Caderno de Aulas Praticas - Uff

UFF – CMF UFF – CMF – – MAF CADERNO DE DE AULAS AULAS PRÁTICAS PARA PARA A A DISCIPLINA DE TOXICOLOGIA

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MODELO PARA RELATÓRIOS DE AULA PRÁTICA UFF- CMF – MAF - DISCIPLINA DE TOXICOLOGIA RELATÓRIO DE AULA PRATICA Nome do aluno: aluno: ................................................................................................................... Turma: ............ Data:. ......... Título da aula: Análise de paraquat em cascas de maça Objetivo da análise: A determinação de paraquat em casas de maça visa garantir que o agrotóxico não está presente em concentração acima do permitido pela legislação. Principio analítico: Após extração e separação cromatográfica em placa de CCD, o paraquat pode ser quantificado por densitometria. Relatório de atividades: As cascas de maçã foram trituradas em liquidificador. Uma alíquota de 10 g foi extraída com 20 mL de metanol. Após filtração, o solvente foi separado e evaporado em banho-maria a 50 ºC sob corrente de ar. O resíduo seco obtido da extração foi ressuspendido em 100 microlitros de metanol e 10 microlitos foram aplicados à placa de CCD, previamente ativada. Após o desenvolvimento cromatográfico no sistema solvente clorofórmio: acetona 8:2, a placa foi removida da cuba cromatográfica e deixada dei xada à temperatura ambiente por alguns minutos para secar. A placa foi examinada sob luz UV 254nm e algumas manchas de cor escura foram observadas, inclusive no padrão de Paraquat. A seguir, foi aplicado o reagente cromogênico (solução de nitrito de sódio) e as manchas referentes ao Paraquat apresentaram a cor azul, tanto na amostra quanto no padrão. O valor de Rf obtido para o Paraquat foi de 0,72. As outras manchas que apareceram no UV não apresentaram cor quando submetidas ao reagente cromogênico. Uma curva de calibração foi preparada com aplicação na placa de 10 microlitros de soluções de paraquat em diferentes concentrações, com triplicata de cada concentração. Após leitura densitométrica, os valores obtidos foram utilizados para construção da curva de calibração. A equação obtida por regressão regressão linear foi Y = 0,98x + 0,005 (incluir gráfico). Com base na equação, a quantidade de paraquat foi determinada na amostra, sendo de 0,03 mg. Cálculos: 0,03 mg em 10 microlitros = 0,3 mg em 100 microlitos. mic rolitos. 0,3 mg em 10g de amostra = 30 mg / Kg de amostra = 30 ppm Interpretação do resultado: A concentração de paraquat encontrada (30 ppm) está acima do permitido pela legislação (1 ppm), sendo o produto considerado impróprio para consumo humano.

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Roteiro de Aula Aula Prática – Módulos 1 e 2 (extração e TLC) Extração e identificação de fármacos de caráter ácido e neutro em urina

1) Preparação da solução padrão padr ão (1mg / mL em metanol) Ácido salicílico Sulfametoxazol Fenobarbital Diazepam 2) Preparação da amostra fortificada - Acrescentar 50µL de d e cada solução padrão a 5mL de urina ur ina (concentração final = 10µg/mL). 3) Ativação das placas de CCD - Cortar 3 placas de CCD ( 10 x 4 cm) e ativar em estufa a 110º C por 1 hora. 3) Procedimento de extração das urinas (branco e amostra fortificada) - Aliquotar 5 mL da amostra de urina para tubo de centrífuga - Ajustar o pH para 3,5 com gotas de solução de HCl ou H 2SO4 - Adicionar 100 mg de NaCl e agitar no vórtex para dissolver o sal - Acrescentar 5 mL de éter e tampar o tubo. - Misturar por inversão os tubos durante 15 min. - Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases estão bem separadas) - Transferir o sobrenadante para um becher de 10 mL - Evaporar o solvente no banho-maria a 45ºC , sob leve corrente de ar, para par a obtenção do resíduo seco. 4) Procedimento de identificação por CCD - Ressuspender o resíduo obtido da evaporação do solvente com 100µL de metanol - Aplicar o resíduo (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicação), do branco e da amostra fortificada. - Aplicar 10 microlitros da solução padrão, conforme o esquema abaixo. BB

A

CC

m p a e z i a d

- Sistema solvente de desenvolvimento d esenvolvimento – Placa A = acetato de etila:metanol:amônia (8,5:1:0,5) Placas B e C = clorofórmio:acetona (8:2) - Após o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 minutos, sob corrente corr ente de ar. - Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm e 366 nm) - Reagentes cromogênicos – Placa A = Solução de cloreto férrico, seguido de Dragendorff Placa B = Solução de nitrato mercuroso Placa C = Solução de p -dimetilaminobenzaldeído -dimetilaminobenzaldeído (PAB) - Anote todos os resultados e calcule os Rfs.

