõsoes consiste em elementos longos dispersos altamente repetitivos – LINEs. Outros elementos que não codificam as suas próprias transcriptases reversas e que também sofrem transposição através de RNA são os elementos repetitivos dispersos curtos – SINEs. Estes não codificam proteínas, logo representam pseudogenes que surgem através da transposição mediada por RNA. Os pseudogenes processados correspondem a pseudogenes que surgiram, similarmente, por transcrição reversa de pequenos mRNAs.


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Formação de um pseudogene processado

Amplificação Génica A amplificação génica resulta na replicação repetitiva de uma certa região do cromossoma. Em certos casos, a amplificação génica serve para aumentar a expressão genética durante o desenvolvimento. A amplificação também ocorre frequentemente em células cancerosas, onde pode resultar na elevada expressão de genes que contribuem para a proliferação celular descontrolada.

Amplificação génica


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Capítulo 7 - Processamento e Síntese de RNA Transcrição em procariotas O mRNA foi primeiro descoberto na E.Coli, e foi também deste organismo que se purificou e estudou pela primeira vez a RNA polimerase.

RNA polimerase e Transcrição A principal enzima responsável pela síntese de RNA é a RNA polimerase, que catalisa a polimerização de ribonucleótidos. A síntese de RNA é semelhante à de DNA, mas a RNA polimerase não precisa de um primer, como a DNA polimerase, para iniciar a síntese. Assim, a transcrição começa de novo em locais específicos no início dos genes. A RNA polimerase é uma enzima complexa, constituída por múltiplas cadeias polipeptídicas e várias subunidades - α, β, β’, ω, σ. Esta última tem uma fraca ligação e facilmente se separa das outras. A RNA polimerase é capaz de fazer a transcrição sem a subunidade σ, mas sem ela não se consegue ligar especificamente às sequencias de DNA que sinalizam o início da transcrição – a subunidade σ é essencial para o inicio da transcrição. A sequencia especifica de DNA ao qual a RNA polimerase se liga para dar inicio à transcrição é chamada promotor. A região antes do inicio da transcrição contem dois sets de sequências que são semelhantes numa série de genes. Estes sets têm 6 nucleótidos cada, e localizam-se nas posições -10 e -35, relativamente ao inicio da transcrição, nucleótido +1.

Sequências de promotores de E.coli

Primeiro, genes com promotores que diferem destas sequências consenso são transcritos menos eficientemente do que genes com promotores com sequências mais próximas. Segundo, mutações nas sequências consenso -10 ou -35 têm fortes efeitos na funcionalidade do promotor. Terceiro, os locais onde a RNA polimerase se liga ao promotor foram identificados por experiencias footprinting. A subunidade σ liga-se especificamente a sequências nas regiões -10 e -35 do promotor, confirmando a importância destas sequências. O DNA footprinting é uma técnica que permite identificar exactamente onde uma proteína se liga ao DNA (por exemplo a identificação dos locais de ligação da RNA polimerase).


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Footprinting de DNA

Concluindo, na ausência de σ a RNA polimerase liga-se não especificamente ao DNA, com baixa afinidade. σ direcciona a RNA polimerase para o promotor, levando ao inicio da transcrição. Após a adição de cerca de 10 nucleótidos, a subunidade σ é libertada da RNA polimerase, que depois deixa o promotor e continua a elongação. À medida que avança, a RNA polimerase desenrola a cadeia de DNA à frente, e volta a enrolar atrás.


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Transcrição na E.coli pela RNA polimerase

A síntese continua até a polimerase encontrar um sinal de terminação. A transcrição cessa, o RNA é libertado da polimerase, e a enzima desassocia-se. Há dois mecanismos alternativos: 1. O mais simples – inversão simétrica da sequência repetida GC seguida de aproximadamente 7 A. Isto leva a à formação de um segmento de RNA que pode formar um loop estável por complementaridade de bases, que por sua vez leva à quebra da sua associação com a cadeia de DNA e termina a transcrição. 2. Pode ser terminada por uma proteína específica (Rho) que se liga a segmentos de grande extensão.


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Terminação da transcrição

Repressores e controlo negativo da transcrição A transcrição pode ser regulada tanto no início como durante a transcrição. Mas a grande maioria é no início. Foi analisado o caso da expressão de enzimas envolvidas no metabolismo da lactose na E.Coli. A enzima que catalisa a clivagem da lactose é a β-galactosidase e é apenas expressa quando a lactose está presente na bactéria. Quando não está a célula economiza. A lactose por isso, induz a síntese de enzimas que a degradam. O metabolismo da lactose envolve o produto de dois linked-genes: a lactose permease- transporta a lactose para a célula; a transacetilase – inactiva uma série de enzimas tóxicas que entram na célula com a permease. Foram isolados mutantes que tinham defeitos na regulação de genes envolvidos no metabolismo da lactose. Várias experiências foram feitas que fizeram perceber que alelos estavam envolvidos e que mutações eram dominantes ou recessivas. O conjunto de genes que codifica a β-galactosidade, permease e a transacetilase é chamado operão. O operador controla a transcrição. O gene i codifica uma proteína que regula a transcrição ligando-se ao operador. Esta proteína é denominada repressor, porque quando ligada ao operador bloqueia a transcrição. Na presença de lactose, esta liga-se ao repressor, inactivando. Como o repressor já não se pode ligar ao operador, a transcrição do operão iniciase. O principio da regulação por genes é que o controlo da transcrição é mediado por sequências especificas de DNA. Este sistema é aplicável a procariótas e a eucariótas.


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Controlo negativo do operão lac

Controlo positivo da transcrição O efeito da glicose na expressão de genes envolvidos no seu metabolismo é um bom exemplo de controlo positivo da transcrição. A glicose é sempre preferencialmente usada, por isso, enquanto esta estiver disponível, as enzimas envolvidas noutros catabolismos de fontes de energia alternativas, não são expressas.

RNA polimerases eucariótas e Factores de transcrição A transcrição é mais complexa nas células eucariótas. Estas contêm RNA polimerases múltiplas, que precisam de interagir com uma grande variedade de proteínas adicionais para iniciar a transcrição.

RNA polimerases eucariotas Existem três diferentes: 1. Genes de proteínas codificantes são transcritos pela RNA polimerase II 2. rRNA e tRNA são transcritos pela RNA polimerase I e III. 3. A RNA polimerase II transcreve também microRNA (importantes reguladores na transcrição e tradução em eucariótas). Apesar de reconhecerem diferentes promotores e transcreverem diferentes classes de genes, as RNA polimerases têm características comuns.


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Factores de transcrição e Início da transcrição pela RNA polimerase II RNA polimerase II foi o foco da maior parte dos estudos na transcrição em células eucariótas. Ao contrário da RNA polimerase das bactérias que consegue começar a transcrição apenas com a subunidade σ, a RNA polimerase II não. Precisa de uma série de proteínas, factores de transcrição, que não estão associados à RNA polimerase. Cerca de 10% dos genes do genoma humano codificam factores de transcrição. O promotor de muitos genes transcritos pela polimerase II contém uma sequência semelhante a TATAA localizada entre 25-30 nucleótidos acima do local de inicio da transcrição. Esta sequência – TATA box – assemelha-se à sequência em -10 no promotor das bactérias. Os promotores da polimerase II contêm ainda uma segunda sequência bastante importante – uma sequência de iniciação ou Inr. Apesar de alguns promotores possuírem estas duas sequências, há outros que apenas têm uma delas. Muitos promotores que não têm a TATA box, mas têm a sequência Inr têm uma sequência adicional – DPE – que funciona em cooperação com a sequência Inr. O primeiro passo na formação do complexo de transcrição é a ligação do factor de transcrição TFIID ao promotor. Este factor é ele próprio constituído por várias subunidades. De seguida liga-se o factor TFIIB, que vai fazer de ponte entre o promotor e a RNA polimerase II. Mais três factores são adicionados – TFIIF, TFIIH, TFIIE. Estes têm subunidades que são helicases, proteínas cinase, etc. O terminal C da polimerase II é constituído por tandem repeats de 7 aminoácidos. A fosforilação destes aminoácidos liberta da polimerase da sua associação com o complexo inicial e leva ao recrutamento de outras proteínas que permitem a RNA polimerase II começar a transcrição. Um grande complexo de proteínas denominado Mediator, é também necessário. Consiste em 20 subunidades diferentes e é essencial a uma série de regulações.

Transcrição pela RNA polimerase I e III As RNA polimerases I e III também necessitam de factores de transcrição adicionais para se ligarem aos promotores dos genes que codificam rRNAs, tRNAs e snRNAs

Regulação da transcrição em Eucariotas Como nas bactérias, a transcrição em seres eucariótas é controlada pela ligação de proteínas a sequências de regulação específicas que modulam a actividade da RNA polimerase. Um diferença importante, no entanto, consiste na condensação do DNA em cromatina, que limita a sua disponibilidade para molde de transcrição. Como resultado, modificações na estrutura da cromatina têm um importante papel no controlo da transcrição nas células eucariótas.

Sequências Cis-acting reguladoras: Promotores e Enhancers A transcrição em bactérias é regulada pela ligação de proteínas a sequências cis-acting que controlam a transcrição de genes adjacentes. Nas células eucariótas há sequencias que desempenham um papel semelhante.


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Promotor eucarióta

Genes transcritos pela RNA polimerase II têm alguns elementos importantes no promotor, como a TATA box e a sequencia Inr, que servem como local de ligação especifico para os factores de transcrição. Mas existem outras sequências igualmente importantes que servem como local de ligação a diversos factores de regulação que controlam a expressão de genes individualmente. Localizam-se na maior parte das vezes a montante (upstream) da TATA box, a 100 nucleótidos, ou até a 10 Kb. Estas sequências são chamadas enhancers – 2 repetições de 72 pares de bases, essenciais à transcrição a partir deste promotor. Descobriu-se que estas repetições estimulavam a transcrição, e que a sua actividade não depende nem da distância ao promotor, nem da sua orientação relativamente ao promotor – são eficazes tanto upstream, como downstream, forward ou backward.

Acção de enhancers


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Isto é possível devido à capacidade do DNA fazer loopings, que permite que um factor de transcrição ligado a um enhancer muito distanciado, possa interagir com as proteínas associadas à RNA polimerase ou Mediador. A ligação de proteínas especificas reguladoras da transcrição a enhancers é responsável pelo controlo da expressão de genes durante o desenvolvimento e a diferenciação, assim como durante a resposta da células a hormonas e factores de crescimento. Um exemplo: O enhancer da imunoglobulina está apenas activo nos linfócitos. Assim esta sequência reguladora é em parte responsável pela especificidade destas células. Apesar do DNA looping permitir aos enhancers actuar a uma distância considerável, a actividade de qualquer enhancer é específica a um determinado promotor. Esta especificidade é mantida em parte por insulator ou elementos barreira, que dividem os cromossomas em domínios independentes e apenas permitem que um enhancer actue apenas no seu promotor. Nota: Uma grande barreira para a terapia genética é que os genes introduzidos são muitas vezes mal regulados ou inactivados por causa da estrutura da cromatina próxima.

Estrutura e funcionamento de Activadores da Transcrição Como os factores de transcrição são centrais para a regulação da expressão genica, perceber os seus mecanismos é um dos desafios da Biologia Molecular. Os activadores da transcrição ligam-se a sequências reguladoras de DNA e estimulam a transcrição. Normalmente consistem em dois domínios independentes: um que se liga especificamente ao DNA e outra que estimula a transcrição interagindo com outras proteínas. A principal função do domínio que se liga ao DNA é precisamente ligar o factor de transcrição ao local certo do DNA, e o domínio de activação estimular a transcrição através de interacções proteína-proteína. Existem diferentes activadores da transcrição, que contêm diferentes tipos de domínios de ligação ao DNA. Exemplos: domínio zinc fingers (encontram-se no factor TFIIA, receptores de hormonas esteróides…); leucine zipper, helix-loop-helix. Os domínios de activação dos activadores da transcrição não estão tão bem caracterizadas como domínios de ligação ao DNA. Eles interagem com as proteínas do Mediador e com os factores de transcrição, para recrutar a RNA polimerase e facilitar a formação do complexo de transcrição. Os factores de transcrição interagem ainda com uma vasta variedade de coactivadores que estimulam a transcrição modificando a estrutura da cromatina. É importante notar que os activadores não regulam apenas o inicio da transcrição: Elongação e processamento de RNA podem também ser regulados, ambos por modulação directa da actividade da RNA polimerase e pelos efeitos na estrutura da cromatina.

Repressores eucariótas A expressão genética das células eucariótas é regulada por repressores assim como por activadores da transcrição. Os repressores ligam-se a sequencias especificas de DNA e inibem a transcrição. Nalguns casos, os repressores limitam-se a interferir com a ligação de outras factores de transcrição ao DNA. Por exemplo, a ligação de um repressor perto do local de inicio da transcrição, pode bloquear a interacção da RNA polimerase com o promotor, que é uma acção semelhante aos repressores nas bactérias. Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Ao contrário dos repressores que simplesmente interferem com o local de activação da transcrição, há outros, os repressores activos, que contêm locais específicos que inibem a transcrição via interacções proteína-proteína.

Acção de repressores eucariótas

Muitos repressores activos têm um importante papel na regulação, como por exemplo no crescimento celular e diferenciação. Os alvos dos repressores são diferentes: os repressores podem inibir a transcrição interagindo com proteínas específicas, com o Mediador ou factores de transcrição, e corepressores que actuam modificando a estrutura da cromatina. Um importante papel dos repressores, é também inibir a expressão de certos genes em certas células, levando assim à diferenciação celular.

Relação da estrutura da cromatina com a transcrição Como se viu anteriormente, a regulação da transcrição é feita também através da estrutura da cromatina. O DNA das células eucariótas está ligado a histonas. A unidade de estrutura é o nucleossoma, que consiste em 147 bp de DNA, enrolado à volta de uma histona (que é constituída por várias subunidade, que podem estar presentes numa ou em duas quantidade). A cromatina é depois condensada, sendo enrolada em estruturas altamente organizadas. Esta Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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condensação tem implicações claras na transcrição, por isso a estrutura da cromatina é um aspecto crítico da expressão genética nas células eucariótas. Genes que estão a ser transcritos encontram-se na forma descondensada (eucromatina). Os factores de transcrição e a RNA polimerase têm de ultrapassar o problema do DNA estar condensado, em vez de estar livre, pois é difícil ligarem-se estando o DNA enrolado nas histonas, podendo até nem conseguir reconhecer o local de ligação. Várias modificações são características de cromatina transcricionalmente activa, como modificações nas histonas, rearranjo dos nucleossomas, e a associação de duas proteínas cromossomais não histónicas, chamadas proteínas HMGN. A acetilação de histonas (HAT) está relacionada com a activação da transcrição nos cromossomas em diversas células eucariótas. As histonas têm dois domínios: um domínio envolvido nas interacções com outras histonas e no enrolamente de DNA à volta do nucleossoma, e um outro domínio, o domínio amino-terminal, rico em lisina e que pode ser modificado por acetilação. (A lisina tem carga positiva, o DNA carga negativa devido ao grupo fosfato. Se se acetilar as lisinas estas deixam de ser posigtivas, e deixam de ser atraídas pelo DNA, descondensando.) Estudos fizeram a ligação entre a acetilação de histonas e a regulação da transcrição, demonstrando que os activadores da transcrição e os repressores estão associados com as histonas acetiltransferases (HAT) e desacetilases (HDAC), respectivamente. Parece que alterações específicas nas histonas afectam a expressão dos genes, providenciando locais de ligação para as proteínas reguladoras – histone code.

Acetilação de Histonas

Outro modo de regular a estrutura da cromatina é através dos factores de remodelação dos nucleossomas, que actuam sem remover ou alterar as histonas.


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Regulação da transcrição por RNAs não codificantes A expressão dos genes pode ser regulada não só por factores de transcrição, mas também por sequencias de RNA não codificantes. Por sua vez, o RNA não codificante pode reprimir a transcrição induzindo alterações nas histonas que levam à condensação do DNA. MicroRNA (miRNA) são sequencias de RNA naturalmente não codificantes. Os miRNAs são transcritos como precursores contendo repetições inversas que formam estruturas steam-loop. De seguida são clivados e dão origem a miRNA maduros. Estes podem associar-se a complexos RISC ou a RITS. O fenómeno de inactivação do cromossoma X é um outro exemplo de RNA não codificante. Em muitos animais, incluindo o Homem, as fêmeas têm dois cromossomas X, e os machos um X e outro Y. O cromossoma X contém centenas de genes que não estão presentes no pequeno cromossoma Y. Deste modo, as fêmeas têm quase o dobro de genes em relação aos machos. No entanto, tanto os machos como as fêmeas possuem nas células o mesmo número de proteínas. Para isto, é necessário haver um fenómeno de compensação, que consiste num mecanismo que inactiva a maior parte dos genes de um dos cromossomas X, na fêmea, por conversão em heterocromatina (cromatina condensada) desde cedo. Consequentemente, apenas uma cópia da maioria dos genes localizados no cromossoma X estão disponíveis para transcrição tanto na fêmea como no macho. Apesar do fenómeno ainda não ser completamente claro, parece que a chave está nas sequências não codificantes de RNA.

