DESARROLLO DE UNA FERMENTACION ALCOHOLICA A PH REGULADO Y TEMPERATURA DE 25°C EN EL BIORREACTOR BIOFLO 3000 M1227 Y ESTUDIO INICIAL DE FERMENTACIONES EN SISTEMA CONTINUO
GABRIEL MAURICIO RAMIREZ NIETO JULIAN FELIPE PEDROZA FLOREZ
Proyecto de grado para optar por el título de Ingeniero de Producción Agroindustrial
Director BERNADETTE KLOTZ Bióloga ROSA ERLIDE PRIETO Química UNIVERSIDAD DE LA SABANA FACULTAD DE INGENIERIA DE PRODUCCION AGROINDUSTRIAL BOGOTA, D.C. 2001
Nota de aceptación _______________________ ___________ _____________________ _________ _______________________ ___________ _____________________ _________ _______________________ ___________ _____________________ _________
_______________________ ___________ _____________________ _________ Presidente del Jurado
_______________________ ___________ _____________________ _________ Jurado
_______________________ ___________ _____________________ _________ Jurado
Bogotá D.C, 16 de Julio del 2001
A mis Padres por su paciencia y colaboración durante estos dos años. Julián Pedroza A mis Padres, mi hermana y mi esposa Vilma y mis hijos. Mauricio Ramírez
AGRADECIMIENTOS Los autores expresan sus agradecimientos a: La Doctora Bernadette Klotz y la Doctora Erlide Prieto, directoras del presente proyecto, por su valiosa colaboración y orientación para el desarrollo del mismo.
CONTENIDO Pág
RESUMEN ---------------------------------------------------------------------------- XIV INTRODUCCION --------------------------------------------------------------------- XV 1. OBJETIVOS ------------------------------------------------------------------------- 16 1.1 GENERAL -------------------------------------------------------------------------- 16 1.2 ESPECÍFICOS--------------------------------------------------------------------- 16 2. REVISION BIBLIOGRAFICA---------------------------------------------------- 17 2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA
EN EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES CEREVISIAE --------------------------------------------------------------------------- 17 2.1.1 Biología de las fermentaciones ------------------------------------------------------------ 17 2.1.1.1 Glucólisis -------------------------------------------------------------------------------------- 17 2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos-------------------------------------------- 21 2.1.2 Requerimientos nutricionales de la levadura------------------------------------------- 22 2.1.2.1 Substratos utilizados como fuente de carbono-------------------------------------- 23 2.1.2.2 Substratos utilizados como fuente de nitrógeno ------------------------------------ 23 2.1.3 Condiciones de la fermentación ----------------------------------------------------------- 24 2.2 VARIABLES QUE AFECTAN LA FERMENTACION ALCOHOLICA 25 2.2.1 Temperatura ------------------------------------------------------------------------------------ 25 2.2.2 pH-------------------------------------------------------------------------------------------------- 26 2.2.2.1 Ajuste del pH --------------------------------------------------------------------------------- 27 2.2.2.2 Buffers ----------------------------------------------------------------------------------------- 27 V
Contenido
VI
2.2.3 Aireación ----------------------------------------------------------------------------------------- 28 2.3 BIORREACTORES ------------------------------------------------------------------------- 28 2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores ----------------------------------------------------- 28 2.3.2 Monitoreo de la fermentación -------------------------------------------------------------- 29 2.3.3 Retroalimentación ----------------------------------------------------------------------------- 30 2.4 CULTIVOS CONTINUOS ---------------------------------------------------------------- 30 2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo --------------------------------------- 32 2.4.2 Cinética del cultivo continuo----------------------------------------------------------------- 32 3. MATERIALES Y METODOS ------------------------------------------------------------- 35 3.1 PROCEDIMIENTO -------------------------------------------------------------------------- 35 3.2 DISEÑO EXPERIMENTAL -------------------------------------------------------------- 36 3.2.1 Diagramas de flujo ---------------------------------------------------------------------------- 36 3.2.1.1 Pruebas preliminares ---------------------------------------------------------------------- 36 3.2.1.2 Pruebas en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------ 36 3.2.2 Preparación de los medios de cultivo para pruebas preliminares ---------------- 37 3.2.3 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo------- 38 3.2.4 Activación e inoculación de la levadura ------------------------------------------------- 38 3.2.5 Variables a medir durante la fermentación preliminar ------------------------------- 39 3.2.5.1 pH ----------------------------------------------------------------------------------------------- 39 3.2.5.2 Número de microorganismos ------------------------------------------------------------ 39 3.2.5.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa--------------------------------- 39 3.2.6 Análisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares---------------------- 39 3.2.7 Pruebas preliminares en el Bioflo --------------------------------------------------------- 39 3.2.8 Fermentación alcohólica en el Bioflo ----------------------------------------------------- 40 3.2.9 Fermentación alcohólica sin regulación de pH ---------------------------------------- 40 3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentación en el Bioflo--- 40 3.2.11 Reproducibilidad de la fermentación alcohólica en el Bioflo --------------------- 41 3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentación ----------------------------------------- 41 3.2.11.2 Técnicas utilizadas------------------------------------------------------------------------ 42 3.2.11.3 Validación estadística de los datos --------------------------------------------------- 42
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3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuo--------------------------- 42 3.3 MATERIALES Y METODOS------------------------------------------------------------ 42 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total-------------------------- 42 3.3.1.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 42 3.3.1.2 Reacciones que se presentan ----------------------------------------------------------- 43 3.3.1.3 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 43 3.3.1.4 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 43 3.3.1.5 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 44 3.3.1.6 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 45 3.3.2 Método para la determinación de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------------------------- 45 3.3.2.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 45 3.3.2.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 46 3.3.2.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 46 3.3.2.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 47 3.3.2.5 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 48 3.3.3 Determinación del número de microorganismos por recuento en cámara de conteo Neubauer Improved --------------------------------------------------------------------- 48 3.3.3.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 48 3.3.3.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 49 3.3.3.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 49 3.3.3.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 49 3.3.3.5 Cálculo y expresión de los resultados------------------------------------------------- 49 3.3.4 Método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por el método de destilación simple ------------------------------------------------------------------- 50 3.3.4.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 50 3.3.4.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 50 3.3.4.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 50 3.3.4.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 50 3.3.5 Determinación de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ------------ 51 3.3.5.1 Fundamento del método ------------------------------------------------------------------ 51 3.3.5.2 Materiales ------------------------------------------------------------------------------------- 51
Contenido
VIII
3.3.5.3 Reactivos-------------------------------------------------------------------------------------- 51 3.3.5.4 Procedimiento-------------------------------------------------------------------------------- 51 4. PRESENTACIÓN DE RESULTADOS ---------------------------------------- 53 4.1 GUIA DE MANEJO DEL SISTEMA DE BOMBAS
PERISTÁLTICAS ---------------------------------------------------------------------- 53 4.1.1 Configuración de sistema de bombas peristálticas para control de pH -------- 55 4.2 RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES ------------- 56 4.2.1 Porcentajes de variación de pH para los medios semisintético y natural ------ 57 4.3 RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 57 4.3.1 Determinación de velocidad de agitación para una fermentación alcohólica-- 57 4.3.2 Determinación de la concentración de ácido y base --------------------------------- 58 4.3.3 Fermentación preliminar en el Bioflo ----------------------------------------------------- 58 4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS ----------------------------------- 58 4.4.1 Calibración de método de determinación de nitrógeno total ----------------------- 59 4.4.1.1 Curva de calibración del método Kjeldahl con urea ------------------------------- 59 4.4.1.2 Curva de calibración para etapa de destilación y titulación---------------------- 60 4.4.2 Calibración del método de determinación de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon --------------------------------------------------------------------- 62 4.5 RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS
EN EL BIOFLO -------------------------------------------------------------------------------------- 63 4.5.1 Datos de crecimiento de microorganismos --------------------------------------------- 63 4.5.2 Datos de contenido de nitrógeno total en la biomasa-------------------------------- 65 4.5.3 Datos de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa----------------------- 66 4.5.4 Datos de azúcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------- 66 4.5.5 Volúmenes consumidos de ácido y base por el sistema de regulación de pH ------------------------------------------------------------------------------------------------------ 67 4.5.6 Variación de pH en las fermentaciones sin control de pH -------------------------- 68 5. DISCUSION DE RESULTADOS ------------------------------------------------------- 69
Contenido
IX
5.1 SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR
RANGO DE FLUCTUACION DE PH ----------------------------------------------------- 69 5.2 ANALISIS DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO ---- 70 5.3 ANALISIS DE METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS-------------------- 70 5.3.1 Análisis de la estandarización del método de determinación de nitrógeno total------------------------------------------------------------------------------------------- 70 5.3.2 Análisis de la estandarización del método de determinación de azúcares reductores residuales-------------------------------------------------------------------- 71 5.4 ANALISIS DE FERMENTACION CON REGULACION DE PH
RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH------- 72 5.4.1 Crecimiento de microorganismos --------------------------------------------------------- 72 5.4.2 Contenido de nitrógeno en la biomasa ------------------------------------------- 73 5.4.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa ----------------------------------- 76 5.4.4 Azúcares reductores residuales y contenido de etanol ----------------------------- 76 5.4.4.1 Balance de masa de azúcar consumido en las fermentaciones---------------- 77 5.4.5 Comportamiento del pH en fermentaciones sin regulación de pH --------------- 82 5.5
ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS
DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO-------------------------------------------------------------- 82 CONCLUSIONES-------------------------------------------------------------------------------------- 85 RECOMENDACIONES------------------------------------------------------------------------------- 87 ANEXOS ------------------------------------------------------------------------------------------------- 88 BIBLIOGRAFÍA --------------------------------------------------------------------------------------- 105
LISTA DE TABLAS Pág Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes ---------------------------------------------------------23 Tabla 2.2 Composición del extracto de levadura producido mediante autólisis------- 24 Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores -------------------------- 29 Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados--------------------------------------------------------- 35 Tabla 3.2 Medio de cultivo semisintéticos ------------------------------------------------------ 37 Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales------------------------------------------------------------- 38 Tabla 4.1 Ciclo de funcionamiento de bombas peristálticas------------------------------- 54 Tabla 4.2 Caudales de bombas peristálticas para flujos de entrada y salida empleando tubo de silicona de 1/8”--------------------------------------------------------------- 55 Tabla 4.3 Resultados para medio semisintético ----------------------------------------------- 56 Tabla 4.4 Resultados para medio natural ------------------------------------------------------ 56 Tabla 4.5 Porcentajes de variación de pH------------------------------------------------------ 57 Tabla 4.6 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de operación a diferentes velocidades de agitación -------------------------------- 57 Tabla 4.7 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de operación a diferentes concentraciones------------------------------------------- 58 Tabla 4.8 Resultados de calibración para método total de Kjeldahl--------------------- 59 Tabla 4.9 Resultados para etapa de destilación y titulación del método Kjeldahl --------------------------------------------------------------------------------------------------- 61 Tabla 4.10 Resultados de calibración para método de determinación de azúcares reductores----------------------------------------------------------------------------------- 62 Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos ------------------------------ 64 Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrógenos celular por mililitro ---------------- 65 Tabla 4.13 Resultados de toma de °Brix a 20 °C--------------------------------------------- 66 Tabla 4.14 Resultados de determinación de azúcares reductores residuales-------- 67 X
Lista de Tablas
XI
Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol ----------------------------------------------- 67 Tabla 4.16 Variación de pH en una fermentación sin control de pH -------------------- 68 Tabla 5.1 Porcentajes de error del método de determinación de nitrógeno total en diferentes estandarizaciones realizadas---------------------------------------------------- 71 Tabla 5.2 Mayor crecimiento de microorganismos en fermentaciones en el Bioflo ----------------------------------------------------------------------------------------------- 72 Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrógeno en fermentaciones en el Bioflo -------------- 73 Tabla 5.4 Rangos de contenido de nitrógeno por célula ----------------------------------- 74 Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrógeno por célula ----------------- 75 Tabla 5.6 Balance de azúcares en fermentaciones en el Bioflo para 10 litros de medio ------------------------------------------------------------------------------- 79 Tabla 5.7 Porcentajes de consumo de azúcares en diferentes fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------------------------------- 80 Tabla 5.8 Valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilución y µmax para una fermentación en sistema continuo ---------------------------------------- 84 .
LISTA DE FIGURAS Pág Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis ------------------------------------------------------------ 19 Figura 2.2 Vía anaerobia de la glucólisis ------------------------------------------------------- 20 Figura 2.3 Vía aeróbica de la glucólisis --------------------------------------------------------- 20 Figura 2.4 Relación de concentración de substrato y velocidad específica de crecimiento de un microorganismo --------------------------------------------- 21 Figura 2.5 Curva de crecimiento típica de una población celular ------------------------ 22 Figura 2.6 Componentes del retroalimentador ------------------------------------------------ 30 Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilución y concentración de substrato en un quimiostato -------------------------------------------------------------------------------------- 31
XII
LISTA DE ANEXOS Pág Anexo A Datos de fermentaciones preliminares----------------------------------------------- 88 Anexo B Datos de fermentaciones en el Bioflo ------------------------------------------------ 90 Anexo C Datos del seguimiento de una fermentación con flujos de entrada y de salida ------------------------------------------------------------------------------------ 94 Anexo D Sistema de bombas peristálticas del Bioflo 3000 M1227 --------------------- 100
XIII
RESUMEN En la línea de investigación de fermentación, se continuó con el conocimiento en el manejo y funcionamiento del biorreactor; este trabajo presentó un aporte complementario enfocado a la evaluación del sistema de regulación de pH y su incidencia en el desarrollo de una fermentación alcohólica. Para establecer la influencia de la variable pH se determinó parámetros como crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno, consumo de sólidos solubles totales, contenido de sacarosa, contenido de etanol y contenido de azúcares residuales, comparando una fermentación con regulación de pH contra una sin regulación, presentando mejor rendimiento al controlar el pH. Para el estudio inicial de fermentaciones en sistema continuo, el biorreactor presentó inconsistencias en los flujos que no permitieron desarrollar dicho proceso.
Abstract: The purpose of this project was to establish the effect of a regulated pH on an ethanolic fermentation at 25°C. Also, through this study it was want to complete instruction manual of the biorreactor Bioflo. Following parameters were determined during the growth of Saccharomyces cerevisiae in a system with controlled and non controlled pH: total nitrogen content, growth of microorganism, consumption of total soluble solids, sucrose content, ethanol content and residual sugars content. In addition, initial steps for the establishment of a continuos culture realized.
XIV
INTRODUCCION La facultad de Ingeniería de la Universidad de La Sabana adquirió un biorreactor para investigación en el área de fermentaciones y como apoyo en la formación académica. Los trabajos anteriormente realizados en el Bioflo se centraron en establecer una guía de manejo y funcionamiento de éste, determinando la precisión y la reproducibilidad de fermentaciones alcohólicas a temperatura constante de 30 °C y 25 °C. El presente trabajo es un complemento al manejo del biorreactor, en el cual se evalúa el sistema de regulación de pH y los sistemas continuos de cultivo, brindando un aporte al protocolo de operación del equipo. El monitoreo y control de una fermentación es un área activa de investigación que busca mejorar la eficacia de los bioprocesos, alcanzando uniformidad y confiabilidad en el proceso de fermentación. La variable pH es de gran importancia ya que afecta al proceso fermentativo de diversas maneras, produciendo reacciones no deseadas, inhibiendo la actividad enzimática de las levaduras y formando productos no esperados en el proceso de fermentación. Es por esto que el trabajo está orientado al manejo y funcionamiento del biorreactor en el desarrollo de una fermentación alcohólica a pH regulado y temperatura óptima de 25 °C para el crecimiento de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Con el fin de medir la reproducibilidad de esta fermentación se realiza el seguimiento de parámetros tales como crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno en la biomasa, consumo de sacarosa, variación de sólidos solubles, contenido de azúcares reductores residuales y contenido de etanol. Adicionalmente se continuó con la estandarización de los métodos analíticos aceptados internacionalmente a las condiciones del laboratorio de investigación de la Facultad. Se han realizado nuevas adquisiciones de equipos, que ofrecen mejor exactitud y precisión en los análisis, como lo es la determinación de contenido de nitrógeno total en una muestra. A la vez se empleo el método de titulación de Lane y Enyon, alternativo para determinación de azúcares reductores residuales diferente al método colorimétrico empleado en las anteriores investigaciones. Como parte principal de la guía complementaria de manejo y funcionamiento del Bioflo, se encuentra la configuración de los sistemas de bombas peristálticas, necesarias para controlar variables como pH en una fermentación alcohólica y dar pie al uso del biorreactor en sistema continuo, lo cual se evaluó de manera preliminar en el presente trabajo y servirá para el que desee profundizar las investigaciones realizadas por la facultad de Ingeniería en la línea de fermentación. XV
CAPITULO 1
OBJETIVOS 1.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar una fermentación alcohólica a pH regulado y temperatura constante en el Bioflo y realizar un estudio preliminar de fermentaciones en sistema continuo.
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS •
•
•
•
•
Determinar mediante fermentaciones alcohólicas preliminares, qué medio de cultivo, semisintético o natural, presenta un mayor rango de variación de pH. Determinar la concentración necesaria de ácido y base a ser utilizada en la regulación de pH y configurar de manera preliminar los sistemas de bombas peristálticas del Bioflo. Determinar la reproducibilidad de una fermentación alcohólica en el biorreactor a pH constante y temperatura de 25 °C. Establecer una guía de manejo y funcionamiento del sistema de bombas peristálticas del biorreactor en una fermentación alcohólica utilizando el sistema de regulación de pH. Realizar pruebas iniciales para el manejo del Bioflo en cultivos continuos
16
CAPITULO 2
REVISION BIBLIOGRAFICA En éste capítulo se presenta el marco teórico para el desarrollo del siguiente trabajo. Básicamente se hace una revisión sobre la fermentación alcohólica, variables que afectan la fermentación, el funcionamiento de un Biorreactor y la teoría básica sobre fermentaciones en sistema continuo.
2.1 CONDICIONES DE LA FERMENTACION ALCOHOLICA EN EL CRECIMIENTO DE LA LEVADURA SACCHAROMYCES C E R E V I S I A E .
La fermentación en gran escala puede llevarse a cabo mediante el uso de hongos, levaduras o bacterias, pero las levaduras son las más utilizadas por su papel en la fabricación de bebidas alcohólicas. Son los microorganismos que más se usan en la bioindustria, se pueden cultivar por las células mismas y por los productos finales que se producen durante la fermentación alcohólica. La producción de alcohol por levadura se realiza por una fermentación alcohólica anaeróbica, del cual resulta un rendimiento menor de células, pero cantidades satisfactorias de alcohol y CO 2. Durante los primeros días del proceso de fermentación, las células de levadura crecen por respiración consumiendo oxigeno y creando un medio anaerobio. Tan pronto como él oxigeno desaparece se inicia la fermentación, produciendo alcohol. La levadura pasa de metabolismo aerobio al anaerobio. La tolerancia al alcohol depende, además de las características genéticas de la cepa, de diversos factores ambientales como la concentración de azúcares en el medio desde el inicio de la fermentación y en fases posteriores, temperatura, pH y de manera importante la concentración del etanol en las diferentes etapas de la fermentación.
2.1.1 Biología de las fermentaciones.
1
Aproximadamente el 96% de la producción del etanol mediante fermentación a nivel industrial se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces cerevisiae. El etanol se produce en la ruta de glucólisis, específicamente en la vía anaeróbica, en la que el piruvato producido se convierte en acetaldehído y etanol. La reacción global es la siguiente: Glucosa + 2 ADP + 2 Pi
2 Etanol + 2 CO 2 +ATP + Energía
El rendimiento teórico de 1 gramo de glucosa es de 0.51 gramos de etanol y 0.49 gramos de CO2. Aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en biomasa y el rendimiento en etanol y CO 2 alcanzan el 90% del valor teórico. El ATP formado se utiliza para las necesidades energéticas de la célula (Owen, 1991, 134). En cuanto a la estructura celular de la levadura, la envoltura de la célula de levadura incluye una membrana plasmática, un espacio periplásmico y una pared celular constituida principalmente por polisacáridos y una pequeña cantidad de péptidos. La pared tiene una estructura semirrígida permeable al soluto que proporciona a las levaduras una considerable fuerza compresional y tensil. 2.1.1.1
Glucólisis
La glucólisis ejemplifica de que manera los procesos bioquímicos de una célula se desarrollan en pequeños pasos secuenciales, los cuales son catalizados cada uno por una enzima específica. Los primeros pasos de la glucólisis requieren de un ingreso de energía, que es suministrada por el acoplamiento de estos pasos al sistema ATP/ADP. La secuencia completa comienza con una molécula de glucosa. Se invierte energía en los pasos 1 y 3 por transferencia, en cada paso, de un grupo fosfato desde una molécula de ATP a la molécula de azúcar. La molécula de 6 carbonos, proveniente de la glucosa presenta la lisis en el paso 4 y a partir de este paso en adelante la secuencia produce energía. Cabe anotar que en este paso se producen 2 moléculas de gliceraldehído fosfato que en el paso final producirá las dos moléculas de ácido pirúvico. En los pasos 6 y 9 las moléculas de ADP toman energía del sistema, fosforilándose a ATP. De esta forma la molécula de glucosa se ha convertido en dos moléculas de ácido pirúvico. La ganancia neta de energía son dos moléculas de ATP y dos moléculas de NADH por molécula de glucosa. El ácido pirúvico obtenido en la glucólisis puede seguir dos vías. Una vía es aeróbica (respiración) y la otra es anaeróbica (fermentación). La vía aeróbica es la vía principal del metabolismo energético de las levaduras en presencia de oxígeno y la vía anaeróbica es la vía fermentativa que funciona en ausencia de un aceptor externo de electrones. En ausencia del oxígeno el ácido pirúvico se convierte en etanol. La siguiente gráfica muestra las dos etapas de la glucólisis; La primera etapa usa ATP y la segunda produce ATP y NADH.
2
Figura 2.1 Secuencia de la glucólisis
Fuente: CURTIS, Helena. Biología. •
Vía anaeróbica o fermentación: Los pasos por los cuales el ácido pirúvico, formado por la glucólisis, se convierte anaerobiamente en etanol. En el primer paso se desprende CO2. En el segundo, se oxida el NADH y se reduce el acetaldehído. La mayoría de la energía potencial de la glucosa permanece en
3
el alcohol, que es el producto final de la secuencia. Se producen 2 moléculas de etanol más 2 moléculas de CO 2 a partir una molécula de glucosa. Glucosa 2 Etanol + 2 CO2 Figura 2.2 Vía anaerobia de la glucólisis
Fuente: CURTIS, Helena. Biología. Vía aeróbico o respiración: En presencia de oxígeno, la siguiente etapa de la degradación de la glucosa implica la oxidación progresiva del ácido pirúvico a CO2 y agua, proceso conocido como respiración. El paso previo es la oxidación del ácido pirúvico a un grupo acetilo de dos carbonos que se combina con la coenzima A para formar el acetilCoA. El acetilCoA entra en el ciclo de Krebs que es el siguiente paso de la respiración, en el cual los carbonos donados por el grupo acetilo se oxidan a CO2 y los átomos de hidrógeno pasan a los transportadores de electrones. Lo mismo que en la glucólisis, en cada paso interviene una enzima específica. Figura 2.3 Vía aeróbica de la glucólisis •
Fuente: CURTIS, Helena. Biología
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La secuencia respiratoria completa es: Glucosa + 6 O2 6 CO2 + 6 H2O + Energía 2.1.1.2 Ciclo de crecimiento de microorganismos Una población de microorganismos presenta generalmente un patrón de crecimiento característico cuando se inocula en un medio de cultivo fresco. •
Fase de retraso: En esta fase las células se ajustan a las nuevas condiciones. Si un cultivo que crece exponencialmente es inoculado al mismo medio bajo las mismas condiciones de crecimiento, no se observa fase de retraso y el crecimiento exponencial continua a la misma velocidad.
Fase exponencial: Es la etapa en la cual la velocidad de crecimiento de las células aumenta progresivamente. Transcurrido un periodo de tiempo, las células crecen a una velocidad máxima constante y no dependen de la concentración de substrato. La siguiente gráfica ilustra este comportamiento. Figura 2.4 Relación de concentración de substrato y velocidad específica de crecimiento de un microorganismo •
Fuente: TREVAN, M. Biotecnología: principios biológicos. La zona B a C equivale a la fase exponencial del cultivo, con substrato en exceso y un crecimiento a una velocidad máxima constante. La zona A a B corresponde a la desaceleración de la velocidad de crecimiento, desde el final de la fase exponencial hasta el inicio de fase estacionaria. En la fase exponencial, el comportamiento del crecimiento de un microorganismo en un cultivo puede describirse mediante la siguiente ecuación: Nt = N0 x 2n donde: Nt es número de células en un tiempo t N0 es el número de células inoculadas n es el número de generaciones al tiempo t
5
•
Fase estacionaria: Lo que limita el crecimiento en esta fase es que alguno de los nutrientes indispensables se agota o algún producto de desecho fabricado en el medio llega a un nivel en el que es inhibidor y cesa el crecimiento exponencial. En la fase estacionaria no hay incremento ni decremento en la cantidad de células, pero muchas de las funciones celulares pueden continuar, incluyendo el metabolismo energético y la producción de metabolitos secundarios.