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Roteiro de Aula Prática – Módulos 1 e 2 (extração e TLC) Extração e identificação de fármacos de caráter básico e neutro em urina

1) Preparação da solução padrão (solução metanólica a 1mg/mL) Clorpromazina Amitriptilina 4-N-metilaminoantipirina (MAA) – produto de hidrólise ácida da dipirona Diazepam 2) Preparação da amostra fortificada Amostra A = acrescentar 50µL da solução padrão de clorpromazina e MAA a 5mL de urina (concentração final = 10µg/mL). Amostra B = acrescentar 50µL da solução padrão de amitriptilina e diazepam a 5mL de urina (concentração final = 10µg/mL 3) NaOH 5M. 4) Ativação das placas de CCD - Cortar 2 placas de CCD ( 10 x 5 cm) e ativar em estufa a 110º C por 1 hora. - A placa B deverá ser previamente nebulizada com solução de KOH 1% em metanol, seca e então ativada. 5) Procedimento de extração das urinas (branco e amostra fortificada) - Aliquotar 5 mL da amostra de urina para tubo de centrífuga - Alcalinizar a amostra com 3 gotas da solução de NaOH 5M (~pH 11,5) - Acrescentar 5mL do solvente extrator – diclorometano:isopropanol (9:1); tampar o tubo. - Misturar por inversão durante 15 minutos. - Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases estão bem separadas) - Descartar o aquoso e transferir o solvente para um pequeno becher, filtrando sobre papel de filtro previamente umedecido com diclorometano - Evaporar no banho-maria a 45ºC na capela, sob leve corrente de ar, para obtenção do resíduo seco. 6) Procedimento de identificação por CCD (placa alcalina) - Ressuspender o resíduo obtido da evaporação do solvente com 100µL de metanol - Aplicar o resíduo (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicação), do branco e da amostra fortificada. - Aplicar 10 microlitros da solução padrão, conforme o esquema abaixo.


- Sistema solvente de desenvolvimento: Placa A - metanol:amônia (10 : 0,15) Placa B – clorofórmio:metanol (90:10) - Após o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 min, sob corrente de ar - Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm) - Reagente cromogênico – Placa A: reagente FPN e, depois, reagente de Dragendorff Placa B: solução de Iodo Platinado acidificada - Anote os resultados e calcule o Rf.

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Roteiro de Aula Prática – Módulos 1 e 2 (extração e TLC) Extração e identificação de inseticidas

1) Preparação da solução padrão (solução em acetato de etila a 1mg/mL) aldicarb metilparation 2) Preparação da amostra fortificada Preparar arroz cozido apenas em água. Fortificar uma porção do arroz com preparações comerciais dos inseticidas (um ou ambos). 3) Ativação das placas de CCD - Cortar 1 placa de CCD ( 10 x 7 cm) 4) Procedimento de extração (branco de matriz e matriz fortificada) - Com auxílio de uma espátula, transferir uma alíquota da amostra para dois tubos de centrífuga (até mais ou menos a altura que corresponde a 2 mL). - Adicionar a um tubo 5mL de acetonitrila e a outro 5 mL de éter de petróleo ou hexano. - Misturar por inversão durante 15 minutos. - Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases estão bem separadas) - Transferir o solvente para um pequeno bécher - Evaporar no banho-maria a 45ºC na capela, sob leve corrente de ar, para obtenção do resíduo seco. 5) Procedimento de identificação por CCD - Ressuspender os resíduos obtidos da evaporação do solvente com 100µL de acetona. - Aplicar os resíduos na placa (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicação), do branco e da amostra fortificada. - Aplicar 10 microlitros da solução padrão, conforme o esquema abaixo

2 2 o b n c t r a a r ti o co t ra n s o d i c a r a a n os ra r m B m l A A t i l p B A e M

- Sistema solvente de desenvolvimento: Placas A = Hexano:acetona 8:2 - Após o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 min, sob corrente de ar - Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm) - Aplicar o reagente cromogênico – solução de cloreto de paládio - Anote os resultados e calcule o Rf.


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Roteiro de Aula Prática – Módulo 3 (aplicação da colorimetria na análise toxicológica)

Avaliação do ácido δ–aminolevulínico em urina (ALA-U) Material:

1. Espectrofotômetro para a região do visível (553nm) 2. Solução-estoque de ALA Em balão volumétrico de 100mL, dissolver 6,4 mg de cloridrato de ALA e completar volume (concentração final de 50mg/L). Essa solução é estável por mais de 2 meses quando refrigerada e protegida da luz.