Metilação do DNA Este é outro mecanismo que controla a transcrição nos eucariótas. Os resíduos de citosina podem ser modificados pela adição de um grupo metilo. O DNA é metilado especificamente em citosinas localizadas antes de Guaninas, na cadeia de DNA, e esta metilação está relacionada com a repressão da transcrição. Os genes no cromossoma X inactivo estão também metilados, o que supõe que este processo está também envolvido no processo de inactivação.


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Metilação de DNA

A metilação tem também um importante papel de regulação num fenómeno conhecido como genomic imprinting, que controla a expressão de alguns genes envolvidos no desenvolvimento de embriões. Há alguns imprinting genes cuja expressão depende se provêm do pai ou da mãe. Nalguns casos apenas o alelo paterno é expresso, e o alelo materno é transcricionalmente inactivo. Metilação de DNA parece ter um papel chave na distinção entre alelos paternos e maternos. O gene H19 é um exemplo. É transcrito apenas o alelo materno. Este gene é especificamente metilado durante o desenvolvimento das células germinativas masculinas, mas não nas femininas.

Imprinting genético

Processamento de RNA e turnover RNA acabado de ser sintetizado tem de ser modificado de várias maneiras de modo a poder ser convertido na sua forma funcional. O RNA das bactérias é uma excepção, pois não necessita de qualquer modificação. O splicing (processamento) é um dos processos que o RNA sofre, sendo mais um local de regulação.

Processamento de mRNA em Eucariótas Nas bactérias os ribossomas têm acesso directo ao mRNA, mas nas células eucariótas isto não se passa. O mRNA tem de ser transportado do núcleo para o citoplasma antes de poder se usado. O produto inicial da transcrição nos eucariótas é o pré-mRNA. O processamento inclui modificações nas extremidades do mRNA, assim como remoção dos intrões. O primeiro passo no processamento é a modificação do terminal 5’ do pré-mRNA, pela adição de uma estrutura – a 7-metilguanosina cap. Este cap é adicionado após a transcrição dos primeiros 20-30 nucleótidos. Este estabiliza o RNA, e ajuda o mRNA a ficar alinhado no ribossoma durante a tradução. O terminal 3’ é definido pela clivagem do que foi transcrito, e adição de uma cauda apenas com adeninas (A) – poliadenilação. Após este processo o RNA que tinha sido transcrito depois destas sequências é degradado, terminado a transcrição. Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Mas a modificação mais significativa é a remoção dos intrões, por splicing. As sequências codificantes de RNA (exões) são interrompidas por outras não codificantes (intrões) que são retiradas.

Processamento de mRNAs eucarióticos

Formação das extremidades 3’ de mRNAs eucarióticos

Mecanismos de Splicing Vários sistemas foram desenvolvidos in vitro para explicar este mecanismo.


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1. Primeiro, o pré-mRNA é clivado no local de splicing 5’, e a extremidade 5’ do intrão une-se a um nucleótido de adenina perto da extremidade 3’ do intrão (branch point). Neste passo, uma ligação pouco usual faz-se entre o terminal 5’ do intrão, e o grupo hidroxilo, no carbono 2, da adenina. O resultado é um loop formado pelo intrão. 2. O segundo passo é a clivagem na extremidade 3’ do intrão e a ligação dos 2 exões. O intrão é retirado e posteriormente degradado. Estas reacções envolvem 3 sequências específicas: sequências na extremidade 5’ do intrão, na extremidade 3’ deste, e no local de ligação (branch point) (onde a extremidade 5’ se liga ao intrão, formando um loop).

Splicing de pré-mRNA

Análises bioquímicas revelaram que o splicing ocorre num grande complexo – spliceossoma – composto por proteínas e RNAs. Os RNAs constituintes do spliceosoma denominam-se small nuclear RNA (snRNA) e são U1, U2, U4, U5 e U6. O primeiro passo realizado pelo spliceossoma é a ligação de U1 snRNA ao local de splicing 5’. Esta ligação involve o reconhecimento de certos pares de bases. U2 snRNA liga-se de seguida ao branch point, também por complementariedade de bases. De seguida, um complexo formado por U4/U6 e U5 snRNAs é incorporado no spliceosoma. A reacção de splicing é acompanhada por rearranjos nos snRNAs. U5 liga-se de seguida às sequências na extremidade 3’ do intrão, seguido do corte e ligação dos exões. Os snRNA não se limitam a reconhecer as sequências consenso, mas clivam também o intrão – self-splicing. São capazes de remover os seus próprios intrões na ausência de outras proteínas ou factores de RNA. Os intrões contêm frequentemente várias sequências que são semelhantes às sequências consenso, por isso o spliceossoma tem de ter capacidade para identificar os locais correctos, de modo a reproduzir um mRNA funcional.


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Intrões Self-splicing

Splicing Alternativo (Alternative splicing) O papel central do slipicing no processamento de pré-mRNA abre várias possibilidades na regulação da expressão dos genes. Como a maior parte dos pré-mRNA contem múltiplos intrões, diferentes mRNA podem ser produzidos a partir do mesmo gene por diferentes combinações de terminações 5’ e 3’ do intrão. A possibilidade de juntar exões de várias maneiras origina uma nova maneira de controlo, gerando múltiplos mRNA a partir do mesmo pré-mRNA. Este processo é chamado splicing alternativo. Este mecanismo providencia também um papel importante na diferenciação celular dos diferentes tecidos. O splicing alternativo actua pela acção de um repressor que funciona bloqueando a ligação de um factor do spliceossoma, e um grande grupo de proteínas regulam o splicing alternativo, ligando-se a sequências silenciadoras nos pré-mRNA. Noutros casos, o splicing alternativo é controlado por activadores que recrutam factores do spliceosoma para locais de ligação do intrão, que de outra maneira não seriam reconhecidos. O activador de splicing melhor estudado pertence à família das proteínas SR.

Edição de RNA A Edição de RNA refere-se a eventos que introduzem alterações nas sequências codificantes de proteínas de alguns mRNA. Este tipo de alterações inclui a desaminação das citosinas em uridinas e adenosinas em inosinas. Um dos melhores exemplos é a edição de mRNA da apolipoproteína B, que transporta lípidos no sangue. Neste caso, dois diferentes tecidos geram duas formas diferentes de apolipoproteínas a partir do mesmo mRNA. Nos humanos, a ApoB100 é sintetizada no fígado por tradução de um mRNA não editado. No entanto, uma proteína mais curta é sintetizada no intestino como resultado da tradução de um mRNA editado, onde um C foi trocado por um U por desaminação. Esta alteração altera do codão da glutamina (CAA) no mRNA não editado, para um codão de terminação (UAA), resultando na síntese de um mRNA mais curto.


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Edição do mRNA da apolipoproteína B

Degradação de RNA Os mRNAs funcionais de eucariótas são degradados a diferentes velocidades, funcionando como um mecanismo adicional de controlo da expressão genética. Em alguns casos, sinais extracelulares são responsáveis pelas taxas de degradação de mRNAs. As células possuem um sistema de controlo de qualidade (nonsense-mediated mRNA decay) que leva à degradação de mRNA’s que não têm a sequência completa prevenindo a síntese de proteínas anormais. A degradação no citoplasma é outro modo de controlo da expressão dos genes. Enquanto o rRNA e tRNA são muito estáveis, o mRNA bacteriano é rapidamente degradado, permitindo respostas rápidas e variações ambientais. mRNA eucarióta por outro lado tem taxas de degradação variadas, sendo outra forma de regulação da expressão genética. A degradação no citoplasma ocorre por: encurtamento das cadeias poli-A; remoção do cap na extremidade 5’; degradação por nucleases a partir das extremidades. Existem ainda mRNA’s instáveis que codificam proteínas reguladoras e contêm muitas sequências ricas em AU perto da extremidade 3’.

Regulação da estabilidade do mRNA do receptor de transferrina B Regulação do mRNA para o receptor transferrina: Os níveis de mRNA para o receptor transferrina (receptor membranar que permite a entrada de ferro na célula) são controlados pela disponibilidade de ferro. Se a disponibilidade de ferro for adequada, o mRNA é rapidamente degradado, como resultado de uma clivagem perto da extremidade 3’. Se o ferro for escasso, contudo, uma proteína reguladora liga-se à sequência perto da extremidade 3’ do mRNA, protegendo-o da clivagem.


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Capítulo 8 – Síntese, processamento e regulação proteica Tradução do mRNA A tradução é a transformação da mensagem contida no mRNA na sequência de aminoácidos que constituem uma cadeia polipeptídica. O mRNA contém a informação para a síntese proteica, sendo é lido no sentido 5’→3’. A cadeia polipeptídica é sintetizada do N-terminus para o C-terminus. Cada aminoácido é especificado por codões do RNA e o mecanismo de tradução é semelhante em todas as células. Na tradução temos vários intervinientes: o mRNA que contém a informação genética para a síntese de proteínas; os aminoácidos que são monómeros das proteínas; tRNA que selecciona e transporta o aminoácido apropriado e reconhece o codão correspondente do mRNA; ribossomas que são sistemas de leitura, que promovem a ligação entre aminoácidos, sendo constituídos por RNA ribossómico (rRNA) e proteínas; enzimas que catalisam as reacções e ATP que transfere energia para o sistema.

RNAs de transferência Cada um dos 20 aminoácidos tem que ser alinhado com os codões correspondentes do mRNA. Para isso existe o tRNA, que serve como adaptador para este processo, fazendo a ligação entre o mRNA e o aminoácido correspondente. Este tem uma estrutura de L, requerida para se encaixar do ribossoma durante a tradução. Todos os tRNAs terminam numa extremidade 3’ com a sequência CCA à qual se liga o aminoácido. Na outra porção do tRNA localiza-se uma sequência de 3 nucleótidos complementar ao codão (anticodão). A ligação dos aminoácidos ao tRNA específico é catalisada pela aminoacil tRNA sintetase (ATP-dependente), que reconhece um aminoácido para o tRNA correcto.

Estrutura dos tRNAs


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O Ribossoma Os ribossomas são locais de síntese proteica, tanto nos procariótas, como nos eucariótas. Neles se faz a ligação entre o tRNA e o mRNA. Os ribossomas têm duas subunidades que geralmente se apresentam separadas no citoplasma, só se ligando para efectuar a síntese proteica, contendo cada uma delas proteínas e rRNA. O ribossoma permite manter os aa juntos e a realização das ligações peptídicas durante a síntese proteica.

Organização do mRNA e início da tradução A tradução não começa na extremidade 5’ do mRNA, mas em locais específicos. Assim, existem locais entre a extremidade 5’ e o local de iniciação que não são traduzidos – 5’ untranslated regions (UTRs). Em procariótas, o mRNA pode codificar mais que uma cadeia polipeptídica específica, denominando-se policistrónico. Nos eucariontes, porém, cada mRNA codifica apenas uma cadeia polipeptídica, sendo monocistrónico.

mRNAs procarióticos e eucarióticos

Nos procariótas os codões de iniciação de mRNAs são precedidos por uma sequência, a sequência Shine-Dalgarno, que alinha o mRNA no ribossoma para a tradução, através da complementaridade de bases com a extremidade 3’ do rRNA. Assim, este emparelhamento permite não só a iniciação da tradução na extremidade 5’, como em locais internos do mRNA, no caso de mRNAs policistrónicos


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Sinais para a iniciação da tradução

Em contraste, os ribossomas eucarióticos reconhecem o mRNA ligando-se ao cap de 7metilguanosina na extremidade 5’. Depois os ribossomas descem ao longo do mRNA até encontrarem o codão de iniciação (geralmente AUG - metionina). Em engenharia genética é muito importante notar que RNAs humanos não contêm a sequência Shine-Dalgarno, e por isso quando se recorre a um vector plasmídico e se coloca num procarióta, se o gene de interesse não contiver esta sequência, o ribossoma do procarióta não conseguirá reconhecer o local a partir do qual se começa a síntese proteica.

Processo de Tradução A tradução divide-se em 3 etapas: iniciação, elongamento e finalização. Iniciação 1. Ligação do mRNA e de um tRNA iniciador, que transporta usualmente o aminoácido metionina à subunidade menor de um ribossoma; 2. A subunidade maior do ribossoma liga-se ao conjunto, ficando o ribossoma funcional. São necessárias proteínas não ribossomais especificas – factores de iniciação eucarióticos. Alongamento É a fase de tradução dos codões sucessivos do mRNA e da ligação dos aminoácidos. Os locais do ribossoma a que se liga o tRNA designam-se sítios P, A e E. 1. O tRNA iniciador liga-se ao sítio P; 2. O próximo tRNA liga-se ao sitio A, pelo emparelhamento com o segundo codão; 3. Há a formação de uma primeira ligação peptídica entre o aminoácido que ele transporta e a metionina;


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4. Durante este processo o ribossoma move 3 nucleótidos ao longo do mRNA, posicionando o codão seguinte no sitio A vazio; 5. O alongamento do péptido continua até que um codão STOP seja translocado no sitio A do ribossoma. Finalização 1. Os codões de finalização não têm nenhum anticodão complementar, mas existem factores de libertação que reconhecem os sinais e terminam a síntese proteica. Estes factores ligam-se a um codão STOP no sitio A e estimulam a hidrólise do polipéptido completo do ribossoma; 2. O tRNA é libertado, as subunidades do ribossoma e o mRNA dissociam-se.

Visão geral da tradução

A síntese proteica é um processo com as seguintes propriedades: 1. Complexidade: faz interferir vários agentes 2. Rapidez: uma célula eucariótica junta 140 aminoácido de uma cadeia de hemoglobina em dois a três minutos. 3. Amplificação: a mesma zona de DNA pode ser transcrita várias vezes, formando-se assim várias moléculas de mRNA idênticas. Por outro lado, os polirribossomas mostram que a tradução da mesma mensagem é descodificada simultaneamente por vários ribossomas. Originam-se, deste modo, várias cadeias polipeptídicas idênticas, resultando cada uma delas da tradução efectuada por cada ribossoma. Desta forma, apesar de o mRNA ter curta duração, como a sua mensagem podem ser traduzida várias vezes é amplificada a sua actividade.

Regulação da Tradução A tradução de mRNAs particulares pode ser regulada pela ligação de proteínas repressoras, microRNAs não-codificantes, e poliadenilação controlada. De forma global, a actividade das células é modulada em resposta ao stress celular, disponibilidade de nutrientes, e estimulação por factores de crescimento (FC). Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Um mecanismo de regulação da tradução é a ligação de proteínas repressoras (que bloqueiam a tradução) a sequências de RNA específicas. Um exemplo é a regulação da síntese de ferritina, a proteína que armazena ferro dentro a célula. A tradução da ferritina é regulada pela disponibilidade de ferro: mais ferritina é sintetizada se o ferro for abundante. Esta regulação é mediada por uma proteína, que na ausência do ferro se liga a uma sequência na UTR 5’ do mRNA da ferritina, bloqueando a sua tradução. Na presença de ferro, o repressor não se liga à UTR 5’, permitindo que a tradução prossiga.

Regulação traducional da ferritina

É de realçar que a ligação da mesma proteína reguladora a locais diferentes do mRNA pode gerar efeitos diferentes na expressão génica, num caso podendo inibir a tradução, e noutro estabilizando o mRNA, aumentando a síntese proteica. Outro mecanismo envolve a modulação da actividade dos factores de iniciação, particularmente o IF-2. No entanto este processo tem efeitos globais na actividade de tradução, não sendo específico. Contrariamente a estes processo, existe um que envolve o factor IF-4E que se vai ligar à extremidade 5’ dos mRNAs e age como uma proteína reguladora da tradução, estimulando o inicio da tradução, pelo recrutamento da pequena subunidade do ribossoma. A regulação da tradução pode ainda ser efectuada por miRNAs (cadeia dupla), que se associam ao complexo RISC, desdobrando-se em duas cadeias simples. Depois o miRNA conduz o RISC à sequência complementar de mRNA, levando à clivagem do mRNA ou repressão da sua tradução.

Dobragem Proteica e Processamento A tradução completa o fluxo de informação genética dentro da célula, no entanto gera-se uma sequência de aminoácidos que não corresponde a uma proteína funcional. Para que esta seja funcional, a cadeia de aminoácidos tem que se dobrar sobre si mesma e adquirir uma conformação tridimensional, possivelmente associando-se a outros polipéptidos formando complexos funcionais. Muitas proteínas sofrem ainda outras modificações pós-traducionais, como a clivagem, ligações covalentes a lípidos e glícidos, que vão determinar a sua função e localização correcta dentro da célula.