Fase de muerte: Después de alcanzar la fase estacionaria y continuar con la incubación de las células, estas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo más probable es que mueran. En algunos casos, la muerte se acompaña por lisis celular, dando a lugar a disminución en el conteo microscópico directo junto con la disminución del conteo de viabilidad. Gráficamente, en escala semilogarítmica se observa el comportamiento típico del crecimiento de una población de microorganismos. Figura 2.5 Curva de crecimiento típica de una población celular •
Fuente: BROCK, T. Microbiología.
2.1.2
Requerimientos nutricionales de la levadura
Los microorganismos se cultivan en agua, a la que se le han añadido los nutrientes apropiados. La solución acuosa que contiene los nutrientes necesarios
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se denomina medio de cultivo. Lo nutrientes existentes en el medio de cultivo dan a la célula microbiana todos los ingredientes requeridos para que produzca más células semejantes a ella misma. Además de las fuentes de energía, que pueden ser substancias orgánicas o inorgánicas, o luz, el medio de cultivo debe de tener fuentes de carbono, de nitrógeno y macro y micro nutrientes respectivos. Un medio de cultivo óptimamente equilibrado es obligatorio para considerar la máxima producción. La composición de los medios de cultivo debe ser constantemente adaptada a los procesos de fermentación. En general los requerimientos básicos de nutrientes para los microorganismos y las formas comunes de satisfacerlos en los cultivos se enuncian en la siguiente tabla. Tabla 2.1 Requerimientos de nutrientes
NUTRIENTE
FORMA QUIMICA SUMINISTRADA AL MEDIO DE CULTIVO
CARBONO
GLUCOSA, ACETATO, PIRUVATO, MEDIOS COMPLEJOS COMO EXTRACTO DE LEVADURA, PEPTONA
NITROGENO
ORGANICOS: AMINOACIDOS Y BASES NITRGENADAS, INORGANICOS: KNO 3, (NH4)2SO4,
FOSFORO
Na2HPO4, KH2PO4
AZUFRE
Na2SO4, H2S
POTASIO
KCL, K 2HPO4
MAGNESIO
MGSO4, MgCL2
SODIO
NaCl
HIERRO
QUELATOS DE HIERRO, FeCl3
MICRONUTRIENTES
MnSO 4, CuCl2, ZnCl2, CoCl2, NiCl2, Na2MoO4, Na2Se4
Fuente: BROCK, T. Microbiología 2.1.2.1
Substratos utilizados como fuente de carbono
Los carbohidratos son tradicionalmente las fuentes de energía en la industria de la fermentación. Por razones económicas la glucosa o la sacarosa puras rara vez son utilizadas como única fuente de carbono, excepto en los procesos que exigen el control exacto de la fermentación. La melaza, el extracto de malta, el almidón, las dextrinas, la celulosa y los aceites vegetales son utilizados comúnmente como fuentes de carbono en diversos procesos fermentativos. 7
2.1.2.2
Substratos utilizados como fuente de nitrógeno
Muchos procesos a gran escala utilizan amonio, sales, urea o amonio gaseoso como fuente de nitrógeno. Una fuente de nitrógeno que es metabolizada eficientemente es el líquido de maceración del maíz, que se forma durante la formación de almidón a partir de maíz. Los extractos de levadura son excelentes substratos para muchos microorganismos. El extracto de levadura contiene aminoácidos, péptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. Las peptonas pueden ser utilizadas por muchos microorganismos pero son relativamente caras para la aplicación industrial. Las fuentes de peptonas incluyen la carne, la caseina, la gelatina, la queratina, las semillas de maní, la harina de soya, las semillas de algodón y las semillas de girasol. El extracto de levadura es medio complejo y su composición se presenta a continuación. Tabla 2.2 Composición del extracto de levadura producido mediante autólisis COMPOSICIÓN (%) MATERIA SECA
70
NITROGENO TOTAL
8.8
PROTEINA (N * 6.25)
55
AMINOACIDOS
38.4 CONTENIDO EN VITAMINAS (ppm)
TIAMINA
20-30
RIVOFLAVINA
50-70
PIRIDOXINA
25-35
ACIDO PANTOTENICO
200
NIACINAMINDA
600
Fuente: CRUEGER, W. Biotecnología: Manual de microbiología industrial. El extracto de levadura al ser un medio complejo, provee de la mayoría de los factores potenciales de crecimiento, factores que consisten en vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas, los cuales no pueden ser sintetizados por algunos microorganismos. Se establece que los medios de cultivo para llevar a cabo una fermentación alcohólica a nivel laboratorio, que muestran mayor rendimiento son los que utilizan extracto de levadura, acompañado de un complejo vitamínico (Alba y Sierra, 1999, 123)
2.1.3 Condiciones de la fermentación. En la fermentación alcohólica las levaduras utilizan los azúcares sacarosa, fructosa, maltosa y maltotriosa en este orden. La sacarosa es hidrolizada primeramente por la invertasa localizada en el espacio periplásmico extracelular.
8
Aunque las fermentaciones alcohólicas son en gran medida anaerobias, las levaduras necesitan algo de oxígeno para sintetizar algunos esteroles y ácidos grasos insaturados. Muchas cepas de Saccharomyces cerevisiae pueden producir concentraciones de etanol de hasta el 12 % al 14%. Existen cepas seleccionadas capaces de producir hasta un 18% a 20% de alcohol, aunque la velocidad de fermentación se ve fuertemente reducida cuando la concentración de etanol aumenta (Owen, 1991, 136). En las levaduras, los valores de pH comprendidos entre 3 y 6 son la mayoría de las veces favorables al crecimiento y actividad fermentaria. La velocidad de fermentación aumenta generalmente con la temperatura entre los 15°C y los 35 °C y los niveles de glicerol, acetona, acetaldehído y piruvato se elevan en los medios de fermentación. La formación de niveles elevados de alcohol también depende de la temperatura (Owen, 1991, 136). En la producción de bebidas alcohólicas deben controlarse las fermentaciones de forma que, por un lado se asimilen los carbohidratos y otros nutrientes y se conviertan en alcohol y en compuestos con aromas característicos y deseables, y por otro lado, se minimice la formación de aromas y sabores indeseables. Entre los componentes del aroma y sabor se encuentran otros alcoholes diferentes del etanol, ésteres, compuestos carbonílicos, ácidos orgánicos, compuestos azufrados, aminas y fenoles. A medida que la riqueza alcohólica aumenta, la población de otras levaduras que se encuentran en el medio a fermentar decrece y va siendo sustituida como población dominante por la Saccharomyces cerevisiae. Este patrón de sucesión está fuertemente influenciado por las condiciones de fermentación como son la temperatura y el pH; por ejemplo, a una temperatura de 25°C y pH de 3.0 a 3.5, las cepas de Saccharomyces cerevisiae dominan la fermentación y las otras especies mueren. Como también la adición de SO2 reduce la población de levaduras silvestres en el medio y de esta manera favorece la preponderancia de Saccharomyces cerevisiae, ya que esta especie es más resistente a este biocida (García, 1993, 295).
2.2 VARIABLES ALCOHOLICA
QUE
AFECTAN
LA
FERMENTACION
La fermentación es un proceso determinante en la composición final del producto fermentado. Son muchos los factores que influyen en el desarrollo de una fermentación: Temperatura, pH y aireación.
2.2.1 Temperatura La temperatura es el factor de influencia decisiva para las actividades de las levaduras. La temperatura más adecuada para su reproducción y la fermentación 9
oscila entre 22 °C a 27 °C y se reproduce con mayor rapidez cuando la temperatura es de 25 °C. A temperaturas superiores a 30 °C, las levaduras pierden capacidad para desdoblar los azúcares y al aproximarse a 40 °C dejan de crecer y reproducirse (Alvarez, 1991, 112). En una fermentación alcohólica nunca se debe superar temperaturas de 32 °C durante el periodo fermentativo ya que se corren varios riesgos(Madrid, Marzo de 1991): • Inactivación de las levaduras responsables de la transformación de los azúcares en alcohol y CO2. • Pérdida de alcohol por evaporación con merma de grado alcohólico. • Iniciación de fermentaciones indeseables. La influencia de la temperatura sobre el poder fermentativo, medida del porcentaje de etanol que una cepa de levadura es capaz de producir, es diferente. Cuando se fermenta a temperatura baja o moderada las fermentaciones son lentas, pero el grado alcohólico alcanzado es generalmente mayor que a temperaturas elevadas o superiores a los 30 °C ó 35 °C (Suárez, 1990, 211). Además las fermentaciones alcohólicas efectuadas a 25 °C obtienen mejores resultados que las efectuadas a 30 °C ya que: El crecimiento de microorganismos determinado, muestra que a 25 °C la levadura se desarrolla un 25.5% más que a 30 °C; El consumo de sólidos solubles, sacarosa y grado alcohólico a 25 °C es de 42.8 %, 71.0 % y 7.3 °GL respectivamente mientras que a 30 °C es de 36.4%, 63.8 % y 6.0 °GL(Merchan y Castillo, 1999, 120). El buen desarrollo de la fermentación esta en parte ligado a la necesidad de evitar que las levaduras sean sometidas a temperaturas demasiado elevadas. La experiencia ha demostrado que son tanto más sensibles a la elevación de temperaturas cuanto más vieja sea la población, lo que constituye una causa de ralentización y a veces de parada de la marcha fermentativa, mientras quedan en el medio azúcares aun no transformados en alcohol. A partir de 30 °C se puede considerar que las levaduras reducen progresivamente su actividad, hasta cesarla completamente cuando se aproxima a los 40 °C. El hecho de tratar de mantener la temperatura a un nivel razonablemente bajo no aspira solamente a la mayor regularidad de la fermentación y mayor grado alcohólico, si no que tiende a frenar la perdida por volatilización de una fracción importante de compuestos aromáticos (Suárez, 1990, 211).
2.2.2 pH El crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentación no se ve afectado por la variación de pH entre 3.5 y 6.0 en el medio, pero a valores de pH entre 3.05 hasta 3.50 en el medio, se logra alcanzar un máximo de rendimiento de acuerdo a la formación de producto y crecimiento de la levadura (Aleixandre, Noviembre de 1998). En una fermentación alcohólica, el pH varía normalmente entre un mínimo de 2.8 y un máximo de 3.8, rango que depende básicamente de la composición del medio 10
a ser fermentado (De Rosa, 1998, 194). Se establece que el pH en valores menores que 3.0 en un proceso fermentativo, se presenta el fenómeno de inhibición por pH, el cual se debe al efecto que esta variable tiene sobre los centro activos de las enzimas. Estos centros presentan actividad en un determinado estado de ionización y este estado varía en función del pH el medio. Por lo tanto, la actividad enzimática es función del número de centros activos y estos, dependen del pH del medio. Por otra parte, este fenómeno puede interpretarse por el importante efecto que el pH del medio tiene sobre la estructura y la permeabilidad de la membrana celular (Revista Alimentación, equipos y tecnología, Junio de 1993). La marcha fermentativa depende además del pH del medio y los productos que resultan son mejores en cuanto a rendimiento a valores de pH bajos. También el conjunto de las floculaciones coloidales están reguladas por el pH del medio, así como algunas de sus características organolépticas tales como color y sabor. En la levadura Saccharomyces cerevisiae el crecimiento se da más rápido que en las bacterias a bajos valores de pH, ofreciendo la ventaja de operar una fermentación alcohólica evitando contaminación. Si se utiliza sacarosa como fuente de carbono el sistema es más sensible al pH que al utilizar glucosa, ya que la inversión de la sacarosa se acelera a pH bajos. El producto final de una fermentación alcohólica esta constituido esencialmente por una solución hidroalcohólica de ácidos orgánicos salificados en distintas proporciones, especialmente de potasio, magnesio y calcio. Esta solución contiene diferentes sustancias, que pueden permanecer en estado de solución verdadera, de solución coloidal o de simple suspensión. Las proporciones de estos constituyentes pueden ser sensiblemente variables entre ellos y esto en función de diversos factores tales como pH. El pH es una característica de primaria importancia, y esto por diferentes motivos. Ante todo organolépticamente el pH influye fuertemente sobre la sensación de acidez, dado que ésta depende más de la concentración hidrogeniónica (fuerza ácida) que de la cantidad de ácidos contenidos. Sobre la formación del fosfato férrico y consiguiente quiebra fosfática tiene fuerte influencia el pH, y se ha podido demostrar que el pH óptimo para el pleno desarrollo de éste fenómeno se sitúa sobre el valor de 3.3. A valores sensiblemente inferiores o superiores el enturbiamiento no aparece. Se puede comprender como las desviaciones de pH pueden hacer aparecer riesgos que no se tenían, hecho que se produce, por ejemplo, a continuación del tratamiento de un vino con un desacidificante o también por la adición directa de un ácido (De Rosa, 1998, 239). 2.2.2.1 Ajuste del pH •
Adición de ácido tartárico o de ácido cítrico: Los dos únicos ácidos que se pueden usar tanto tecnológicamente como legalmente, son el ácido tartárico y el cítrico.
11
•
Desacidificación: Los desacidificantes utilizables técnicamente en las fermentaciones son: el carbonato de calcio, el bicarbonato de potasio y el tartrato neutro de potasio.
2.2.2.2 Buffers En los medios de cultivo es deseable mantener un pH constante (rango 3.0 –3.5) durante el proceso fermentativo y esto se logra mediante el empleo de amortiguadores o buffers. También sucede que el pH en un medio de cultivo se ajusta adicionando un compuesto alcalino, por ejemplo hidróxido de sodio si el pH es demasiado ácido; o un compuesto ácido, por ejemplo el ácido clorhídrico, si el pH es demasiado alcalino. Como los microorganismos suelen provocar cambios en el pH de sus ambientes al desarrollarse, lo mejor es adicionar al medio de cultivo un amortiguador de pH, actuando dentro de los límites máximos de pH; por lo tanto, se deben seleccionar amortiguadores para diferentes regiones de pH. Para límites próximos a la neutralidad (pH 6.0 a 7.5) el fosfato constituye un amortiguador apropiado (Brock, 1993, 349). Generalmente los sistemas proteicos de un medio de cultivo permiten un efecto buffer en el mismo.
2.2.3 Aireación La velocidad de fermentación al inicio del proceso fermentativo, depende estrechamente de las condiciones de aireación, desarrollándose dicha fermentación más rápidamente cuando las levaduras están mejor aireadas. Por lo tanto, es conveniente airear el medio hasta el máximo, máximo que coincidirá con él limite de solubilidad de un gas (oxígeno) en un liquido y que es muy bajo. Por mucho que se airee al principio, se tenderá a alcanzar muy pronto la saturación del mosto en oxígeno. La utilización del oxígeno por levaduras sólo tiene lugar al comienzo de la fermentación. Una vez arrancada ésta, no necesita oxigenación o de lo contrario se desviaría el proceso alcohólico, y comenzaría entonces la metabolización de los azúcares por vía respiratoria, produciendo mayor cantidad de células. La fermentación con agitación es ligeramente más rápida que la fermentación sin agitación. A pesar de ello, los niveles finales de etanol y azúcar obtenidos son similares en ambas condiciones de operación, observándose un ligero aumento en el grado alcohólico y el azúcar residual en la fermentación sin agitación (López, Marzo de 1995, 55).
2.3 BIORREACTORES Son dispositivos para el cultivo de microorganismos que permiten el control tanto de la densidad de la población, como de la velocidad de crecimiento. Su aplicación incluye la preparación de bebidas alcohólicas, como una amplia gama en la industria biotecnológica. Se pueden adaptar para realizar cultivos 12
discontinuos o continuos. En cultivos discontinuos, el microorganismo crece a partir de una limitada cantidad de medio hasta que se agota un nutriente esencial o se acumulan subproductos tóxicos hasta niveles que inhiben el crecimiento. En cambio en el tipo continuo se emplean dos elementos en su control, la velocidad de flujo y la concentración de un nutriente limitante.
2.3.1 Monitoreo y control de biorreactores En el ambiente dentro de un biorreactor se debe asignar la óptima actividad catalítica para las levaduras mediante parámetros como temperatura, pH, oxígeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitación, que tienen un significativo efecto en el desarrollo de la fermentación y las reacciones enzimáticas. Para proveer el ambiente deseado, las propiedades del sistema deben ser monitoreadas y se deben tomar acciones de control para rectificar cualquier desviación de los valores deseados. El monitoreo y control de las fermentaciones es un área activa de investigación destinada a mejorar la productividad de los bioprocesos y alcanzar una confiable y uniforme operación de fermentación. Varios niveles de procesos de control existen en la industria de la fermentación. El control manual es el más simple, requiere de operación humana para manipular dispositivos tales como bombas, motores y válvulas. La retroalimentación es usada para mantener parámetros a valores específicos. Con la creciente aplicación de los sistemas de computadoras en la industria de la fermentación, también se quiere apuntar a la implementación de controles avanzados y estrategias de optimización basado en modelos de fermentación.
2.3.2 Monitoreo de la fermentación Para entender el control del estado de una fermentación se debe conocer las variables críticas que afectan a un bioproceso. Estas variables pueden ser agrupadas en tres categorías: físicas, químicas y biológicas. Muchas de las medidas físicas están establecidas en la industria; otras están actualmente siendo desarrolladas o son foco de investigación para obtener nuevos instrumentos. Idealmente las medidas deben realizarse in situ y en línea. Actualmente el monitoreo en línea tiene aplicación en los siguientes grupos: •
Producción de biomasa.
•
Producción de enzimas microbianas.
•
Producción de metábolitos microbianos: etanol, ácido cítrico, acetona, butanol, polisacaridos, vitaminas.
Procesos de transformación: glucosa a etanol, etanol a vinagre, producción de antibióticos. Las medidas que son realizadas en línea generalmente son: temperatura, presión, pH, oxígeno disuelto, velocidad de flujo, velocidad de agitación, consumo de energía, nivel de espuma. •
13
Tabla 2.3 Parámetros medidos o controlados en biorreactores FISICOS TEMPERATURA, PRESION, NIVEL DE LIQUIDO, NIVEL DE ESPUMA, VELOCIDAD DE AGITACION, CONSUMO DE ENERGIA, VELOCIDAD DE FLUJO DE GAS, VELOCIDAD DE FLUJO DE MEDIO, VISCOSIDAD DEL CULTIVO
QUIMICOS
PH, OXIGENO Y CO2 DISUELTO, POTENCIAL REDOX, COMPOSICION DE GAS DE SALIDA, CONDUCTIVIDAD, COMPOSICION DEL MEDIO
BIOLOGICOS CONCENTRACION DE BIOMASA, CONCENTRACION DE ENZIMAS, COMPOSICION DE BIOMASA(ADN, ARN, PROTEINA, ATP/ADP/AMP/NAD), MORFOLOGIA.
FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principies.
2.3.3 Retroalimentación Cuando se necesita mantener el valor de una variable constante durante el proceso, por ejemplo el pH a un valor dado, se tienen diferentes sistemas controladores. Uno de los controladores más simples es el de retroalimentación, el cual consta de un aparato de medición (potenciómetro) que envía el valor de la medición al controlador. En el controlador el valor medido es comparado con el valor establecido o fijo y se registra la diferencia. La desviación con respecto al valor real se llama error, el cual es usado por el controlador para determinar que acción debe seguir para corregir el proceso. El controlador produce una señal la cual es transmitida al ejecutar encendiéndolo o apagándolo; Para el caso del pH, si la medida baja del punto determinado, una bomba adiciona álcali a la fermentación hasta retornar el valor de pH requerido. Figura 2.6 Componentes del retroalimentador
FUENTE: DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering principles.
2.4 CULTIVOS CONTINUOS 14
Si se prepara un cultivo de tal forma que el cese del crecimiento se deba al agotamiento del medio, es decir, limitación del substrato, en lugar de la acumulación de metabolitos tóxicos, entonces la fase exponencial del crecimiento puede prolongarse mediante la adición de nuevo medio al recipiente. Esta operación puede repetirse hasta que el recipiente se llene, No obstante, si se instala un sistema de flujo continuo en un fermentador de tal forma que el cultivo fresco desplace, en un volumen igual, al cultivo agotado, entonces se puede conseguir una producción de células de forma continua. Un fermentador continuo de tanque agitado contiene dispositivos para la alimentación y descarga en continuo. El contenido del recipiente se encuentra en estado estacionario, es decir, no varia con el tiempo; esto se aplica a la retención de microorganismos y a la concentración de los componentes del medio en el fermentador. Las condiciones de estado estacionario pueden alcanzarse operando sobre principios quimiostáticos, que implican ajustar el caudal del alimento al fermentador a un valor apropiado y constante, permitiendo a las concentraciones de microorganismos, substrato y producto bioquímico alcanzar sus niveles naturales. En el quimiostato, el crecimiento de las células se controla ajustando la concentración de un substrato mediante la fijación de una tasa de dilución que fijará la tasa de crecimiento en el sistema. Cualquier substrato que se requiera puede ser utilizado como substrato limitante. Generalmente los substratos limitantes que más incidencia tienen en el crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae son el ion amonio, glucosa y fosfato (Crueger, 1991, 79). Los efectos de diferentes tasas de dilución y concentración del substrato limitante para la proliferación de los microorganismos se explican así: Cuando las tasas de dilución son altas, el organismo no puede crecer lo suficientemente rápido para ir de acuerdo con su dilución y el cultivo es lavado del quimiostato. En el otro extremo, con tasas de dilución muy lentas una fracción importante de las células pueden morir de inanición, puesto que el nutriente limitante no llega con la suficiente rapidez para mantener el metabolismo celular. La concentración de microorganismos en el quimiostato se controla por la cantidad de nutriente limitante. Si la concentración de éste (nutriente en el medio que llega) se elevara dejando constante la tasa de dilución, la concentración de microorganismos aumentaría aunque la tasa de crecimiento seguiría siendo la misma y la concentración de substrato en el quimiostato seguiría siendo virtualmente cero. De esta manera, ajustando la tasa de dilución y la concentración de substrato, experimentalmente se puede obtener a voluntad una variedad de concentración de microorganismos y tasas de crecimiento. La figura 2.7 explica el comportamiento del efecto de diferentes tasas de dilución respecto a la concentración de microorganismos y las tasas de crecimiento.
15
Figura 2.7 Efectos de la tasa de dilución y concentración de substrato en un quimiostato
Fuente: BROCK, T. Microbiología De acuerdo a la gráfica anterior, se nota que a altas tasas de dilución, el crecimiento no puede equilibrar la dilución, la población se extingue y la concentración del substrato alcanza un máximo. Sin embargo, en el mayor rango de tasas de dilución, la concentración de microorganismos permanece constante y la concentración de substrato conserva un valor muy bajo. Aunque la concentración de microorganismos permanece constante, la tasa de crecimiento y el tiempo de duplicación varía en un intervalo amplio. En conclusión, los dispositivos para cultivo continuo (quimiostatos) son un medio para mantener la población en crecimiento exponencial durante largos periodos. Lo principal de un dispositivo para cultivo continuo es reabastecer lentamente el recipiente del cultivo con medio fresco, en tanto se elimina el medio ya usado y las células a la misma velocidad. La velocidad a la que se realiza esta dilución rige la velocidad de crecimiento de la población celular en el recipiente del cultivo.
2.4.1 Diferencias entre cultivo continuo y discontinuo • •
•
El cultivo continuo opera bajo condiciones de un estado de equilibrio, es decir, las concentraciones de todos los componentes del cultivo son constantes. El cultivo continuo opera bajo condiciones limitantes de substrato mientras que el cultivo discontinuo, en la fase exponencial, funciona en presencia de exceso de substrato. La velocidad de crecimiento en el cultivo continuo está controlada por la velocidad de dilución (y por ello bajo el control del operario) y su valor es siempre menor que la velocidad máxima de crecimiento µmax. Por en contrario, la velocidad específica de crecimiento µ en la fase exponencial de un
16
cultivo discontinuo alcanzará la velocidad máxima de crecimiento correspondiente a las condiciones que prevalezcan en el cultivo.