Curca de calibração em água: Separar 5 balões volumétricos de 10mL. Em cada balão adicionar, respectivamente, os seguintes volumes de solução-estoque de ALA: 0,1 – 0,2 – 0,5 – 1 – 2 mL. Avolumar com água destilada. Concentrações obtidas: 0,5 – 1 – 2,5 – 5 e 10 mg/L. 3. Tampão acetato, pH 4,6. Em balão volumétrico de 1L, dissolver 136g de acetato de sódio triidratado em 700mL de água destilada e adicionar 57 mL de ácido acético glacial. Completar volume.

4. Reativo de E HRLICH modificado (preparado no dia da utilização ) Em balão volumétrico de 25 mL, dissolver 0,5g de p-dimetilaminobenzaldeído em cerca de 15 mL de ácido acético glacial. Adicionar 2,5 mL de HClO 4 60% e 2,5 mL de água destilada. Completar volume com ácido acético.

5. Acetato de etila e acetoacetato de etila Procedimento para o GRUPO A (preparo da amostra e do branco) 1. Colocar em cada um de dois tubos de ensaio, 1mL de urina e 1mL de tampão acetato. Rotular um tubo como amostra e outro como branco. 2. Adicionar 0,2 mL de acetoacetato de etila no tubo da amostra e agitar por 5 segundos. 3. Manter os tubos em banho de água fervente durante 10 minutos. 4. Esfriar e adicionar 3ml de acetato de etila aos dois tubos: agitar manualmente (aprox. 50 inversões). 5. Centrifugar, se necessário, e transferir a camada orgânica superior para outro tubo (tanto o branco quanto a amostra). 6. Adicionar 2 mL de reativo de EHRLICH a cada tubo e misturar. AGUARDAR 10 minutos, até que a reação se complete. 7. Determinar a absorvância, usando o branco para zerar o equipamento. Procedimento para o GRUPO B (preparo da curva de calibração). Preparar em duplicata. 1. Colocar no tubo de ensaio, 1mL de cada solução de ALA preparada de acordo com a tabela acima. 2. Adicionar 1 mL de tampão acetato. 3. Adicionar 0,2 mL de acetoacetato de etila e agitar por 5 segundos. 4. Manter os tubos em banho de água fervente durante 10 minutos. 5. Esfriar e adicionar 3ml de acetato de etila aos dois tubos: agitar manualmente (aprox. 50 inversões). 6. Centrifugar, se necessário, e transferir a camada orgânica superior para outro tubo. 7. Adicionar 2mL de reativo de EHRLICH a cada tubo e misturar. AGUARDAR 10 minutos até que a reação se complete.


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8. Enquanto isso, preparar branco de reagentes misturando 3mL de acetato de etila com 2mL de reativo de EHRLICH. Zerar o equipamento com o branco de reagentes. 9. Determinar a absorvância das duplicatas de cada concentração, iniciando pela concentração mais baixa. 10.Construir a curva de calibração (absorvância x concentração de ALA) usando planilha EXCEL®. Obter equação da reta através de regressão linear. Procedimento para o GRUPO C (dosagem da creatinina) (KIT LABTEST) 1. Fazer a diluição prévia da amostra misturando 0,2mL de urina com 4,8 mL de água destilada 2. Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como descrito no quadro 1. Quadro 1. Esquema analítico para a dosagem da creatinina. Branco 2 mL

Teste 2 mL 0,25 mL

Padrão 2 mL

Tampão Amostra Agua deionizada 0,25 mL Padrão 0,25 mL Ácido pícrico 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL Misturar e incubar em banho-maria a 37ºC durante 10 minutos Selecionar o comprimento de onda do espectrofotômetro para 510nm e zerar o aparelho com o branco. Determinar a absorvância do teste (A1) e do padrão. Acidificante (colocado na cubeta) 0,1 mL 0,1 mL Homogeneizar e deixar à temperatura ambiente por 5 minutos Zerar o equipamento com o branco e determinar a absorvância do teste (A2) 3. 4.

Calcular a concentração de creatinina urinária através da fórmula: Creatinina (mg/dL) = 4 x [(A1 – A2) / Abs padrão ] x 25

Para todos os grupos: Calcular a concentração de ALA na amostra com auxílio da curva de calibração. mg/L ALA = mg ALA/g creatinina g/L creatinina

Valor de referência (NR-7): até 4,5mg/g creatinina

Baseado em: Tomokuni, K; Ogata, M. Simple Method for Determination of Urinary δ -aminoleculinic acid as na Index of Lead Exposure. Clinical Chemistry, v. 18: 1534 – 36, 1972.