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Chaperonas e Dobragem Proteica Toda a informação necessária para uma proteína adoptar a conformação tridimensional correcta é fornecida pela sua sequência de aminoácidos. No entanto existem proteínas que facilitam essa dobragem, denominadas chaperonas, que apenas catalisam a dobragem de cadeias, pois a forma como esta é feita é determinado unicamente pela sequência de aminoácidos. Na ausência de chaperonas, as cadeias polipeptídicas dobradas ou não seriam instáveis, dobrando-se incorrectamente ou agregando-se em complexos insolúveis.

Acção de Chaperonas durante a tradução

Enzimas que catalisam a Dobragem Proteica A formação de ligações dissulfito entre os resíduos de cisteínas é importante na estabilização de estruturas dobradas de muitas proteínas, pelo que a enzima dissulfito isomerase catalisa a quebra e a formação destas ligações. As ligações dissulfito são restritas a proteínas destinadas a serem segregadas ou incorporadas na membrana, porque o citosol contem agentes redutores que mantêm a cisteína na sua forma reduzida, impedindo que se formem pontes dissulfito.

Clivagem Proteica A clivagem proteica da cadeia polipeptídica, designada de proteólise, é um passo importante na maturação de muitas proteínas (um exemplo é a frequente remoção da metionina iniciadora). São frequentemente adicionadas sequências sinalizadoras, que marcam o destino da proteína. É necessário clivar essa sequência para que a proteína mature.


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O papel de sequências-sinal na translocação através da membrana

Outro exemplo é o da insulina, que é sintetizada contendo uma única cadeia, que contém uma sequência sinalizadora. Inicialmente é clivada essa sequência sinalizadora, pelo que a restante cadeia estabelece as ligações que irão dar origem à sua conformação tridimensional. Por fim, esta cadeia é clivada em dois pontos, sendo retirado um segmento intermédio, originando-se assim dois domínios diferentes. A presença daquele segmento intermédio não é para contribuir para a função da proteína, mas sim para a sua correcta conformação.

Processamento proteolítico da insulina

Glicolização Muitas proteínas são modificadas por adição de glícidos, num processo denominado de glicosilação, e passam a designar-se glicoproteínas. As porções glicídicas desempenham um papel importante na dobragem proteica no retículo endoplasmático, na marcação de proteínas e como locais de reconhecimento nas interacções célula a célula. As glicoproteínas são geralmente segregadas ou incorporadas na membrana, e o processo de glicosilação ocorre no reticulo endoplasmático, geralmente, durante a tradução. Existe a N ou O glicosilação,


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dependendo do local onde esta ligado o glícido, e isso faz com que difira o local onde e realizada a glicosilação

Ligação de Lípidos Algumas proteínas são modificadas pela ligação de lípidos à cadeia polipeptídica, que geralmente marcam e ancoram essas proteínas à membrana plasmática. Existem três tipos de adição de lípidos: N-miristoilação, prenilação e palmitoilação. Um quarto tipo, a adição de glicolípidos, tem um papel importante no ancoramento de algumas proteínas na face extracelular da membrana.


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Capítulo 10 – Encaminhamento e transporte de proteínas Além da presença de núcleo, outro aspecto determina a diferença entre células procariótas e células eucariótas: a compartimentação de actividades celulares em organitos delimitados por membranas. A esta divisão do citoplasma corresponde uma maior eficiência nos processos das células eucariótas, apesar do maior volume, que pode ser 1000 vezes superior ao de uma bactéria. Porque a organização das células eucariótas é complexa, tarefas como o encaminhamento das proteínas aos seus destinos é de grande relevância. O primeiro passo do encaminhamento proteico toma lugar ainda durante a tradução pelos ribossomas livres, que podem ligar-se à membrana do retículo endoplasmático. O elongamento da cadeia peptídica prossegue neste organito com o seu deslocamento para o lúmen, local em que ocorre o folding (dobragem). É a partir do retículo endoplasmático que as protéinas são dirigidas para organitos como o Aparelho de Golgi, em que são processadas e encaminhadas selectivamente para os seus destinos: endossomas, lisossomas, membrana citoplasmática ou exterior da célula. Estes organitos distinguem-se dos restantes pelo seu papel no processamento de proteínas, à qual se associa o transporte de vesículas entre eles.

O retículo endoplasmático O RE é um organito que consiste num conjunto de tubos e sacos (cisternas) que se estendem da membrana nuclear para o citoplasma, sendo o maior organito de muitas células eucarióticas. Estas cisternas encontram-se delimitadas pela membrana do retículo endoplasmático. Consideram-se 3 domínios na membrana do retículo: RE rugoso, coberto de ribossomas na sua superfície externa; RE de transição, em que ocorre a exportação de vesículas para o Golgi; e, por fim, RE liso, que está envolvido no metabolismo de lípidos.

O retículo endoplasmático e a secrecção de proteínas O papel do RE na secreção de proteínas foi entendido através de experiências em que foram utilizados aminoácidos radioactivos que, após a sua inclusão em proteínas sintetizadas, poderiam ser observados através de autoradiografia, revelando assim o percurso destas biomoléculas na célula. Estes resultados permitiram estabelecer o percurso das proteínas destinadas ao exterior da célula: REr > Golgi > vesículas de secreção > exterior da célula. Estudos posteriores mostraram que esta via de secreção não serve unicamente o transporte de proteínas para o exterior da célula, mas também o encaminhamento daquelas para outros compartimentos – membrana citoplasmática, lissossomas. Algumas proteínas são ainda retidas nos primeiros organitos da via – RE, Golgi – desempenhando funções nestes.

Encaminhamento de proteínas para o Retículo Endoplasmático A entrada de proteínas no RE é uma das principais etapas no transporte intracelular de proteínas nas células eucariotas, já que é um ponto comum a todas as vias desse transporte. Com efeito, proteínas destinadas à membrana citoplasmática, aos lisossomas ou ao Golgi são, numa fase inicial da via, encaminhadas para o RE. Esse encaminhamento pode ser feito Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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durante ou após a tradução dos mRNA pelos ribossomas livres. Nos mamíferos, este encaminhamento ocorre principalmente durante a tradução dos mRNA (embora possa ser póstradução), enquanto nas leveduras, por exemplo, o encaminhamento é maioritariamente posterior à tradução. As proteínas destinadas a outros organitos, tais como citoplasma, mitocôndrias, cloroplastos ou peroxisomas são sintetizadas nos mesmos ribossomas livres e libertadas directamente no citosol. Não existe diferença estrutural entre os ribossomas livres e os ribossomas associados a RE. Toda a síntese proteica se inicia em ribossomas livres. No entanto, ribossomas livres envolvidos na síntese de proteínas de secreção são encaminhados para a membrana do retículo endoplasmático através de uma sequência-sinal intrínseca à própria proteína em tradução. Estes pequenos segmentos de sinalização são normalmente clivados da cadeia polipeptídica durante a transferência da proteína para o lúmen do retículo endoplasmático. Esta hipótese foi estudada em 1971, através de experiencias in vitro em que se conclui que ribossomas livres traduzem proteínas de secreção um pouco maiores do que a proteína secretada in vivo. No entanto, se na experiência fossem incluídos microssomas (a unidade básica do retículo endoplasmático rugoso) verificava-se uma clivagem daquelas proteínas à dimensão esperada. Estas experiências deram mais detalhe à hipótese que propunha a existência de uma sequência no terminal amina que encaminharia a cadeia polipeptídica até ao ER e seria posteriormente clivada por uma protease microssomal. As conclusões foram confirmadas por outras experiências envolvendo DNA recombinante, em que a adição de uma sequência codificante de uma sequência sinal se mostrou suficiente para direccionar a proteína recombinante ao retículo endoplasmático. Depois de emergirem do ribossoma, durante a tradução, as sequências-sinal são reconhecidas e acopladas a uma signal recognition particle (SRP) que consiste em seis polipéptidos e ainda um pequeno RNA (srpRNA). A SRP liga-se então ao ribossoma e à sequência-sinal, inibindo a tradução até que o complexo – SRP, ribossoma e cadeia polipeptídica em crescimento – se ligue ao receptor de SRP, na membrana do RE. A ligação daquele complexo ao receptor de SRP promove a separação deste último do complexo, originando-se uma SRP livre para um novo ciclo de encaminhamento. Já acoplado à membrana do RE, o ribossoma liga-se então a uma proteína de translocação, que promove a inserção da sequência-sinal num canal da membrana - translocon. Todo este processo é mediado pela ligação de GTP à SRP e ao receptor de SRP. É a transferência do complexo ribossoma + cadeia polipeptídica para o translocon que abre o canal de membrana e permite, a prossecução da tradução através deste. A sequência-sinal é então clivada e a cadeia polipeptídica é libertada no lúmen do RE. O encaminhamento de cadeias polipeptídicas para o RE pode, nalguns casos, ser feito após a tradução. Estas proteínas são sintetizadas nos ribossomas livres, mantidas na estrutura primária por proteínas (chaperonas) do citosol (para que possam entrar no translocon) e a sua sequência-sinal é reconhecida por receptores da membrana do RE associados ao translocon. Não há necessidade de SRP.


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Inserção de proteína na membrana do Retículo Endoplasmático As proteínas destinadas ao exterior da célula ou à permanência no lúmen dos organitos envolvidos no transporte proteico permanecem no lúmen do ER. No entanto, as proteínas destinadas à incorporação nas membranas celulares (citoplasmática, Golgi, RE, lisossomas) começam por ser inseridas na membrana do RE, ao invés de libertadas no seu lúmen. Embora transportadas pela mesma via de secreção de proteínas, estas proteínas são transportadas como componentes de membrana e não como proteínas solúveis. As proteínas integrais de membrana mantêm-se nestas através das suas sequências hidrofóbicas que a atravessam, maioritariamente hélices α de 20 a 25 aminoácidos, diferindo na forma como estão inseridas na mesma relativamente a 1) número de domínios transmembranares e 2) localização das porções amino-terminal ou carboxilo-terminal da cadeia, que tanto podem estar no lado citosólico como no lado do lúmen. Este último aspecto é determinado pelo processo de translocação da cadeia até ao interior do RE.

Inserção de uma proteína na membrana do RE com uma sequênciasinal clivável e uma única stop-transfer sequence1 A sequência-sinal é clivada à medida que o polipéptido atravessa a membrana do RE e, portanto, a porção terminal amina da cadeia é exposta ao interior do lúmen. No entanto, a translocação do péptido é interrompida por uma stop-transfer sequence que fecha o translocon e sai deste lateralmente, de forma a ancorar-se às caudas hidrofóbicas dos fosfolípidos da membrana do ER. A continuação da tradução após a stop-transfer sequence resulta numa proteína de transmembranar com a porção carboxílica no lado citosólico.

Inserção de uma proteína na membrana do RE com uma sequênciasinal interna à sequência (e, portanto, não-clivável)2 Esta posição interna da sequência sinal pode levar à introdução de proteínas na membrana do RE em ambas as orientações. Assim, a sequência-sinal pode determinar uma inserção tal do polipéptido que a sua porção N-terminal se expõe no lado citosólico. A restante cadeia polipeptídica é translocada para o interior do lúmen do RE à medida que a tradução ocorre. A sequência sinal não é clivada e actua, então, como domínio transmembranar, ancorando a proteína à bicamada lipídica. Pode também acontecer que a sequência-sinal promova a translocação do domínio N-terminal através da membrana; a prossecução do processo de tradução resulta numa proteína transmembranar com a sua porção N-terminal voltada para o lúmen do RE. Note-se que a orientação é a mesma obtida quando a sequência-sinal é “clivável” e seguida por uma stop-transfer sequence.

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Sequência usualmente em hélice- que impede a translocação da cadeia peptídica “a montante” para o lúmen do RE. Figura 10.12 2 Figura 10.12 Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Inserção de uma proteína na membrana do RE com múltiplas stoptransfer sequences (domínios transmembranares)3 Uma sequência-sinal interna pode determinar na inserção de uma cadeia polipeptídica com a sua porção N-terminal no lado citosólico. Uma stop-transfer sequence sinaliza o encerramento do canal de translocação, originando-se um loop no lúmen do retículo endoplasmático. A tradução continua no citosol até que uma nova sequência-sinal traduzida reabre o canal de translocação; a prossecução da tradução origina um loop no citosol. O processo pode ser repetido múltiplas vezes, resultando em proteínas que atravessam a membrana várias vezes. A maior parte das proteínas transmembranares destinadas a outros compartimentos na via de secreção são a eles dirigidas através de vesículas de transporte. No entanto, há excepções, como por exemplo proteínas da membrana interna do núcleo, que é contígua à membrana do RE.

Folding e Processamento proteico no Retículo Endoplasmático Eventos como (1) o folding das cadeias polipeptídicas na sua correcta estrutura tridimensional, (2) a congregação de várias cadeias peptídicas para originar proteínas de múltiplas subunidades, (3) modificações covalentes envolvidas no processamento das proteínas que entram na via de secreção, (4) primeiros estágios da glicosilação e (5) adição de glicolípidos a algumas proteínas da membrana citoplasmática ocorrem tanto durante a translocação ao longo da membrana do RE como no lúmen desse organito. Ao serviço destes eventos estão proteínas do lúmen do retículo endoplasmático, como as chaperones. Uma destas proteínas é a BiP, cuja função será por um lado ligar-se a cadeias polipeptídicas unfolded, à medida que estas atravessam a membrana do RE e entram no lúmen, e, por outro, mediar o processo de folding. Proteínas correctamente estruturadas são libertadas pelas chaperones e podem ser transportadas para o Golgi. Caso existam erros de folding, as proteínas seguem uma via de degradação. A formação de pontes dissulfito entre as cadeias laterais de duas cisteínas é um importante aspecto deste processo de folding no interior do RE, já que o poder redutor no citosol não permite estas ligações. Outro evento importante que ocorre no RE é a glicosilação de resíduos de asparagina, que consiste na adição de um oligossacarídeo de 14 resíduos (9 manoses, 2 N-acetilglucosamina e 3 Glucoses [estes últimos removidos ainda durante o processo de glicosilação]). Algumas proteínas estão unidas à membrana lipídica através de GPI (um glicolípido) que substitui, após a tradução, o domínio transmembranar daquela proteína, constituindo, dessa forma, o único ponto de contacto entre a proteína e a membrana. A orientação destas proteínas no retículo determina que aquelas proteínas são expostas à superfície da célula.

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Figura 10.14


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Controlo de Qualidade no Retículo Endoplasmático Algumas das proteínas sintetizadas no RE são degradadas antes de prosseguirem na via de secreção. Este é o princípio do controlo de qualidade que se verifica no RE e que consiste no encaminhamento de proteínas cujo folding foi errado para vias de degradação. Este processo de verificação, ainda não totalmente compreendido, implica, entre várias outras proteínas, pelo menos quatro chaperones. Há no entanto duas chaperones cujo funcionamento é conhecido. São proteínas do lúmen do RE que assistem o folding e que verificam a correcção do processo. Caso o folding de uma cadeia polipeptídica ocorra de forma errada, essas proteínas começam por ser encaminhadas para uma repetição do folding. Se, depois de múltiplos ciclos, o folding continuar a ser errado, os resíduos de manose são removidos e a proteína segue uma retro-translocação através do translocon, chegando ao citosol onde é marcada pela ubiquinona e degradada pelo proteossoma. No caso de uma acumulação de proteínas unfolded, um processo de sinalização mediado pelo BiP é desencadeado, resultando numa inibição da síntese proteica, aumento da expressão genética de proteínas chaperones e um aumento na actividade do proteossoma, visando uma aceleração do processo de eliminação de proteínas misfolded (folding errado).

O retículo endoplasmático liso e a síntese de lípidos Além das actividades de processamento e secreção de proteínas, o RE [liso] é o principal organito envolvido na síntese de lípidos. Porque os lípidos são biomoléculas muito hidrofóbicas, a sua síntese ocorre em associação com membranas celulares pré-existentes, sendo posteriormente transportados até aos seus destinos. Na composição das membranas celulares entram principalmente três tipos de lípidos: fosfolípidos, colestrol e glicolípidos. Os primeiros, mais abundantes, são sintetizados no lado citosólico da membrana do RE, através de precursores solúveis. Na síntese de fosfolípidos, os ácidos gordos são transferidos para o Glicerol-3-fosfato, em reacções catalisadas por enzimas associadas à membrana. Posteriormente, o fosfolípido é inserido na membrana, podendo ser alterado por enzimas. Esta síntese no lado citosólico da membrana do RE permite que a cauda hidrofóbica do fosfolípido esteja embutida na membrana, enquanto ocorrem outras reacções a partir de precursores solúveis. Nota para o facto de a síntese de lípidos ocorrer apenas no lado citosólico da membrana do RE, pelo que a integridade da camada interna é assegurada por movimentos de flip-flop (mediados por flippases, com gasto de energia). Além de ser o local de síntese de fosfolípidos, o RE é também local de síntese de outros componentes lipídicos da membrana, como o colestrol e a ceramida, sendo que esta última é precursora da síntese de esfingomielina no Golgi. Devido ao seu papel na síntese de lípidos, o RE liso encontra-se muito desenvolvido nas células secretoras de hormonas esteróides.