µmax
2.4.2 Cinética del cultivo continuo En un proceso continuo en condiciones de equilibrio la perdida de células debida al fluido que sale debe ser balanceada por el crecimiento del microorganismo(Trevan, 1990,86). D=µ La velocidad de flujo D se define como la velocidad de flujo volumétrico que entra y sale a través del volumen del fermentador. D es definida como: D=F/V Donde D es la velocidad de dilución en h -1, V es el volumen de fermentador en ml y F es el flujo en ml*h -1. La concentración de substrato en el quimiostato viene determinada por la velocidad de dilución. En efecto, esto se debe a que el crecimiento está consumiendo el substrato hasta una concentración que permite que la velocidad de crecimiento iguale a la velocidad de dilución. Si el substrato se agota hasta un grado en que su concentración tenga un nivel inferior al que soporta la velocidad de crecimiento impuesta por la velocidad de dilución, se da la siguiente secuencia de sucesos (Trevan, 1990, 87): •
•
La velocidad de crecimiento de las células será menor que la velocidad de dilución y saldrán del quimiostato a una velocidad superior a la que se está formando, por lo que decrece la producción. La concentración de substrato en el quimiostato aumentará dado que existe un número menor de células para consumir el substrato.
La mayor concentración de substrato ocasionará que las células crezcan a una velocidad mayor que la velocidad de dilución, con lo que aumentará la concentración de biomasa. La disminución de la velocidad de crecimiento y el cese del crecimiento debido al agotamiento de substrato puede describirse por la relación entre µ y la concentración residual de substrato limitante esencial. El substrato limitante es aquel componente del medio que primero se agota y esto se explica de acuerdo a la relación de Monod. El efecto controlador de la velocidad de dilución está regulado, esencialmente, por la relación entre µ y s(Trevan, 1990, 87): •
µ = µmax
x s / K s + s donde s es la concentración residual del substrato limitante y K s es la constante de utilización o saturación para el substrato limitante y equivale a la concentración de substrato cuando el valor de µ es la mitad que el de µmax. En un estado de equilibrio µ = D; por lo tanto: 17
D = µmax x se / Ks + se Donde se es la concentración del substrato residual en el estado de equilibrio. Despejando se de la ecuación anterior resulta: se = Ks x D / µmax – D Esta ecuación predice que la concentración de substrato en el quimiostato viene determinada por la velocidad de dilución. En efecto, esto se debe a que el crecimiento está consumiendo el substrato hasta una concentración que permite que la velocidad de crecimiento iguale a la velocidad de dilución. La concentración de células en el quimiostato en el estado de equilibrio viene definida por la ecuación: xe = Y ( S R – ( Ks x D / µmax – D ) ) donde: Y es factor de rendimiento para el substrato limitante (g biomasa/ g substrato consumido). SR es la concentración original del substrato en el medio. La velocidad específica máxima de crecimiento en los procesos industriales se escoge de forma que se obtenga el rendimiento más alto en el volumen más pequeño del fermentador y en el tiempo más corto. El modelo de Monod no es generalmente aplicable a la fermentación continua a velocidades muy bajas o muy altas de dilución. A velocidades medias de dilución la relación molar entre la biomasa producida y el CO 2 que se desprende es constante. A bajas velocidades de dilución la proporción de CO2 se hace más grande. Esto se debe a que se utiliza más fuente de energía para el mantenimiento de la estructura celular, para la regulación osmótica o para la motilidad de la célula. Por otra parte, a velocidades altas de flujo una parte del carbono añadido es oxidado incompletamente (a productos como piruvato, acetato o ácidos tricarboxílicos) y de esta forma se reduce la productividad. A bajas velocidades de flujo, con nitrógeno como substrato limitante, se forman materiales de reserva, como polisacáridos, lo que resulta en un aumento en el tamaño de la célula y por tanto de la biomas
18
CAPITULO 3 MATERIALES Y METODOS En este capítulo se describen las metodologías que fueron utilizadas para la realización de este trabajo. Las metodologías internacionalmente aceptadas, fueron adaptadas a las infraestructuras de los laboratorios con los que cuenta la Facultad de Ingeniería.
3.1
PROCEDIMIENTO
Para la implementación de las normas se realizaron los siguientes pasos: Tabla 3.1 Normas y métodos utilizados
DETERMINACION
NORMA/METODOS
Nitrógeno
Norma AOAC 960.52
Etanol
Manual de métodos analíticos para el control de calidad de bebidas alcohólicas (NTC) y norma AOAC 969.12
Azúcares reductores Sólidos solubles totales y % Sacarosa
Norma AOAC 923.09 Refractómetro y Sacarómetro
Conteo de microorganismos
Método cámara de conteo
FUENTE: Autores −
Elaboración de curvas de calibración para los métodos de determinación de nitrógeno y azúcares reductores, utilizando muestras de concentración conocida, para los métodos empleados.
1
−
Cálculo del porcentaje de error de exactitud al comparar el valor teórico de las muestras de concentración conocida con el valor de las muestras experimentales.
3.2
DISEÑO EXPERIMENTAL
3.2.1 Diagramas de flujo 3.2.1.1 Pruebas preliminares Preparación de medios de cultivo s1, s2, s3, n1, n2, n3 (s= medio semisintético, n= medio natural)
Cada medio se prepara por triplicado en erlenmeyer de
Activación de levadura a 35°C en solución 5% de azúcar
Inocular la levadura activada a
Desarrollo de las fermentaciones a temperatura de 25 °C hasta estabilización de sólidos solubles totales Determinación de parámetros en función del tiempo: número de microorganismos, sólidos solubles totales, %sacarosa, pH Evaluación de las fermentaciones: selección del medio de mayor fluctuación de pH 3.2.1.2
Pruebas en el Bioflo
Configuración del funcionamiento del bioflo: velocidad de agitación, concentración de ácido y base para regulación de pH y bombas de alimentación
Se toma una muestra diaria de 15 ml cada medio (s1, s2, s3, n1, n2, n3). Se determina
Se determina mediante regresión lineal la pendiente para cada medio de cultivo y el porcentaje de variación de Para la velocidad de agitación se observan los tiempos de operación a velocidades de 50, 75 y 100 r.p.m. Para la concentración de ácido y base, se emplea concentraciones de 1 N 5 N
2
Fermentación alcohólica en el biorreactor, preparación de medio de cultivo a 10 litros bajo condiciones constantes de temperatura 25 °C y pH de 4.5, paralelo a una fermentación sin funcionamiento del sistema de regulación de pH a 25°C. Determinación de parámetros en función del tiempo: número de microorganismos, sólidos solubles totales y %sacarosa, nitrógeno total. Determinación de parámetros finales: contenido de etanol y azúcares residuales Elaborar guía de manejo y funcionamiento del bioflo bajo trabajo de regulación de pH Trabajo preliminar para manejo del bioflo en cultivos continuos: concentración de substrato limitante y tasa de dilución.
El número de réplicas de cada fermentación es de dos (2) empleando el medio s2.
Se realiza por triplicado tomando una muestra diaria de 30 ml a excepción de porcentaje de sacarosa que se toma al final de la Se realiza al final de cada fermentación por triplicado determinando media aritmética
Se emplea el medio s2 a un volumen de 10 litros, tomando muestra diaria para determinar crecimiento de microorganismos, contenido
3.2.2 Preparación de los medios de cultivo para pruebas preliminares El medio de cultivo utilizado para este estudio se presenta en la tabla 3.2 y 3.3 Tabla 3.2 Medios de cultivo semisintéticos CONTENIDO
MEDIO S1
MEDIO S2
MEDIO S3
Extracto de levadura (g/l)
8.00
8.00
8.00
Sacarosa (g/l)
100.00
100.00
100.00
Metabisulfito de Sodio (g/l)
0.05
0.05
0.05
Solución Madre de Complejo vitamínico (ml/l de medio)
0.11
0.11
0.11
3
Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 (g/l)
0.25
Fosfato de Amonio (NH4)2HPO4(g/l)
0.25
Fuente: Autores
Tabla 3.3 Medio de cultivo naturales CONTENIDO
MEDIO N1
MEDIO N2
MEDIO N3
Piña ( Ananas comosus) (g/l)
1000.00
1000.00
1000.00
Metabisulfito de Sodio (g/l)
0.05
0.05
0.05
Solución Madre de Complejo vitamínico (ml/l de medio)
0.11
0.11
0.11
Sulfato de Amonio (NH4)2SO4 (g/l) Fosfato de Amonio (NH4)2HPO4(g/l)
0.25 0.25
Fuente : Autores Cada medio se elaboró por triplicado. Posteriormente se debe llegar a 20°Brix con más adición de sacarosa.
3.2.3 Esterilización de los erlenmeyer y adecuación de los medios de cultivo Para la esterilización de los 18 erlenmeyer se utilizó una estufa WTB-BINDER, para ello se procedió a cerrarlos con papel aluminio, con el fin de que permanecieran estériles hasta el tiempo en el que fueran utilizados. La esterilización se llevó a cabo a 200 oC durante dos horas. Se procedió a la introducción del medio en los erlenmeyer, este proceso se realizó dentro de una cámara de flujo laminar CAE ET (30"x36"x6"), para evitar la contaminación de los medios de cultivo. Luego se aumentó la temperatura de los medios a 25oC, al colocarlos en una estufa Binder adecuada a esta temperatura. En la preparación del medio de cultivo se agregó el metabisulfito de sodio con el fin de realizar una inhibición bacteriana química, y de esta forma, evitar el crecimiento de la flora bacteriana que podría contaminar el medio, formada principalmente por bacterias fermentativas tolerantes a medios ácidos.
4
3.2.4 Activación e inoculación de la levadura La levadura Saccharomyces cerevisiae se activó previamente antes de ser inoculada en cada cultivo. Esta preparación es necesaria para 1 litro de medio. Se pesó 5 gramos de sacarosa comercial y se depositaron en el balón aforado de 100 ml completando el volumen con agua destilada. Se colocó en el baño termostatizado hasta que llegó a una temperatura de 35 °C. Se pesó 0.6 gramos de levadura y se colocó en el vaso de precipitado de 100 ml. Se añadió 6 ml de la solución azucarada y se dejó en el baño termostatizado a 35 °C hasta que se notara la presencia de gas (CO2). (Alba y Sierra, 1999, 76) Se depositaron los 6 ml de la levadura activada para inocular el medio de cultivo el cual se fijo a 20 °Brix adicionando sacarosa. La inoculación de la levadura se realizó tomando en consideración los procedimientos para el manejo estéril de cultivos. Para ello todas las inoculaciones se realizaron en la cámara de flujo laminar CAE ET, utilizando material previamente esterilizado (pipetas, erlenmeyer) y utilizando el mechero para flamear todo el material que tuviera contacto con los medios.
3.2.5 Variables a medir durante la fermentación preliminar 3.2.5.1
pH
Para medir el pH, se tomó una muestra diaria de cada medio durante la fermentación, agitando previamente de manera suave durante 30 segundos el medio de cultivo. El pH fue medido mediante un potenciómetro debidamente calibrado. 3.2.5.2
Número de microorganismos
El conteo se realizó diariamente por triplicado durante la fermentación, empleando la cámara de conteo Neubauer Improved en el microscopio. 3.2.5.3
Sólidos solubles totales y %sacarosa
Los sólidos solubles totales se tomaron diariamente y por triplicado durante la fermentación, empleando el refractómetro y el porcentaje de sacarosa se tomó el día final de la fermentación utilizando el aerómetro-sacarómetro, según °Brix Tp 20 °C.
3.2.6 Análisis de los datos obtenidos en las pruebas preliminares Para la determinación de los parámetros se tomaron muestras diarias de manera estéril y por triplicado. El análisis se realizó mediante un manejo estadístico simple, determinando cual es el medio de cultivo que presenta mayor rango de
5
fluctuación de pH. Las metodologías que se siguieron para la determinación de los parámetros se presentan en la sección 3.3.
3.2.7 Pruebas preliminares en el Bioflo Se realizaron ensayos preliminares con el medio que presentó mayor rango de fluctuación de pH, a un volumen de 6 litros; Estas pruebas permitieron configurar las siguientes condiciones para llevar a cabo la fermentación alcohólica: •
•
•
Determinación de velocidad de agitación. De manera previa empleando agua y posteriormente con medio. Concentración de ácido y base para regulación de pH empleando ácido cítrico y carbonato de calcio, solo con funcionamiento del sistema regulador del Bioflo. Se determinó mediante las necesidades volumétricas de ácido y base para regular el pH en el funcionamiento del mismo sistema regulador. Configuración de bombas de alimentación peristálticas para salida y entrada de flujos del biorreactor.
3.2.8 Fermentación alcohólica en el Bioflo. Se utilizó el medio de cultivo evaluado en ensayos preliminares. El número de réplicas de las fermentaciones son dos (2) con un volumen total de 10 litros. Las fermentaciones en el biorreactor se llevaron a las siguientes condiciones constantes: • •
Temperatura de 25° C pH de 4.5: pH que permite evaluar mejor el sistema de bombas peristálticas y observar el desarrollo continuo del sistema de regulación de pH, ya que difiere del pH normal del desarrollo de una fermentación (pH de 2.8 hasta 3.8).
3.2.9 Fermentación alcohólica sin regulación de pH. Se utilizó el medio de cultivo evaluado en ensayos preliminares. El número de réplicas de las fermentaciones son dos (2) con un volumen total de 10 litros. Las fermentaciones en el biorreactor se llevaron a las siguientes condiciones constantes: •
Temperatura de 25° C
•
Se realizó la comparación de las dos fermentaciones mediante los datos de las variables medidas a lo largo de cada fermentación.
3.2.10 Diagrama de flujo de puesta en marcha de una fermentación en el Bioflo Lavar y esterilizar el vaso del Bioflo en autoclave 6
Preparar medio de cultivo en recipiente de 10 litros Ajustar sólidos solubles totales a 20° Brix Instalar el vaso en la cabina de control y agregar el medio de cultivo Conectar mangueras del condensador y adaptar el motor al vaso Insertar la termocupla y abrir la válvula de agua a una presión de 20 psi Encender el Biorreactor y seleccionar modo 2 de fermentación. Calibrar e instalar el potenciómetro Fijar la temperatura y pH de trabajo: 25°C y 4.5 respectivamente Inocular la levadura y fijar agitación al medio. Medir a diario: Número de m.o, sólidos solubles totales, Contenido de nitrógeno, y pH en fermentación sin regulación. Determinar al final de la fermentación: azúcares reductores, contenido alcohólico y % de sacarosa.
3.2.11 Reproducibilidad de la fermentación alcohólica en el Bioflo La reproducibilidad de la fermentación alcohólica se determinó por medio de las variables a ser medidas durante el desarrollo de cada fermentación tanto para la fermentación con regulación de pH y sin regulación. 3.2.11.1 Variables a medir durante la fermentación •
Número de microorganismos: Se tomó una muestra diaria durante la fermentación para conteo total mediante cámara Neubauer Improved.
7
•
•
•
•
•
Sólidos solubles totales y % sacarosa: Se tomó una muestra diaria, se realizó por refractómetro y sacarómetro respectivamente. El porcentaje de sacarosa se tomó solo al final de cada fermentación. Nitrógeno total: Se tomó una muestra diaria, se realizó mediante método Kjeldahl. Contenido de etanol: Al final de la fermentación se tomó una muestra, se realizó mediante destilación alcohólica, según Norma Icontec. Azúcar residual: Al final de la fermentación, se realizó mediante método de AOAC 923.09. pH: Se realizó la lectura en el monitor del Bioflo diariamente.
3.2.11.2
Técnicas utilizadas
•
Número de microorganismos: Cámara de conteo Neubauer Improved.
•
Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa: Refractómetro y aerómetro (sacarómetro).
•
Nitrógeno total: Método Kjeldahl, según Norma AOAC 960.52.
•
Contenido de etanol: Método de destilación, según el Manual de Métodos analíticos para el control de calidad de bebidas alcohólicas (ICONTEC).
•
Azúcar residual: Norma AOAC 923.09.
3.2.11.3 Validación estadística de los datos El análisis se realizó mediante un manejo estadístico simple, determinando media aritmética y desviación estándar en cada una de las variables medidas a lo largo del proceso de fermentación con un intervalo de confianza del 95%.
3.2.12 Pruebas preliminares para trabajo de cultivos continuos Se trabajó de manera preliminar un cultivo continuo en el Bioflo, utilizando el medio semisintético con fosfato de amonio, que fue alimentado durante el proceso con el mismo. Se trabajó un cultivo con un volumen constante de 10 litros en el vaso del Biorreactor. Se establecieron los siguientes parámetros: • •
Concentración de sustrato limitante. Tasa de dilución, que determina la tasa de crecimiento. Los cultivos preliminares en sistema cerrado permiten establecer la tasa de crecimiento en la fase exponencial; en la fase exponencial se encuentra el máximo consumo de sustrato limitante y formación de producto. En el cultivo continuo, la salida de producto determina la entrada de sustrato limitante al sistema abierto.
8
3.3 MATERIALES Y METODOS 3.3.1 Método Kjeldahl para la determinación de nitrógeno total 3.3.1.1 Fundamento del método En este método la muestra analizada se descompone con ácido sulfúrico concentrado en caliente, para convertir el nitrógeno en ion amonio. Cuando la descomposición se completa, la solución resultante se enfría, se diluye y se alcaliniza con hidróxido de sodio. El amonio liberado liberado se separa por destilación y se recoge en una solución ácida y posteriormente se cuantifica por titulación. El ácido sulfúrico que se utiliza para descomponer la muestra, oxida al carbono e hidrógeno a dióxido de carbono y agua, siendo esta etapa la más crítica en este método. 3.3.1.2 Reacciones que que se presentan muestra + H 2 SO4 + H2O (NH4)2 SO4 + CO2 Digestión (NH4)2 SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2 SO4 + 2H2O Destilación 2 NH3 + 2H3BO3 2H2BO3- + 2NH4+ Destilado 2H2 BO3- + 2HCl 2H3 BO3 + 2Cl- Titulación Para calcular un volumen teórico de HCl con una normalidad dada se tiene de la estequiometría de la reacción: ml de HCl x Normalidad = Xg N [(132g (NH 4)2 SO4 x 34g NH3 x121g H2BO3 x 73 g HCl x 1 equiv. HCl x 1000ml) / (28g N x 132g (NH 4)2 SO4 x 34g NH3 x121g H2BO3 x 36.5 g HCl)] Donde se obtiene: ml de HCl x Normalidad HCl = Xg Nitrógeno x 71.43 3.3.1.3 Materiales −
Sistema de digestión de KJELDAHL BUCHI B-316
−
Unidad de destilación BUCHI B-316
−
Centrífuga HERMLE Z320
−
Tubos de vidrio para digestión BUCHI
−
Vaso de precipitado de 1000 ml (plásticos)
−
Bureta de 10 ml ( + 0.05 ml)
−
Pipetas de 5 y 10 ml (+ 0.045 - 0.05 ml) respectivamente
9
−
Erlenmeyer de 250 ml
−
Placa de calefacción y agitación
−
Tubos para centrífuga
−
Balanza analítica
3.3.1.4 Reactivos −
Acido sulfúrico concentrado concentra do r.a
−
Pastillas catalizadoras de Kjeldahl sin selenio
−
Indicador de Taschiro
− −
Acido bórico al 2% Solución de hidróxido de sodio al 32%
−
Acido clorhídrico 1 N
−
Agua destilada
−
Carbonato de sodio
3.3.1.5 Procedimiento !
−
−
−
−
−
−
−
Digestión Tomar una muestra homogenizada de 20 ml del fermento y colocarla en un tubo de ensayo para centrifugarla a 4000 r.p.m. durante 20 minutos. Una vez centrifugado eliminar el líquido sobrenadante con ayuda de una pipeta de 5 ml. Adicionar al tubo tub o de d e ensayo e nsayo 20 ml agua destilada y agitar vigorosamente para que el sedimento se separe de la parte inferior del tubo. Verter esta solución en un tubo de vidrio para digestión digestión de Kjeldahl y enjuagar dos veces más el tubo de ensayo con agua destilada, vertiendo el agua de enjuague en el tubo de vidrio para digestión. Adicionar 20 ml de ácido sulfúrico concentrado y una pastilla de catalizador de Kjeldahl sin selenio. Encender el sistema de digestión BUCHI dejando el control de temperatura en 10 e instalar el tubo de vidrio con la muestra junto con el sistema de evacuación de gases. Se debe asegurar debidamente el sistema de evacuación de gases para evitar fugas, observando que los gases circulen en el sentido correcto. Al iniciar la digestión se debe regular la temperatura te mperatura del sistema de digestión, observando la formación de un anillo de gases en la parte media del tubo de vidrio de digestión. 10
−
− − !
−
−
−
−
−
−
Calentar hasta que se complete la reacción, esto se verifica cuando la solución resultante toma una coloración verde manzana traslúcida. Dejar enfriar y permitir la completa evacuación de los gases de digestión. Desmontar el sistema y pasar a la unidad de destilación. Destilación: Verificar el correcto funcionamiento de la unidad de destilación BUCHI, observando los contenedores de ácido bórico, NaOH y agua destilada. A la vez, se debe abrir la llave de refrigerante. Configurar la unidad de destilación en el panel de control, seleccionando el debido método de trabajo, que que establece una destilación de 5 minutos. minutos. Adaptar el tubo de vidrio de digestión en la unidad de destilación y a la vez colocar un erlenmeyer de 250 ml para recoger el destilado. Iniciar la destilación oprimiendo la tecla “enter”, en este momento la unidad adiciona 80 ml de NaOH al 32% al tubo de digestión y 75 ml de ácido bórico al 2% al erlenmeyer. Una vez terminado el tiempo de destilación se retira el tubo de digestión y el erlenmeyer que contiene el destilado. Adicionar indicador taschiro y se procede a valorar la solución del erlenmeyer recolector de 250 ml con ácido clorhídrico 1 N debidamente valorado, con un viraje de color verde a azul oscuro.
3.3.1.6 Cálculo y expresión de los resultados El contenido de nitrógeno de la muestra se calcula de la siguiente manera: Nm= (VHCl * NHCl)/71.43 Donde: Nm: contenido de nitrógeno de la muestra en gramos. VHCl: volumen de HCl gastados en la titulación en ml. NHCl: Normalidad de HCl (equivalentes por litro). En éste caso 0.94656 N (Solución de HCl 1N debidamente valorada con NaOH 1 N valorado con biftalato de potasio) 71.43: constante de la estequiometría de las reacciones.
3.3.2 Método para la determinación de azúcares reductores reductores por titulación de Lane y Enyon 3.3.2.1 Fundamento del método Los azúcares reductores están constituidos por aquellos azúcares que poseen acción reductora directa sobre una solución cupro-tartárico-alcalina.
11
Esta determinación comprende los siguientes pasos: Clarificación Determinación de azúcares reductores totales por titulación. (Método volumétrico). El método volumétrico o la titulación de Lane y Eynon para la determinación de azúcares reductores consiste en la adición de la muestra a determinar azúcares reductores a una solución de reactivo de Felhing. La titulación termina cuando la solución que contiene los azúcares reductores reduce la solución de Felhing con la aparición de un precipitado de coloración roja debido al óxido cuproso. 3.3.2.2 Materiales !
!
−
Balón aforado de 100 ml (+ 0.1 ml)
−
Balón aforado de 1000 ml (+ 0.4 ml)
−
Balón aforado de 2000 ml (+ 0.6 ml)
−
Balón aforado de 250 ml
−
Balanza analítica METTLER TOLEDO (+ 0.1 mg)
−
Pipeta volumétrica de 10 ml (+ 0.05 ml)
−
Vaso de precipitado de 1000 ml
−
Vaso de precipitado plástico de 1000 ml
−
Vaso de precipitado de 250 ml
−
Erlenmeyer de 500 ml
−
Embudo de Buchner
−
Papel filtro diámetro de poro de 0.2 µm
−
Perlas de vidrio
−
Placa calefactora y de agitación
−
Bureta de 10 ml (+ 0.05 ml)
−
Bureta de 50 ml (+ 0.1 ml)
3.3.2.3 Reactivos •
Solución de azúcar invertido al 1% (2 litros)
−
Sacarosa pura y seca = 23.75 granos
−
Acido benzoico = 4 gramos
−
Acido clorhídrico = 9 ml r.a.
−
Agua destilada = 2000 ml
12
•
Solución A (1 litro)
−
Sulfato cúprico puro 5H2O = 69.3 gramos
−
Agua destilada = 1000 ml
•
Solución B (1 litro)
−
Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado = 354 gramos
−
Hidróxido de sodio puro = 100 gramos
−
Agua destilada = 1000 ml
•
Clarificación del fermento
−
Solución saturada de acetato neutro de plomo
−
Oxalato de potasio anhidro
•
Titulación
−
Azul de metileno
3.3.2.4 Procedimiento • −
Preparación de solución estándar de azúcar invertido Disolver 23.75 gramos de sacarosa pura en cerca de 120 ml de agua en un matraz volumétrico de 250 ml. Añadir 9 ml de HCl concentrado y déjese en reposo durante 8 días a temperatura ambiente. Diluir hasta la marca con agua. Transferir 200 ml a un matraz volumétrico de 2 litros. Añadir cerca de 200 ml de agua agitando y 71.4 ml de una solución de NaOH 1 N y 4 gramos de ácido benzoico. Agregar 1 litro de agua, mezclar y verificar con papel indicador que la solución tenga aproximadamente un pH de 3. Ajustar si es necesario y diluir hasta la marca. Esto produce una solución estable al 1% (m/v) de azúcar invertido.