Mecanismo da reação: O

C

OCH2CH3

O

CH2 CH3

O

C

OCH2CH3 OH

CH H3C

HOOCCH 2CH2 CH2CH2COOH

O CH2

H2N

OH

H

NH2

ACIDO δ-AMINOLEVULÍNICO

ACETOACETATO DE ETILA

H2O O CH3CH2O

CH2CH2COOH

C

H3C

N H

ÁCIDO 2-METIL-3-CARBETOXI-4-PROPIONICOPINOL

H N(CH3)2 O p- DIMETILAMINOBENZALDEÍDO

OCH2CH3 O

H3C

C

CH2CH2COOH

N H

C H

Complexo vermelho

N(CH3)2

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Roteiro de Aula Prática – Módulo 3 (aplicação da colorimetria na análise toxicológica)

Avaliação do ácido hipúrico urinário no diagnóstico do uso abusivo de tolueno Princípio do método: O ácido hipúrico reage com o cloreto de benzenosulfonila, na presença de piridina, formando um composto róseo-avermelhado, de λmax = 410nm, cuja intensidade de coloração é proporcional à concentração de ácido hipúrico presente na amostra. O

O

O

+

S

O

Cl-

O OH

N H

N

O

Ácido hipúrico

N

Material: 1. Ácido hipúrico 2. Cloreto de benzenosulfonila (cuidado; corrosivo – trabalhar com óculos de proteção e luvas, na capela e adicionar lentamente ao tubo escorrendo pelas paredes do tubo). 3. Piridina (cuidado: odor pungente, cancerígeno - trabalhar na capela, com luvas e óculos de proteção). Curva de calibração em água (0,25 a 2,5 mg/mL): Solução estoque a 2,5mg/mL: pesar 62,5 mg de ácido hipúrico em um becker e adicionar 20 mL de água deionizada (para auxiliar na dissolução, coloque o becker no ultra-som com água aquecida a 50ºC). Deixe esfriar, e transfira quantitativamente para balão volumétrico de 25 mL, avolumando com água deionizada. Preparar diluições da solução estoque em água nas seguintes concentrações: 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5 mg/mL. Quadro 1. Esquema analítico para dosagem do ácido hipúrico: Amostra / reagente Tubo da amostra Tubo da curva de calibração Urina 0,2 Solução de calibração 0,2 Piridina 0,5 0,5 CBS 0,2 0,2 Água destilada 2 2 Aguardar de 5 – 10 minutos

Tubo do branco de reagentes 0,5 0,2 2,2

Tabela 1. Valores de absorvância obtidos para a curva de calibração. mg/mL Absorvância Concentração de ácido hipúrico na amostra (mg/mL): 2,5 2 Concentração de creatinina (mg/dL): 1,5 1 Resultado final: 0,5 0,25 Interpretação: valor de referência: até 1,5 g/g creatinina I.B.M.P (NR-7): até 2,5 g/ g creatinina Baseado em Yoshida, M. et al. Simple colorimetric semiquantitation method of hippuric acid in urine for demonstration of toluene abuse. Legal Medicine, v. 7: 198 – 200, 2005.


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Roteiro de Aula Prática – Módulos 3 (espectrofotometria no visível)

Dosagem de Metemoglobina

A oxidação do ferro contido na hemoglobina para a forma férrica inviabiliza a ligação da hemoglobina com o oxigênio. Várias substâncias químicas são capazes de promover essa conversão, entre elas: medicamentos (antipirina, dapsona, metoclopramida, anestésicos locais), conservantes de alimentos (nitratos, nitritos e cloratos), e agentes como anilina, nitrobenzeno, hidrazinas, polifenóis. Algumas patologias estão associadas com aumento de metemoglobina (hemoglobinose M e indivíduos deficientes de glicose-6-P desidrogenase ou de NADH diaforase). Princípio do método: o percentual de globinas na forma de metemoglobina (MetHb) é avaliado através da diferença de absorvância obtida com a conversão da MetHb existente (A 1) à cianometemoglobina (A 3). O total de globinas é avaliado depois de sua conversão à metemoglobina (A 2) e posteriormente à cianometemoglobina A 4). Obs.: a absorção máxima da metemoglobina ocorre a 632 nm. 0,8 mL de sangue heparinizado em tubo de centrífuga 2,2 mL de água destilada 1 mL de solução tampão fosfato 1 gota de TRITON X-100

Centrifugar a 10.000 rpm por 15 minutos ( nossa centrífuga é velocidade máxima por 30 minutos) 2,4 mL

sobrenadante

0,2 mL + 2,2 mL reativo ferricianeto-fosfato

A1

Ler as absorvâncias a 632 nm (A1 e A2)