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Exportação de Lípidos e Proteínas a partir do Retículo Endoplasmático Tanto as proteínas como os fosfolípidos são transportados ao longo da via de secreção em vesículas de transporte. Estas moléculas são exportadas a partir do RE em vesículas que se destacam da membrana deste organito e que transportam conteúdo – cargo – através do ERGIC (compartimento intermediário entre o RE e o Golgi) e, posteriormente, do Golgi. Processos de transporte posteriores envolvem a passagem do cargo entre as diferentes cisternas daquele organito e deste para os lisossomas ou membrana citoplasmática. Na maioria dos casos, as proteínas do lúmen são empacotadas em vesículas que, depois de libertadas pelo organelo-origem, se fundem com a membrana do organelo-receptor, libertando o seu conteúdo no lúmen deste organito. Note-se que a orientação topológica das proteínas associadas à membrana é mantida ao longo da via de secreção. Assim, proteínas expostas na superfície citosólica da membrana do RE mantêm-se expostas nas superfícies citosólicas da membrana do Golgi ou do citoplasma, enquanto proteínas voltadas para o lúmen do RE serão expostas no lúmen do Golgi e à superfície extracelular da célula. A maior parte das proteínas que entram no RE de transição são transportadas para o ERGIC e para o Golgi. No entanto, estão sinalizadas por sequências que determinam ou a sua exportação ou a sua retenção no RE. Existem proteínas na membrana do RE que parecem reconhecer proteínas do lúmen destinadas à secreção; no entanto, detectaram-se muito poucos sinais (ligandos daquelas proteínas transmembranares) pelo que se aponta para uma via de secreção default em que proteínas não marcadas para exportação são também transportadas até ao Golgi. Coloca-se então a situação de as proteínas do lúmen, como as isomerases de pontes dissulfido ou as chaperones, se perderem para a célula. Esta situação não ocorre de facto, pois muitas dessas proteínas apresentam sequências-sinal de aminoácidos na porção C-terminal (KDEL) que promovem o retro-transporte das mesmas ao RE. Verifica-se ainda que proteínas às quais foi retirada a sequência-sinal não retornam ao RE, prosseguindo a via da secreção. Estas sequências ligam-se então a proteínas específicas da membrana dos compartimentos celulares e retornam selectivamente ao RE. As sequências KDEL e KXXX (no código de aminoácidos de uma só letra) são os sinais conhecidos mais relevantes no retro-transporte das proteínas do lúmen (KDEL) e da membrana (KXXX) do RE. O retro-transporte destas proteínas é a primeira ramificação do sorting proteico. Outros pontos de ramificação desta via, como a retenção no Golgi versus exportação para membrana citoplasmática ou lisossomas, ocorrem noutros níveis de transporte.


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O Aparelho de Golgi O aparelho (ou complexo) de Golgi funciona como uma fábrica em que as proteínas recebidas do RE são processadas e destinadas a vários locais: endossomas, membrana citoplasmática, lisossomas ou meio extra-celular. Conforme já referido, a síntese de esfingomielina e glicolípidos tem lugar neste organito.

Organização do Golgi Na maioria das células o Golgi é constituído por cisternas e vesículas cujos limites são membranas lipídicas. Uma das propriedades deste organito é a sua polaridade, tanto em estrutura como em função. Assim, as proteínas do RE entram pela face cis, convexa e orientada para o núcleo, e saem pela face trans, côncava. Este processo de transporte é essencial na manutenção da estrutura e funcionalidade do complexo de Golgi, como demonstram experiências em que o transporte de vesículas a partir do RE é bloqueado. Ao passar pelo Golgi, as proteínas são modificadas e destinadas aos seus locais. No Golgi podem considerar-se quatro compartimentos: a rede cis, a rede trans e as pilhas Golgi medial e trans. É nestas últimas que ocorrem os principais metabolsimos do complexo de Golgi. As proteínas modificadas são posteriormente transportadas à rede trans, um centro de distribuição, dirigindo as moléculas aos seus destinos.

Glicosilação de proteínas no Golgi O processamento proteico que ocorre no Golgi envolve a modificação e a síntese da porção glicídica das glicoproteínas. A modificação dos oligossacarídeos adicionados no RE é uma das etapas cruciais deste processamento. O processamento desses N-linked oligossacarídeos é feito através de uma sequência de reacções:

A extensão destas modificações depende de diversos factores tais como estrutura da proteína e quantidade de enzimas de processamento disponíveis no Golgi, que varia de acordo com o tipo de célula. Assim, consoante estes factores variem é possível obter glicoproteínas muito variadas. As glicosiltransferases adicionam resíduos de monossacarídeos, enquanto as glicosidades removem esses mesmos resíduos.


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O processamento dos resíduos glicídicos N-linked das proteínas lisossomais difere do aplicado às proteínas dirigidas à membrana citoplasmática ou à secreção. Estes são modificados por uma reacção de fosforilação de manose, cuja enzima reconhece a estrutura tridimensional das proteínas lisossomais (folding). Esta etapa previne a remoção dos resíduos noutras etapas de processamento. O sinal manose-6-fosfato é então reconhecido por um receptor próprio na região trans do Golgi, que encaminha a glicoproteína para os lisossomas ou endossomas.

Outras modificações proteicas podem ter lugar no Golgi, tais como: adição sequencial de resíduos glicídicos às cadeias laterais de serina e treonina dentro de sequências específicas.

Metabolismo dos lípidos e dos polissacarídeos no Golgi Síntese da esfingomielina (v. p. 413)

Encaminhamento e exportação das proteínas a partir do Golgi O encaminhamento selectivo de lípidos, proteínas e glícidos a partir do Golgi para outros organitos implica a sua distribuição prévia por diferentes tipos de vesículas, que se destacam da face trans do Golgi e se dirigem aos locais-alvo. Ao contrário do que acontece no retículo endoplasmático, a preservação no Golgi de proteínas próprias daquele organito é feita através de uma retenção associada à ligação das mesmas à membrana do Golgi. Assim, esses sinais correspondem a domínios transmembranares que impedem a inclusão dessas proteínas no lúmen das vesículas. Sinais na porção citoplasmática dessas proteínas transmembranares asseguram o retro-transporte daquelas proteínas até ao Golgi. A via de secreção constitutiva, que ocorre em todas as células, conduz a uma secreção não regulada de proteínas. No entanto, células responsáveis pela secreção de hormonas possuem vias alternativas em que proteínas específicas são secretadas como resposta a estímulos ambientais. A secreção de hormonas, neurotransmissores e enzimas digestivas pelas células do pâncreas são exemplos dessa via de secreção regulada, caracterizada por vesículas de secreção maiores que se fundem com a membrana citoplasmática quando o ambiente for apropriado. A polaridade das células de alguns tecidos (como o epitelial) encerra uma ainda maior complexidade no transporte de proteínas para a membrana citoplasmática, já que esta não apresenta características uniformes, sendo constituída por um domínio apical e outro basolateral. A via de secreção constitutiva (não regulada) tem então de promover o “carregamento” de, pelo menos, dois tipos de vesículas de secreção. A via de distribuição proteica mais conhecida é a que encaminha proteínas com manoses-6-fosfato aos lisossomas. Nota para o facto de o M6P ser responsável pela inclusão das proteínas lisossomais em Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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vesículas específicas dirigidas àqueles organitos. No caso das plantas e leveduras, em que não existem lisossomas, as proteínas são transportadas para os vacúolos.

O mecanismo do transporte de vesículas Conforme ficou claro, as vesículas de transporte são essenciais ao metabolismo das células, pois permitem o transporte de biomoléculas entre organitos, bem como do seu interior para o meio extra-celular. Além disso, as vesículas são também relevantes em processos como a endocitose. O transporte de vesículas é, então, uma actividade crucial das células. A selectividade desse processo assegura a organização da célula e das suas funções. Como visto, a especificidade do transporte baseia-se no empacotamento selectivo e na fusão dirigida das vesículas aos locais-alvo.

A experimentação e a compreensão dos mecanismos do transporte de vesículas Os progressos na compreensão do transporte de vesículas assentaram em 3 grandes vectores experimentais: (1) isolamento de leveduras mutantes que são deficientes no distribuição e transporte de proteínas; (2) reconstituição do transporte vesicular em sistemas in vitro; (3) análises bioquímicas de vesículas sinápticas, responsáveis pela regulação da secreção de neurotransmissores. As conclusões dos vários estudos convergem numa certa uniformidade dos processos envolvidos na secreção. Estudos recentes com proteínas GFP de fusão permitiram observar a via de transporte de proteínas específicas in vivo.

Selectividade do Cargo, Proteínas Coat e Destacamento de Vesículas A maioria das vesículas que transporta proteínas do RE para o Golgi e deste para os seus alvos está revestida por proteínas citosólicas que, por via da sua função, se designam por proteínas de revestimento. Inicialmente, as proteínas de secreção são seleccionadas de outras proteínas. As proteínas de revestimento aderem à vesícula à medida que esta se destaca da membrana dadora e são geralmente removidas antes de a vesícula atingir a membrana alvo. Os processos de formação e destacamento das vesículas são regulados por proteínas ligadas a GTP. Os complexos proteicos envolvidos na génese das vesículas parecem ser próprios de cada via de destacamento, transporte e fusão de vesículas. Há a considerar três tipos de vesículas de revestimento: vesículas cop-coated (I e II) e vesículas chlatrin-coated. As vesículas COPII destacam-se do RE para o ERGIC ou para o Golgi; as vesículas COPI destacam-se do ERGIC ou do Golgi, mediando também o transporte de vesículas entre as cisternas deste organito; as vesículas chlatrine-coated são responsáveis pelo uptake de moléculas do meio extra-celular, por endocitose, bem como pelo transporte de moléculas desde a rede trans do Golgi até aos seus destinos. A formação destas últimas vesículas requer clatrina, GTP binding-protein – ARF1 - e pelo menos duas outras moléculas. A clatrina desempenha um papel estrutural na formação da vesícula constituindo uma rede semelhante à de um cesto que distorce a membrana e inicia o destacamento. Durante o transporte, o GTP ligado a ARF1 é hidrolisado a GDP. Este conjunto é libertado para o citosol e reciclado. A perca do ARF1 e a acção de enzimas uncoating promovem a desintegração da rede de clatrina. Enquanto as vesículas COPI e COPII estão confinadas a alvos específicos, as


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vesículas clathrin-coated podem ter variados destinos. Como os alvos requerem diferentes proteínas, diferentes proteínas medeiam o seu transporte até aos diferentes destinos.

Fusão de Vesículas A fusão de uma vesícula de transporte com a membrana do alvo envolve dois eventos: (1) o reconhecimento da membrana alvo por parte da vesícula e (2) a fusão das membranas e a consequente libertação do conteúdo para o organelo-alvo. Estudos dos últimos anos sustentam modelos de fusão de vesículas baseados no reconhecimento entre proteínas da vesícula e do alvo – tethering, seguida de fusão das mesmas. Análises destas proteínas permitiram o desenvolvimento da hipótese SNARE, em que a fusão das vesículas é mediada por interacções entre proteínas transmembranares SNARE (vSNAREs [proteínas transmembranares das vesículas] e t-SNARES [dos alvos]). É a interacção entre as SNAREs que promove a aproximação das membranas, a sua instabilidade e consequente fusão das mesmas. No entanto, todo este processo, que envolve docking, tehtering e fusion envolve a formação de um complexo proteico à semelhança do que acontece no destacamento de vesículas. As proteínas Rab, GTP bindind-proteins, participam em muitos destes processos de fusão e destacamento de vesículas e estão directamente envolvidas na especificidade dos transportes de vesículas. (Para pormenores, v. p. 423). A exocitose é um tipo específico de fusão de vesículas transportadoras com a membrana citoplasmática, em que o conteúdo da vesícula é libertado secretado para o exterior da célula (Cooper também utiliza o termo exocitose para fusões com outras membranas celulares, v. tabela 10.1). Neste processo intervêm também GTP-binding proteins e um complexo proteico de oito subunidades.

Lisossomas Os lisossomas são organelos delimitados por membrana que contêm enzimas capazes de degradar todos os tipos de biomoléculas aos seus monómeros constituintes. Pode dizer-se que o lisossoma funciona como o sistema digestivo da célula, permitindo a digestão de moléculas provindas do meio extra-celular ou dos próprios constituintes das células. Podem apresentar diferentes formas consoante o seu conteúdo.

Hidrolases ácidas próprias dos lisossomas Os lisossomas contêm mais de 50 diferentes tipos de enzimas degradativas que hidrolisam todo o tipo de biomoléculas. Mutações nos genes que codificam estas proteínas são responsáveis por múltiplas doenças, designadas por lysossomal storage diseases, em virtude da acumulação de material orgânico nos lisossomas dos indivíduos afectados. A doença de Gaucher é uma delas e consiste numa mutação no gene que codifica uma enzima responsável pela degradação de glicolípidos. Outras doenças lisossomais podem ter a sua génese em Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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mutações nos genes que codificam as enzimas responsáveis pela adição do sinal de manose-6fosfato às proteínas destinadas aos lisossomas. Estas enzimas têm um pH de actuação óptimo consideravelmente abaixo do pH citoplasmático, o que garante uma digestão controlada. O carácter ácido dos lisossomas é assegurado pelo uptake de H+, que, com gasto de ATP, assegura uma concentração de protões 100 vezes superior no lisossoma.

Endocitose e formação do lisossoma O papel dos lisossomas na digestão de produtos da endocitose não se resume à sua função, mas também à sua formação. Com efeito, os lisossomas são formados quando uma vesícula de transporte provinda da rede trans do Golgi se funde com uma vesícula endocítica. A formação de lisossomas corresponde, então, a um ponto de contacto entre a via endocítica e a via de secreção. À fusão das vesículas endocíticas com os early endossomes segue-se uma reciclagem dos receptores da superfície celular, que retornam à membrana e a maturação dos endossomas, que consiste no abaixamento do pH. Como referido anteriormente, as hidrolases ácidas são incorporadas em vesículas dirigidas aos lisossomas através do resíduo de M6P. Depois da remoção das clatrinas destas vesículas, elas fundem-se com os endossomas maturos. O pH ácido promove a dissociação dos complexos receptor-M6P, libertando-se as enzimas no interior do endossoma. Os receptores podem ser dirigidos até ao Golgi (reciclagem). Os late endossomes são então maturados em lisossomas, adquirindo um carácter muito ácido que promove a digestão de biomoléculas.

Fagocitose e Autofagia Nos lisossomas, além da via da secreção e da via endocítica, convergem também duas outras vias: a fagocitose e a autofagia. A fagocitose consiste num uptake de grandes partículas, associadas à emissão de pseudópodes pela célula fagocítica. Origina-se uma vesícula fagocítica que se funde com o lisossoma, procedendo-se à digestão do seu conteúdo. Os lisossomas assim formados podem ser muito grandes e heterogéneos, em função do seu conteúdo. Os lisossomas são também responsáveis pela autofagia, ou seja, o gradual turnover os próprios componentes da célula. A autofagia, ao contrário da fagocitose, ocorre em todas as células e desempenha tarefas críticas em certas etapas do desenvolvimento embrionário. O primeiro passo da autofagia é a enclausura de um organelo numa membrana derivada da membrana do retículo endoplasmático. A vesícula resultante – um autofagossoma – funde-se com um lisossoma, ocorrendo a digestão do material nela presente.


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Capítulo 11 – Bioenergética e Metabolismo Mitocôndrias Geram energia metabólica em células eucarióticas, criando ATP de glícidos e ácidos gordos através de fosforilação oxidativa. Contêm o seu próprio DNA, RNA (mRNA, tRNA e rRNA) e as suas proteínas provêm tanto do genoma nuclear, sintetizadas em ribossomas livres no citosol, como do seu próprio genoma.

Organização e Função das Mitocôndrias

São constituídas por uma dupla membrana com um espaço intermembranar e uma matriz. Na matriz estão presentes o património genético do organito e enzimas necessárias ao metabolismo oxidativo. A membrana interna, que apresenta cristas projectadas na matriz que aumentam a sua área, possui proteínas envolvidas na fosforilação oxidativa e proteínas de transporte. É também impermeável à maioria dos iões e pequenas moléculas, mantendo o gradiente de protões que dirige a fosforilação oxidativa. A membrana externa possui porinas que permitem a passagem de pequenas moléculas, tornando o espaço intermembranar análogo ao citoplasma.

O Sistema Genético das Mitocôndrias

As mitocôndrias possuem o seu próprio sistema genético, constituído por moléculas de DNA circular. Pensa-se que evoluíram de bactérias, provavelmente de Rickettsias, por endossimbiose. O DNA mitocondrial contém praticamente todos os genes que codificam os rRNAs e tRNAs mitocondriais, sendo as restantes proteínas necessárias ao seu metabolismo codificadas pelo genoma nuclear.