•
Clarificación del fermento
−
Tomar 100 ml del fermento y colocarlo en un vaso de precipitado.
−
−
Neutralizar exactamente con solución de NaOH 1N. Para soluciones coloreadas es conveniente utilizar un potenciómetro para controlar la neutralización. Agregar por pequeñas porciones, solución de acetato neutro de plomo, hasta que no se observe la formación de más precipitado.
−
Diluir con agua hasta la marca del matraz, mezclar y dejar en reposo.
−
Filtrar la parte sobrenadante, utilizar papel y embudos secos (filtrar a vacío).
−
Agregar por pequeñas porciones, oxalato de potasio anhidro, agitando después de cada adición hasta que no se observe la formación de más precipitado. Volver a filtrar. 13
El filtrado que se obtiene corresponde, volumen a volumen, con el fermento original. •
Determinación de azúcares por titulación
−
Colocar en un erlenmeyer de 500 ml, 15 ml de agua destilada, 5 ml de la solución B y 5 ml de la solución A.
−
Añadir algunas perlas de vidrio y colocar el erlenmeyer con la solución de Felhing en una placa calefactora.
− −
−
Hervir la solución exactamente 2 minutos. Agregar 4 gotas de azul de metileno 5 segundos antes de terminar el periodo de ebullición. Añadir desde la bureta el fermento a la solución en ebullición hasta que desaparezca el color azul dejando la coloración roja debida a la aparición de óxido cuproso. Esta titulación no debe sobrepasar los 3 minutos.
3.3.2.5
Cálculo y expresión de los resultados
La concentración de azúcares reductores en el fermento se determina de la siguiente manera: [ ] Azúcares reductores = g de azúcar invertido que reducen 10 ml de Felhing/ Volumen de titulación en ml. Los gramos de azúcar invertido que reducen 10 ml de Felhing se obtienen a partir de una titulación con la solución patrón de azúcar invertido al 1%.
3.3.3 Determinación del número de microorganismos por recuento en cámara de conteo Neubauer Improved. 3.3.3.1 Fundamento del método Las cámaras de conteo se utilizan para determinar microscópicamente el número de microorganismos totales (vivos y muertos) en un determinado volumen de suspensión. Este método se emplea en muestras con concentraciones de microorganismos mayores o iguales 106 m.o/ ml y que no contengan partículas que impidan determinar de manera precisa el número de microorganismos. En las cámaras de conteo hay una retícula grabada sobre la superficie de una placa de vidrio, con cuadros de un área pequeña y conocida. Sobre cada cuadro hay un volumen de magnitud conocida, muy pequeña, pero medida con mucha precisión. Se debe contar la cantidad de células por unidad de área de la retícula, empleando el microscopio de contraste, obteniendo una medida del número de células por el pequeño volumen de la cámara. De aquí se determina fácilmente el número de células por mililitro de suspensión, multiplicándolo por un factor de dilución basado en el volumen de la cámara donde se colocó la muestra.
14
La cámara de conteo Neubauer Improved es detallada a continuación. La profundidad de la cámara es de 0.1 mm. La cuadrícula de recuento muestra 9 cuadros grandes, cada uno de 1 mm2. Los 4 cuadros grandes de las esquinas están divididos en 16 cuadros con aristas de 0.25 mm. Se utilizan para recuento de leucocitos. El cuadrado grande central esta dividido en 25 cuadrados medianos con aristas de 0.2 mm y cada cuadrado mediano esta subdividido en 16 cuadrados pequeños con aristas de 0.05 mm y una superficie de 0.0025 mm 2. Todos los cuadrados medianos tienen líneas de límite triple. La línea central es la frontera y decide si las células de esta zona se deben contar o no. 3.3.3.2 Materiales −
Microscopio de contraste de fases
−
Cámara de conteo Neubauer Improved
−
Tubos de ensayo
−
Pipeta de 10 ml (+0.075 ml)
−
Pipeta de 1 ml (+0.01 ml)
−
Mechero de alcohol
−
Macropipeta
−
Goteros
3.3.3.3 Reactivos −
Formaldehído
−
Agua destilada
3.3.3.4 Procedimiento −
− −
Tomar por triplicado muestras de fermento de manera homogénea de 1 ml y diluir a 1x10-1 en un tubo de ensayo (9ml de agua destilada y 1 ml del medio fermentado). Adicionar dos gotas de solución de formaldehído al 40%. Agitar y tomar una o dos gotas de la suspensión homogénea, colocándola sobre la cámara Neubauer Improved. Cubrir con un cubreobjetos el área de las celdas.
−
Colocar la cámara de conteo en el microscopio y enfocar con el lente de 40X, ajustando el debido contraste.
−
Situarse en el cuadro grande central de los 9 cuadrados existentes de la cámara.
15
−
Hacer el conteo de los cinco cuadrados que conforman el cuadrado grande central, preferiblemente en forma diagonal. Cada cuadrado tiene a su vez 16 cuadrados pequeños.
3.3.3.5 Cálculos y expresión de los resultados Realizar los cálculos correspondientes según la siguiente fórmula estadística: NMO = P / (SC x Pf x Fd) •
NMO = Número de microorganismos por microlitro ( µl). Si el resultado se requiere expresar por ml, se debe multiplicar por 1000 el resultado obtenido.
•
P = Número de partículas contadas. Corresponde al promedio de 5 cuadros.
•
SC = Superficie contada que corresponde a 0.04 mm 2.
•
Pf = Profundidad de la cámara que corresponde a 0.1 mm.
•
Fd = Factor de dilución utilizado
3.3.4 Método para la determinación del contenido alcohólico de etanol por el método de destilación simple 3.3.4.1 Fundamento del método La muestra se somete a destilación simple en condiciones específicas y en el destilado se determinan los grados alcoholimétricos (porcentaje de etanol en volumen), utilizando un alcoholímetro. 3.3.4.2 Materiales −
Alcoholímetros Gay Lussac – Cartier a 15 °C(+ 0.1 °G.L)
−
Mechero de gas
−
Probeta de 250 ml
−
Aparato de destilación
−
Balón aforado de 250 ml
−
Perlas de vidrio
3.3.4.3 Reactivos −
Agua destilada
3.3.4.4 Procedimiento •
Destilación 16
−
En un balón aforado de 250 ml adicionar la muestra y llenar hasta la marca.
−
Instalar el aparato de destilación.
−
−
−
−
En el balón de destilación verter la muestra, a continuación lavar el balón que contenía la muestra con agua destilada, llenándolo hasta las tras cuartas partes del mismo. Adicionar el agua de lavado al balón de destilación. Agregar perlas de vidrio para regular la ebullición. Comenzar la destilación con un calentamiento regulado y continuo. Recoger el destilado en el mismo balón en que se midió la muestra, éste balón debe estar sumergido en agua con hielo para evitar pérdidas debido a la alta volatilidad del etanol. La destilación termina cuando se han completado las ¾ partes del balón que recibe el destilado, retirando el tubo ubicado en la parte inferior del refrigerante y lavándolo con agua por dentro y por fuera sobre el mismo balón.
−
Completar a volumen con agua destilada hasta la marca.
•
Estimación del grado alcoholímetrico
−
Llenar la probeta del alcoholímetro e introducir el mismo en la probeta.
−
Dejar en reposo el alcoholímetro hasta que se estabilice realizando la lectura por el menisco inferior del alcoholímetro.
3.3.5 Determinación de sólidos solubles totales y % de sacarosa 3.3.5.1 Fundamento del método La determinación de sólidos solubles totales se basa en una medición refractométrica de la cual se obtiene el valor a una temperatura dada. El porcentaje de sacarosa se realiza mediante el uso de un aerómetro, el cual se introduce en una solución y la lectura se realiza por el menisco que forma. 3.3.5.2 Materiales −
Refractómetro
−
Sacarómetro
−
Termómetro (0-110 °C)
−
Probeta de 250 ml
3.3.5.3 Reactivos −
Alcohol
17
3.3.5.4 • −
Procedimiento
Sólidos solubles totales Limpiar el prisma del refractómetro con alcohol y agua destilada, utilizando algodón para evitar ralladuras.
−
Verificar que la lectura sea cero colocando dos o tres gotas de agua destilada.
−
Llevar a 20 °C la muestra del fermento.
−
Hacer la respectiva medición con dos o tres gotas de fermento dejándolas caer sobre el prisma.
−
Observar la medición ajustando debidamente el refractómetro.
•
Porcentaje de sacarosa
−
−
Tomar una muestra de 250 ml de fermento, llevarla a 20 °C y colocarlo en una probeta Introducir el sacarómetro en la probeta, esperar a que se estabilice cuidando de que no se pegue en las paredes. Realizar la lectura.
18
CAPITULO 4 PRESENTACION DE RESULTADOS En este capítulo se presentan los resultados de las pruebas correspondientes al diseño experimental presentado. Además se presenta la guía de manejo y funcionamiento del sistema de bombas peristálticas del Biorreactor en una fermentación alcohólica aplicando el sistema de regulación de pH. Cabe anotar que en la metodología utilizada para determinar nitrógeno total y azúcares reductores fue necesario realizar una estandarización del equipo previo al desarrollo del método respectivo. En cuanto a las tablas de resultados, las celdas que se encuentran sombreadas corresponden a los días en que no se tomó la medida por ser fin de semana y el laboratorio no se encuentra disponible para su uso.
4.1
GUIA DE MANEJO PERISTALTICAS
DEL
SISTEMA
DE
BOMBAS
El Biorreactor Bioflo 3000 M1227 consta de un sistema de cinco bombas peristálticas asignables dependiendo la variable a controlar. Cada bomba tiene un modo de funcionamiento y operación dependiendo del parámetro a controlar en una fermentación discontinua o continua. Los modos de funcionamiento son los siguientes: − Modo Off: En éste modo la bomba no tiene ningún funcionamiento ya que no
responde al Feedback Control Loop. La bomba se encuentra apagada.
− Modo Manual: Este modo funciona cumpliendo ciclos variables de las bombas.
Se le asigna un valor especifico entre 0% y 100%, que determina un caudal para un porcentaje de velocidad.
− Modo Base y Acido:
Cuando el sistema de regulación de pH entra en funcionamiento, el modo ácido y base en las bombas peristálticas son los que realizan la acción de control de pH a un valor especifico.
− Modo On: Este modo funciona cumpliendo una operación de velocidad fija en
la bomba y su valor es de 125%, donde la bomba funciona de manera continua.
1
− Modos LVL1, LVL2, LVL3: Estos modos se utilizan cuando los sensores de
control de niveles en el Bioflo están presentes en el sistema. Generalmente estos modos se utilizan para fermentaciones en continuo. Cada uno de los modos de nivel pueden a la vez seleccionarse para manejo del sistema continuo. Los modos de función del LVL1, 2 y 3 son Off, Add y Harvest. Esto indica que cada sensor de nivel puede ser utilizado para alimentar de medio de cultivo o para cosechar respectivamente, teniendo en cuento que cada sensor de nivel se le asigna una bomba. En general, para el sistema de bombas peristálticas se emplean como entrada o salida de flujos del Biorreactor, las cuales deben instalarse apropiadamente para su correcto funcionamiento (Ver Anexo D). La configuración de las bombas depende de su uso y se instalan en el sistema así: − Para flujos de entrada al Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de
pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto hasta la parte baja de la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba, para esto se coloca la bomba en modo “ON”, hasta que se adapta totalmente el tubo. El tubo de silicona termina por acoplarse al recipiente contenedor. La bomba se configura en los modos mencionados.
− Para flujos de salida del Biorreactor: se adapta el tubo de silicona de 1/8 de
pulgada al puerto necesario. El tubo va desde el puerto designado hasta la parte alta de la bomba seleccionada y debe dar vuelta a la bomba para terminar acoplado en el recipiente contenedor. Las bombas en su funcionamiento tienen unos ciclos variables de velocidad con los cuales determinan caudales de entrada y de salida del Biorreactor. Los ciclos variables se enuncian a continuación. Tabla 4.1 Ciclos de funcionamiento de bombas peristálticas D A T O S D E C IC L O S D E F U N C I O N A M IE N T O T IE M P O C IC L O D E % M U E R T O T R A B A J O V E L O C ID A D ( s e g ) ( # G IR O ) 5 1 5 .0 1 /8 1 0 1 3 .5 1 /4 1 5 1 3 .0 3 /8 2 0 1 2 .8 5 /8 3 0 1 1 .5 7 /8 4 0 1 0 .9 1 1 /8 5 0 8 .9 1 3 /8 6 0 7 .8 1 3 /4 7 0 6 .8 2 8 0 5 .5 2 1 /4 9 0 5 .2 2 1 /2 1 0 0 3 .0 2 3 /4
Fuente: Autores
2
A la vez se presenta los caudales determinados a diferentes porcentajes de velocidad para las bombas peristálticas, medidos para caudales de entrada y de salida, de acuerdo a las diferencias presentadas en el desarrollo posterior del sistema en continuo empleando los puertos designados para cosecha y alimentación del Bioflo ( Ver Anexo D). Se determinaron los caudales entre un rango de 5 % – 50 % de velocidad de la bomba debido a su frecuencia de uso para cultivos continuos. Tabla 4.2 Caudales de bombas peristálticas para flujos de entrada y salida empleando tubo de silicona de 1/8 “ % VELOCIDAD 5 15 20 25 30 35 40 50 100
CAUDAL DE ALIM EN TACION (ml/min) 0.175 0.475 0.630 0.785 0.940 1.095 1.250 1.565 3.125
CAUDAL DE COSECHA (ml/min) 0.200 0.575 0.780 0.985 1.190 1.395 1.600 2.004 4.031
% DIFERENCIA ENTRE CAUDAL DE ALIMENTACION Y COSECHA 12.50 17.39 19.23 20.30 21.01 21.51 21.88 21.91 22.48
Fuente: Autores
4.1.1 Configuración de sistema de bombas peristálticas para control de pH Para la utilización del sistema de regulación de pH, en el Bioflo se deben seleccionar dos bombas peristálticas para la adición de ácido y de base de acuerdo a la acción de control. Los pasos a seguir son: − Seleccionar el ácido y la base a utilizar para la regulación de pH. En éste caso
se utilizó ácido cítrico e hidróxido de potasio respectivamente.
− Adaptar dos tubos de silicona a las bombas seleccionadas. El tubo se instala
de la siguiente manera: desde el puerto de adición que se encuentra en la tapa del vaso del Bioflo, hasta la parte de abajo de la bomba peristáltica, dándole la vuelta alrededor de ella hasta el recipiente donde se encuentra el ácido y la base respectivamente. Los recipientes a utilizar son erlenmeyer de 500 ml con tapón de caucho por donde se inserta el tubo de silicona. Cada bomba debe configurarse en el modo ácido o base correspondiente.
− Después de adaptar los tubos de silicona de 1/8 de pulgada a las bombas se
deben conectar a los puertos de adición de ácido y base que se encuentran en la tapa del Bioflo, según la figura incluida en el Anexo D.
− Para seleccionar el modo de funcionamiento de la bomba, en la pantalla del
Bioflo, se coloca el cursor en la columna “FEED1” y “FEED2” respectivamente, con la tecla “ALTER” se pasa al modo base y ácido respectivamente. La bomba se mueve en sentido horario, por lo cual el fluido se moverá en dicha 3
dirección. Verificar si el ácido o la base están siendo bombeados dentro del vaso de acuerdo al siguiente paso. − Escribir el valor del pH de trabajo, colocando el cursor en la columna de “pH1”
y fila “SET” y oprimir “ENTER”.
− En la pantalla “MASTER” del Bioflo, llevar el cursor a la columna “pH1” y fila
“CONTROL”, donde inicialmente aparece el letrero “OFF”. Oprimir la tecla “ALTER” hasta que aparezca el titulo “P.I.D” para luego oprimir “ENTER”. En el Anexo D se presentan las figuras de guía para la instalación y configuración de sistema de bombas peristálticas y la configuración de los puertos de entrada y salida de flujos del Bioflo.
4.2
RESULTADOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES
Se presenta las siguientes tablas de resultados para las fermentaciones en erlenmeyer empleando medio semisintetico y natural. Tabla 4.3 Resultados para medio semisintético S1
DIA
pH
°Brix
Rango + Rango -
Rango + Rango -
S2 N° m .o/m l
pH
°Brix
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
S3 N° m .o/m l
pH
°Brix
N° m .o/m l
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
0
6.35
6.32
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
6.76
6.72
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
6.36
6.34
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
1
4.69
4.62
20.1
19.5
3.4E+07
2.8E+07
4.82
4.76
20.1
19.7
4.4E+07
3.1E+07
4.60
4.58
20.1
19.3
3.7E+07
2.6E+07
4
3.93
3.65
9.3
8.9
6.1E+07
5.8E+07
3.77
3.60
9.4
8.2
6.6E+07
4.4E+07
3.73
3.67
8.5
8.1
8.8E+07
4.4E+07
5
3.94
3.66
8.7
7.8
1.1E+08
8.6E+07
3.78
3.62
8.3
7.3
9.6E+07
6.4E+07
3.75
3.70
7.8
6.8
1.5E+08
8.2E+07
6
3.94
3.65
8.2
7.1
1.5E+08
1.1E+08
3.80
3.64
7.5
6.6
1.1E+08
6.6E+07
3.77
3.72
6.9
6.2
1.1E+08
9.2E+07
8
3.98
3.68
6.5
6.0
7.5E+07
5.6E+07
3.83
3.67
6.8
6.2
6.9E+07
5.4E+07
3.80
3.76
6.6
6.0
7.9E+07
6.6E+07
11
3.96
3.72
6.1
5.8
6.3E+07
4.0E+07
3.86
3.71
6.5
6.0
5.7E+07
4.0E+07
3.84
3.80
6.3
5.5
6.5E+07
6.0E+07
Fuente: Autores Tabla 4.4 Resultados para medio natural N1
DI
N2
N3
pH
°Brix
N° m .o/m l
pH
°Brix
N° m .o/m l
pH
°Brix
N° m .o/m l
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
Rango + Rango -
0
3.56
3.53
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.61
3.58
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
3.54
3.52
20.0
20.0
0.0E+00
0.0E+00
1
3.68
3.66
17.3
12.0
2.7E+07
2.3E+07
3.71
3.69
19.9
17.5
3.1E+07
2.6E+07
3.67
3.66
19.5
17.5
2.5E+07
2.4E+07
4
3.82
3.80
6.7
6.6
4.5E+07
3.0E+07
3.72
3.70
7.0
6.9
4.8E+07
4.0E+07
3.73
3.72
6.6
6.5
5.1E+07
3.6E+07
5
3.94
3.90
6.6
6.4
1.1E+08
8.1E+07
3.90
3.86
6.6
6.4
1.0E+08
6.5E+07
3.88
3.85
6.6
6.4
1.2E+08
9.0E+07
6
3.95
3.94
6.9
6.7
1.1E+08
8.3E+07
3.88
3.86
7.0
6.9
9.8E+07
8.7E+07
3.87
3.85
7.0
6.7
1.3E+08
9.2E+07
8
3.96
3.95
6.7
6.2
1.0E+08
9.2E+07
3.89
3.88
6.9
6.5
1.3E+08
8.1E+07
3.89
3.88
6.8
6.6
9.4E+07
8.9E+07
11
3.98
3.96
6.6
6.0
1.2E+08
9.7E+07
3.91
3.89
6.7
6.3
1.5E+08
8.2E+07
3.89
3.88
6.7
6.5
1.1E+08
7.5E+07
Fuente: Autores El porcentaje de sacarosa medido para todos los medios en el día 11 de la fermentación fue del 0 %.
4
4.2.1 Porcentajes de variación de pH para los medios semisintético y natural Para calcular la variación de pH a lo largo de las fermentaciones, se presenta los porcentajes de variación de pH. El porcentaje de variación se calculó comparando dos valores en la fermentación, uno comparando el valor de pH del día final respecto al inicial y otro comparando el valor de pH mayor durante la fermentación respecto al pH más bajo en la misma. Los porcentajes de variación de pH calculados día a día se presentan en al Anexo A. Tabla 4.5 Porcentajes de variación de pH
MEDIO SEMISINTETICO
% DE VARIACION
MEDIO NATURAL
S1
S2
S3
N1
N2
N3
PH INICIAL – PH FINAL
39.3
43.7
39.8
11.8
8.3
10.2
PH MAYOR –PH MENOR
40.1
45.4
41.7
10.6
7.7
9.2
Fuente: Autores
4.3
RESULTADOS DE PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO
4.3.1 Determinación de velocidad de agitación para una fermentación alcohólica El Bioflo permite variar las velocidades de agitación. Se determinó una velocidad de agitación óptima para efectuar una fermentación alcohólica en el Biorreactor; con éste fin se configura el sistema de regulación de pH del Bioflo y se trabaja a diferentes velocidades de agitación, empleando agua y posteriormente con medio de cultivo para determinar la concentración de ácido cítrico y como base carbonato de calcio a utilizar. Tabla 4.6 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de operación a diferentes velocidades de agitación Agitación (R.P.M)
pH Inicial
pH Final
Tiempo de operación (min.)
50
7
3
22.20
50
3
5
32.11
75
7
3
21.00
75
3
5
25.09
100
7
3
18.08
5
100
3
5
24.00
Fuente: Autores A velocidad de agitación de 125 r.p.m. se presenta turbulencia y formación de espuma, lo cual no es deseable que se presente en el proceso de fermentación.
4.3.2 Determinación de la concentración de ácido y base Utilizando el medio de cultivo que presentó mayor variación de pH en las fermentaciones preliminares (Ver Tabla 4.5) se trabajó a diferentes concentraciones de ácido y base con funcionamiento del sistema de regulación de pH. Tabla 4.7 Resultados de volúmenes consumidos de ácido y base, y tiempo de operación a diferentes concentraciones CONCENTRACION
1N 5N
pH inicial
pH final
7
3
3
5
7
3
3
5
Volumen consumido (ml) Acido
Base
694
Tiempo de operación (min.) 115
870 435
195 75
600
142
Fuente: Autores
4.3.3 Fermentación preliminar en el Bioflo Los resultados de ésta fermentación respecto al uso del sistema de regulación de pH se presentan a continuación. Unicamente de manera preliminar se observó los consumos de ácido y base empleando el sistema de regulación de pH del Bioflo. El consumo total durante los 10 días de fermentación de ácido y base fueron respectivamente de: 600 ml de ácido cítrico 5 N y 1750 ml de carbonato de calcio 5N. Se observó que al transcurso de la fermentación se formó un precipitado debido a la baja solubilidad del Carbonato de calcio en el medio, presentando problemas para realizar conteo de microorganismos. Para solucionar dicho problema se implemento el uso de KOH. El comportamiento del crecimiento de microorganismos bajo el efecto del KOH 5 N como base fue positivo, presentando valores de crecimiento de 2.7 x10 7 m.o/ml hasta 3.9 x10 7 m.o/ml en los dos primeros días de fermentación y permite el uso de dicha base en las fermentaciones propuestas para el proyecto con fines de análisis.
6
4.4 ESTANDARIZACION DE METODOLOGIAS A continuación se presentan las calibraciones de los métodos de determinac ión de nitrógeno total y de azúcares reductores.
4.4.1 Calibración del método de determinación de nitrógeno total En el presente trabajo, se utilizó un equipo de digestión y destilación BUCHI, el cual provee una mayor exactitud en la determinación de nitrógeno respecto al equipo anteriormente usado por los otros trabajos de investigación referentes a la línea de fermentación de La Universidad de La Sabana. 4.4.1.1 Curva de calibración del método Kjeldahl con urea − Pesar en papel copia diferentes cantidades de urea previamente seca desde
0.005 g. hasta 0.5 g. Realizar un blanco, utilizando únicamente el papel para restar al resultado de los demás puntos y obtener el nitrógeno total.
− Seguir la metodología enunciada para la determinación de nitrógeno total. − Graficar el nitrógeno recuperado en función del peso de urea correspondiente.