A2

Adicionar 80 µL reativo cianeto Aguardar 1 minuto A3

Ler as absorvâncias a 632 nm (A3 e A4) % Metemoglobina = 100 x

A4

A1 – A3 (A2 – A4) x 12

Valor de referência (NR-7): < 2% Soluções

A. Solução de ferricianeto de potássio a 5% B. Solução tampão fosfato 0,5 M pH 7,2 (juntar 10 mL de solução 0,5 M de NaH 2PO4 com 7 mL solução de NaOH 0,5 M). Reativo de ferricianeto-fosfato: em tubo de ensaio graduado misturar 0,2 mL de solução A com 2,5 mL de solução B e completar volume q.s.p. 10 mL com água destilada (preparo diário). C. Solução de cianeto de sódio a 10% (preparo recente) D. Solução de ácido acético a 12% Reativo cianeto: em tubo de ensaio misturar 1 mL da solução C com 0,9 mL da solução D.


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Figura 1. Diferentes espectros de absorção com comprimento de ondas específicos (nm) de oxiemoglobina, deoxiemoglobina, metemoglobina e cianometemoglobina. Fonte: Naoum, P.C. et al. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 26(1): 19 - 22, 2004.

Referência da metodologia : Hegesh, E. et al. Clin. Chim. Acta, v. 30: 679 – 82, 1970.


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Roteiro de Aula Prática – Módulo 3 (espectrofotometria no visível)

Determinação da Dapsona no plasma / soro A dapsona é um fármaco quimioterápico empregado principalmente no tratamento da hanseníase e na prevenção da infecção respiratória por P. carinii em pacientes aidéticos e crianças com leucemia linfoblástica aguda. Principais produtos de bioativação: monoacetildapsona (ADDS) e mono-N-hidroxidapsona (NHDDS). Ela também atua sobre o P. falciparum sendo indicada na profilaxia da malária Os efeitos adversos são mais comuns em concentrações plasmáticas superiores a 0,01 mg / mL e incluem anemia hemolítica e formação de metemoglobina. Reações de hipersensibilidade cutânea podem estar presentes em até 17% dos pacientes. Estão sob risco maior os indivíduos deficientes de NADH-citocromo b5-redutase (heterozigotos) que podem chegar a mais de 10% de MetHb em 3 – 10 semanas de tratamento. A avaliação dos níveis plasmáticos de dapsona é útil para o diagnóstico da intoxicação medicamentosa e para ajuste da dose. Níveis terapêuticos: 0,5 – 5 µg/mL. Princípio do método: A dapsona, em meio ácido, forma um complexo colorido com o PAB.

Procedimento: 1. Solução padrão de DDS 1mg/mL – Pesar 0,01g de DDS e dissolver em etanol absoluto utilizando balão volumétrico de 10mL. Acondicionar a solução em vidro âmbar e conservar em geladeira. 2. Curva de calibração em plasma ou soro. Transferir quatro alíquotas (0,01, 0,02, 0,04 e 0,06mL) da solução padrão de DDS para quatro tubos de centrífuga. Evaporar o solvente e acrescentar 2 mL de plasma. Levar ao vortex por 1 minuto. Fazer cada concentração em triplicata. Em paralelo, separar 2 mL de plasma para o branco. 3. Reativo de Ehrlich Pesar 3 g de 4-dimetilaminobenzaldeído (PAB) e diluir em etanol absoluto. Completar ao volume para 100mL. Acondicionar em vidro âmbar e conservar sob refrigeração.

4. Seguir o procedimento analítico esquematizado abaixo. 2mL de plasma ou soro

2 gotas de solução KOH 6% (para obter pH 10 – 11) 10 mL de CHCl3 agitar por 15 minutos e centrifugar Fase aquosa