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O seu código genético é ligeiramente diferente do das restantes células, através de uma extensão do mecanismo “wobble” e alterações da correspondência entre codão e aminoácido. As mitocôndrias de um organismo são provenientes exclusivamente do oócito, pelo que as doenças mitocondriais são transmitidas pela mãe.

(estes assuntos estão explicados em muito maior detalhe dos documentos disponibilizados pela Teresa Tomaz)

Importação de Proteínas e Montagem de Mitocôndrias

Como já foi referido, a maioria dos genes que codificam proteínas necessárias à replicação e expressão do DNA mitocondrial estão no núcleo da célula. Alguns destes genes foram transferidos para o núcleo aquando a associação endossimbiótica entre células. As proteínas mitocondriais codificadas pelo genoma nuclear são sintetizadas em ribossomas livres e têm que atravessar parte ou toda dupla membrana mitocondrial para o seu destino final, a matriz, o espaço intermembranar ou a própria membrana.

Importação de proteínas para a matriz mitocôndrial: As proteínas destinadas à matriz da mitocôndria possuem pré-sequências, em hélice-α, clivada após a sua importação pela MPP.

1. Ligação das pré-sequências a receptores membranares associados ao complexo Tom. 2. Passagem através de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Passagem pelo do espaço intermembranar. 4. Passagem através do complexo Tim (poro), na membrana interna. 5. A continuação da passagem da proteína requer o potencial electroquímico gerado através da membrana interna. Este torna a matriz negativa e o espaço intermembranar positivo, o que dirige a pré-sequência positiva para a matriz.


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Existem várias chaperonas que auxiliam a importação:

1. Hsp70 citosólica – mantém as proteínas num estado apenas parcialmente folded para que possam ser translocadas através das membranas. 2. Hsp70 mitocondrial (associada ao complexo Tim) – funciona como alavanca para “puxar” a proteína para a matriz. 3. Hsp70 mitocondrial (da matriz) – ajudam ao término do folding proteico. 4. Hsp60 mitocondrial (chaperonina) – dentro da qual pode existir folding adicional.

NOTA: todas as interacções entre proteínas e chaperonas necessitam de ATP dentro e fora da mitocôndria e do potencial electroquímico gerado através da membrana interna.

Importação de proteínas para as membranas interna ou externa:

As proteínas destinadas às membranas possuem sinais de importação mitocondriais internos em conjunto ou não com pré-sequências.

Caso possuam apenas sinais de importação mitocondriais internos:

1. Reconhecimento, em associação com uma chaperona Hsp90, por um complexo Tom diferente do do primeiro caso. 2. Passagem através do mesmo complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Reconhecimento, no espaço intermembranar, por complexos Tim e levados a outro complexo Tim (poro), na membrana interna. 4. Reconhecimento de sinais stop-transfer que promovem a integração das proteínas na membrana.


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Caso possuam sinais de importação mitocondriais internos e pré-sequências:

1. Reconhecimento, em associação com uma chaperona Hsp70, pelo mesmo complexo Tom do caso anterior. 2. Passagem através de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Umas proteínas são integradas directamente na membrana através do complexo Tom (poro), quanto que outras migram para o espaço intermembranar e são depois integradas na membrana.

Importação de proteínas para o espaço intermembranar*:

As proteínas destinadas ao espaço intermembranar possuem sequências-sinal complexas.

1. Reconhecimento, em associação com uma chaperona Hsp70, pelo mesmo complexo Tom do caso anterior. 2. Passagem através de outro complexo Tom (poro), na membrana externa. 3. Umas proteínas migram directamente para o espaço intermembranar. 4. Outras são transportadas pelo complexo Tim (poro) na membrana interna até à matriz, onde a sequência sinal é clivada e expõe um sinal secundário que as dirigem para o espaço intermembranar *ou para a membrana interna.

NOTA: A translocase que dirige as proteínas do caso anterior a partir da matriz é também responsável pela integração das poucas proteínas membranares codificadas pelo genoma da mitocôndria.

Os fosfolípidos mitocondriais são removidos do retículo endonplasmático por proteínas de transferência de fosfolípidos e integrados nas membranas mitocondriais. As mitocôndrias sintetizam cardiolipina, um fosfolípido incomum.


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Peroxissomas

São pequenos organitos revestidos por membrana que contêm enzimas envolvidas num leque de reacções metabólicas, algumas de metabolismo energético. Não possuem genoma, todas as suas proteínas (peroxinas) estão codificadas no genoma nuclear e são na sua maioria* sintetizadas em ribossomas livres. Normalmente replicam-se por divisão.

Funções dos Peroxissomas

1. Diversas reacções de oxidação, tendo como substratos ácido úrico, purinas, metanol e o mais importante, ácidos gordos. 2. Degradação do peróxido de hidrogénio (H2O2, água oxigenada) através da enzima catalase, criado nas suas próprias reacções de oxidação. 3. Biossíntese de lípidos, do aminoácido lisina e plasmalogéneos - fosfolípidos presentes apenas no cérebro e coração).

Construção de Peroxissomas

*As peroxinas provêm tanto de ribossomas livres como do retículo endoplasmático. As provenientes do retículo podem fundir-se entre si ou com peroxissomas preexistentes, e funcionam também como receptores para as peroxinas sintetizadas nos ribossomas livres, que são reconhecidas através de sequências específicas. Proteínas e lípidos são constantemente integrados nos peroxissomas, o que implica numa variação da sua constituição ao longo da sua maturação. As doenças lisossomais devem-se tanto à falta de enzimas individuais como à disfunção das vias de integração de proteínas, sendo estas últimas responsáveis pela falha em múltiplas enzimas.


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Capítulo 12 – O citoesqueleto e o movimento celular O citoesqueleto apresenta uma função estrutural, determinando também a forma da célula, a posição dos organelos e a organização geral do citoplasma. É igualmente responsável pelo movimento celular. É uma estrutura dinâmica que é constantemente reorganizada. É composto por três tipos de filamentos proteicos: filamentos de actina, filamentos intermédios e microtúbulos.

Estrutura e Organização dos filamentos de actina Os filamentos de actina são particularmente abundantes junta à membrana plasmática, onde formam uma rede que proporciona suporte mecânico, determina a forma da célula e movimentos da superfície celular.

Montagem e Desmontagem dos Filamentos de Actina Os monómeros de actina (actina G) polimerizam para formar filamentos de actina (actina F). Este processo começa com a formação de dímeros e trímeros (nucleação), que depois vão crescendo pela adição de monómeros às duas extremidades. (Fig 12.2) Os filamentos de actina apresentam polaridade: possuem uma extremidade positiva e outra negativa. A polimerização faz-se em ambas as extremidades, todavia na extremidade positiva o crescimento é mais rápido do que na extremidade negativa. A actina ligada a ATP (maior afinidade ao filamento) associa-se à extremidade positiva (em rápido crescimento), verificando-se que na extremidade negativa há uma dissociação de monómeros ligados a ADP (Fig 12.4) Existem proteínas, denominadas proteínas de ligação à actina, que regulam a união e separação dos filamentos. Entre estas destacam-se Arp2/3, que se liga à extremidade positiva, iniciando a formação de ramificações (Fig 12.7), formina, que facilita a nucleação (que requer um correcto alinhamento dos três primeiros monómeros de actina para o seguimento da polimerização) (Fig 12.6), ADF/cofilina, que possui dois tipos diferentes de actividade: por um lado, despolimerização de actina através do aumento da taxa de dissociação de monómeros de actina na extremidade negativa, por outro, divisão do filamento em dois, o que cria novas extremidades positivas (Fig 12.8), profilina, que estimula troca de ADP por ATP, o que resulta na formação de monómeros actina/ATP que se dissociam da cofilina e ficam disponíveis para integrarem filamentos (Fig 12.8).

Organização dos filamentos de Actina Os filamentos individuais de actina organizam-se em dois tipos principais de estruturas: feixes e redes (Fig 12.9). Os feixes podem ser paralelos ou contrácteis. Os primeiros estão associados à proteína fimbrina. Os segundos estão associados a α-actinina. Quer a fimbrina quer a αactinina contém dois domínios de ligação de cálcio (Fig 12.10). As redes encontram-se associadas a filamina, que é um dímero de duas subunidades que formam um “V” flexível que


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estabelece ligações cruzadas entre os filamentos de actina, originando redes ortogonais (Fig 12.11).

Associação com a Membrana Plasmática Os filamentos de actina também se ligam à membrana plasmática, o que permite a manutenção da estrutura e da função da célula, sendo esta ligação feita por proteínas da família da calponina. Um exemplo é a distrofina. Há doenças genéticas ligadas ao cromossoma X (por exemplo distrofia de Duchenne e distrofia de Becker), que resultam de mutações no gene da distrofina, e que levam à degeneração progressiva do músculo esquelético. Existem filamentos de actina nos locais de adesão entre células adjacentes. As adesões focais são mediadas pela ligação de integrinas (proteínas transmembranares) a proteínas da matriz extracelular. As fibras “stress” (feixes de filamentos de actina ligados de forma cruzada por αactinina) encontram-se ligadas ao domínio citoplasmático das integrinas por complexos que envolvem várias proteínas (Fig 12.16). Nas zónulas de adesão, as proteínas transmembranares são as caderinas. Estas, que são dependentes de cálcio, ligam-se a outras caderinas no espaço extracelular e a cateninas no lado citosólico. É a este complexo que se ligam os filamentos de actina (Fig 12.17).

Projecções da Superfície Celular A superfície da maioria das células tem uma variedade de protusões e extensões que estão envolvidas no movimento celular, na fagocitose ou em funções especializadas, como é o caso da absorção de nutrientes. Um exemplo são as microvilosidades, que apresentam um esqueleto formado por filamentos de actina, empacotados em feixes por fimbrina e vilina. Estão ligados à membrana ao longo do seu comprimento por braços laterais constituídos por miosina I e calmodulina. Os feixes de filamentos de actina encontram-se assentes na trama terminal (Fig 12.9). Temos ainda outros exemplos de projecções: pseudópedes (envolvidos na fagocitose), lamelipódias e filipódias (associadas ao movimento celular).

Actina, Miosina e Movimento Celular A interacção entre a actina e a miosina II é responsável pela contracção muscular. Esta associação também ocorre em células não contrácteis, conduzindo a fenómenos como a citocinese, transporte vesicular e movimento celular. Na citocinese verifica-se que, após a mitose, a célula é dividida em duas por um anel contráctil constituído por filamentos de actina e por miosina II (Fig 12.30). No transporte vesicular, verifica-se a interacção entre os filamentos de actina e a miosina I (que, ao contrário da miosina II, apresenta uma cauda pequena e não forma nem dímeros nem filamentos). A cauda da miosina I liga-se à membrana da vesícula e a sua cabeça liga-se ao filamento de actina (Fig 12.32). Na migração celular, verifica-se a emissão de filipódias, que depois aderem ao substrato. Finalmente, a parte de trás é recolhida (Fig 12.34). Várias experiências demonstraram que a extensão de projecções envolve a ramificação e polimerização de filamentos de actina. A emissão de projecções é regulada pelas proteínas Rho (ligadas ao GTP), que estimulam a Arp 2,3e a ADF/Cofilina.


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Filamentos Intermédios Ao contrário dos filamentos de actina e dos microtúbulos, os filamentos intermédios não estão directamente envolvidos no movimento celular. Apresentam uma função estrutural, visto que fornecem força mecânica às células e tecidos.

Proteínas dos Filamentos Intermédios Enquanto os filamentos de actina e os microtúbulos são polímeros de um único tipo de proteínas (actina e tubulina, respectivamente), os filamentos intermédios são compostos por uma grande variedade de proteínas que são expressas em diferentes tipos de células (para ver alguns exemplos consultar Tab 12.2). As proteínas dos filamentos intermédios apresentam um domínio central em α-hélice, uma cabeça e uma cauda com tamanho e formas variáveis (Fig 12.36).

Montagem dos Filamentos Intermédios Os polipéptidos unem-se à volta um do outro para formar dímeros. Estes associam-se de forma anti-paralela para formar tetrâmeros, que por sua vez se associam pelas extremidades para formar protofilamentos e lateralmente para formar filamentos. Cada filamento apresenta aproximadamente 8 protofilamentos (Fig 12.37). Ao contrário dos filamentos de actina e dos microtúbulos, os filamentos intermédios são apolares, dado que não apresentam extremidades positivas e negativas distintas. Os filamentos intermédios são geralmente mais estáveis que os filamentos de actina e os microtúbulos, não apresentando o comportamento dinâmico associado a estes outros elementos do citoesqueleto.

Organização Intracelular dos Filamentos Intermédios Os filamentos intermédios formam uma rede elaborada no citoplasma da maioria das células, estendendo-se desde um anel a rodear o núcleo até á membrana plasmática (Fig 12.38). Os filamentos de queratina e vimentina servem, aparentemente, para posicionar o núcleo. Os filamentos intermédios podem-se associar não só à membrana plasmática como também a outros elementos do citoesqueleto. Os filamentos de queratina das células epiteliais estão firmemente ancorados à membrana plasmática por duas áreas de contacto celular especializado: desmossomas e hemidesmossomas. Os desmossomas são junções entre células adjacentes nas quais o contacto célula-célula é mediado por proteínas transmembranares da família das caderinas. No lado citosólico, os desmossomas estão associados a uma placa densa de proteínas intracelulares à qual os filamentos de queratina estão unidos. Estas uniões são mediadas por desmoplaquina, um membro de uma família de proteínas chamada plaquinas. Os hemidesmossomas são ligações entre células epiteliais e tecido conjuntivo nos quais os filamentos de queratina estão ligados por diferentes membros da família das plaquinas (p.e. plectina) a integrinas (Fig 12.39). A plectina contribui para a ligação entre elementos do citoesqueleto, aumentando a estabilidade mecânica da célula (Fig 12.40).


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Epidermólise Bulhosa Simples Doença genética causada por uma mutação no gene que codifica a queratina. Os indivíduos afectados por esta doença apresentam severas anormalidades a nível da pele, de entre as quais se destacam lise das células da epiderme após traumas mecânicos mínimos. Consultar o texto “Expression Of Mutant Keratin Causes Abnormal Skin Development” pág. 502/503

Microtúbulos São o terceiro componente do citoesqueleto, sendo estruturas rígidas que, tal como a actina, são dinâmicas. Estão envolvidos na determinação da forma da célula, numa grande variedade de movimentos celulares, no transporte intracelular de organelos e na separação dos cromossomas durante a mitose.

Estrutura e organização Dinâmica dos Microtúbulos Os microtúbulos são constituídos por um único tipo de proteína globular, neste caso a tubulina, que é um dímero formado por uma tubulina-α e por uma tubulina-β que se polimerizam para formar os protofilamentos. Estes vão constituir os microtúbulos (cada um composto por 13 protofilamentos) (Fig 12.42) Os microtúbulos são polares, uma vez que, tal como a actina, apresentam uma extremidade positiva (de crescimento rápido) e uma extremidade negativa (de crescimento lento) (Fig 12.43). Nos microtúbulos verifica-se instabilidade dinâmica, resultante da hidrólise de GTP ligado a tubulina-β durante ou logo após a polimerização, o que reduz a afinidade de ligação em relação a moléculas adjacentes (Fig 12.44).

Organização Intracelular dos Microtúbulos A extremidade negativa dos microtúbulos está ancorada nos nos centrossomas, que, em interfase, estão localizados perto do núcleo. Durante a mitose, os microtúbulos reorganizamse para formar o fuso mitótico (Fig 12.45). Os centrossomas possuem um par de centríolos, que são estruturas cilíndricas altamente polares compostas por 9 tripletos de microtúbulos associados a diversas proteínas, como por exemplo a γ-tubulina (associada ao lúmen do centríolo) (Fig 12.48).

Drogas que Afectam a Estabilidade dos Microtúbulos Actualmente existem drogas que influenciam a estabilidade dos microtúbulos, sendo usados, por exemplo, no tratamento de cancro, uma vez que a divisão celular é travada se não se verificar uma correcta formação e organização do fuso mitótico. Exemplos de drogas destabilizadoras dos microtúbulos: colchicina, vimblastina,... Droga estabilizadora dos microtúbulos: taxol Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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Motores Microtubulares e Movimento O movimento de vesículas e organelos ao longo dos microtúbulos é baseado na acção de proteínas motoras: cinesinas, que fazem o transporte em direcção à extremidade positiva dos microtúbulos, ou seja, para zonas mais periféricas, e dineínas, que fazem o transporte em direcção à extremidade negativa, que se encontra no centro da célula (Fig 12.51).