La urea teóricamente contiene 46.62% de nitrógeno (Bonilla y Martínez, 1999, 40). Tabla 4.8 Resultados de calibración para método total de Kjeldahl UREA(g) 0.0051 0.0080 0.0100 0.0156 0.0202 0.0252 0.0503 0.0752 0.1006 0.1500 0.2003 0.2502 0.3006 0.3503 0.4006 0.5005
NITROGENO NITROGENO TEORICO(g) RECUPERADO(g) 0.002354 0.002318 0.003730 0.003643 0.004678 0.004638 0.007273 0.007067 0.009417 0.009329 0.011733 0.011480 0.023434 0.022960 0.035058 0.034230 0.046900 0.045710 0.069914 0.067580 0.093364 0.091210 0.116643 0.113300 0.140140 0.135500 0.163310 0.157300 0.186760 0.179900 0.233333 0.225900 P R O M E D IO % E R R O R M E T O D O = P R O M E D I O % R E C U P E R A C IO N = C O R R E L A C IO N T O D O S L O S D A T O S =
%ERROR
%RECUPERACIÓN
1.54 2.32 0.85 2.83 0.94 2.15 2.02 2.36 2.54 3.34 2.31 2.87 3.31 3.68 3.67 3.19
98.46 97.68 99.15 97.17 99.06 97.85 97.98 97.64 97.46 96.66 97.69 97.13 96.69 96.32 96.33 96.81
2.49 97.51 0.99999
Fuente: Autores
7
La gráfica de la curva de calibración correspondiente se presenta a continuación. Gráfica 4.1 Curva de calibración para el método total de Kjeldahl CURVA DE CALIBRACION METODO TOTAL 0.250000
0.200000
) g (
0.150000
O N E G O R T I N
0.100000
0.050000
0.000000 0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
UREA(g) Nitrógeno teórico (g)
Nitrógeno recuperado (g)
Fuente: Autores 4.4.1.2
Curva de calibración para etapa de destilación y titulación
− Preparar una solución madre de sulfato de amonio al 0.9428% donde 1 ml de la solución madre contiene 0.002 g. de nitrógeno.
− Tomar diferentes volúmenes de solución madre desde 2.5 ml hasta 90 ml incorporándolos en los tubos de vidrio para trabajar en el sistema BUCHI de destilación. Seguir el procedimiento para la destilación y titulación.
− Graficar el nitrógeno recuperado en función del volumen de solución madre del sulfato de amonio.
0.6
Tabla 4.9 Resultados de calibración para etapa de destilación y titulación del método Kjeldahl SOLUCION SULFATO 0.9428% (ml) 2.5 5.0 10.0 15.0 20.0 30.0 45.0 50.0 55.0 60.0 70.0 80.0 90.0
NITROGENO TEORICO(g)
NITROGENO RECUPERADO(g)
%ERROR
%RECUPERACION
0.005000 0.010000 0.020000 0.030000 0.040000 0.060000 0.090000 0.100000 0.110000 0.120000 0.140000 0.160000 0.180000
0.004858 0.009938 0.019870 0.029810 0.039750 0.059400 0.089220 0.098940 0.108800 0.117600 0.136800 0.156100 0.174900
2.84 0.62 0.65 0.63 0.63 1.00 0.87 1.06 1.09 2.00 2.29 2.44 2.83
97.16 99.38 99.35 99.37 99.38 99.00 99.13 98.94 98.91 98.00 97.71 97.56 97.17
PROMEDIO %ERROR METODO = PROMEDIO %RECUPERACION= CORRELACION TODOS LOS DATOS =
1.46 98.54 0.999939
Fuente: Autores Gráfica 4.2 Curva de calibración para destilación y titulación en método Kjeldahl C U R V A D E C A L I B R A C I O N P A R A D E S T I L A C IO N T I T U L A C I O N 0. 2
0.18
0.16
0.14
) g ( O N E G O R T I N
0.12
0. 1
0.08
0.06
0.04
0.02
0 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
SULFATO (ml) N i tr óg e n o t eó ri co ( g )
N i tr óg e n o r ec u pe ra d o ( g )
Fuente: Autores
10
El error del método total (digestión, destilación y titulación) es del 2.49%, el error para destilación y titulación es de 1.46%, por lo tanto el error para la etapa de digestión es de 1.03%.
4.4.2
Calibración del método de determinación de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon
Los trabajos anteriores en la línea de investigación de fermentación emplearon el método colorimétrico, el cual se diferencia en su fundamentación teórica pero tienen la misma finalidad. La diferencia más notable es que el método empleado en el presente trabajo permite fijar un error de exactitud. − Con la solución de azúcar invertido al 1% se realizó la titulación por el método
de Lane y Enyon descrito previamente. La titulación se trabajo para reducir 10 ml de solución Felhing, de donde se determina que 0.0545 g. de azúcar invertido reduce 10 ml de la solución Felhing.
− De acuerdo a lo anterior se fijan 5 volúmenes teóricos de titulación de 15, 20,
30, 40 y 50 mililitros y cada volumen debe contener 0.0545 g. de azúcar invertido, por lo cual se deben preparar a partir de la solución madre de azúcar invertido al 1%.
− Siguiendo el método enunciado para la titulación, se procede a determinar los
volúmenes reales en la titulación a las concentraciones teóricas establecidas. La concentración real de azúcar invertido se determina así: [ ] Azúcares reductores = g. de azúcar invertido que reducen 10 ml de Felhing(0.0545g) / Volumen de titulación en ml.
Tabla 4.10 Resultados de calibración para método de determinación de azúcares reductores. VOLUMEN CONCENTRACI CONCENTRACI TEORICO DE ÓN REAL DE VOLUMEN REAL ÓN DE SOLUCION DE SOLUCION DE DE SOLUCION SOLUCION DE % ERROR AZUCAR AZUCAR DE AZUCAR AZUCAR INVERTIDO INVERTIDO(g./ INVERTIDO (ml) INV.(g./ml) (ml) ml) 0.00363 15 0.00368 14.8 1.3 0.00272 20 0.00275 19.8 1.0 0.00182 30 0.00182 29.9 0.3 0.00136 40 0.00137 39.9 0.2 0.00109 50 0.00109 49.9 0.2 Fuente: Autores El porcentaje de error total del método es el promedio de los cinco puntos determinados y es de 0.6 %.
11
Gráfica 4.3 Curva de calibración del método de determinación de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon C A L IB R A C I O N M E T O D O D E D E T E R M I N A C IO N D E A Z U C A R E S R E D U C T O R E S 0.0040
0.0035 ) l m / g ( O D I T R E V N I R A C U Z A E D N O I C U L O S E D N O I C A R T E N C N O C
0.0030
0.0025
0.0020
0.0015
0.0010
0.0005
0.0000 0
10
20
30
40
50
60
V O L U M E N D E S O L U C I O N D E A Z U C A R I N V E R T I D O ( m i l i li tr o s ) V O LU M EN T EO R IC O (m l)
V O L UM E N R EA L(m l)
Fuente: Autores
4.5
RESULTADOS DE LAS FERMENTACIONES ALCOHOLICAS EN EL BIOFLO
A continuación se presentan los datos de las variables medidas durante el desarrollo de las fermentaciones con regulación de pH y sin regulación.
4.5.1
Datos de crecimiento de microorganismos
Para las cuatro fermentaciones, dos con regulación de pH y dos sin regulación del mismo, se presentan los datos de crecimiento determinados por el conteo cámara Neubauer Improved con los rangos de error de precisión respectivos. Se calculó de acuerdo a la formula enunciada en el procedimiento para conteo de microorganismos. Los triplicados realizados para el conteo de microorganismos en cada fermentación se presentan en el Anexo B.
12
Tabla 4.11 Resultados de crecimiento de microorganismos N°M.O/ml FERM. 1
N°M.O/ml FERM. 2
N°M.O/ml FERM. 1 SIN CONTROL DE PH
N°M.O/ml FERM. 2 SIN CONTROL DE PH
DIA
0 1 2 3 4 7 8 9 10
RANGO MENOR
RANGO MAYOR
RANGO MENOR
RANGO MAYOR
RANGO MENOR
RANGO MAYOR
RANGO MENOR
RANGO MAYOR
2.1E+07 9.8E+07 1.1E+08 1.4E+08 1.4E+08 1.2E+08 7.2E+07 6.8E+07 6.2E+07
2.4E+07 1.0E+08 1.2E+08 1.4E+08 1.4E+08 1.2E+08 7.7E+07 7.1E+07 6.5E+07
2.2E+07 1.0E+08 1.2E+08 1.4E+08 1.5E+08 1.1E+08 6.6E+07 6.3E+07 5.7E+07
2.5E+07 1.1E+08 1.3E+08 1.4E+08 1.5E+08 1.1E+08 7.0E+07 6.5E+07 5.8E+07
2.4E+07 7.1E+07 8.3E+07 9.4E+07
2.5E+07 7.4E+07 8.5E+07 9.7E+07
2.3E+07 7.5E+07 8.7E+07 9.9E+07
2.4E+07 7.8E+07 9.1E+07 1.0E+08
7.1E+07 6.6E+07 6.1E+07 5.2E+07
7.6E+07 6.9E+07 6.3E+07 5.5E+07
7.4E+07 6.8E+07 6.4E+07 5.5E+07
7.8E+07 7.0E+07 6.8E+07 5.8E+07
Fuente: Autores Las gráficas de crecimiento para cada fermentación se presentan a continuación con el fin comparativo de las mismas. Gráfica 4.4 Curvas de crecimiento de microorganismos para fermentaciones con control y sin control de pH. CURVAS DE CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS 1.0E+09
O R T I L I L I M R O P S A L U L E C ° N
1.0E+08
1.0E+07 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
TIEMPO(DÍAS)
N °M .O /M L F E R M . 1 N°M.O/ML FERM. 1 SIN CONTR OL
N °M .O /M L F E R M . 2 N°M.O/ML FERM. 2 SIN CONTR OL
Fuente: Autores
13
4.5.2
Datos de contenido de nitrógeno total en la biomasa
El nitrógeno determinado corresponde a la cantidad de nitrógeno celular por mililitro de fermento, utilizando la formula descrita en el procedimiento para el método Kjeldahl. De acuerdo a los volúmenes de titulación de HCL 0.94656 N, determinados por triplicado para cada día de la fermentación, la desviación estándar es cero (Ver Anexo B). De acuerdo a esto se tomó el porcentaje de error del método de determinación de nitrógeno total, que es de 2.49 %, para determinar los rangos de nitrógeno celular por mililitro. Tabla 4.12 Resultados de contenido de nitrógeno celular por mililitro FERM. 1 mg N / ml
FERM. 2 mg N / ml
FERM. 1 SIN CONTROL DE PH mg N / ml
FERM. 2 SIN CONTROL DE PH mg N / ml
DIA
0 1 2 3 4 7 8 9 10
RANGO INFERIOR
RANGO SUPERIOR
RANGO INFERIOR
RANGO SUPERIOR
RANGO INFERIOR
RANGO SUPERIOR
RANGO INFERIOR
RANGO SUPERIOR
0.0644 0.2257 0.2584 0.2906 0.3549 0.2906 0.2584 0.2257 0.1936
0.0676 0.2373 0.2716 0.3054 0.3731 0.3054 0.2716 0.2373 0.2034
0.0965 0.2257 0.2584 0.3228 0.3876 0.2906 0.2257 0.1936 0.1614
0.1015 0.2373 0.2716 0.3392 0.4074 0.3054 0.2373 0.2034 0.1696
0.0644 0.1936 0.2257 0.2584
0.0676 0.2034 0.2373 0.2716
0.0644 0.2257 0.2584 0.2906
0.0676 0.2373 0.2716 0.3054
0.1936 0.1936 0.1614 0.1614
0.2034 0.2034 0.1696 0.1696
0.2257 0.1936 0.1614 0.1614
0.2373 0.2034 0.1696 0.1696
Fuente: Autores Utilizando el rango para todos los días de las fermentaciones, se realizo la gráfica de contenido de nitrógeno celular por mililitro. Gráfica 4.5 Curva de nitrógeno celular por mililitro para fermentaciones con control y sin control de pH C O N T E N ID O
D E
N IT R O G E N O
C E L U L A R
0.46
0.41
0.36 O R T I L I L I M / O N E G O R T I N E D S O M A R G I L I M
0.31
0.26
0.21
0.16
0.11
0.06
0.01 0
1
2
3
4
5 6 T I E M P O ( D IA S )
F E R M . 2 m g N / m l F E R M . 1 S IN C O N T R O L D E P H m g N / m l
7
8
9
10
11
F E R M . 1 m g N / m l F E R M . 2 S IN C O N T R O L D E P H m g N / m l
Fuente: Autores
14
4.5.3
Datos de sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa
Debido a que todas las muestras tomadas se midieron a 20 °C no fue necesario realizar corrección con tablas a los datos obtenidos. Tabla 4.13 Resultados de toma de °Brix a 20°C D IA
F E R M .1 C O N REGULACION
FERM . 2 CON REGULACION
F E R M . 1 S IN REGULACION
F E R M . 2 S IN REGULACION
0 1 2 3 4 7 8 9 10
2 0 .0 1 7 .9 1 4 .1 1 0 .7 8 .2 7 .4 7 .0 6 .5 6 .2
2 0 .0 1 7 .5 1 4 .0 1 0 .1 8 .0 7 .2 6 .8 6 .4 6 .0
2 0 .0 1 8 .0 1 4 .7 1 1 .8
2 0 .0 1 7 .3 1 4 .1 1 0 .5
7 .7 7 .1 6 .8 6 .4
7 .3 6 .8 6 .4 6 .0
Fuente: Autores Gráfica 4.6 Curva de °Brix para fermentaciones con control y sin control de pH °Brix C ° 0 2 a x i r B °
20.0 18.0 16.0 14.0 12.0 10.0 8 .0 6 .0 4 .0 2 .0 0 .0 0
2
4
6
8
10
12
Tie mpo(día s )
F E R M .1 C O N R E G U LA C IO N F E R M . 1 S IN R E G U L A C IO N
F E R M . 2 C O N RE G ULA C IO N F E R M . 2 S IN R E G U LA C IO N
Fuente: Autores El porcentaje de sacarosa medido en el día 10 de cada fermentación fue de 0 % de sacarosa.
4.5.4
Datos de azúcares reductores residuales y contenido de etanol
Al final de cada fermentación se determinó la concentración de azúcares reductores. A manera de ejemplo para la fermentación 1 con control de pH se presenta el calculo: [ ] Azúcares reductores = 0.0545 g. Azúcar reductor / 40.8 ml fermento donde 40.8 es el volumen gastado en la titulación para dicha determinación. [ ] de azúcares reductores es igual a 0.00133 g/ml ó 0.133% p/v de azúcar reductor en
15
el fermento. El porcentaje de error del método de determinación de azúcares residuales es muy bajo (0.62%), por lo cual los datos obtenidos no tienen rango alguno. Tabla 4.14 Resultados de determinación de azúcares reductores residuales CONCENTRACION DE AZUCARES REDUCTORES EN g/ ml DIA 10
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2 FERMENTACION 1 FERMENTACION 2 CON CON SIN REGULACION SIN REGULACION REGULACION DE REGULACION DE DE PH DE PH PH PH
0.00133
0.00141
0.00157
0.00151
Fuente: Autores Para el contenido de etanol, la temperatura de trabajo fue de 15°C debido a la calibración del alcoholímetro. Para el día final de la fermentación se tiene que la para las fermentaciones con regulación de pH el contenido de alcohol es de 10 °G.L y para las fermentaciones sin regulación de pH el contenido de alcohol es de 8 °G.L. La toma de contenido de etanol no presento error de precisión ni error de exactitud en el método. Tabla 4.15 Resultados de contenido de etanol CONTENIDO DE ETANOL EN °G.L DIA 10
FERMENTACION 1 FERMENTACION 2 FERMENTACION 1 FERMENTACION 2 CON CON SIN REGULACION SIN REGULACION REGULACION DE REGULACION DE DE PH DE PH PH PH
10
10
8
8
Fuente: Autores
4.5.5
Volúmenes consumidos de ácido y base por el sistema de regulación de pH
El sistema de regulación de pH y sus acciones de control a lo largo de una fermentación consumen las siguientes cantidades de ácido cítrico 5N e hidróxido de potasio 5N respectivamente: − Para la fermentación 1 con control de pH los volúmenes fueron de 349 ml de
ácido y 234 ml de base.
− Para la fermentación 2 con control de pH los volúmenes fueron de 352 ml de
ácido y 259 ml de base. Los consumos día a día en cada fermentación se presentan en el Anexo B. Aunque se trabajó a concentraciones de ácido y base 5N, los volúmenes consumidos por el sistema de regulación no son iguales debido a que el KOH es una base fuerte y el ácido cítrico es una ácido débil con una disociación baja (K =
16
7.4 x 10-7) en relación con el KOH, lo que ocasiona un mayor consumo de ácido respecto a la base.
4.5.6
Variación de pH en las fermentaciones sin control de pH
Tomando la medida directamente del panel de control del Biorreactor se reportan los valores de pH día a día. Tabla 4.16 Variación de pH en una fermentación sin control de pH D IA 0 1 2 3 7 8 9 1 0
F E R M
E N 6 4 3 3 4 4 4 4
. . . . . . . .
T 8 2 9 9 0 0 0 1
A C IO 5 1 6 0 3 5 8 0
N
1
F E R M
E N 6 4 4 3 4 4 4 4
. . . . . . . .
T 7 3 0 9 0 0 0 0
A C IO 8 3 2 4 1 3 6 9
N
Fuente: Autores
17
2
CAPITULO 5 DISCUSION DE RESULTADOS En éste capítulo se analizan los resultados obtenidos del presente trabajo. Como parte importante, se encuentra el análisis del crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno, sólidos solubles totales, sacarosa, azúcares reductores totales y contenido de etanol entre una fermentación alcohólica con funcionamiento del sistema de regulación de pH en el Bioflo y otra fermentación a las mismas condiciones sin regulación de pH. También se discute la reproducibilidad de estas fermentaciones de acuerdo a las variables medidas en una fermentación alcohólica.
5.1
SELECCION DE MEDIO DE CULTIVO CON MAYOR RANGO FLUCTUACION DE PH
Para lograr observar el funcionamiento continuo del sistema de regulación de pH en el Bioflo y facilitar el desarrollo de la guía de manejo del sistema de bombas peristálticas, es necesario que de manera preliminar se determine que medio de cultivo presenta mayor fluctuación de pH a lo largo de una fermentación. El medio de cultivo seleccionado para trabajar en una fermentación alcohólica en el Bioflo bajo regulación de pH fue el preparado con base semisintética adicionando fosfato de amonio. De acuerdo a los resultados de los datos tomados diariamente de pH, se determinó que el medio presenta un porcentaje de variación entre el inicio y la finalización de la fermentación del 43.7%, como un porcentaje de variación entre el pH más alto y el menor del 45.4% (Ver Tabla 4.5). De acuerdo a la tendencia lineal del pH respecto al tiempo, se parametrizaron los primeros cuatro días de cada fermentación preliminar para determinar la mayor pendiente que indica un mayor rango de fluctuación de pH. La regresión lineal mediante el método de los mínimos cuadrados, determinó que el medio S2 presenta una pendiente negativa de 0.673 con una correlación de 0.905, siendo éste el de mayor pendiente respecto a los otros medios de cultivo analizados. En el Anexo A se incluyen los datos de parametrización para cada una de las fermentaciones preliminares.
69
Discusión de resultados
70
5.2 ANALISIS DE LAS PRUEBAS PRELIMINARES EN EL BIOFLO La velocidad de agitación seleccionada para trabajar una fermentación alcohólica con funcionamiento del sistema de regulación de pH en el Bioflo fue de 100 r.p.m., ya que de acuerdo a los tiempos de operación para efectuar una regulación dentro de unos rangos de pH de 7 hasta 3 y de 3 a 5 respectivamente, fueron de 18.08 minutos para regulación con ácido y 24 minutos para regulación con base. Los resultados son los mejores respecto al tiempo de operación del sistema de regulación de pH de acuerdo a las diferentes velocidades de agitación evaluadas(Ver Tabla 4.6). La agitación a 100 r.p.m. provee una homogenización apropiada para la toma de muestra en el seguimiento del crecimiento microbiano y logra una estabilización rápida del pH en el cultivo. Al trabajar a velocidad de agitación de 125 r.p.m. se presentó turbulencia en el medio, observándose exceso de burbujas de aire y formación de espuma, lo cual presentaría una tendencia a un metabolismo respiratorio en la levadura que no favorece una fermentación alcohólica. Se emplearon dos concentraciones diferentes de ácido y base para evaluar cual concentración es la indicada para usar en el sistema de regulación de pH. La concentración de ácido cítrico 5 N y de carbonato de calcio 5 N mejoran la operación del sistema de regulación de acuerdo a los volúmenes consumidos y el tiempo de acción y no se emplearon concentraciones mayores ya que la levadura puede ser afectada en su estado fisiológico. En un rango de regulación de pH son menores respecto a una concentración 1 N (Ver Tabla 4.7). El funcionamiento del Bioflo es apropiado bajo las concentraciones de 5 N y se evita excesos de volumen en una fermentación alcohólica, que dificultaría el manejo de las bombas peristálticas destinadas al sistema de regulación de pH. Ajustando aun más el funcionamiento del sistema de regulación de pH del Bioflo, se opto por utilizar KOH como base, porqué en la fermentación preliminar en el biorreactor el carbonato de calcio presentó problemas debido a la baja solubilidad del mismo, afectando la toma de muestras para realizar la determinación de recuento de microorganismos, y el uso del KOH presentó un crecimiento de microorganismos positivo y no influye en el metabolismo de la levadura.
5.3
ANALISIS DE METODOLOGIAS ESTANDARIZADAS
5.3.1 Análisis de la estandarización del método de determinación de nitrógeno total La metodología de determinación de nitrógeno por el método Kjeldahl tiene a lugar su estandarización en un equipo que permite obtener mayor confiabilidad en los datos obtenidos, disminuyendo errores del procedimiento. El porcentaje de error para el método total es del 2.49 % obteniendo una recuperación de nitrógeno de 97.51% para determinaciones de nitrógeno que contengan desde 0.002 g hasta 0.23 g del mismo. El error es menor a valores de nitrógeno de 0.0035 g y a medida que aumenta la cantidad de nitrógeno el error aumenta paulatinamente. El error para la etapa de destilación y
Discusión de resultados
71
titulación es de 1.46% y permite definir que el error en la etapa de digestión es de 1.03%. Respecto a las anteriores estandarizaciones realizadas en la línea de investigación, se presentó una notable mejora en cuanto al porcentaje de error del método. En la siguiente tabla se presenta la comparación de los porcentajes de error del método de determinación de nitrógeno total. Tabla 5.1 Porcentajes de error del método de determinación de nitrógeno total en diferentes estandarizaciones realizadas AUTORES
ALBA, D Y SIERRA, R. (EQUIPO KJElDAHL NACIONAL)
BONILLA, H Y MARTINEZ, V. (EQUIPO KJElDAHL NACIONAL)
MERCHAN, C Y CASTILLO, A. (EQUIPO KJElDAHL NACIONAL)
RAMIREZ, G Y PEDROZA, J. (EQUIPO BUCHI)
PORCENTAJE ERROR METODO TOTAL
6.26 %
7.45 %
8.00 %
2.49 %
PORCENTAJE ERROR ETAPA DESTILACION Y TITULACION
2.75 %
4.50 %
6.00 %
1.46 %
PORCENTAJE DE ERROR ETAPA DE DIGESTION
3.51 %
2.95 %
2.00 %
1.03 %
RANGO PARA DETERMINACION DE NITROGENO (g)
0.002 – 0.05
0.004 – 0.025
0.004 – 0.025
0.002 – 0.23
ESTANDARIZACION
Fuente: Tesis de línea de investigación en fermentación. Universidad de La Sabana. El equipo BUCHI reduce errores sistemáticos y aleatorios que se puedan presentar por parte del operario como también el error que presenta el equipo en el procedimiento, lo cual representa mayor confiabilidad en los datos obtenidos.
5.3.2 Análisis de la estandarización del método de determinación de azúcares reductores residuales Para la metodología de determinación de azúcares mediante la titulación de Lane y Enyon, el porcentaje de error de 0.62% indica que el método es apropiado y los datos obtenidos son confiables debido al bajo porcentaje de error. Cabe anotar que el método exige un estricto seguimiento en su procedimiento para que el error sea mínimo. Las anteriores estandarizaciones utilizaron el método colorimétrico el cual se basa en una curva de calibración y una estimación lineal para determinar la concentración de azúcar reductor. La determinación de azúcares por titulación es alternativo y no es comparable con el método anteriormente trabajado en cuanto al error del método. Pero cabe recalcar que debido al bajo error presentado, el método empleado en el presente proyecto puede ser utilizado para posteriores análisis en la línea de investigación y lograr una mejora en su procedimiento.
Discusión de resultados
5.4
72
ANALISIS DE FERMENTACION CON REGULACION DE PH RESPECTO A UNA FERMENTACION SIN REGULACION DE PH
Para efectos de análisis se discute el comportamiento de las variables medidas a lo largo de las fermentaciones con regulación y sin regulación de pH en el Bioflo, comparando con los antecedentes presentados por los anteriores trabajos de investigación realizados en el biorreactor.