Fase orgânica

Filtrar 5 mL de HCl 3N / agitar por 15 minutos e centrifugar

desprezar

Fase orgânica desprezar

Fase aquosa 4 mL

2 mL etanol absoluto 2 mL de reativo Ehrlich A itar or 20 s

Ler absorvância a 470 nm


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5. Montar uma planilha Excel® com os resultados (absorvância x concentração). Obter a equação da curva de calibração através de regressão linear. Avaliação da recuperação (exatidão): Tomar duas alíquotas de solução padrão (0,010 e 0,040) e colocar cada uma em um tubo de centrífuga. Fazer triplicata desse procedimento. Adicionar 4 mL de HCl 3N em cada tubo. Homogeneizar. Adicionar 2mL de etanol absoluto e 2 mL de reativo de Ehrlich. Agitar por 20 segundos e ler a absorvância. Obter a média dos valores de absorvância (M2). Construir a curva de calibração (Absorvância x microgramas dapsona). Obter a média dos valores de absorvância obtidos para análise de plasma fortificado a 10µg/mL. Anotar o valor de absorvância correspondente (A1). Avaliar a massa de dapsona correspondente a essa absorvância utilizando a curva Abs x massa dapsona [M1]. M1 = massa de dapsona realmente extraída M2 = massa de dapsona teoricamente extraída [(10 µg x 2) x 4/5] Cálculo de rendimento %: [M1 / M2] x 100 Avaliação da precisão intra-série: Calcular o Coeficiente de Variação (CV) dos resultados para cada concentração da curva de calibração através da formula: CV% = (desvio-padrão / média) x 100 Como você estudaria a especificidade/ seletividade ? A técnica tem sensibilidade adequada para monitorar concentrações tóxicas de DDS ? Como você avaliaria a linearidade desse método?

Baseado em: Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas, (SP), v. 25, n. 2, p. 177-178, 1989.


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Roteiro de Aula Prática – Módulo 4 (aplicação da enzimologia na análise toxicológica)

Dosagem de nitrito e nitrato em alimento Nitratos e nitritos são usualmente empregados como conservantes para alimentos. Quando ingerido pelo homem, o nitrato sofre ação da flora microbiana sendo reduzido a nitrito. Por reagir com aminas e amidas presentes no meio, os nitritos geram nitrosaminas e nitrosamidas, sabidamente carcinogênicas, mutagênicas e teratogênicas. O nitrito também interage com a oxiemoglobina, oxidando o ferro e gerando aumento nas taxas de metemoglobina segundo a reação: 2 O 2Fe2+ + 3NO2- + 2H+ = 2Fe3+ + 3NO3- + H2O. Princípio do método: O nitrito é quantificado por reação com o Reagente de Griess, formando um composto róseo-violeta, com λmax = 540 nm. O nitrato é quantificado como nitrito após ser reduzido pelo vanádio trivalente. A diferença entre as duas dosagens expressa a concentração real de nitrato presente na amostra.

Mecanismo da reação de Griess Preparo de soluções e reagentes: 1. Solução estoque de Nitrato e de Nitrito a 1mg/mL – Pesar 0,050g de nitrato ou nitrito de sódio e dissolver em água destilada utilizando balão volumétrico de 50mL. Armazenar por no máximo duas semanas. 2. Soluções de trabalho (A. B e C) de nitrato e nitrito: em balões volumétricos de 100 mL diluir os seguintes volumes das soluções estoque: Solução A: 5 mL ; Solução B: 1 mL ; Solução C: 0,1 mL 3. Reagente de Griess (dosagem do nitrito) Pesar 200 mg de sulfanilamida e 10 mg de N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NEED) e dissolver em 150 mL de HCl 1M. Armazenar em vidro âmbar e conservar sob refrigeração por no máximo um mês. 4. Reagente de Griess com redutor (dosagem do nitrato): Pesar 400 mg de VCl3 (pesar em capela de exaustão) e diluir com 50 mL de HCl 1M. Pesar 200 mg de sulfanilamida e 10 mg de (NEED) e dissolver em 100 mL de HCl 1M. Misturar as duas soluções. Armazenar em vidro âmbar e conservar sob refrigeração por no máximo um mês. 5. Curva de calibração do nitrito. Preparar triplicata de cada concentração. Em tubos de ensaio adicionar os seguintes volumes de solução de nitrito, água destilada e reagente de Griess. Massa de nitrito Solução de trabalho Água destilada Reagente de Griess ( µg) (mL) (mL) Branco de reagentes 1 1 0,25 250 L da solução C 0,90 1 0,5 50 L da solução B 0,95 1 1 100 L da Solução B 0,90 1 2,5 50 L da Solução A 0,95 1 5 100 L da Solução A 0,90 1


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6. Montar uma planilha Excel® com os resultados (absorvâncias x massas). Obter as equação da curva de calibração através de regressão linear. 7. Preparo da amostra: Pesar cerca de 10 g de lingüiça triturada - 70 ml de água destilada - Banho-maria de 80 ºC por 35 min - Esperar esfriar - Transferir para um balão volumétrico de 250 mL - Lavar o béquer com 30 mL de água destilada quente e juntar ao balão - 2 mL da solução de ferrocianeto de potássio a 15% - 2 mL da solução de sulfato de zinco a 30% - Completar volume com água destilada - Esperar 5 minutos - Filtrar em papel pregueado Whatmann nº 4 Filtrado 250 L

250 L Adicionar 750 L de água destilada

Nitrato - 1mL do reagente de Griess com VCl3 - Aquecer a 48,5°C por 70 min Ler absorvância a 540 nm (nitritos totais = nitrato + nitrito)