Cílios e Flagelos Os cílios e os flagelos são projecções baseadas em microtúbulos, que permitem o movimento (locomoção) de uma grande variedade de células eucarióticas. Para visualizar exemplos de cílios e flagelos consultar Fig 12.53. A principal estrutura dos cílios e flagelos é o axonema, que é composto por micortúbulos e por proteínas a eles associadas. Os microtúbulos encontram-se organizados numa disposição “9+2”, na qual um par central de microtúbulos está rodeado por 9 conjuntos de 2 microtúbulos. Os microtúbulos periféricos estão ligados por pontes de nexina e apresentam 2 braços de dineínas. É a actividade motora dessas dineínas axonemais que dirige o batimento dos cílios e dos flagelos. (Fig 12.54) As extremidades negativas dos microtúbulos dos cílios e flagelos estão ancorados no corpo basal, que é uma estrutura similar ao centríolo e que contém 9 tripletos de microtúbulos (Fig 12.55) Resumo das Funções Os microtúbulos permitem a locomoção (os cílios e os flagelos apresentam um esqueleto de microtúbulos). Os microtúbulos participam no transporte intracelular de vesículas e organelos. Os microtúbulos intervêm na separação dos cromossomas durante a mitose, visto que são essenciais para a formação do fuso mitótico, que pode ser visualizada na Fig 12.58


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Capítulo 13 – Membrana Plasmática Transporte de pequenas moléculas Medicina Molecular: Fibrose Cística (FC) A Doença A fibrose cística é uma doença letal hereditária recessiva. Afecta um em cada 2500 recémnascidos brancos, rara nas outras “raças”. A disfunção característica da fibrose cística é a produção de muco anormalmente espesso e aderente por vários tipos de células epiteliais, incluindo as células que revestem os tractos respiratório e gastrointestinal. A manifestação clínica primária é uma doença respiratória resultante da obstrução das vias aéreas superiores por muco, seguida por infecções bacterianas recorrentes. Na maioria dos doentes o pâncreas também fica comprometido, pois os ductos pancreáticos ficam obstruídos por muco. As glândulas sudoríparas também apresentam um funcionamento anormal e a presença excessiva de sal no suor é um indicativo para o diagnóstico da fibrose cística. Os procedimentos-padrão para esta doença incluem terapia física para promover drenagem bronquial, administração de antibióticos e reposição de enzimas pancreáticas.

Bases Moleculares e Celulares Defeito no transporte de Cl- nos epitélios afectados (que incluem os ductos de glândulas sudoríparas e as células que revestem o tracto respiratório). O gene da fibrose cística codifica uma proteína (denominada CFTR – regulador da condutância transmembranar da fibrose cística) que pertence à família dos transportadores ABC. A CFTR funciona como um canal de Cl, portanto as mutações responsáveis pelo estabelecimento da fibrose cística resultam directamente no transporte deficitário de Cl-.

Prevenção e Tratamento O isolamento do gene da fibrose cística possibilita um mapeamento genético para a identificação dos indivíduos portadores do alelo mutado. A compreensão do funcionamento da CFTR como canal de Cl- tem sugerido novas abordagens para o tratamento. Uma possibilidade é a utilização de drogas que estimulem a abertura de outros canais de CL- nos epitélios afectados. Alternativamente, a terapia génica possibilita a potencial reposição dos genes da CFTR normal no epitélio respiratório dos pacientes com fibrose cística. Esta possibilidade baseou-se em experiências que demonstraram que a introdução do gene normal da CFTR em cultura de células de paciente com fibrose cística era suficiente para restaurar a função do canal de CL-. Além disso, a aplicação em potencial da terapia génica para FC é grande pela facilidade de acesso às células epiteliais que revestem as vias aéreas superiores (utilizando o sistema de aspersão de aerosóis).


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Estudos com animais experimentais têm demonstrado que vectores virais podem transmitir o cDNA da CFTR para o epitélio respiratório, e em 1993 iniciou-se o primeiro protocolo experimental de tratamento em humanos contudo a eficiência de de transferência tem sido baixa e a expressão do cDNA da CFTR transferido tem sido mantida por menos de um mês.

Endocitose Endocitose é o processo através do qual as células eucarióticas são capazes de englobar macromoléculas e partículas do meio que as circunda. Na endocitose, o material a ser internalizado é circundado por uma área de membrana plasmática, que brota para o lado de fora para formar a vesícula que conterá o material a ser internalizado.

Fagocitose Durante a fagocitose as células internalizam grandes partículas como bactérias, resto celulares ou até células intactas. A ligação de uma partícula aos receptores de superfície de uma célula fagocítica leva à emissão de pseudópodes, que circundam as partículas e depois as suas membranas fundemse para formar uma grande vesícula intracelular (fagossoma). Os fagossomas fundem-se com os lisossomas, formando fagolisossomas, nos quais o material ingerido é digerido por acção de hidrolases ácidas dos lisossomas. As amibas utilizam a fagocitose para capturar partículas alimentares, como bactérias ou outros protozoários. Em animais multicelulares, o principal papel da fagocitose é fornecer defesa contra microrganismos invasores e eliminar células velhas ou danificadas do corpo. Nos mamíferos a fagocitose é uma função de dois tipos de glóbulos brancos, os macrófagos (eliminam microrganismos de tecidos infectados e células velhas ou mortas) e os neutrófilos (eliminam microrganismos de tecidos infectados).


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Endocitose Mediada por Receptor A endocitose mediada por receptor é um exemplo de pinocitose (captação de fluidos ou macromoléculas em pequenas vesículas). A endocitose mediada por receptor possibilita o mecanismo de captação selectiva de macromoléculas específicas. As macromoléculas que serão internalizadas ligam-se inicialmente a receptores específicos de superfície celular, que estão concentrados em regiões especializadas da membrana plasmática, denominadas regiões recobertas por clatrina. Depois originam-se pequenas vesículas cobertas por clatrina contendo os receptores e as suas respectivas macromoléculas ligadas. Estas vesículas fundem-se com os endossomas jovens, nos quais os seus conteúdos são classificados para serem transportados para o lisossoma ou para serem reciclados na membrana plasmática.

Formação de vesículas cobertas por clatrina

A internalização do colesterol por células de mamíferos permite uma melhor compreensão da endocitose mediada por receptor. O colesterol é transportado através da corrente sanguínea na forma de partículas lipoproteicas, sendo a mais comum a lipoproteína de baixa densidade (LDL). A internalização de LDL por células de mamíferos dá-se mediante a ligação do LDL com receptores específicos de superfície celular que se encontram concentrados nas regiões recobertas por clatrina e são internalizados por endocitose. A hipercolesterolémia familiar (abordada de forma mais detalhada mais à frente) permitiu descobertas importantes no processo de internalização do LDL. É uma doença hereditária e os pacientes com esta doença apresentam níveis muito elevados de colesterol sérico e sofrem de ataques cardíacos precocemente. As células desses pacientes são incapazes de internalizar LDL a partir dos fluidos extracelulares, resultando na acumulação de altos níveis de colesterol na circulação, pois a doença resulta de uma mutação no receptor de LDL (concentrado nas regiões recobertas por clatrina). Essas mutações podem ser de dois tipos: as células podem simplesmente não ser capazes de se ligar ao LDL (demonstrando que os receptores específicos Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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de superfície celular são necessários para a internalização de LDL); ou as células podem ligar-se mas ser incapazes de internalizá-lo (os receptores destes pacientes são incapazes de se concentrar nas regiões recobertas por clatrina, o que evidencia o papel central das regiões recobertas por clatrina na endocitose mediada por receptores).

A clatrina organiza-se numa estrutura semelhante a uma cesta de basquete que distorce a membrana, formando pontos de invaginação. Uma proteína de ligação a GTP, a dinamina, organiza-se em anéis em redor desses pontos invaginados, promovendo finalmente a liberação das vesículas cobertas para o lado de dentro da célula. Fluidos extracelulares também podem ser incorporados nas vesículas cobertas conforme estas brotam da membrana plasmática, de modo que a endocitose mediada por receptor resulta numa internalização não-selectiva de fluidos extracelulares e outros materiais (endocitose de fase fluida), além da internalização de macromoléculas específicas. As regiões recobertas por clatrina geralmente ocupam 1 a 2% da área da superfície da membrana plasmática. Enquanto a endocitose dependente da clatrina é a principal via de internalização tanto de fluidos como de macromoléculas específicas, as células também usam vários mecanismos independentes da clatrina, um desses mecanismos envolve a captação de moléculas em caveolas (pequenas invaginações da membrana plasmática), noutro mecanismo, vesículas grandes podem mediar a internalização de fluidos, num processo conhecido por macropinocitose.

Key Experiment: O Receptor de LDL O Contexto A hipercolesterolémia familiar (FH) é uma doença genética, apresentando os pacientes altos níveis séricos de colesterol e sofrendo ataques cardíacos em idade jovem. Brown e Goldstein em 1972 iniciaram os seus trabalhos sobre esta doença, com a ideia de que a superprodução de colesterol resultava de um defeito no mecanismo de controlo que normalmente regula a biossíntese de colesterol. Após terem realizado algumas experiências, detectaram que a adição de LDL a um meio de cultura de fibroblastos* humanos normais inibe a actividade da HMGCoA redutase, que é uma enzima cuja actividade limita a via de biossíntese do colesterol. Em Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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contraste a HMG-CoA redutase não é afectada pela adição de LDL às células dos pacientes, resultando numa superexpressão de colesterol pelas células FH. Contudo, experiências subsequentes indicaram que esta anomalia na regulação da enzima HMG-CoA redutase não é resultante de mutações no gene da enzima, em vez disso, a regulação anormal da enzima parecia estar relacionada com uma incapacidade das células FH de extrai colesterol a partir do LDL. Brown e Goldstein, em 1974, demonstraram que a lesão nas células FH é resultante de um defeito na ligação do LDL ao seu receptor na superfície celular.

Esquematicamente: Fibroblastos humanos normais Adição de LDL Inibe a actividade de HMG-CoA redutase (enzima cuja actividade limita a via de biossíntese de colesterol)

Células dos pacientes Adição de LDL Actividade de HMG-CoA redutase não é afectada Resulta numa superexpressão de colesterol pelas células FH

Mas esta anomalia não é resultante de uma mutação no gene da enzima, é porque as células estavam incapacitadas para extrair colesterol a partir da LDL. Lesão nas células FH é resultante de um defeito na ligação de LDL ao seu receptor na superfície celular

As experiências Em 1974 Brown e Goldstein realizaram experiências em que analisaram a ligação de LDL marcado com isótopo radioactivo a fibroblastos obtidos tanto de indivíduos normais como pacientes de FH.

Os dados das experiências sugerem que os fibroblastos normais possuem um receptor específico para o LDL que está ausente ou alterado nas células FH, eles concluíram que o defeito da ligação de LDL observado em células FH “pode representar uma lesão genética primária nesta enfermidade”, respondendo pela incapacidade do LDL em inibir a HMG-CoA redutase e pela resultante superprodução de colesterol. Experiências adicionais demonstraram que o LDL ligado a fibroblastos normais estava associado com a membrana da célula, sugerindo que o receptor de LDL seja uma proteína de superfície celular. Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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O Impacto Após a identificação do receptor de LDL, Brown e Goldstein demonstraram que o LDL ligado à superfície celular é rapidamente internalizado e degradado nos lisossomas, gerando colesterol livre. Posteriormente, em colaboração com Richard Anderson, estabeleceram que o receptor de LDL é internalizado por endocitose a partir de regiões recobertas por ligantes. Além disso, os seus estudos iniciais demonstraram que o receptor de LDL é reciclado para a membrana plasmática após a dissociação do seu ligante dentro da célula.

Tráfego de Proteínas na Endocitose Após a sua internalização, as vesículas cobertas por clatrina libertam-se das suas coberturas e fundem-se com os endossomas jovens, que são vesículas com extensões tubulares localizadas na periferia das células (a fusão é mediada pelas proteínas de ligação ao GTP Rab). Os endossomas jovens funcionam como um tipo de compartimento de selecção, onde as moléculas colectadas pela endocitose são tanto recicladas para a membrana plasmática como transportadas para os lisossomas, onde são degradadas.


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Os endossomas jovens mantêm um pH interno ácido (de 6 a 6,2) como resultado da acção da bomba de H+ da membrana, o que leva à dissociação de vários ligantes dos seus receptores dentro do endossoma jovem. A reciclagem para a membrana plasmática é o principal destino das proteínas de membrana internalizadas pela endocitose mediada por receptores, com vários receptores (como o receptor LDL) regressando à membrana plasmática após a dissociação dos seus ligantes nos endossomas jovens. Ligantes e proteínas de membrana que são destinados para a degradação nos lisossomas são transportados dos endossomas jovens para os endossomas maduros (mais ácidos que os jovens), que estão localizados próximos ao núcleo. Estes endossomas maduros evoluem para lisossomas e tornam-se ainda mais ácidos (pH em torno do 5). Dentro dos lisossomas o material endocitado é degradado por acção de hidrolases ácidas. Alguns receptores são transportados para os lisossomas, onde são degradados juntamente com os seus ligantes. Há um tipo especializado de reciclagem dos endossomas que desempenha uma importante função na transmissão de impulsos nervosos. As vesículas sinápticas vazias são recolhidas da membrana plasmática em vesículas cobertas por clatrina, que se fundem com endossomas jovens, aí as vesículas são regeneradas, acumulam novos suprimentos de neurotransmissores e são recicladas para a membrana plasmática, ficando então disponíveis para um novo ciclo de transmissão sináptica.

gEm células polarizadas, receptores internalizados também podem ser transferidos através da célula para domínios celulares opostos da membrana plasmática (p. e. domínio basolateral – endossoma jovem – membrana apical), um processo denominado transcitose.


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Capítulo 15 – Sinalização Celular Moléculas Sinalizadoras e os seus receptores Modos de sinalização célula-célula Existem 3 tipos de sinalização: 1. Endócrina, em que as hormona são secretadas por células endócrinas e transportadas pela circulação, até chegarem às células alvo (estrogénios). 2. Parócrina, em que a molécula sinalizadora é libertada pelas células e actua nas células vizinhas alvo (neurotransmissores). 3. Autócrina, que é a produção de um factor de crescimento pela célula, que ao ser secretada e recebida pela própria célula, a vai estimular (sistema auto-imune).


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Modos de sinalização celular


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Hormonas esteróides e a Superfamília dos receptores nucleares Todas as moléculas sinalizadoras actuam ligando-se aos receptores das células alvo. Alguns receptores são expressos na superfície da célula alvo, mas alguns são proteínas intracelulares, localizados no citosol, ou no núcleo. Estes receptores intracelulares responde a pequenas moléculas sinalizadoras hidrofóbicas que se conseguem difundir através da membrana plasmática. As hormonas esteróides são um exemplo clássico, sendo todas sintetizadas a partir do colesterol. Entre elas, incluem-se: testosterona, estrogénios, progesterona, corticoesteróides, etc. Outro exemplo de uma hormona lipossolúvel é a hormona tiróide.

Acção de hormonas esteróides

Devido aos seus caracteres hidrofóbicos, estas hormonas são capazes de entrar nas células, difundindo-se pela membrana celular. Dentro da célula ligam-se a receptores intracelulares, que são membros da superfamília dos receptores nucleares. Estes são factores de transcrição que contêm domínios para a ligação ao ligando, ligação ao DNA, e activação da transcrição. A ligação do ligando regula função destes receptores, activando ou inibindo os genes alvo, pelo que estas hormonas estão directamente relacionadas com a regulação da expressão genética.

Neurotransmissores Os neurotransmissores transportam sinais entre neurónios, ou de um neurónio para células alvo (como as células musculares). São pequenas moléculas hidrofílicas, que incluem: acetilcolina; dopamina; epinefrina (adrenalina); serotonina; histamina; glutamato; glicina; e o ácido GABA. A libertação dos neurotransmissores é sinalizada pela chegada de um potencial de acção no terminal do neurónio. Os neurotransmissores difundem-se pela fenda sináptica e Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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ligam-se aos receptores na superfície da célula alvo. Há neurotransmissores que também têm função hormonal, como a epinefrina. Como são moléculas hidrofílicas, os neurotransmissores são incapazes de se difundirem através da membrana celular. Muitos receptores são canais iónicos dependentes de ligandos, pelo que a ligação dos neurotransmissores induz uma mudança conformacional que abre estes canais, resultando num fluxo de iões através da membrana. Outros receptores de neurotransmissores estão associados a proteínas G, que indirectamente induzem a abertura de canais.