5.4.1 Crecimiento de microorganismos En la siguiente tabla se presenta los valores de mayor número de microorganismos durante la totalidad de cada una de las fermentaciones realizadas en el Bioflo. Tabla 5.2 Mayor crecimiento de microorganismos en fermentaciones en el Bioflo FERMENTACIONES
1 CON REGULACION DE PH
2 CON REGULACION DE PH
1 SIN REGULACION DE PH
2 SIN REGULACION DE PH
NUMERO DE MICROORGANISMOS / MILILITRO
1.4 E+08
1.5 E+08
9.5 E+07
1.0 E+08
DESVIACION ESTANDAR
2.5 E+06
1.0 E+06
1.6 E+06
1.6 E+06
Fuente: Autores Observando las gráficas de crecimiento se tiene que las fermentaciones realizadas con regulación de pH a valor de 4.5, temperatura de 25°C y agitación a 100 r.p.m. presentan un mayor crecimiento de microorganismos respecto a las fermentaciones sin regulación de pH. El crecimiento en las fermentaciones con regulación de pH es 47.15% - 50.20% mayor respecto a las que no regulan el pH, debido a que al no regular el pH, hay una tendencia a la producción de metabolitos secundarios (ácido cítrico, ácido málico y otros), los cuales acidifican el medio impidiendo una mayor producción de biomasa y etanol, pero con un consumo de sólidos solubles similar para ambas fermentaciones, comportamiento observado en la variación de pH que presentan las fermentaciones sin utilizar la regulación de pH (Ver Tabla 4.16); al inicio de la fermentación se tiene un pH de 6.85 y al día 1 el pH disminuye a un valor de 4.21 y para las fermentaciones que utilizan el sistema de regulación, el pH permanece constante a un valor de 4.5, fijado desde el inicio del proceso. Para fermentaciones alcohólicas desarrolladas en el biorreactor por los anteriores trabajos de la línea de investigación, controlando únicamente la variable temperatura, el mayor crecimiento microbiano a 25 °C fue de 1.4E+08 y a 30 °C fue de 7.6E+07. Al desarrollar una fermentación regulando el pH a 4.5 se obtiene un crecimiento 6.60% mayor respecto a una fermentación a temperatura constante de 25 °C, pero significativa respecto a una temperatura constante de 30 °C al ser un 97.50% mayor el crecimiento en la fermentación a 25 °C y pH de 4.5. El comportamiento que se observa en la comparación de este parámetro, indica que a 25 °C el crecimiento de microorganismos se favorece ya que es la temperatura óptima para el desarrollo de una levadura. También se observa que al regular el pH esta tendencia de mayor crecimiento se
Discusión de resultados
73
beneficia levemente ya que el pH fijado a 4.5 difiere del pH óptimo para el desarrollo de la levadura en una fermentación, el cual es de 3.5 y fue ajustado al inicio de las fermentaciones que no controlan el pH a lo largo del proceso (Aleixandre, Noviembre de 1998). Otro factor que favorece el crecimiento de microorganismos es el medio de cultivo, ya que el extracto de levadura es el medio que más provee de requerimientos nutricionales a la levadura, respecto al preparado a base de peptona utilizado por fermentaciones realizadas en el Bioflo. Las fermentaciones desarrolladas en el presente trabajo mantuvieron una agitación constante mientras que los antecedentes presentados solo realizan agitación antes de tomar la muestra. Gráfica 5.1 Comparación del mayor crecimiento de microorganismos para distintas fermentaciones en el Bioflo. 2.0E+08 1.5E+08
1.5E+08
1.4E+08 7.6E+07
m.o por ml 1.0E+08
5.0E+07
TEMPERATURA 25°C Y PH 4.5 TEMPERATURA 25°C TEMPERATURA 30°C
0.0E+00 CRECIMIENTO
Fuente: Autores 5.4.2 Contenido de nitrógeno en la biomasa Los datos de contenido de nitrógeno que se presenta en la siguiente tabla corresponden a los días en que se obtuvo el mayor crecimiento de microorganismos en las fermentaciones en el Bioflo bajo las condiciones ya establecidas. Tabla 5.3 Mayor contenido de nitrógeno en fermentaciones en el Bioflo FERMENTACIONES
FERM. 1 CON REGULACION DE PH
FERM. 2 CON REGULACION DE PH
FERM. 1 SIN REGULACION DE PH
FERM. 2 SIN REGULACION DE PH
RANGOS DE NITROGENO MILIGRAMOS DE NITROGENO / MILILITRO
0.3549 – 0.3731
0.3876 – 0.4074
0.2584 – 0.2716
0.2906 – 0.3054
Fuente: Autores De acuerdo a los rangos de contenido de nitrógeno, para las fermentaciones con regulación de pH la diferencia es de un 3.7% y para las de sin regulación la diferencia es del 6.5%, diferencias calculadas tomando los datos más cercanos de cada rango. Los parámetros determinados en las fermentaciones realizadas presentan reproducibilidad debido a la similitud en sus datos y sus porcentajes de diferencia son bajos, teniendo en cuenta que se trata de un sistema biológico. Se observa una tendencia de un menor contenido de nitrógeno en las fermentaciones que no regulan el pH. El contenido de nitrógeno para las fermentaciones con regulación de pH es entre 33.37% - 37.34% mayor que el contenido de nitrógeno para las fermentaciones sin regulación de pH.
Discusión de resultados
74
Para las fermentaciones desarrolladas en el Bioflo por los anteriores trabajos de investigación, controlando únicamente la variable temperatura, el nitrógeno en la biomasa para el día donde se presenta el máximo contenido, a 25 °C fue de 0.2649 mg/ml –0.3110 mg/ml y para 30°C fue de 0.1934 mg/ml - 0.2245 mg/ml. El contenido de nitrógeno es mayor para una fermentación con regulación de pH en un 21.50 % respecto a una fermentación con temperatura de 25 °C y un 67.00 % mayor respecto a una fermentación con temperatura de 30 °C. Estos porcentajes son amplios debido a que el medio que más provee de requerimientos nutricionales y favorece la producción de biomasa es el preparado a base de extracto de levadura respecto al preparado a base de peptona utilizado por los anteriores trabajos de investigación; respecto a la fermentación a 30 °C es mucho mayor porqué al trabajar a 25 °C se favorece el crecimiento de la levadura ya que es la temperatura óptima para su desarrollo. Según los resultados de contenido de nitrógeno en la biomasa, se confirma la tendencia del crecimiento de microorganismos en una fermentación alcohólica, observando que al regular el pH la concentración de microorganismos concuerda con el contenido de nitrógeno determinado siendo este mayor respecto a la fermentación que no regula pH. Nuevamente se establece que la temperatura y la regulación de pH son determinantes para que el crecimiento de microorganismos sea más eficiente. Para efecto de balance entre contenido de nitrógeno celular y el conteo de microorganismos se analiza el contenido de nitrógeno en miligramos por célula para cada fermentación. El contenido de nitrógeno por célula presenta significativas fluctuaciones para los análisis del día cero (0) debido a que en la determinación de nitrógeno se pudo haber cometido errores en el método, específicamente en la centrifugación de la muestra y retiro del sobrenadante para obtener únicamente las levaduras presentes, ya que la cantidad de biomasa al inicio de cada fermentación es baja y dificulta el análisis de nitrógeno en la muestra. Concretamente se descartó el dato del día 0 para la fermentación 2, ya que la determinación de nitrógeno para todas las fermentaciones en el día 0 fueron tomadas 30 minutos después de inocular la levadura al medio y el resultado debe ser similar, por lo cual este dato presentó un error en el procedimiento de la toma de muestra. En la siguiente tabla se presenta el análisis a partir de los valores de las Tablas 4.11 y 4.12. Tabla 5.4 Rangos de contenido de nitrógeno por célula C O N T E N I D O D E N IT R O G E N O ( m g ) / C E L U L A FERM.1
FERM. 2
F E R M . 1 S IN C O N T R O L DE PH
F E R M . 2 S IN C O N T R O L DE PH
RANGOS
RANGOS
RANGOS
RANGOS
D IA
0 1 2 3 4 7 8 9 10
2 .8 E -0 9 2 .2 E -0 9 2 .0 E -0 9 2 .2 E -0 9 2 .4 E -0 9 2 .5 E -0 9 2 .9 E -0 9 3 .3 E -0 9 3 .1 E -0 9
Fuente: Autores
3 .0 E -0 9 2 .3 E -0 9 2 .1 E -0 9 2 .3 E -0 9 2 .6 E -0 9 2 .6 E -0 9 3 .0 E -0 9 3 .4 E -0 9 3 .2 E -0 9
4 .1 E -0 9 2 .1 E -0 9 2 .0 E -0 9 2 .4 E -0 9 2 .6 E -0 9 2 .6 E -0 9 2 .8 E -0 9 3 .0 E -0 9 2 .8 E -0 9
4 .3 E -0 9 2 .2 E -0 9 2 .1 E -0 9 2 .5 E -0 9 2 .7 E -0 9 2 .7 E -0 9 3 .0 E -0 9 3 .2 E -0 9 2 .9 E -0 9
2 .6 E -0 9 2 .6 E -0 9 2 .8 E -0 9 2 .6 E -0 9
2 .8 E -0 9 2 .7 E -0 9 3 .0 E -0 9 2 .8 E -0 9
2 .7 E -0 9 3 .0 E -0 9 3 .1 E -0 9 2 .8 E -0 9
2 .9 E -0 9 3 .1 E -0 9 3 .2 E -0 9 2 .9 E -0 9
2 .7 E -0 9 2 .8 E -0 9 2 .7 E -0 9 3 .0 E -0 9
2 .9 E -0 9 2 .9 E -0 9 2 .8 E -0 9 3 .2 E -0 9
2 .9 E -0 9 2 .9 E -0 9 2 .5 E -0 9 2 .9 E -0 9
3 .1 E -0 9 3 .0 E -0 9 2 .7 E -0 9 3 .0 E -0 9
Discusión de resultados
75
Se observa una tendencia a un menor contenido de nitrógeno por célula durante los primeros días de las fermentaciones que regulan pH, ya que el pH interactua con el estado fisiológico de la levadura, comportamiento reflejado en el conteo de microorganismos. Durante la fase estacionaria de crecimiento no se observan fluctuaciones del contenido de nitrógeno por célula para cada una de las fermentaciones. De acuerdo a los valores de contenido de nitrógeno por célula para los días donde se tiene el mayor crecimiento de microorganismos (día 4 para fermentación con regulación de pH y día 3 para fermentación sin regulación de pH), el contenido de nitrógeno por célula es mayor en 8.14 % en una fermentación sin regulación de pH respecto a una fermentación con pH regulado. De manera concreta, una levadura que se desarrolla en una fermentación sin regulación de pH tiende a una mayor cantidad de nitrógeno que una que se desarrolla en una fermentación a pH regulado. En la siguiente tabla se presenta los rangos de porcentaje peso a peso de nitrógeno por célula en cada una de las fermentaciones desarrolladas. Tabla 5.5 Rangos de porcentaje peso a peso de nitrógeno por célula % P /P N I T R O G E N O / C E LU L A FERM.1
FERM . 2
RANGOS
RANGOS
D IA
0 1 2 3 4 7 8 9 10 PROMEDIOS
1 1 .1 6 8 .5 2 8 .0 1 8 .7 3 9 .5 6 9 .6 5 1 1 .3 3 1 2 .7 6 1 1 .9 8 1 0 .1 9
1 1 .7 3 8 .9 5 8 .4 2 9 .1 7 1 0 .0 5 1 0 .1 4 1 1 .9 1 1 3 .4 1 1 2 .5 9 1 0 .7 1
1 6 .0 9 8 .0 4 7 .7 6 9 .2 4 1 0 .0 6 1 0 .0 8 1 1 .0 4 1 1 .8 5 1 0 .9 6 9 .8 8
1 6 .9 2 8 .4 5 8 .1 6 9 .7 1 1 0 .5 7 1 0 .6 0 1 1 .6 0 1 2 .4 5 1 1 .5 2 1 0 .3 8
F E R M . 1 S IN C O N T R O L F E R M . 2 S IN C O N T R O L DE PH DE PH RANGOS
RANGOS
1 0 .2 9 1 0 .1 8 1 1 .0 1 1 0 .2 5
1 0 .8 2 1 0 .7 0 1 1 .5 7 1 0 .7 7
1 0 .7 3 1 1 .5 6 1 2 .0 5 1 0 .9 7
1 1 .2 8 1 2 .1 5 1 2 .6 6 1 1 .5 3
1 0 .6 6 1 0 .8 3 1 0 .5 3 1 1 .8 2 1 0 .7 0
1 1 .2 1 1 1 .3 9 1 1 .0 6 1 2 .4 2 1 1 .2 4
1 1 .4 0 1 1 .3 5 9 .9 4 1 1 .1 9 1 1 .1 5
1 1 .9 8 1 1 .9 3 1 0 .4 5 1 1 .7 6 1 1 .7 2
Fuente: Autores De acuerdo a los promedios obtenidos de toda la marcha fermentativa, se observa que el porcentaje de nitrógeno por célula es mayor en un rango del 8.15 % - 8.18 % de una fermentación sin regulación de pH respecto a la fermentación con regulación de pH a 4.5. Estos porcentajes de diferencia que se observan en la anterior comparación, se deben a la directa incidencia de la variable pH en cuanto a su comportamiento en la fermentación sin regulación de pH durante el proceso fermentativo, ya que los valores de pH en las fase de crecimiento presentan un valor cercano al pH óptimo (3.05 – 3.50) para el desarrollo de la levadura (Aleixandre, Noviembre de 1998 ). La variación de pH en el desarrollo de una fermentación sin regulación de pH se observa en la Tabla 4.16. El porcentaje de nitrógeno por célula tiende a ser más estable a lo largo de la fermentación sin regulación de pH debido a que la levadura como sistema biológico, maneja de manera natural el pH, lo que no sucede al regular el pH debido a que el valor fijado de 4.5 desde el inicio de la fermentación esta alejado del rango óptimo de pH para el desarrollo de la levadura en una fermentación alcohólica y no es un manejo natural del pH.
Discusión de resultados
76
5.4.3 Sólidos solubles totales y porcentaje de sacarosa El comportamiento del consumo de sólidos solubles totales durante las fermentaciones desarrolladas fue similar tanto para la fermentación con regulación de pH como para las que no regulan (Ver Gráfica 4.6). En el día 4 para las fermentaciones que no regulan pH no se tuvo registro de datos (día festivo), pero la tendencia del consumo de sólidos solubles es semejante para todas las fermentaciones, y dicho dato (día 4) también tiene un comportamiento similar a pesar de no registrarse así en la Gráfica 4.6. En el día final de las fermentaciones el porcentaje de sacarosa es cero, es decir toda la sacarosa fue desdoblada por la levadura en su metabolismo; se observa que los sólidos solubles totales disminuyen hasta un valor aproximado a 6.0 °Brix ya que la levadura en la última etapa de las fermentaciones termina de consumir la sacarosa presente en el medio quedando en el mismo sólidos solubles diferentes a la sacarosa y compuestos que la misma levadura produce. El mayor consumo de sólidos solubles se dió durante los primeros cuatro días de cada fermentación debido a que la levadura se encuentra en la fase exponencial de crecimiento, fase en la cual existe mayor demanda de nutrientes para su desarrollo y producción de metabolitos con una tasa de crecimiento de 0.019 h-1 y un número de duplicaciones para las fermentaciones que regulan pH de n=2.6 y para las que no regulan pH de n=2.0, disminuyendo los sólidos solubles a valores aproximados de 8.0 °Brix. De aquí al final de la fermentación la levadura se encuentra en la fase estacionaria de crecimiento, debido a que los nutrientes empiezan a agotarse y la levadura se encuentra en un metabolismo de mantenimiento, y el consumo de sólidos solubles pasa de 8.0 °Brix hasta valores de 6.0 °Brix. De acuerdo al comportamiento del consumo de sólidos solubles en las fermentaciones con y sin regulación de pH, se observa que el pH no influye en dicho consumo, pero los resultados presentados por anteriores trabajos en fermentaciones en el Bioflo muestran que existe un bajo consumo de sólidos solubles totales llegando hasta valores de 13.1 °Brix para una fermentación alcohólica a 30 °C y de 11.7 °Brix para una fermentación alcohólica a 25 °C. Estas fermentaciones no presentaron agitación constante durante la marcha fermentativa, por lo cual existe menos oxígeno disuelto en el medio y las levaduras destinan el consumo de sólidos solubles al proceso de fermentación. A la vez estas fermentaciones realizan un ajuste inicial de pH a valor de 3.5 y por lo tanto la levadura no requiere de una producción alta de metabolitos secundarios para acidificar el medio, donde la variación de pH durante la marcha fermentativa se encuentra en un rango de 3.5 hasta 2.9, presentando un consumo de sólidos solubles bajo para dicha producción de metabolitos.
5.4.4 Azúcares reductores residuales y contenido de etanol Las fermentaciones con regulación de pH presentan una menor cantidad de azúcares reductores al final de la fermentación respecto a las fermentaciones sin regulación. La cantidad de azúcares reductores al final de las fermentaciones es mínima, con valores muy próximos a cero (0.00133 g/ml – 0.00157 g/ml), concordando con el contenido de sacarosa que fue de cero. De acuerdo a los resultados (Ver Tabla 4.14) la fermentación con regulación de pH tiene una concentración de azúcares reductores 11% menor que la concentración en la fermentación sin regulación de pH, indicando que hay un mayor
Discusión de resultados
77
consumo de azúcares por las levaduras en una fermentación con pH regulado para la producción de etanol, y en producción de biomasa. Respecto al contenido de etanol al final de cada fermentación, se obtiene mayor grado alcohólico en una fermentación con regulación de pH, un 25 % mayor que una fermentación sin regulación de pH, de acuerdo a los resultados presentados en el numeral 4.5.4. La menor producción de alcohol en una fermentación sin regulación de pH se debe a que en la fase inicial del proceso existe una mayor demanda energética por parte de la levadura para la producción de metabolitos secundarios que disminuyen el pH de un valor de 6.8 hasta valores aproximados de 4.0, lo que causa una disminución en el grado alcohólico. En si la levadura tuvo la necesidad de acidificar el medio disminuyendo la producción de metabolitos primarios (etanol) y con tendencia a la producción de metabolitos secundarios (ácidos orgánicos). Al regular el pH a lo largo de una fermentación la levadura se adaptó a las condiciones dadas para producir mayor cantidad de alcohol y a su vez consumir los azúcares proporcionados obteniendo menor cantidad de azúcares reductores residuales al final de la fermentación. La levadura en su metabolismo se adapta mejor al mantener constantes las variables en el proceso tales como pH y temperatura, a pesar de no manejar un pH óptimo. Esto se confirma de acuerdo a los antecedentes presentados en fermentaciones realizadas en el Bioflo sin regulación de pH, donde la fermentación desarrollada a 30 °C el porcentaje de azúcares reductores finales fue del 10.60 % y el contenido alcohólico fue de 6.2 °G.L y para una fermentación a 25 °C el porcentaje de azúcares reductores finales fue de 6.30 % y el contenido alcohólico fue del 7.0 °G.L. De acuerdo al contenido de alcohol, al utilizar el medio semisintético con extracto de levadura, dicho contenido fue mayor respecto a las fermentaciones que utilizaron el medio a base de peptona debido a que el medio con extracto de levadura provee a las células los nutrientes necesarios y adecuados para su crecimiento y producción de metabolitos (Alba y Sierra, 1999, 120). El balance de consumo de azúcares expresa de mejor manera las diferencias presentadas entre una fermentación con regulación de pH y sin regulación. 5.4.4.1
Balance de masa de azúcar consumido en las fermentaciones
El balance de azúcares representa la cantidad de azúcares consumidos en respiración, fermentación y el transformando en biomasa en una fermentación alcohólica. AZUCAR ADICIONADO AL MEDIO = AZUCAR CONSUMIDO EN RESPIRACION Y PRODUCTOS SECUNDARIOS + AZUCAR CONSUMIDO EN FERMENTACION + AZUCAR TRANSFORMADO EN BIOMASA + AZUCAR NO FERMENTADO O RESIDUAL Para efecto de expresar los cálculos se presentan a continuación tomando como ejemplo la fermentación 1 con regulación de pH: −
Azúcar consumido en fermentación: Se calcula a partir de la reacción general de la fermentación presentada en la revisión bibliográfica. Esta reacción no incluye los metábolitos secundarios producidos que no se tendrán en cuenta para facilitar los
Discusión de resultados
78
cálculos debido a que se encuentran en cantidades mínimas. De la fermentación 1 con regulación de pH se tiene 10 °G.L de alcohol. Esto se expresa como 10 mililitros de alcohol en 100 mililitros de mezcla etanol – agua. Para el fermento en el volumen de 10 litros del Bioflo se tiene: 10000 ml Fermento x 0.10 ml (alcohol/ml fermento) = 1000 ml alcohol La densidad de alcohol puro a 15 °C es 0.793 g / ml Gramos de alcohol = 1000 ml alcohol x 0.793 g / ml = 793 gramos de alcohol producidos en la fermentación. De la reacción general de fermentación se tiene: Gramos de glucosa consumida en la fermentación = Gramos de alcohol producido x 180 g glucosa / 92 g de alcohol = 793 g alcohol x 1.956 g glucosa / g alcohol =
1551 g glucosa consumido en la fermentación −
• •
Azúcar transformado en biomasa: La levadura Saccharomyces cerevisae contiene un 45 % de carbono en base seca (Bonilla y Martínez, 1999, 89). El peso de una levadura seca activa se puede hallar a partir del recuento inicial y la cantidad de la levadura que se inoculo para iniciar la fermentación así: Para 10 litros de medio se inoculo 6 g de levadura seca El recuento inicial de microorganismos se obtiene de la Tabla 4.11 para el día cero de fermentación y es: 2.26 x 1011 m.o
•
El peso de una levadura seca es igual a 6 g levadura inoculada/ 2.26 x 10 11 levaduras = 2.65 x 10 -11 g / levadura.
•
Gramos de carbono en una levadura = 2.65 x 10 -11 g / levadura 1.19 x 10-11 g de Carbono / levadura.
x 0.45 =
El azúcar transformado en biomasa implica tomar el mayor recuento de microorganismos durante cada fermentación; para el caso de la fermentación 1con regulación de pH se presenta el día cuarto. De acuerdo a esto se tiene: 1.41 x 1012 microorganismos y el contenido de carbono en éste conteo es: Gramos de carbono final = 1.19 x 10 -11 g de Carbono / levadura x 1.41 x 1012 levadura = 16.77 g Carbono
•
•
•
−
Gramos de carbono producido = Gramos de Carbono final – Gramos de Carbono iniciales = 16.77 g Carbono – (6 g x 0.45) = 16.77 g C – 2.7 g C = 14.07 g Carbono producido en una fermentación. El contenido de carbono en la glucosa representa el 40 %. Los gramos de glucosa que se transforman en biomasa son iguales: 14.07 g C x g glucosa /0.40 g carbono = 35.17 gramos glucosa transformados en Biomasa. Azúcar no fermentado o residuales: De acuerdo a la Tabla 4.14 la concentración de azúcares reductores residuales en la fermentación 1 con regulación de pH fue de
Discusión de resultados
79
0.00133 gramos de azúcar residual / mililitro de fermento. Para 10000 mililitros de fermento = 13.30 gramos de azúcar residuales. Para el balance total el azúcar adicionado al medio para cada fermentación llevada a 20 ° Brix es de 2100 g. La conversión del azúcar adicionado para expresarlo como glucosa es: 2100 g sacarosa x (360 g glucosa/342 g sacarosa)= 2210.50 g Glucosa. El balance general queda así: 2210.50 g glucosa adicionado = Azúcar consumido en respiración y productos secundarios + 1551 g de azúcar consumido en fermentación + 35.17 g de azúcar transformada en Biomasa + 13.30 g de azúcar residual Azúcar consumido en respiración y productos secundarios = 611.03 gramos La siguiente tabla presenta el balance de consumo de azúcares para cada una de las fermentaciones realizadas, junto con los porcentajes de consumo. Tabla 5.6 Balance de azúcares en fermentaciones en el Bioflo para 10 litros de medio −
FERMENTACION
FERMENTACION 1 CON REGULACION DE PH
FERMENTACION 2 CON REGULACION DE PH
FERMENTACION 1 SIN REGULACION DE PH
FERMENTACION 2 SIN REGULACION DE PH
Cantidad de azúcar en gramos
%azúcar Consumido
Cantidad de azúcar en gramos
%azúcar Consumido
Cantidad de azúcar en gramos
%azúcar Consumido
Cantidad de azúcar en gramos
%azúcar Consumido
AZUCAR CONSUMIDO EN FERMENTACION
1551
70.16
1551
70.16
1241
56.14
1241
56.14
AZUCAR TRANSFORMADO EN BIOMASA
35.17
1.59
35.14
1.58
19.48
0.88
22.03
0.99
AZUCAR RESIDUAL
13.30
0.60
14.10
0.63
15.70
0.71
15.10
0.68
AZUCAR CONSUMIDO EN RESPIRACION Y PRODUCTOS SECUNDARIOS
611.03
27.65
610.26
27.63
934.32
42.26
932.37
42.17
CONSUMO AZUCARES
AZUCAR ADICIONADO
2210.50
2210.50
2210.50
2210.50
Fuente : Autores De acuerdo a los porcentajes de azúcar consumido en fermentación, no se alcanzo el rendimiento reportado en la bibliografía del 95% debido a que la levadura tuvo una tendencia a consumir azúcares para el proceso de respiración y la producción de metabolitos secundarios. El rendimiento se acerca más al teórico al regular el pH y es menor al no regular el pH debido a la acidificación que se presenta en el proceso. También este rendimiento no fue el máximo debido a que se manejo un medio semisintético en las fermentaciones y dicho rendimiento se basa en requerimientos nutricionales óptimos para la levadura proveídos por medios naturales como lo es un mosto de uva.