Nitrito - 1mL do reagente de Griess sem VCl3 - Aguardar 70 min Ler absorvância a 540 nm (nitrito real na amostra)

8. Calcular a massa de nitrito presente nas alíquotas através da equação da curva de calibração. 9. Calcular a concentração de nitrato levando em consideração que: a) Nitritos totais – nitrito real = nitrito que veio do nitrato b) 5 mg de nitrato geram 4 mg de nitrito após a redução c) a massa de nitrito estava contida em 250 mL; uma alíquota mil vezes menor foi tomada para o ensaio (250 L); então a massa obtida deve ser multiplicada por 1000; d) a seguir, a massa encontrada estava na quantidade pesada de lingüiça, então faça uma regra de três para saber quanto teria em 1000g (Kg) da amostra. e) a concentração de nitrito deve ser expressa em mg/Kg (ppm). 10. Comparar os valores máximos permitidos pelo Ministério da Saúde e da Agricultura descritos no D.O.U, Brasília, 28 de junho de 1976, p. 8904: 500 ppm para nitrato e 200 ppm para nitrito. O Ministério da Saúde, através da Portaria nº 1004, de 11 de Dezembro de 1998, reduziu esses limites para 150 ppm de nitrito e 300 ppm de nitrato


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Referências bibliográficas:

1. 2. 3. 4. 5.

Doane T. A. e Horwáth W. R. Analytical Letters, v. 36, n. 12, p. 2713–2722, 2003. Miranda K. M., Espey M. G. e Wink D. A. Nitric Oxide: Biology and Chemistry , v. 5, n. 1, p. 62–71, 2001. Governo do Brasil. Ministério da Agricultura. Instrução Normativa nº 20, de 21/07/1999. Rodkey, F. L. Clinical Chemistry, v. 22, n. 12, p. 1986 – 1990, 1976. AOAC Official Method 993.03 Nitrate in Baby Foods. J.AOAC Int., v. 77, p. 425, 1994.


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Avaliação da atividade da colinesterase em soro / plasma Princípio do método: a atividade da enzima colinesterase presente no plasma / soro é avaliada frente ao substrato adicionado (acetiltiocolina) à amostra. A hidrólise da acetiltiocolina produz ácido acético e colina. A colina reage com o DTNB formando o TNB que absorve na região do visível (400 – 420 nm). Preparo dos reagentes

1. Tampão fosfato 52 mM - pH 7,2 Preparar solução 0,104 M de fosfato de sódio monobásico (NaH 2PO4) e 0,104 M de fosfato de sódio dibásico (Na2HPO4). Misturar 84 mL da primeira com 216 mL da segunda. Acrescentar 300 mL de água destilada. 2. Solução de DTNB (ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico) a 0,26 mM em tampão fosfato pH 7,2 Pesar 51,5 mg do ácido e dissolver no tampão fosfato em balão volumétrico de 500 mL. Completar volume. Esta solução é estável por 6 semanas em frasco âmbar na geladeira. 3. Solução de iodeto de acetiltiocolina 28 mM Pesar 451,2 mg do sal e dissolver em água destilada em balão volumétrico de 10 mL. Obtenção do soro

Colher cerca de 2mL de sangue em tubo sem anticoagulante. Centrifugar suavemente a 3000 rpm por 10 minutos. Com auxílio de uma pipeta automática, transferir cerca de 0,2 ml do sobrenadante, de cor amarelo claro (soro), para um outro tubo graduado. Diluição da amostra Diluir o soro 1:10 com água deionizada imediatamente antes da análise. Homogeneizar. Quadro 1. Esquema analítico para dosagem da colinesterase (todos os reagentes deverão estar estabilizados a 25ºC). Reagentes Tubo da Tubo do branco de amostra reagentes (µL) (µL) Amostra diluída 20 Água deionizada 20 DTNB 3000 3000 Acetiltiocolina 100 100 Misturar manualmente. Depois de 2 minutos, anotar o primeiro valor de absorvância obtido a 405 nm. Realizar mais três leituras em intervalos de 30 segundos. Nota.: o primeiro valor de absorvância não pode exceder 0,5. Se a variação de absorvância (30s) for maior que 0,2 será necessário diluir a amostra com água deionizada.