Hormonas Peptídicas e Factores de crescimento As hormonas peptídicas são hormonas sinalizadoras compostas por aa. Os exemplos mais conhecidos são: insulina, glucagina, hormonas de crescimento. Os neuropéptidos são moléculas sinalizadoras peptídicas secretadas por neurónios. Funcionam como neurotransmissores, e em certos casos neurohormonas. Os factores de crescimento (FC) são polipéptidos que induzem o crescimento e diferenciação de células animais. Um exemplo da actividade de um FC é a cura de feridas, por parte do FC derivado de plaquetas (PDGF). Este está armazenado em plaquetas, e é libertado durante a coagulação sanguínea no local do ferimento. Estimula a proliferação de fibroblastos vizinhos, contribuindo para o crescimento do tecido lesado. As citocinas, por outro lado, regulamo desenvolvimento e diferenciação das células sanguíneas, e controlam a actividade dos linfócitos durante a resposta imunológica. Existem ainda os FC ancorados à membrana da célula, que medeiam interacções directas entre células. As hormonas peptídicas, e os FC são incapazes de cruzar a membrana celular, por isso actuam ligando-se a receptores na superfície das células alvo.

Funções dos Receptores da Superfície Celular A ligação de um ligando a um receptor na superfície da célula inicia uma cadeia de reações intracelulares, chegando em última instância ao núcleo celular, e resultando em alterações na expressão génica.

Receptores Acoplados a Proteínas G Os receptores acoplados a proteínas G são receptores cuja ligação do ligando causa uma mudança conformacional que activa a proteína G. A proteína G é uma proteína da família proteínas sinalizadoras, que é regulada pela ligação do nucleótido guanina. O funcionamento das proteínas G pode ser descrito da seguinte forma: 1. As proteínas G heterotriméricas consistem em 3 subunidades (α,β e γ). A subunidade α liga-se a nucleótidos de guanina que regulam a actividade da proteína G. No estado de repouso, a α está ligada ao GDP mais a β e γ;


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2. A ligação da hormona altera a conformação do receptor acoplado à proteína G, estimulando a libertação do GDP e a sua troca por GTP; 3. A subunidade α ligada ao GTP fica activa e dissocia-se do complexo (β e γ); 4. Tanto a α, como o complexo β e γ vão actuar sobre as moléculas alvo; 5. A actividade da α é terminada quando o GTP se hidrolisa a GDP; 6. A subunidade α inactiva (ligada ao GDP) reassocia-se ao complexo β e γ, voltando tudo ao ponto de partida (de repouso), pronto para um novo ciclo.

Activação hormonal da adenilil ciclase

Há vários tipos de proteínas G, e estas ligam-se a diferentes tipos de receptores. Além disto, algumas subunidades de certas proteínas G regulam canais iónicos. (neurotransmissor acetilcolina).

Receptores associados a tirosina-cinases Alguns receptores da superfície celular estão directamente ligados a enzimas intracelulares, como é o caso dos receptores associados a tirosina-cinases, que fosforilam os seus substratos nos resíduos de tirosina. Esta família inclui receptores para a maioria dos FC polipeptídicos. Há muitos tipos de tirosina cinases. Mas o mecanismo pelos quais actuam é similar: 1. Os receptores associados a tirosina cinases ligam-se, no domínio extracelular, aos ligandos (exemplo: FC); 2. Activação dos domínios cinases citosólicos; 3. Desta activação resulta uma autofosforilação (fosforilação dos próprios receptores), e uma fosforilação das moléculas alvo; 4. Fosforilação das proteínas alvo propaga o sinal iniciado pela ligação do FC. Em alguns tipos de receptores, o ligando induz a formação de dímeros (dois receptores iguais juntam-se), o que provoca a autofosforilação da porção citosólica desses receptores. Esta Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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autofosforilação aumenta a actividade cinásica, e induz a criação de locais para a ligação com proteínas alvo, que serão fosforiladas.

Receptores de citocinas, e Tirosinas cinases não receptoras Alguns receptores estimulam tirosinas-cinases às quais não estão covalentemente ligados. É o caso da superfamília dos receptores de citocinas. A principal diferença entre os receptores acoplados a tirosina cinases e os receptores de citocinas, é que os últimos estão associados de forma não covalente a tirosinas cinases na sua porção citosólica. Mas apesar desta diferença, o mecanismo é semelhante, ou seja, a ligação de um ligando à porção extracelular do receptor induz a actividade cinásica da tirosina cinase. Alguns receptores de citocina são usados pelo HIV como receptores da superfície celular para a infecção dos linfócitos.

Receptores ligados a outros tipos de enzimas Há receptores com outras actividade enzimáticas, como é o caso dos receptores associados a fosfatases, a serina ou treonina cinases, e guanilil ciclases. As tirosina fosfatases removem grupos fosfato de resíduos de tirosina, contrabalançando os efeitos das tirosina cinases. Em certos casos têm efeitos regulatórios negativos na sinalização celular, terminando os sinais iniciados pela fosforilação de tirosinas cinases. Alguns ligandos peptídicos ligam-se a receptores cujos domínios citosólicos são guanilil ciclases, que catalisam a formação de cGMP. Receptores Guanilil ciclases têm um domínio extracelular que permite a ligação do ligando, pelo que esta estimula a formação de cGMP. O cGMP é um mensageiro secundário.

Vias de transmissão de sinais intracelulares Na maioria dos casos de estimulação de receptores, uma cadeia de reacções transmite sinais da superfície celular para uma variedade de alvos intracelulares – o processo denomina-se transmissão de sinais intracelular. Alguns dos alvos dessas vias incluem factores de transcrição que regulam a expressão genética, pelo que tais vias ligam a superfície celular ao núcleo: estímulos extracelulares levam à alteração na expressão genética.

A via do cAMP: Mensageiros Secundários e Fosforilação de Proteínas O cAMP é uma adenosina monofosfato na qual o grupo fosfato se liga covalentemente aos carbonos 3’ e 5’, formando uma estrutura cíclica. É um importante mensageiro secundário na resposta ao estímulo de diversas hormonas. Um mensageiro secundário é um composto cujo metabolismo é alterado pela interação de um ligando com um receptor. Funciona como um transmissor de sinais, regulando vias intracelulares. O ATP é transformado em cAMP pela adenilil ciclase e o cAMP é degradado a AMP pela cAMP fosfodiesterase. A acção do cAMP repercute-se sobre a proteína cinase dependente de cAMP, ou proteína cinase A (PKA), da seguinte forma: 1. A forma inactiva da proteína cinase A possui subunidades regulatórias e catalíticas. Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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2. O cAMP liga-se às subunidades regulatórias da PKA, libertando as subunidades catalíticas 3. As subunidades catalíticas livres ficam activas e fosforilam resíduos de serina das proteínas alvo. Cada ligando activa apenas um receptor, contudo um receptor por estimular centenas de moléculas. E cada uma dessas moléculas pode estimular a produção de outras, ao longo da cascata de sinalização. Assim, a ligação de hormonas a um pequeno número de receptores activa um grande número de enzimas alvo intracelulares. Em certos casos, o cAMP pode regular canais iónicos (sensação de odores).

GMP cíclico O GMP cíclico (cGMP) é também ele um importante mensageiro secundário em células animais. O cGMP é formado pela guanilil ciclase, e degradado por uma fosfodiesterase. A estimulação das guanilil ciclases (NO ou ligandos peptídicos) eleva os níveis de cGMP, que vão mediar respostas biológicas (exemplo: dilatação de vasos sanguíneos). A maioria das vezes o cGMP activa proteínas cinases dependentes de cGMP, podendo também regular canais iónicos.

Fosfolípidos e CA2+ Os fosfolípidos e o cálcio são mensageiros secundários comuns, activados a jusante de receptores associados a proteínas G ou associados a tirosina cinases. A hidrólise do fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) gera diacilglicerol e inositol 1,4,5 trifosfato (IP3), que activa a proteína cinase C e mobiliza o cálcio de reservas intracelulares, respectivamente. O aumento dos níveis de cálcio intracelulares activam diversas proteínas alvo, como as cinases dependentes de Ca2+/calmodulina.

Vias da MAP cinase As vias da MAP cinase são cascatas de proteínas cinases, que transmitem sinais. Os elementos centrais são as MAP cinases, que são activadas em resposta a factores de crescimento, ou outras moléculas sinalizadoras. Nos mamíferos, as MAP cinases são reguladoras do crescimento celular e diferenciação.

FC + Receptor  ocorre troca de GDP por GTP na Ras  activa a Raf cinase fosforila/activa MEK  fosforila/activa ERK  ERK passa para o núcleo e liga-se a regiões reguladoras de DNA (activa determinados genes)  transcrição  proteína  determina entrada no ciclo celular Esquema da via das MAP cinases – cascatas de fosforilação

Cortesia de Luís Carreto


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Activação das ERK MAP cinases


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Capítulo 16 – O ciclo celular A auto-reprodução talvez seja a principal característica das células, algo que se aplica a todos os organismos vivos, sejam eles unicelulares ou multicelulares. Todas as células se reproduzem dividindo-se em duas, considerando-se uma célula-progenitora que origina duas células filha. Estas por sua vez possuem as capacidades de crescer e de se dividir, originando-se, por sucessivas divisões, uma população de células com um ancestral comum. As bactérias são o exemplo mais simples desta capacidade, podendo formar colónias de milhões de células numa noite apenas, se colocadas em meio adequado à sua proliferação. No caso do homem, um organismo multicelular mais complexo, ciclos sucessivos de divisão celular após a formação do ovo resultam num número de 1014 células, em média. A divisão de todas as células é um processo que tem de ser cuidadosamente regulado para assegurar a transmissão de genomas intactos às células-filhas. Nos eucariontes, a progressão no ciclo celular é regulada por uma série de proteínas-cinases, verificando-se, por comparação de leveduras e humanos, que este processo foi conservado ao longo da evolução. Nos higher eukaryotes, toda a maquinaria envolvida na regulação do ciclo é ela própria regulada por factores de crescimento que controlam a proliferação celular, permitindo, desta forma, uma coordenação com a divisão celular das outras células do organismo. Pouco surpreendente é o facto de anomalias na regulação do ciclo celular poderem causar uma anormal proliferação de células cancerígenas. Por isto, o estudo do cancro, do ciclo celular e das vias de sinalização celular estão interligados.

O ciclo celular da célula eucariota O ciclo de divisão da maioria das células compreende 4 processos coordenados: crescimento, replicação do DNA, distribuição dos cromossas duplicados às células-filhas e divisão celular (propriamente dita). Nas bactérias, o crescimento e a regulação do ciclo celular ocorrem ao longo de grande parte do ciclo de divisão, sendo os cromossomas e a membrana plasmática distribuídos às células-filhas. Nos eucariotas o ciclo é mais complexo e compreende quatro discretas fases. Embora o ciclo celular seja um processo contínuo, pode afirmar-se que a replicação do DNA ocorre durante uma única fase do ciclo, sendo os cromossomas replicados posteriormente distribuídos aos núcleos das células filhas por intermédio de um conjunto de processos que precede a divisão propriamente dita. Todo o ciclo é regulado, como referido anteriormente.

Fases do ciclo celular A divisão de células eucariotas pode ser estudada por cultura de células humanas, que se dividem aproximadamente a cada 24 horas. A observação microscópica do ciclo celular levou à sua divisão em duas grandes fases: fase M e interfase. Durante a interfase, que compreende G1, S e G2, a célula prepara a divisão celular. Ao nível microscópico, nesta fase os cromossomas encontram-se descondensados no núcleo, pelo que este apresenta um aspecto uniforme; ao nível molecular, a célula cresce e replica o seu DNA. A fase M, embora represente apenas 5% do tempo de Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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vida da célula, é o processo mais crítico de todo o ciclo, pois é nele que ocorre a separação dos cromossas e a citocinese. Compreende uma série de sub-etapas que serão abordadas mais à frente. Células embrionárias e células estaminais correspondem a dois exemplos em que os ciclos celulares escapam à regra geral. Com efeito, após a fertilização do ovo ocorrem ciclos sucessivos que incluem, entre as mitoses, apenas uma rápida fase S. Não ocorre crescimento celular. No caso das células estaminais, estas percorrem a fase G1 e seguem para a fase G0, uma fase de latência em que as células permanecem metabolicamente activas, mas não proliferam, salvo se houver um estímulo externo, como um factor de crescimento. O estudo das fases do ciclo celular requer a identificação das células. Enquanto as sub-fases da fase M são facilmente vislumbradas ao microscópio óptico, as fases G1, S e G2 necessitam de uma interpretação bioquímica. Células em fases S podem ser facilmente identificadas por autoradiografia, se cultivadas num meio com nucleótidos radioactivos durante poucos minutos. Estas análises permitem estimar o tempo que dura cada uma das fases. Considere-se a situação de se colocarem nucleótidos radioactivos num meio com células em cultivadas durante diferentes tempos. Células que se encontravam na fase S serão observadas durante várias horas, pois incorporaram os ditos nucleótidos. Células marcadas radioactivamente em mitose serão observadas apenas passadas 4 horas, o que sugere que entre G2 e Fase M medeia esse intervalo de tempo. Células em diferentes fases do ciclo celular apresentam diferentes quantidades de DNA (para pormenores, v. p. 652). Experimentalmente, pode determinar-se essa quantidade (entre 2n e 4n) células com recurso a marcadores fluorescentes e a uma posterior medição da intensidade.

Regulação do Ciclo Celular por Sinais de Crescimento e Sinais Extracelulares A progressão da célula pelas várias fases do ciclo celular é regulada tanto por sinais intracelulares como extracelulares. A prova disso é a proliferação de células animais em cultura quando expostas a factores de crescimento. Todo a progressão pelas várias fases do ciclo é regulada e acompanhada por uma série de pontos de controlo que regulam essa mesma progressão. Um destes pontos de controlo, conhecido nas leveduras como START, ocorre no final da fase G1 e controla a transição entre esta e a fase S. Nas leveduras este ponto é conhecido como START; quando ultrapassado, as células entram em fase S e prosseguem para a divisão. No caso das leveduras, esta passagem é muito regulada por factores externos, como a disponibilidade de nutrientes, mas também pela dimensão da célula; ainda nestes seres vivos, que podem reproduzir-se por gemulação, é importante assegurar que tanto célula-progenitora como célula-filha atingem Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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dimensões mínimas para que a divisão possa prosseguir. O START representa, assim, uma verificação da existência, ou não, das condições necessárias à divisãog. Na maior parte das células animais o processo é análogo, designando-se o checkpoint START por restriction point. No entanto, são factores de crescimento extracelulares que sinalizam a proliferação e determinam a entrada na fase S e no resto do ciclo, diferentemente do que acontece nas leveduras, em que a disponibilidade de nutrientes no meio é mais relevante. No caso da ausência de factores de crescimento durante a fase G1, a célula não progride no ciclo e entra num estado de latência denominado G0, em que a taxa metabólica é reduzida. Os fibroblastos são um exemplo pertinente de células que permanecem num estado de latência G0 até que factores de crescimento derivados de plaquetas, extravasados dos vasos sanguíneos quando, por exemplo, há uma ferida, estimulam a sua proliferação. Existem também células eucariotas em que o principal ponto de controlo das condições necessárias à divisão é feito no final da fase G2, como por exemplo S. Pombe. No caso dos vertebrados, os oócitos ilustram esta regulação, podendo estas células ficar retidas na fase G2 várias décadas até que um contexto hormonal adequado permite a prossecução para a Fase M.

Checkpoints do ciclo celular Os vários eventos que correm durante os vários estágios do ciclo celular têm de ser coordenados para que ocorram na sequência apropriada – por exemplo, é de extrema importância que a célula não inicie a fase M antes de ter terminado a replicação do seu genoma (checkpoint G2), para que não se originem células filhas com informação genética incompleta. Só depois de terminada a replicação se passa esse checkpoint, podendo a célula progredir. Vários destes checkpoints – G1, S e G2 - têm a função de assegurar que material genético incompleto ou danificado não é transmitido à descendência; se forem detectados erros, a célula corrige-os antes de atravessar o checkpoint. A paragem do ciclo nalgum destes checkpoints é mediada por duas proteínas-cinases – ATM e ATR – que são activadas em resposta a dano no DNA, desencadeando uma via de sinalização que culmina na reparação do DNA ou, por vezes, na apoptose. Outro checkpoint importante é aquele que ocorre no final da mitose e que verifica o estado de alinhamento dos cromossomas, para que se garanta uma correcta distribuição destes às duas células-filha. Caso haja erro, a mitose fica bloqueada em metáfase até que os cromossomas estejam alinhados.

Restringindo a replicação do DNA a uma única vez por ciclo O checkpoint da fase G2 previne, por um lado, o início da mitose até que a fase S esteja terminada. No entanto, é também necessário assegurar que o material genético se replica uma e uma só vez. Assim, as várias origens de replicação que apresentam os genomas das células dos mamíferos têm de ser rigidamente controladas para que, uma vez replicados, os segmentos a que elas correspondam não o voltem a ser. Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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O mecanismo molecular que controla as origens de replicação envolve as proteínas helicases MCM que a elas se ligam, juntamente com proteínas de reconhecimento da origem de replicação. As MCM actuam como factores que controlam o início da replicação. Assim, as MCM associam-se às origens da replicação exclusivamente durante a fase G1 e abandonamnas assim que a replicação se inicia já na fase S. A ligação das MCM durante as outras fases do ciclo é impedida pela actividade das proteínas-cinases que regulam a progressão no ciclo.