Discusión de resultados
80
El azúcar consumido en respiración y productos secundarios es un 52.80 % mayor en una fermentación sin regulación de pH respecto a una que no regula pH, lo que indica que en la fermentación sin regulación se producen una mayor cantidad de productos secundarios diferentes al etanol, incluyendo el CO 2 producido por respiración, productos secundarios que pueden ser tóxicos e inhiben el desarrollo de microorganismos, lo cual se observa en el conteo de microorganismos en cada fermentación y en la cantidad de azúcar transformado en biomasa, estableciendo que una fermentación con regulación de pH presenta mejor eficiencia en la producción de etanol y crecimiento de microorganismos, observando que el consumo fue del 70.16 % de sus azúcares para la producción de etanol y la fermentación sin regulación de pH solo consume el 56.14 % del azúcar adicionado para la fermentación. Si todo el azúcar adicionado al medio se hubiera consumido, sin quedar azúcar residual al final de la fermentación entonces este azúcar se repartiría en los porcentajes de consumo de azúcar respectivos para fermentación, transformación en biomasa y el consumido en respiración y productos secundarios. Tomando como ejemplo la fermentación 1 con regulación de pH, el azúcar consumido en fermentación aumentaría e implica un leve aumento en el grado alcohólico final. De acuerdo a los valores de la Tabla 5.5 el azúcar consumido en fermentación llegaría a un valor de 1561 gramos, resultando en un grado alcohólico de 10.06 °G.L, determinado por el cálculo de azúcar consumido en fermentación explicado anteriormente, que implica un aumento solo del 0.60 % en el grado alcohólico, lo que indica que prácticamente todo el azúcar adicionado fue consumido en el proceso. Para las fermentaciones sin regulación de pH el azúcar consumido en fermentación llegaría a 1250 gramos, resultando en un grado alcohólico de 8.06 °G.L ó sea un aumento del 0.75 %. Como antecedente en fermentaciones realizadas en el Bioflo por anteriores trabajos de investigación se tienen los siguientes porcentajes de consumo de azúcares para fermentaciones a 25 °C y 30 °C sin regulación de pH y sin agitación. Tabla 5.7 Porcentajes de consumo de azúcares en diferentes fermentaciones en el Bioflo CONSUMO DE AZUCARES
FERMENTACION A 30 °C
FERMENTACION A 25 °C
% DE AZUCAR CONSUMIDO EN FERMENTACION
42.54
54.12
% AZUCAR TRANFORMADO EN BIOMASA
0.86
1.23
% AZUCAR CONSUMIDO EN RESPIRACION Y PRODUCTOS SECUNDARIOS
16.59
15.00
% AZUCAR RESIDUAL
40.00
29.50
Fuente: Tesis de línea de investigación en fermentación. Universidad de La Sabana.
Discusión de resultados
81
De acuerdo a los datos que se observan en la Tabla 5.6, el porcentaje de azúcar consumido en una fermentación trabajada a 25 °C es similar al obtenido en una fermentación trabajada a 25 °C con agitación y sin regulación de pH (Ver Tabla 5.5); Al agitar el consumo es mayor en un 3.53 % respecto a la fermentación a 25 °C sin agitación. Respecto a la fermentación a 30 °C la diferencia aumenta en dicho consumo, siendo un 31.96 % mayor el consumo en la fermentación a 25 °C sin regulación de pH y con agitación. Esta diferencia es mayor debido a que la temperatura de 30 °C disminuye la producción de alcohol y la levadura pierde capacidad de desdoblar los azúcares (Alvarez, 112, 1991), lo que se explica en la gran cantidad de azúcar no consumido o residual en estas fermentaciones. Al regular el pH a un valor de 4.5, bajo agitación constante de 100 r.p.m. y temperatura de 25 °C, aumenta notablemente la cantidad de azúcar consumido en fermentación, ya que el consumo es un 29.63 % mayor respecto a una fermentación a 25 °C sin agitación y sin regulación de pH. Respecto a una fermentación a 30 °C bajo las condiciones descritas para 25 °C el consumo de azúcar en fermentación es un 64.92 % mayor. Este significativo aumento del consumo de azúcar se debe a la regulación del pH ya que la levadura se adapta mejor a la marcha fermentativa, tolerando concentraciones mayores de alcohol y también a que el medio semisintético con extracto de levadura proporcionó todos los requerimientos nutricionales en cantidades suficientes para su metabolismo. Otra diferencia notable es el consumo de azúcares en respiración, el cual es mayor en fermentaciones con agitación, regulando o no regulando el pH y a temperatura de 25 °C respecto a las fermentaciones que controlan únicamente la variable temperatura realizadas por los trabajos anteriores en la línea de investigación. Esto se debe a que la agitación tiende a aumentar la cantidad de oxígeno disuelto en el medio y la levadura continua empleando el metabolismo respiratorio. Gráfica 5.2 Comparación de porcentajes de consumo de azúcares para diferentes fermentaciones en el Bioflo d o m u s n o s c e r e a d c s ú e z a j a t n e c r o P
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Fermentación a 25 °C
Fermentación a 30 °C
% Azúcar consumido en fermentación % Azúcar consumido en respiración
Fuente: Autores
Fermentaciön a 25 °C, con agitación y pH regulado a 4.5
% Azúcar transformado en biomasa % Azúcar residual
Discusión de resultados
82
5.4.5 Comportamiento del pH en fermentaciones sin regulación de pH En las fermentaciones sin regulación de pH no se realizó un ajuste inicial de pH. El pH del medio al inicio de la fermentación es de 6.8, cercano a la neutralidad y se acidifica hasta el tercer día de fermentación, bajando hasta un valor de 3.9. Esta baja de pH obedece a la formación de productos por parte de la levadura que acidifican el medio, productos tales como ácidos orgánicos provenientes del metabolismo (ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico), pero a partir del tercer día en adelante el pH se estabiliza en valores de 4.0, debido al efecto buffer por parte del medio utilizado, ya que el extracto de levadura es un medio complejo, que contiene proteínas, aminoácidos, peptidos que ejercen dicho efecto en el medio.
5.5
ANALISIS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO
Al trabajar en el biorreactor una prueba inicial en sistema continuo para una fermentación alcohólica, la configuración de las bombas peristálticas para entrada y salida, se realiza de acuerdo a la guía presentada en el Capitulo 4. Lo normal en el funcionamiento del Bioflo es que a una misma velocidad fijada para las bombas que alimentan de medio y cosechan no existan diferencias en sus caudales, sin importar el flujo que se alimente o desaloje del biorreactor o sin importar los puertos a los cuales se conecten los tubos de silicona (de igual diámetro para salida y entrada). Las diferencias presentadas en los flujos hacen que en el desarrollo del cultivo continuo preliminar llevado a cabo, el flujo de cosecha sea mayor que el flujo de alimentación de medio al sistema (Ver Tabla 4.2), disminuyendo el volumen contenido en el vaso del Bioflo a razón de 300 ml diarios aproximadamente, sin cumplir con el sistema quimiostatico en el cual el volumen del sistema debe ser constante. Para trabajar de manera correcta el Bioflo en sistema continuo como quimiostato se deben corregir las diferencias presentadas en los caudales de entrada y salida a un mismo porcentaje de velocidad de las bombas peristálticas. Confirmando el comportamiento presentado en el desarrollo de la fermentación en cultivo continuo, se optó por determinar los flujos de entrada y de salida a diferentes velocidades de la bomba peristálitica empleando como flujo agua, estableciendo que dichos flujos no son iguales a la misma velocidad configurada en la bomba peristáltica. En si, el cultivo continuo en estado quimiostatico no se lleva a cabo debido a la diferencia entre los flujos de alimentación de medio y de cosecha o salida de flujo. Para cumplir con el quimiostato se debe equilibrar las velocidades de las bombas de acuerdo a las diferencias existentes (Ver Tabla 4.2) de tal forma que el medio de alimentación desplace, en un volumen igual, al medio agotado en el Biorreactor para conseguir una producción de células de forma continua. A causa de este comportamiento y para efectos de estudio de lo que involucraría un cultivo en sistema continuo se empleó el modelo matemático basado en la ecuación de Monod para determinar la concentración
Discusión de resultados
83
de substrato limitante dada una tasa de dilución y evaluar el crecimiento de células en el quimiostato bajo condiciones de equilibrio. De acuerdo a la teoría, la tasa de dilución en el quimiostato es igual a la tasa de crecimiento en la que se presenta el equilibrio. En la tabla C.1 del Anexo C, se calculó cada una de las tasas de crecimiento para un cultivo cerrado, y de la teoría se tiene: D=µ en equilibrio Para que se presente el estado de equilibrio en el quimiostato es necesario fijar una tasa de dilución a partir de las tasas de crecimiento calculadas a largo de la fase exponencial en una fermentación con regulación de pH. Para el desarrollo del modelo de Monod, la tasa de dilución se fijo a un valor de D = 0.011 h -1, que proviene del intervalo de 24-48 horas de un cultivo cerrado, dado que en el primer día de cultivo la tasa de crecimiento es máxima con un valor de 0.062 h -1 y posterior a las 48 horas de cultivo la tasa de crecimiento disminuye notablemente hasta 0.003 h -1. La tasa de dilución fijada favorece el equilibrio de forma que no se presente una disminución en la población de microorganismos debido a tasas de dilución muy altas, que hace que el cultivo sea lavado del quimiostato, o una deficiencia en la alimentación de substrato por tasas de dilución muy bajas ya que el nutriente no llega con suficiente rapidez y las células pueden morir por inanición, extremos que no se deben presentar en el desarrollo de un cultivo continuo. De acuerdo a la Gráfica 4.4 el valor de µmax se encuentra dentro del intervalo de tiempo de cultivo de 0-24 horas, ya que después de 24 horas de fermentación viene un estado de desaceleración, por lo tanto µmax = 0.062 h -1 (tasa de crecimiento para primer intervalo de Tabla C.1). De la teoría se tiene el modelo matemático:
se = Ks x D / µmax – D donde Ks para Saccharomyces cerevisiae y como substrato limitante glucosa es 2.5E-5 g/ml (Trevan, 1990, 85). se es la concentración de substrato limitante en el equilibrio. De acuerdo a estos valores en la ecuación se tiene: se = 2.5E-5 g/ml x 0.011 h-1 / 0.062 h-1 – 0.011 h-1 La concentración de substrato limitante en el equilibrio para el desarrollo de un cultivo en sistema continuo se = 5.4E-6 g/ml. Para un volumen de 10000 ml en el biorreactor se tiene una cantidad de 0.05 gramos de glucosa a lo largo del desarrollo de un sistema continuo. La concentración de células para el estado de equilibrio en el sistema continuo se define por la siguiente ecuación: xe = Y ( SR – se ) El valor de SR es la concentración original de substrato en el medio y equivale 0.22 g/ml (Ver Tabla 5.6) y el valor de se es el ya calculado. Y es el factor de rendimiento para el substrato limitante: Y = gramos de biomasa producida / gramos de substrato consumido
Discusión de resultados
84
De la Tabla 5.6 (datos del balance de azúcares en fermentaciones en un cultivo cerrado) se obtiene el valor de gramos de substrato consumido, el cual es el azúcar adicionado menos el azúcar residual = 0.21 g / ml. Los gramos de biomasa producida se obtienen de la diferencia entre los gramos finales de biomasa y los gramos iniciales de biomasa (gramos de levadura inoculada). De acuerdo a esto para la fermentación 1 con regulación de pH los gramos finales de biomasa por mililitro son: 2.6E-11 g/levadura x 1.4E8 levaduras = 3.64E-3 g / ml y los gramos iniciales de biomasa corresponden a lo inoculado que fueron 6.00 gramos / 10000 mililitros = 6E-4 g / ml. El valor de Y es igual a 0.014. La concentración de células es: xe = 0.014 ( 0.21 g/ml – 5.4E-6 g/ml ) El valor de xe es igual a 2.9E-3 gramos de biomasa / ml. Al dividir este valor entre el peso de una levadura (2.6E-11g/levadura) se tiene el número de levaduras presente en el equilibrio que es igual a 1.1E8 levaduras / ml. En un sistema continuo de fermentación se puede variar la tasa de dilución y el valor de -1 -1 µmax teórico para la Saccharomyces cerevisiae esta comprendido entre 0.3 h – 0.5 h (Tuite, 1991, 125) para condiciones ideales de crecimiento. Para complementar el análisis del modelo matemático, se evalúa el comportamiento de se y xe a partir de valores ideales de µmax = 0.5 h -1 y tasa de dilución muy altas D = 0.4 h -1. La siguiente tabla ilustra los diferentes valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilución y µmax. Tabla 5.8 Valores de se y xe a diferentes valores de tasa de dilución y µmax para una fermentación en sistema continuo. VARIABLES EN SISTEMA CONTINUO
µmax
= 0.062 h -1
µmax
= 0.5 h -1
µmax
= 0.5 h -1
D = 0.011 h-1
D = 0.011h-1
D = 0.4 h-1
se (g / ml)
5.4E-6
5.6E-7
1.0E-4
xe (g / ml)
2.9E-3
2.9E-3
2.9E-3
Fuente: Autores De acuerdo a la tabla anterior la concentración de microorganismos permanece constante variando la tasa de dilución en un amplio rango, pero la concentración de substrato residual en el equilibrio se aumenta 177 veces al aumentar notablemente la tasa de dilución, desde 0.011 h -1 hasta 0.4 h-1 y un valor ideal de µmax = 0.5 h -1. En el rango presentado de tasas de dilución la concentración de microorganismos permanece constante y la concentración de substrato conserva un valor muy bajo, aumentando a medida que se aumenta la tasa de dilución.
CONCLUSIONES
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•
•
•
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El desarrollo de una fermentación alcohólica bajo regulación de pH a 4.5 y temperatura constante de 25 °C en el Bioflo 3000 M1227 presentó un mayor rendimiento en cuanto a variables tales como crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno en la biomasa y contenido de etanol. El crecimiento de microorganismos, el contenido de nitrógeno y el contenido de etanol fueron un 48.67%, 35.35% y un 25.00% respectivamente mayor con respecto a una fermentación alcohólica sin regulación de pH y a temperatura de 25 °C. El control de la variable pH presentó una incidencia directa en el desarrollo de una fermentación alcohólica mejorando el rendimiento de acuerdo a la formación de producto y crecimiento de la levadura. El medio de cultivo que presentó el mayor porcentaje de variación de pH a lo largo de una fermentación en erlenmeyer fue el preparado a base de extracto de levadura con fosfato de amonio y su rango de variación de pH fue del 43.7% entre el pH inicial y el pH final. El ácido y base empleados en el funcionamiento del sistema de regulación de pH del biorreactor Bioflo fue el ácido cítrico e hidróxido de potasio a una concentración de 5 N cada uno, ya que permiten un óptimo funcionamiento del sistema de regulación de pH en cuanto al tiempo de operación empleado para regular diferentes rangos de pH. De acuerdo a los parámetros determinados en una fermentación con regulación de pH, el crecimiento de microorganismos, contenido de nitrógeno en la biomasa, consumo de sacarosa, variación de sólidos solubles, contenido de azúcares reductores residuales y contenido de etanol son reproducibles en el biorreactor ya que presentan similitud en las dos fermentaciones realizadas. Se elaboró una guía complementaria de manejo y funcionamiento del sistema de bombas peristálticas del Bioflo, dirigida al uso del sistema de regulación de pH y para el manejo de flujos de entrada y salida en el biorreactor a diferentes velocidades de flujo. Se estandarizó la metodología de determinación de contenido de nitrógeno total empleando un equipo de digestión – destilación BUCHI B-316 el cual presentó un error del método total del 2.49% y un error de la etapa de destilación y titulación del 1.46%, trabajando una curva de calibración para rangos de contenido de nitrógeno entre 0.002 g – 0.23 g. Se realizó la estandarización del método de determinación 85
Conclusiones
86
de azúcares reductores por titulación de Lane y Enyon, el cual presentó un error del 0.62% para un rango de determinación de azúcares entre 0.109% - 0.363% (%p/v). •
El biorreactor Bioflo no permite el montaje de un cultivo continuo en estado quimiostático debido a diferencias notables en los flujos de entrada y de salida.
RECOMENDACIONES Después de haber realizado el presente trabajo se sugiere: •
•
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•
Trabajar un fermentación con pH regulado de 3.5, que de acuerdo a la teoría es el pH óptimo en el desarrollo de una fermentación alcohólica, comparando sus resultados con los obtenidos en el presente trabajo. Trabajar con el Biorreactor una fermentación alcohólica con diferentes substratos para observar el efecto que tiene sobre el sistema de regulación de pH del Bioflo. Además de los parámetros evaluados en una fermentación alcohólica, se sugiere determinar la acidez a lo largo de la fermentación, relacionando esta variable con la incidencia del pH, con o sin regulación de pH. Trabajar con el Biorreactor una fermentación alcohólica con agitación midiendo la variable de oxigeno disuelto, observando su comportamiento en el proceso fermentativo. El biorreactor debe someterse a una revisión técnica con el fin de establecer si existe falla técnica en cuanto al uso de las bombas peristálticas en flujos de entrada y de salida en el Bioflo y lograr dar continuidad al trabajo de fermentaciones en sistema continuo. El biorreactor posee un sistema de configuración de medidores de niveles los cuales permiten determinar flujos de entrada y de salida del Bioflo y puede ser estudiado. Respecto al trabajo en los laboratorios de la Universidad, se sugiere habilitar el trabajo por lo menos los días Sábado con el fin de dar continuidad a un proceso que requiera control diario. Para efectos de eficiencia y economía en el uso del agua para la bomba de refrigeramiento se recomienda instalar un sistema de recirculación de agua. Adaptar un sistema de esterilización para el vaso del Bioflo dentro del laboratorio de Operaciones Unitarias con el fin de evitar posibles accidentes y mayor eficiencia de la esterilización.
87
ANEXO A DATOS DE FERMENTACIONES PRELIMINARES Tabla A.1 Datos de pH medido a 25°C DIA 0 1 4 5 6 8 11
MEDIO SEM ISINTETICO S2 C A B C A
A
S1 B
6.33 4.62 3.74 3.75 3.73 3.76 3.80
6.35 4.68 3.95 3.96 3.96 4.00 3.97
6.32 4.67 3.68 3.69 3.69 3.73 3.75
6.72 4.76 3.75 3.76 3.78 3.81 3.83
6.76 4.81 3.71 3.74 3.76 3.79 3.83
6.74 4.80 3.59 3.61 3.63 3.66 3.70
6.34 4.58 3.69 3.73 3.75 3.79 3.83
S3 B
C
6.36 4.60 3.67 3.70 3.72 3.76 3.80
6.35 4.59 3.73 3.75 3.77 3.80 3.83
A
N1 B
C
3.53 3.66 3.80 3.91 3.94 3.95 3.98
3.55 3.68 3.81 3.94 3.95 3.96 3.96
3.56 3.68 3.82 3.90 3.95 3.96 3.97
MEDIO NATURAL N2 A B C 3.58 3.70 3.70 3.88 3.86 3.88 3.89
3.60 3.71 3.72 3.86 3.87 3.89 3.90
3.61 3.69 3.72 3.90 3.88 3.89 3.91
A
N3 B
C
3.52 3.66 3.73 3.85 3.85 3.89 3.89
3.54 3.67 3.72 3.88 3.85 3.88 3.89
3.54 3.67 3.73 3.86 3.87 3.89 3.88
A
N3 B
C
Tabla A.2 Datos de conteo tomado a 20°C DIA 1 4 5 6 8 11
A
S1 B
13.0 24.0 40.0 49.0 22.0 18.0
11.0 23.0 34.0 62.0 28.0 18.0
MEDIO SEMISINTETICO S2 C A B C A 13.0 24.0 43.0 48.0 29.0 26.0
18.0 20.0 25.0 25.0 22.0 16.0 -1
13.0 27.0 33.0 40.0 28.0 23.0
A 20.0 20.0 9.3 8.1 7.4 6.4 6.1
B 20.0 20.0 8.1 7.2 6.5 6.3 6.1
14.0 19.0 38.0 39.0 24.0 19.0
11.0 36.0 52.0 37.0 27.0 25.0
MEDIO NATURAL N2 A B C
S3 B
C
A
N1 B
C
15.0 24.0 55.0 43.0 28.0 24.0
12.0 19.0 31.0 39.0 32.0 26.0
9.8 18.0 35.8 34.0 38.5 49.1
9.4 15.1 34.1 37.4 36.7 39.8
11.0 11.9 45.8 45.1 40.3 42.1
11.6 18.3 29.8 36.3 52.2 60.4
12.1 15.7 42.8 35.2 35.1 46.2
10.4 18.5 29.0 39.6 37.4 33.2
9.6 14.4 35.1 35.8 35.9 42.6
10.1 20.5 46.8 47.5 36.4 35.6
9.5 17.4 44.4 48.1 37.9 30.4
C 20.0 17.5 6.7 6.4 6.9 6.6 6.4
A 20.0 20.1 6.9 6.6 6.9 6.5 6.3
B 20.0 18.0 7.0 6.4 6.9 6.7 6.5
C 20.0 18.1 7.0 6.5 7.0 6.9 6.7
A 20.0 17.5 6.5 6.5 6.8 6.6 6.5
B 20.0 19.5 6.6 6.4 6.7 6.6 6.5
C 20.0 18.6 6.6 6.6 7.0 6.8 6.7
Factor de Dilución 10 Tabla A.3 Datos de sólidos solubles totales a 20°C DIA 0 1 4 5 6 8 11
A 20.0 20.0 8.9 8.8 8.3 6.0 5.8
B 20.0 19.5 9.1 8.0 7.3 6.2 6.0
C 20.0 19.9 9.3 8.0 7.3 6.5 6.1
C 20.0 19.7 9.0 8.0 7.2 6.8 6.5
A 20.0 19.8 8.2 7.0 6.4 6.2 5.5
B 20.0 20.0 8.5 7.1 6.3 6.0 5.8
C 20.0 19.3 8.1 7.9 7.0 6.6 6.3
A 20.0 12.2 6.6 6.6 6.7 6.2 6.0
B 20.0 14.3 6.7 6.4 6.8 6.6 6.5
88
Tabla A.4 Porcentajes de variación de pH día a día Tabla A.5 Datos de parametrización de pH respecto a tiempo en cultivos INTERVALO DE DIAS
MEDIO SEMISINTETICO
MEDIO NATURAL
S1 26.30 18.60 0.26 0.26 1.05 0.26 46.73
S2 28.90 23.10 0.54 0.54 0.80 1.06 54.94
S3 27.70 19.30 0.81 0.54 0.80 1.05 50.20
N1 3.38 3.81 2.88 0.76 0.25 0.25 11.33
N2 2.77 0.27 4.58 0.25 0.51 0.25 8.63
N3 3.96 1.63 3.48 0.00 0.77 0.00 9.84
MEDIOS
S1
S2
S3
N1
N2
N3
PENDIENTE
0.555
0.673
0.578
0.066
0.042
0.053
CORRELACION
0.895
0.905
0.893
0.983
0.861
0.935
0_1 1_4 4_5 5_6 6_8 8_11 SUMATORIA DE %
preliminares
89
ANEXO B
DATOS DE FERMENTACIONES EN EL BIOFLO Tabla B.1 Datos de conteo en cámara Neubauer Improved P A R T IC U L A S D IA 0 1 2 3 4 7 8 9 1 0
P A R T IC U L A S
F E R M E N T A C IO N 1 C O N R E G U L A C I O N D E P H C O N T A D A S E N C A M A R A N E U B A U E R I M P R O V E D T R IP L IC A D O P R O M E D I O 1 2 3 8 .5 9 .2 9 .5 9 .0 7 4 0 .2 3 9 .5 4 1 .1 4 0 .2 7 4 4 .5 4 2 .3 4 5 .3 4 4 .0 3 5 4 .7 5 5 .8 5 4 .5 5 5 .0 0 5 6 .3 5 7 .9 5 6 .1 5 6 .7 7 4 8 .5 4 6 .2 4 7 .3 4 7 .3 3 2 8 .8 5 2 9 .3 3 0 .8 2 9 .6 5 2 7 .2 2 7 .5 2 8 .5 2 7 .7 3 2 5 .4 2 4 .8 2 5 .8 2 5 .3 3 F E R M E N T A C IO N C O N T A D A S E N
T R IP L IC A D O
D IA 0 1 2 3 4 7 8 9 1 0
P A R T IC U L A S D IA 0 1 2 3 7 8 9 1 0
P A R T IC U L A S D IA 0 1 2 3 7 8 9 1 0
2 C O N R E G U L A C I O N C A M A R A N E U B A U E R
4 4 5 5 4 2 2 2
1 9 2 6 6 8 5 7 6 3
. . . . . . . .