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Tabela 1. Incrementos de absorvância obtidos na avaliação da atividade da colinesterase plasmática Abs

∆

A0 A 30 A 60 A 90

Abs -

∆

Abs (média)

Cálculos: Abs x V 1 V 2 ∆t . ε . d ∆

=

∆ Abs x [3,12 / 0,02 mL]

= mmoles produto / min . L

0,5 min x 1,33 L x mmol –1 x mm –1 x 10 mm

Onde: ∆ Abs / ∆t = incremento médio de absorvância por minuto ε = absortividade molar do corante a 405 nm = 13300 L. mol –1 . cm –1 d = caminho ótico (mm) Lembre-se: A = εbc (onde b = 1 cm e c = moles / L) V1 = volume final da preparação em mL V2 = volume da amostra em mL Definir a atividade da enzima em U / L ou µmoles produto / min . L

Colinesterase plasmática ou pseudocolinesterase - Valores normais por essa técnica: Mulheres: 1700 a 3700 U / L Homens: 1900 – 3800 U / L Variação normal de atividade da colinesterase plasmática em um mesmo indivíduo: até 30% por conta de flutuações fisiológicas ou no ritmo circadiano. Uma redução em mais de 30% da atividade basal do indivíduo pode ser devida a contato com inibidores da colinesterase. Índice Biológico Máximo Permitido (NR7 – Brasil): até 50% de redução do valor basal do indivíduo para colinesterase plasmática.

Baseado em: Analyses of Hazardous Substances in Biological Materials. Angerer, J; Schaller, K.H. eds. VCH – Weinheim. V.3. p.45 – 62, 1991.


+

O

Enzima

(CH3)3NCH2CH2–S–C – CH3 ACETILTIOCOLINA

19

+

(CH3)3NCH2CH2S - + CH3COO + 2H+ TIOCOLINA

S

O2N

ACIDO ACÉTICO

S

NO2

DTNB

COOH

COOH

+

(CH3)3NCH2CH2S

HS S

O2N

NO2 COOH

COOH

TNB (ε = 13.600 para λ = 412nm)

Figura 1. Principais reações químicas no método de Ellman. Fonte: Ellman, G.L. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 82, p. 70 - 77, 1959.


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Reagentes (Clarke’s – Analysis of Drugs and Poisons, 2004) Reagente de Van Urk Dissolver 1 g de p-dimetilaminobenzaldeido em 100 mL de etanol e adicione 10 mL de ácido c lorídrico. Nebulizar a placa com o reagente e aquecer em estufa a 100 ºC por 5 minutos. Manchas amarelas são produzidas por reação com sulfonamidas e meprobamato, Manchas azuis são produzidas com alcalóides do ergot. Manchas rosa e violeta são produzidas por reação com outros compostos, como por exemplo, fenazona. Solução de cloreto férrico Dissolver 5 g de cloreto férrico em 100 mL de água deionizada Manchas azuis ou violetas são obtidas na reação com fenóis. Essa solução pode ser nebulizada sobre uma placa previamente revelada com o reagente de Van Urk. O

OH

O OH

+

FeCl3

OH

Fe3+

O-

+

3 HCl

3

Solução de Nitrato Mercuroso Dissolver 1g de nitrato mercuroso em uma mistura de 50 mL de água destilada e 5mL de acido nítrico. Avolumar para 100 mL. Guarde em frasco de vidro âmbar, protegido da luz. Manchas cinza escuro, que clareiam rapidamente são obtidas na reação com barbitúricos (amidas). Solução de Iodo Platinado acidificado Dissolva 0,25g de cloreto platínico e 5 g de iodeto de potássio em 100 mL de água deionizada. Adicione 5 mL de HCl. Reagente FPN Misture 5 ml de solução de cloreto férrico (a 5%), com 45 mL de solução de ácido perclórico a 20% w/w. A seguir, adicione 50 mL de solução de ácido nítrico a 50% v/v. Manchas rosas, vermelhas ou arroxeadas são produzidas com fenotiazínicos. Manchas azuladas são produzidas por reação com as dibenzazepinas. Reagente de Dragendorff Solução A: misture 2g de subnitrato de bismuto, com 25 mL de ácido acético e 100 mL de água. Solução B: misture 40g de iodeto de potássio em 100 mL de água Misture 10mL da solução A com 10 mL da solução B, e acrescente 20 mL de ácido acético e 100mL de água destilada. A mistura é estável por 2 dias. Cloreto de paládio Dissolver com ajuda de calor, 0,1g de cloreto de paládio em 5 Ml de HCl 2M. Diluir a solução para 100 mL com água destilada. Misturar volumes iguais desta solução com hidróxido de sódio 2M. O reagente assim misturado é estável por várias semanas. Cores do amarelo, laranja ao marrom são obtidas para compostos com enxofre na cadeia (exceto se o enxofre estiver ligando dois anéis ou se for apenas uma cadeia S-alquil, sem halogênios na extremidade).

Caderno de Aulas Praticas - Uff

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