Reguladores da progressão do ciclo celular O avanço na compreensão dos mecanismos envolvidos na regulação do ciclo celular foi conseguido com a obtenção de resultados convergentes obtidos através de experiências realizadas em várias células eucariótas. Esses estudos mostraram que o ciclo de todas as células eucariótas é regulado por proteínas-cinases, responsáveis pela transição entre os diferentes estágios do ciclo.

Proteínas-cinases e regulação do ciclo celular Três distintos projectos experimentais contribuíram para a identificação das moléculas chave envolvidas no processo de regulação do ciclo celular. O primeiro consistiu numa experiência envolvendo oócitos de rã cujo resultado foi o seguinte: a microinjecção de um fragmento de citoplasma retirado de uma célula sujeita a um contexto hormonal que promove a meiose induz, quando introduzido numa célula não sujeita a esse contexto hormonal, a transição da fase G2 para a fase M; assim, conclui-se que o factor que promove esta transição nos oócitos (e, de resto, noutras células somáticas) está presente no citoplasma das células. A segunda experiência visou a análise genética de leveduras mutantes cujas proteínas-cinases responsáveis pela regulação do ciclo eram sensíveis à temperatura. Verificou-se que quando a temperatura não permitia a funcionalidade dessa proteína, o ciclo ficava preso no START. Conclui-se também que as proteínas codificadas pelos genes mutados estudados estão conservadas em todos os eucariontes. A terceira linha de investigação visou o estudo da síntese proteica em embriões do ouriço-do-mar. Constatou-se que a entrada destas células embrionárias na mitose implica a síntese de novas proteínas e verificou-se que a concentração destas proteínas – designadas por ciclinas A e B - aumentava durante a interfase e caía a pique na mitose, facto que sugere o papel de indutoras da mitose. Esta hipótese foi confirmada por estudos posteriores, com a injecção de Ciclina A num oócito a desencadear a fase M nessa célula. Estas três linhas de investigação convergiram em 1988, quando se conseguiu purificar MPF – Maturation Promoting Factor (um dímero), a partir de ovos. Conclui-se que o MPF é um regulador do ciclo muito conservado constituído por Cdk1 e Ciclina B; esta última é uma subunidade regulatória da actividade catalítica da Cdk1 (uma cinase), o que é consistente com a afirmação de que a actividade do MPF é controlada pela acumulação e degradação periódicas de Ciclina B durante o ciclo celular. A Cdk1 é também regulada por fosforilações em 3 aminoácidos. O esquema ilustra este mecanismo (deve ler-se Cdk1 em vez de Cdc2, conforme o The Cell, 4th Edition). Autores: BARRETO, Frederico; MAIA, Maria; ANDRADE, Ricardo Vale de; MESQUITA, Marcos; GUIA, Miguel Filipe; CAVACO, Sónia

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ACdc2 forma complexos com a ciclina B durante S e G2. A Cdc2 é então fosforilada no aminoácido 161, o que lhe confere actividade, como também no aminoácido 15 (e também no aminoácido 14 nas células dos vertebrados), o que inibe a Cdc2. A dos aminoácidos 14 e 15 activa o MPF ao nível da transição entre G2 e a fase M. A actividade da MPF é terminada no fim da Mitose por degradação proteolítica da ciclina B.

Uma vez fosforilada, a Cdk1 fosforila várias proteínas que iniciam os eventos da fase M. Por seu turno, esta proteína estimula também a degradação da Ciclina B, que ocorre por um processo de degradação proteolítca mediado pela ubiquinona. Esta degradação, por seu turno, inactiva a Cdk1 e termina a Mitose.

Famílias de Ciclinas e Cinases dependentes de ciclinas Os estudos acerca da estrutura e função do MPF (Ciclina B / Cdk1) trouxeram a conhecimento outras proteínas da mesma família, com diferentes membros dessa mesma família a controlar a progressão do ciclo noutras fases. Como referido anteriormente, a Cdk1 controla a progressão no ponto START e também o início da mitose em leveduras. No entanto, esta regulação acontece em articulação com outras ciclinas; assim, a transição de G2 para M é mediada por uma interacção da Cdk1 com ciclinas B (1,2,3,4); já a passagem do ponto START é mediada por ciclinas G1; a passagem da fase G1 para a fase S é mediada por ciclinas B (5,6). As interacções levadas a cabo pela Cdk1 e que permitem a progressão são fosforilativas. O esquema ilustra os principais pares Cdk1/ciclinas envolvidas na progressão das diversas fases do ciclo. Vários estudos confirmaram, no entanto, que este emparelhamento não estanque. Com efeito, verificou-se que ratinhos mutados para algumas ciclinas D e E e também Cdk(2,4,6) são capazes de proliferar, sugerindo uma redundância no funcionamento destas proteínas. A actividade das Cdk’s é regulada por quatro mecanismos moleculares: (1) associação com ciclinas, que são sintetizadas e degradadas periodicamente; (2) fosforilação do aminoácido 160; (3) fosforilação inibitória de resíduos de aminoácidos (posições 14 ou 14 e 15) na porção amino-terminal; (4) proteínas inibitórias das CDK’s. É a combinação e o balanço destes múltiplos processos de regulação que dirige a progressão no ciclo celular e, consequentemente, a proliferação.


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Factores de crescimento e regulação das Cdk’s da fase G1 Como já referido, a proliferação de células em animais é regulada por vários factores extracelulares, que têm implicações vias de sinalização intracelulares, sem os quais as células não avançam no restriction point que existe na porção final de G1, entrando, no caso dessa ausência, num estado de latência G0. Um ponto de contacto entre os factores de crescimento extracelulares e a progressão do ciclo são as ciclinas D, cuja síntese é induzida por aqueles enquanto os factores estão presentes. Estas proteínas são também rapidamente degradadas se ocorrer a remoção desses factores de crescimento. Assim, são os pares Cdk(4,6) / CicD que conduzem a passagem do ciclo celular pelo restriction point (v. esquema da página anterior). Dada a importância destas Ciclinas D, é entendível que um descontrolo na regulação (por exemplo, por mutações em proteínas regulatórias) destas proteínas possa ter como consequências uma proliferação descontrolada de células – cancro. A ligação entre as Ciclinas D, o controlo do ciclo e o cancro é ainda corroborado por estudos que mostraram que uma proteína RB (provinda de um gene imunosupressor) mutada está envolvida em muitos cancros humanos. Esta proteína é um regulador de factores de transcrição – E2F, controlando a actividade destes últimos. Assim, uma proteína RB não funcional pode determinar uma transcrição de genes (por exemplo para a proteína Ciclina E) desregulada e uma falta de coordenação entre esta tarefa e a presença/ausência de factores de crescimento externos, o que pode comprometer o ciclo celular. O par Cdk2 / Ciclina E, inibido pela proteína p27 em G0 e na fase inicial de G1, é responsável pela entrada na fase S. Assim, compreende-se outro ponto de contacto entre os factores de crescimentos externos e as vias reguladores do ciclo internas, já que as concentrações dessa proteína p27, inibitória da entrada na fase S, são controladas pelos tais factores externos.

Checkpoints de verificação de erros no DNA A proliferação das células não é controlada apenas por factores de crescimento, mas também por sinais que inibem a progressão no ciclo. A este nível, há a considerar os sinais que interrompem a progressão para que DNA possa ser reparado antes que a divisão prossiga. Essa interrupção é mediada pelas proteínas-cinases ATM e ATR que, detectando problemas na replicação do DNA, fosforilam proteínas que medeiam a interrupção do ciclo, como a CHK1 e a CHK2. Estas proteínas, por seu turno, inibem fosfatases responsáveis pela activação dos pares Cdk/Ciclina, que tanto interrompem o ciclo em G1 como G2. Nas células de mamíferos, há ainda a considerar a proteína p53 - um factor de transcrição que medeia a interrupção do ciclo na fase G1 -, que se mostrou não-funcional em muitos doentes com cancro.


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Capítulo 17 – Morte e Renovação Celular Nos organismos adultos, a morte celular tem que ser compensada pela renovação celular, pelo que a maioria dos tecidos contém células estaminais capazes de compensar a perda de outras células.

Morte Celular Programada Uma célula pode morrer devido a uma lesão traumática (necrose) que pode ser mecânica, causada por tóxicos ou químicos, ou então por suicídio (morte celular programada), denominado de apoptose. A morte celular programada é um processo cuidadosamente regulado, com vista a que o destino de cada célula individual satisfaça as necessidades do organismo como um todo. Nos adultos, é responsável pelo balanceamento da proliferação celular e pela manutenção de um número constante de células nos tecidos em renovação. Os neurónios e as células musculares não sofrem apoptose. A apoptose verifica-se, por exemplo, a nível da destruição do endométrio, de células do sistema imune, de células infectadas por vírus e de células com alterações do DNA. A apoptose é essencial na embriogénese, por exemplo, na formação dos dedos, na qual as células que estão entre os “futuros dedos” sofrem apoptose; se houver erros neste processo não há separação completa.

Eventos Durante a Apoptose (Fig 17.1) Começa por haver fragmentação do DNA e condensação da cromatina, seguidas de fragmentação do núcleo e, por fim, fragmentação da célula (esta não rebenta, ao contrário do que se verifica na necrose), pelo que esta se divide em pequenos corpos apoptóticos.

Fagocitose de Células e Fragmentos de Células Apoptóticas (Fig 17.2) Um dos sinais reconhecidos pela célula fagocitária que remove a célula em apoptose é a fosfatidil-serina, que durante a apoptose é expressa na superfície celular em vez de o ser no lado interno da membrana plasmática. Famílias de Proteases Lisossomais Proteossomas (destroem proteínas no citosol) Caspases (responsáveis pela apoptose)


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Caspases As caspases são uma família de proteases que conduzem aos acontecimentos que caracterizam a apoptose. Entre os seus alvos estão as lâminas nucleares. Elas clivam ao longo da proteína logo a seguir ao aspartato, fazendo com que a lâmina fique fragmentada (Fig 17.4). As principais acções das caspases são destruir o inibidor da DNase, clivar lâminas nucleares e proteínas do citoesqueleto, o que conduz à fragmentação do núcleo, destruição do citoesqueleto, e fragmentação celular. Todas as caspases são sintetizadas como precursores inactivos, que podem ser convertidos na sua forma activa através de clivagem proteolítica, catalisada por outras caspases. Assim, a activação de uma caspase iniciadora desencadeia uma cadeia de reacções que levam à activação de caspases a jusante e à morte celular. Nas células de mamíferos, a caspase iniciadora é a Caspase 9, que é activada ligando-se à Apaf1 e formando um complexo com múltiplas subunidades chamado apoptossoma. A formação deste apoptossoma também requer citocromo C (cytC), que é libertado da mitocôndria por estímulos que desencadeiam a apoptose. Uma vez activada no apoptossoma, a Caspase9 cliva e activa caspases efectoras, que levam à morte celular.

Reguladores Centrais da Apoptose: A família Bcl-2 A família Bcl-2 divide-se em 3 grupos funcionais de proteínas: 1. Antiapoptóticas (Bcl-2) 2. Pro-apoptóticas multidomínios (Bax e Bak) 3. Pro-apoptóticas BH3-only (Bid, Bad, Noxa, Puma, Bim)

Interacções regulatórias entre membros da família Bcl-2 Célula Normal Pro-apoptóticas BH3-only estão inactivas Pro-apoptóticas multidomínios são inibidas pelas Antiapoptóticas.

Célula em Apoptose 1. Sinais que desencadeiam a apoptose activam as Proapoptóticas BH3-only 2. Pro-apoptóticas BH3-only inibem as Antiapoptóticas 3. Activação das Pro-apoptóticas multidomínios 4. Libertação de cyt C 5. Activação das caspases 6. Apoptose


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As caspases também são reguladas pela família de proteínas IAP, que suprimem directamente a apoptose, inibindo as caspases, e marcando-as para degradação em proteossomas.

Vias Sinalizadoras que regulam a apoptose Uma das funções da apoptose é a eliminação de células danificadas. Células com genomas danificados são particularmente perigosas pois há a possibilidade de terem sofrido mutações que possam conduzir ao desenvolvimento de cancro. Assim, danos no DNA desencadeiam a apoptose. Papel do p53 na apoptose induzida por danos no DNA (Fig. 17.9) 1. Danos no DNA 2. Activação de cinases (ATM e CHK2) 3. Fosforilação e estabilização do p53 4. Aumento dos níveis de p53 5. p53 induz a transcrição dos genes que codifica pró-apoptóticas BH3-only (Puma e Noxa) 6. Morte celular Nota: O p53 medeia tanto a paragem do ciclo celular como a apoptose, em resposta a danos no DNA, o que depende da sua extensão (se não se conseguir corrigir os erros ocorre apoptose). Outras vias promovem a sobrevivência das células, inibindo a apoptose. Um exemplo é o do desenvolvimento do sistema nervoso dos vertebrados. 50% dos neurónios morrem por apoptose, pelo que os restantes sobrevivem pois recebem quantidade suficientes de sinais de sobrevivência provindos das suas células alvo. Estes sinais de sobrevivência são factores de crescimento. A maioria das células dos animais mais complexos está programada para sofrer apoptose, a não ser que esta seja suprimida por sinais de sobrevivência provindos de outras células. Uma das vias de sobrevivência celular consiste em factores de sobrevivência que estimulam um receptor membranar tirosina cinase, que activa uma cadeia de fosforilações, que lvam à fosforilação da proteína pró-apoptótica BH3-only, mantendo-a estável na sua forma inactiva. Controla-se assim a supressão da apoptose. Existem alguns péptidos (família dos “tumor necrosis factor” TNF) que induzem directamente a apoptose. Estes TNF ligam-se a receptores da superfície, induzindo a activação directa de caspases (caspase 8), que activam a proteína BH3-only, desencadeando todo o processo que leva à apoptose. Nota: No final do capítulo encontram-se resumos da matéria feitos pelo Miguel Guia.


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Células Estaminais e a Manutenção de Tecidos Adultos De forma a manter o número constante de células nos tecidos e órgãos de organismos adultos, é necessário que a morte celular seja compensada pela proliferação celular. Assim, muitos tecidos possuem uma subpopulação de células que se divide continuamente ao longo da vida, substituindo as células que nos indivíduos adultos têm elevadas taxas de turnover.

Proliferação de Células Diferenciadas A maioria das células diferenciadas em animais adultos perde a capacidade de proliferar, e se morrer é substituída por outras células menos diferenciadas (células estaminais renováveis). No caso dos fibroblastos, estes estão dispersos pelos tecidos conjuntivos, secretando colagénio. Os fibroblastos da pele estão normalmente suspensos em G0, mas rapidamente proliferam se for necessário reparar danos (feridas). Coagulação sanguínea no local da ferida liberta o factor de crescimento PDGF, que activa os receptores tirosina cinases , estimulando a proliferação e migração dos fibroblastos para a ferida, e a secreção de colagénio, que levará à reparação do tecido lesado. As células do endotélio são estimuladas a proliferar pelo factor de crescimento VEGF, que é secretado por células privadas de O2, levando ao crescimento de novos capilares em tecidos com falta de suprimento sanguíneo. No caso das células hepáticas, que estão paradas em G0, quando grande quantidade destas se perde, as células restantes são estimuladas a proliferar, substituindo o tecido perdido.

Células Estaminais Células Estaminais são células que se dividem para produzir células-filhas, uma das quais se mantém célula estaminal, e a outra se diferencia. Servem para manter os tecidos e órgãos de organismos adultos, ao contribuírem para a reposição de células perdidas. As células estaminais foram identificadas em diversos tecidos adultos, como o sistema hematopoiético, a pele, o intestino, músculo esquelético, cérebro e coração.

Aplicações Médicas de Células Estaminais Adultas A capacidade das células estaminais repararem tecidos dás-lhe um enorme potencial terapêutico. Recorre-se a células estaminais adultas para reparar danos feitos ao sistema hematopoiético através do transplante de medula óssea, e enxertos para reparar a epiderme.

Células Estaminais Embionárias e Clonagem Terapêutica Ao contrário das células estaminais adultas, as células estaminais embrionárias são fáceis de isolar e de propagar. Estas são capazes de se dividir indefinidamente, dando origem a todas as células diferenciadas em organismos adultos.

Transferência Nuclear Somática Mamíferos já foram clonados por transferência nuclear somática, na qual o núcleo de uma célula somática adulta é transplantado para um ovo anucleado. Isto abre as portas à clonagem


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terapêutica, na qual as células estaminais embrionárias derivariam de um embrião clonado e usado para transplantação terapêutica. ATENÇÃO: Para uma compreensão rápida e geral dos mecanismos da apoptose, foram feitos apontamentos pelo Miguel Guia, que ajudam a assimilar a matéria.


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Cooper para Tótós

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