3 3 2 9 2 1 1 4
2 9 . 4 3 4 5 5 5 5 9 4 4 2 7 2 5 2 3
5 .5 .8 .8 .3 .3 .8 .3 .1
D E P H I M P R O V E D
P R O 3 9 . 4 2 4 7 5 7 5 8 4 4 2 6 2 5 2 2
8 .8 .1 .3 .5 .1 .2 .5 .8
4 4 5 5 4 2 2 2
M E D I O 9 . 2 6 6 8 4 7 5 3
A
2 0 °C N 0 0 1 0 0 1 1 0 0
A
. . . . . . . . .
5 8 5 7 9 1 0 6 5
1 0 5 0 9 5 2 8 0
2 0 °C
D E S V I A C IO N E S T A N D A R
4 3 .8 7 .4 0 .4 3 .9 0 .5 3 .0 3 .6 3 .1 0
F E R M E N T A C I O N 1 S IN R E G U L A C IO N D E P H C O N T A D A S E N C A M A R A N E U B A U E R I M P R O V E D T R IP L IC A D O P R O M E D I O 1 2 3 9 .5 9 .8 1 0 .2 9 .8 3 2 8 .8 2 8 .6 2 9 .5 2 8 .9 7 3 3 .5 3 4 .2 3 3 .1 3 3 .6 0 3 8 .2 3 7 .5 3 8 .8 3 8 .1 7 2 8 .2 3 0 .1 2 9 .5 2 9 .2 7 2 6 .8 2 6 .2 2 7 .4 2 6 .8 0 2 5 .1 2 4 .8 2 4 .2 2 4 .7 0 2 1 .3 2 0 .8 2 2 .1 2 1 .4 0 F E R M E N T A C I O N 2 S IN R E G U L A C IO N D E P H C O N T A D A S E N C A M A R A N E U B A U E R I M P R O V E D T R IP L IC A D O P R O M E D I O 1 2 3 9 .2 9 .4 9 .7 9 .4 3 3 0 .1 3 0 .5 3 1 .2 3 0 .6 0 3 5 .5 3 4 .8 3 6 .3 3 5 .5 3 3 9 .8 4 0 .5 4 1 .1 4 0 .4 7 3 0 .2 2 9 .7 3 1 .5 3 0 .4 7 2 8 .1 2 7 .5 2 7 .3 2 7 .6 3 2 6 .5 2 7 .1 2 5 .8 2 6 .4 7 2 2 .8 2 3 .1 2 1 .9 2 2 .6 0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
A
. . . . . . . . .
4 6 6 7 4 5 8 4 3
0 0 6 8 0 9 0 2 0
2 0 °C N 0 0 0 0 0 0 0 0
A
. . . . . . . .
3 4 5 6 9 6 4 6
5 7 6 5 7 0 6 6
2 0 °C N 0 0 0 0 0 0 0 0
. . . . . . . .
2 5 7 6 9 4 6 6
5 6 5 5 3 2 5 2
90
Tabla B.2 Datos de °Brix
D IA 0 1 2 3 4 7 8 9 10
F E R M E N T A C I O N 1 C O N R E G U L A C IO N D E P H ° B R IX A 2 0 ° C T R IP L IC A D O P R O M E D IO 1 2 3 20 20 20 2 0 .0 1 8 .2 1 7 .8 1 7 .9 1 8 .0 1 4 .3 14 1 4 .2 1 4 .2 1 0 .6 1 0 .8 1 0 .6 1 0 .7 8 8 .2 8 .4 8 .2 7 .4 7 .4 7 .5 7 .4 7 7 7 7 .0 6 .5 6 .6 6 .5 6 .5 6 .1 6 .2 6 .2 6 .2
D E S V IA C IO N E S T A N D A R
0 0 0 0 0 0 0 0 0
.0 .2 .1 .1 .2 .0 .0 .0 .0
0 1 5 2 0 6 0 6 6
F E R M E N T A C I O N 2 C O N R E G U L A C IO N D E P H ° B R IX A 2 0 ° C T R IP L IC A D O
D IA 0 1 2 3 4 7 8 9 10
D IA 0 1 2 3 7 8 9 10
D IA 0 1 2 3 7 8 9 10
1 20 1 7 .5 1 4 .1 1 0 .1 7 .8 7 .2 6 .8 6 .4 6
2 20 1 7 .4 1 4 .2 1 0 .1 8 .2 7 .3 6 .9 6 .3 5 .9
P R O M E D IO 3 20 1 7 .6 1 3 .9 1 0 .2 8 .1 7 .2 6 .8 6 .4 6
2 0 .0 1 7 .5 1 4 .1 1 0 .1 8 .0 7 .2 6 .8 6 .4 6 .0
F E R M E N T A C IO N 1 S IN R E G U L A C I O N D E P H ° B R IX A 2 0 ° C T R IP L IC A D O P R O M E D IO 1 2 3 20 20 20 2 0 .0 18 18 18 1 8 .0 1 4 .6 1 4 .6 1 4 .8 1 4 .7 1 1 .5 1 2 .2 1 1 .8 1 1 .8 7 .4 7 .8 7 .9 7 .7 7 .2 7 7 .2 7 .1 6 .7 6 .8 6 .8 6 .8 6 .4 6 .3 6 .4 6 .4 F E R M E N T A C IO N 2 S IN R E G U L A C I O N D E P H ° B R IX A 2 0 ° C T R IP L IC A D O P R O M E D IO 1 2 3 20 20 20 2 0 .0 1 7 .2 1 7 .4 1 7 .3 1 7 .3 1 4 .2 1 4 .2 14 1 4 .1 1 0 .5 1 0 .1 1 0 .8 1 0 .5 7 .2 7 .2 7 .4 7 .3 6 .8 6 .9 6 .8 6 .8 6 .4 6 .4 6 .5 6 .4 6 6 .1 6 6 .0
D E S V IA C IO N E S T A N D A R
0 0 0 0 0 0 0 0 0
.0 .1 .1 .0 .2 .0 .0 .0 .0
0 0 5 6 1 6 6 6 6
D E S V IA C IO N E S T A N D A R
0 0 0 0 0 0 0 0
.0 .0 .1 .3 .2 .1 .0 .0
0 0 2 5 6 2 6 6
D E S V IA C IO N E S T A N D A R
0 0 0 0 0 0 0 0
.0 .1 .1 .3 .1 .0 .0 .0
0 0 2 5 2 6 6 6
91
Tabla B.3 Datos de contenido de nitrógeno F E R M E N T A C IO N 1 C O N R E G U L A C IO N D E P H D E T E R M IN A C I Ó N D E N I T R O G E N O C E L U L A R VO LUM EN
D IA 0 1 2 3 4 7 8 9 10
1 0 .1 0 .3 5 0 .4 0 .4 5 0 .5 5 0 .4 5 0 .4 0 .3 5 0 .3
D E T IT U L A C I O N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N / T R IP L IC A D O (m l)
2 0 .1 0 .3 5 0 .4 0 .4 5 0 .5 5 0 .4 5 0 .4 0 .3 5 0 .3
3 0 .1 0 .3 5 0 .4 0 .4 5 0 .5 5 0 .4 5 0 .4 0 .3 5 0 .3
P R O M E D IO 0 0 0 0 0 0 0 0 0
.1 .3 .4 .4 .5 .4 .4 .3 .3
0 5 0 5 5 5 0 5 0
D E S V IA C IO N E S T A N D A R
0 0 0 0 0 0 0 0 0
.0 .0 .0 .0 .0 .0 .0 .0 .0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
F E R M E N T A C IO N 2 C O N R E G U L A C IO N D E P H D E T E R M IN A C I Ó N D E N I T R O G E N O C E L U L A R VO LUM EN
D IA 0 1 2 3 4 7 8 9 10
1 0 .1 5 0 .3 5 0 .4 0 .5 0 .6 0 .4 5 0 .3 5 0 .3 0 .2 5
D E T IT U L A C I O N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N / T R IP L IC A D O (m l)
2 0 .1 5 0 .3 5 0 .4 0 .5 0 .6 0 .4 5 0 .3 5 0 .3 0 .2 5
3 0 .1 5 0 .3 5 0 .4 0 .5 0 .6 0 .4 5 0 .3 5 0 .3 0 .2 5
P R O M E D IO 0 0 0 0 0 0 0 0 0
.1 .3 .4 .5 .6 .4 .3 .3 .2
5 5 0 0 0 5 5 0 5
D E S V IA C IO N E S T A N D A R
0 0 0 0 0 0 0 0 0
.0 .0 .0 .0 .0 .0 .0 .0 .0
0 0 0 0 0 0 0 0 0
F E R M E N T A C IO N 1 S IN R E G U L A C IO N D E P H D E T E R M IN A C I Ó N D E N I T R O G E N O C E L U L A R VO LUM EN
D IA 0 1 2 3 7 8 9 10
1 0 .1 0 .3 0 .3 5 0 .4 0 .3 0 .3 0 .2 5 0 .2 5
D E T IT U L A C I O N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N / T R IP L IC A D O (m l)
2 0 .1 0 .3 0 .3 5 0 .4 0 .3 0 .3 0 .2 5 0 .2 5
3 0 .1 0 .3 0 .3 5 0 .4 0 .3 0 .3 0 .2 5 0 .2 5
P R O M E D IO 0 0 0 0 0 0 0 0
.1 .3 .3 .4 .3 .3 .2 .2
0 0 5 0 0 0 5 5
D E S V IA C IO N E S T A N D A R
0 0 0 0 0 0 0 0
.0 .0 .0 .0 .0 .0 .0 .0
0 0 0 0 0 0 0 0
F E R M E N T A C IO N 2 S IN R E G U L A C IO N D E P H D E T E R M IN A C I Ó N D E N I T R O G E N O C E L U L A R VO LUM EN
D IA 0 1 2 3 7 8 9 10
1 0 .1 0 .3 5 0 .4 0 .4 5 0 .3 5 0 .3 0 .2 5 0 .2 5
D E T IT U L A C I O N H C L 0 . 9 4 6 5 6 N / T R IP L IC A D O (m l)
2 0 .1 0 .3 5 0 .4 0 .4 5 0 .3 5 0 .3 0 .2 5 0 .2 5
3 0 .1 0 .3 5 0 .4 0 .4 5 0 .3 5 0 .3 0 .2 5 0 .2 5
P R O M E D IO 0 0 0 0 0 0 0 0
.1 .3 .4 .4 .3 .3 .2 .2
0 5 0 5 5 0 5 5
D E S V IA C IO N E S T A N D A R
0 0 0 0 0 0 0 0
.0 .0 .0 .0 .0 .0 .0 .0
0 0 0 0 0 0 0 0
Tabla B.4 Consumo de ácido y base por sistema de regulación de pH 92
FERMENTACION 1 ACIDO KOH 5 N CITRICO 5 N (ml) (ml) 88 65 25 34 25 16 31 18 89 50 25 14 31 19 35 18
DIA 1 2 3 4 7 8 9 10
FERMENTACION 2 ACIDO KOH 5 N CITRICO 5 N (ml) (ml) 91 72 28 38 26 15 32 18 98 62 21 15 30 19 26 20
Tabla B.5 Datos de azúcares reductores DIA
FERMENTACION 1
FERMENTACION 2
FERMENTACION 1 SIN CONTROL DE PH
FERMENTACION 2 SIN CONTROL DE PH
VOLUMEN DE TITULACION (ml)
10
41.0
40.8
40.5
38.2
38.5
39.2
35.0
34.5
34.7
36.5 35.5. 36.0
Tabla B.6 Calculo de tasa de multiplicación y n° de generaciones de acuerdo a # de células INTERVALO DE DIAS
N° de Generaciones FERMENTACION 1
TASA DE MULTIPLICACION
N° de Generaciones FERMENTACION 2
TASA DE MULTIPLICACION
0-24 0-48 0-72 0-96
2.1 2.5 2.6 2.6
0.09 0.05 0.04 0.03
2.2 2.5 2.6 2.6
0.09 0.05 0.04 0.03
N° de Generaciones FERMENTACION 1 SIN CONTROL
TASA DE MULTIPLICACION
N° de Generaciones FERMENTACION 2 SIN CONTROL
TASA DE MULTIPLICACION
1.6 1.8 2.0
0.07 0.04 0.03
1.7 1.9 2.1
0.07 0.04 0.03
93
ANEXO C
DATOS DEL SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION CON FLUJOS DE ENTRADA Y DE SALIDA El presente anexo presenta los resultados del estudio preliminar para el montaje de un cultivo continuo en el biorreactor.
RESULTADOS DE LA EVALUACION DE BOMBAS PERISTALTICAS DEL BIOFLO Y SEGUIMIENTO DE UNA FERMENTACION EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO Previo al establecimiento de una fermentación alcohólica con flujo de entrada de nutriente y flujo de salida de cosecha, se determinó la tasa de crecimiento de acuerdo a las fermentaciones en sistema discontinuo previamente trabajadas en el Bioflo. La tasa de crecimiento se calculó para la fase exponencial. µ = ln( xf / xi ) / ∆t
Donde: µ : Tasa de crecimiento
xf : Número de microorganismos día final xi : Número de microorganismos día inicial ∆t
: Intervalo de tiempo entre final e inicial Para las cuatro fermentaciones realizadas se tiene el cálculo de las tasas de crecimiento durante la fase exponencial de crecimiento, la cual se presento durante los primeros cuatro días de la fermentación con control de pH y durante los primeros tres días para la fermentación sin control de pH.
Tabla C.1 Tasas de crecimiento para fermentaciones en sistema discontinuo
INTERVALO DE HORAS
TASA DE CRECIMIENTO FERM. 1 CON REGULACION DE PH (h -1 )
0 -2 4 2 4-48 4 8-72 7 2-96 Fuente: Autores
0 .062 0 .011 0 .003 0 .001
TASA DE TASA DE TASA DE CRECIMIENTO CRECIMIENTO CRECIMIENTO FERM . 1 SIN SIN FERM. 2 SIN FERM. 2 CON REGULACION CONTR OL DE PH (h CONTR OL DE PH (h 1 1 DE PH (h -1 ) ) )
0 .0 6 3 0 .0 1 1 0 .0 0 2 0 .0 0 1
0 .045 0 .00 6 0 .00 5
0.049 0.006 0.005
De acuerdo a las tasas calculadas y a la teoría que define que la tasa de crecimiento es igual a la tasa de dilución, dilución, y se calculó el flujo necesario para desarrollar un sistema continuo de fermentación. La tasa de dilución a emplear es la tasa de crecimiento para la fase exponencial. De acuerdo a esto se tiene que para una fermentación con control de pH la tasa de dilución es igual a 0.011 h -1 por lo tanto el flujo para un volumen del sistema de 10000 mililitros es igual a 110 ml / hr ó 1.8 ml / minuto, para condiciones de equilibrio.
Resultados de una fermentación empleando flujos de entrada y flujos de salida Para fijar los flujos de entrada de nutriente y de salida de producto o cosecha se emplea el sistema de bombas peristálticas descrito en el numeral 4.1. Utilizando el modelo matemático para fermentaciones en sistemas continuos, se fijó la tasa de dilución de acuerdo a las fermentaciones en sistema discontinuo, siendo necesario medir el crecimiento de microorganismos y confrontando el resultado con contenido de nitrógeno y sólidos solubles totales. Los resultados se presentan a continuación. Tabla C.2 Resultados del seguimiento de una fermentación con flujo de entrada y flujo de salida D IA 0 1 2 5 6 7 8 12 13
N° M.O/ml
CONTENIDO DE NITROGENO/ML
R a ng n g o s u p e ri ri o r R a ng n g o i n fe fe ri rio r 2 .6 E + 0 7 1 .9 E + 0 7 6 .4 E + 0 7 4 .8 E + 0 7 7 .5 E + 0 7 6 .4 E + 0 7 1 .0 E + 0 8 7 .2 E + 0 7 8 .5 E + 0 7 6 .2 E + 0 7 7 .3 E + 0 7 5 .7 E + 0 7 7 .1 E + 0 7 3 .8 E + 0 7 5 .6 E + 0 7 5 .2 E + 0 7 5 .8 E + 0 7 4 .7 E + 0 7
m g N IT I T R O G E N O /m /m l . 0.0660 0.1985 0.2650 0.3310 0.2650 0.2480 0.1985 0.1985 0.1985
SOLIDOS SOLUBLES TOTALES
°BRIX A 20°C
2 0 .0 1 8 .8 1 5 .8 9 .0 8 .5 8 .6 9 .0 8 .9 1 0 .0
Fuente: Autores De acuerdo al conteo de microorganismos se calculó la tasa de crecimiento que define la tasa de dilución necesaria para establecer los flujos de entrada y salida en el Biorreactor. Tabla C.3 Tasas de dilución y flujos en la fermentación con flujo de entrada y flujo de salida INTERVALO DE HORAS
TASA DE CRECIMIENTO (hr -1)
0-24 0-48 0-120 0-144 0-168 0-192 0-288 0-312
0.040 0.023 0.011 0.008 0.006 0.005 0.003 0.003
FLUJO(ML/MIN)
% VELOCIDAD DE BOMBAS PERISTALTICAS
3.88 1.79 1.24 0.92 0.75 0.42 0.37
40% 5% 15% 15% 15% 5% 15%
FLUJO BIOFLO TASA DE DILUCIÓN TASA DE DILUCIÓN FLUJO BIOFLO ALIM ALIMEN ENTA TACI CION ONML ML// -1 COSECHA(ML/MIN) COSECHA (hr ) ALIM AL IMEN ENTA TACI CION ON (hr -1) MIN)
1.60 0.20 0.58 0.58 0.58 0.20 0.58
0.010 0.001 0.004 0.004 0.004 0.002 0.005
1.25 0.18 0.48 0.48 0.48 0.18 0.48
0.008 0.001 0.003 0.003 0.004 0.002 0.004
Fuente: Autores Para el día final de fermentación, se determinó el contenido alcohólico y concentración de azúcares reductores dando como resultado 10 °G.L y 0.0218 g azúcar reductor/ mililitro. El conteo de microorganismos se realizó tomando muestra directamente del vaso del biorreactor y se observó que hasta el quinto día se asemeja a un crecimiento exponencial similar a de un cultivo discontinuo(Ver Tabla C.2), notando que la tasa de dilución para el cultivo continuo se fijó a partir del segundo día de fermentación. Entre el intervalo del quinto hasta el octavo día de fermentación se notó un descenso desde 8.5E7 m.o/ml hasta 5.4E7 m.o/ml. Esto se debe a la la diferencia ya expresada para los caudales de entrada y salida de flujo del biorreactor, lo que implica una diferente tasa de dilución para la cosecha y alimentación (Ver Tabla C.3). Del día 8 hasta el día 13 donde se finalizo la fermentación no existen variaciones en el crecimiento de microorganismos ni variación en el contenido de nitrógeno. La gráfica de nitrógeno por célula presentó un comportamiento constante a lo largo de la fermentación, lo que indica que el conteo realizado es equivalente al contenido de nitrógeno durante la fermentación. Para la curva de grados Brix se observa que desde el día quinto hay una estabilización de los mismos hasta finalizar finalizar la fermentación en valores aproximados a 9 °Brix. Esto indica que solo hubo consumo de sólidos solubles durante los primeros 5 días de fermentación en continuo. En los siguientes siguientes días es probable que la concentración de sólidos solubles se mantuviera constante debido a la tasa de dilución, que alimenta de sólidos al cultivo pero también los desaloja del biorreactor. De acuerdo a los valores de tasas de dilución para cosecha y para alimentación, se tiene que la tasa de dilución fue menor que la tasa de crecimiento hasta el día 12 de fermentación. El día 13 la tasa de dilución tiene un valor mayor, tanto para la alimentación como para la cosecha, respecto a la tasa de crecimiento para el intervalo de días de fermentación. Los fines de semana la tasa tasa de dilución dilución debió
adaptarse a un caudal bajo para lograr dar continuidad a la fermentación, evitando el desgaste del medio alimentador. Tabla C.4 Datos de conteo en cámara Neubauer Improved DIA 0 1 2 5 6 7 8 12 13
8.60 26.10 28.00 39.40 28.10 23.00 15.50 22.30 20.50
TRIPLICADOS 10.60 20.90 25.50 28.40 25.60 29.30 21.40 20.85 18.90
7.90 20.40 29.75 35.10 34.60 25.60 28.70 21.20 23.48
P RO M ED IO 9.03 22.47 27.75 34.30 29.43 25.97 21.87 21.45 20.96
DESV. ST D 1.40 3.16 2.14 5.54 4.65 3.17 6.61 0.76 2.32
Tabla C.5 Datos de °Brix tomados a 20°C D IA
0 1 2 5 6 7 8 12 13
P R O M E D IO
TRIPLICADOS
2 0 .0 1 8 .6 1 5 .8 9 .0 8 .4 8 .7 9 .0 8 .8 1 0 .0
2 0 .0 1 9 .0 1 5 .8 9 .0 8 .5 8 .6 9 .0 8 .9 9 .9
2 0 .0 1 8 .7 1 5 .8 8 .9 8 .6 8 .6 8 .9 9 .0 1 0 .0
2 0 .0 1 8 .8 1 5 .8 9 .0 8 .5 8 .6 9 .0 8 .9 1 0 .0
Tabla C.6 Datos de contenido de nitrógeno D IA
0 1 2 5 6 7 8 12 13
T R I P L IC A D O S V O L U M E N H C L 0 .9 4 6 5 6 N ( m l )
0 .1 0 0 .3 0 0 .4 0 0 .5 0 0 .4 0 0 .3 5 0 .3 0 0 .3 0 0 .3 0
0 .1 0 0 .3 0 0 .4 0 0 .5 0 0 .4 0 0 .3 5 0 .3 0 0 .3 0 0 .3 0
0 .1 0 0 .3 0 0 .4 0 0 .5 0 0 .4 0 0 .3 5 0 .3 0 0 .3 0 0 .3 0
P R O M E D IO
0 .1 0 0 .3 0 0 .4 0 0 .5 0 0 .4 0 0 .3 5 0 .3 0 0 .3 0 0 .3 0
Gráfica C.1 Curva de crecimiento de microorganismos
C R E C I M IE N T O D E M I C R O O R G A N IS M O S 1.00E+08
. l m / O . M ° N
Fuente: Autores 1.00E+07
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
TIEMPO (DIAS) N ú m e r o d e m i c r o o rg a n i s m o s / m l
Fuente: Autores Gráfica C.2 Curva de contenido de nitrógeno C O N T E N I D O D E N I T R O G E N O E N M I L IG R A M O S D E N / M L 0.40000
0.35000
0.30000
O R T I L I L I M / O N E G O R T I N g m
0.25000
0.20000
0.15000
0.10000
0.05000 0
1
2
3
4
5
6
7
8
TIEMPO(DIAS) C O N T E N I D O D E N IT R O G E N O / M L
Fuente: Autores
9
10
11
12
13
14
Gráfica C.3 Curva de Grados Brix ° BRIX A 20°C 25
20
15 X I R B °
10
5
0 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
13
14
TIEMPO(DIAS)
Fuente: Autores Gráfica C.4 Contenido de nitrógeno por célula. N/CELULA 1.00E-08 0
1
2
3
4
5
6
7
s o m s i n a g r o o r c i m ° n / ) g m ( N
1.00E-09 TIEMPO(DIAS) N/CELULA
Fuente : Autores
8
9
10
11
12
ANEXO D SISTEMA DE BOMBAS PERISTALTICAS DEL BIOFLO 3000 M1227 Figura D.1 Bombas peristálticas
Figura D.2 Configuración de bombas para salida de flujo del Bioflo
Figura D.3 Configuración de bombas para entrada de flujo del Bioflo
Figura D.4 Configuración de puerto de entrada de flujo en el Bioflo
Figura D.5 Configuración de puerto de salida de flujo en el Bioflo
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Factores que intervienen en la
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