Bi o et h an ol Pr o du c t i o nF r o m Pi n ne ap pl eWa s t e Abs t r ac t Ther ei sg r eati n t er e sti npr odu ci ngbi oe t ha nol f r om bi omas san dt her ei smu muc he mphas mp i so n e xpl oi t i ngl i gnoc el l ul os es our c es ,f r om c r opwas t est hr ought oener gy r i c hc r ops .Somewas t e s t r eams ,howe ver ,c ont ai nbot hc el l ul os i candnonc el l ul os i cs ugar s .Thes ei nc l udewas t esf r om pi neappl epr oc es s i ng. Pi n ea pp l ewa s t e sa r ep r o du cedi nl a r g eamo un t st h r o ug ho utt h ewo r l db yc an ni n gi nd us t r i e s.Th es e was t esar er i c hi ni nt r ac el l ul ars ugar sandpl antc el l wal l swhi c har ec ompos edmai nl yofc el l ul os e, pec t i csubs t anc esandhemi c el l ul os es .Thepur pos eoft hi ss t udywast oi n ves t i gat et hepo t ent i al t o t r ans f or ms uc hr es i duesi nt oet hanol af t erenz ymat i csac char i fi cat i onofpl antc el l wal l s ,and f er me nt at i onoft her e sul t i ngsi mpl esug ar sus i ngt heSa cc har omy c esc er e vi s i aeNCYC2826st r a i n. Thr eedi ffer entf er ment at i onmodes ,di r ec tf er ment at i on,s epar at ehy dr ol y s i sandf er ment at i on,and s i mu l t a ne ou ss ac c ha r i fi c at i o nan df e r men t a t i o no ft h ebi o ma ma sswe r et e s t e da ndcomp ar e d.Th e r es ul t ssh owt ha tt hema i ns uga r sobt ai ne df r om pi neappl ewas t ewer e:gl uc os e,u r oni cac i d,x y l os e, g al a ct o se ,a r a bi n os ean dman no s e.Th eh i g he s te t h ano ly i e l dwa sa ch i e v eda f t e r30h ou r sof s i mu l t aneouss ac c har i fi c at i onan df er men t a t i on,an dr eac hedupt o3 . 9% ( v / v ) ,c or r es pond i ngt ot h e 96% oft het heor et i c al y i el d. Ke ywor ds :e t hanol pr oduc t i on ,p i ne app l ewas t e,Sac c har omy c esc er e vi s i ae,s i mul t an eo us s ac c har i fi c at i onandf er ment at i on,f er ment at i on 1.I nt r oduc t i on Duet ot her api ddepl et i onoft hewor l d' sener gysuppl y ,t her ei sani nc r e as i nggl obal i nt er es ti n al t er nat i v eene r gys our c es( Li n&T ana ka,2 00 6) .Et hanol f r om bi omas scanpr o vi d eas us t ai nabl e, al bei tl i mi t edal t er nat i v et ooi l t omi t i gat et hegl obal ener gypr obl em as soc i at edwi t hf os si l f uel s e xhaus t i onandgr eenhous egasemi s si ons( Far r el l e tal . ,2006) .Cur r ent l y , bi omas sder i v edet hanol i spr o du cedati ndus t r i al s c al ef r om s uc r os eands t ar c h;ho we v er ,t h i spos esc on cer n saboutt he po t en t i al c ompe t i t i onwi t hf oodandf eeds upp l i es( HahnHäg er dal ,Ga l be,Gor wa Gr aus l und ,L i dén , &Zac chi ,2006;Fi el d,Campbel l ,&Lobel l ,2008) .I naddi t i on,t hec onv er s i onoff or es tandgr as s l and i n t on ewc r o pl a ndt os up pl yani n cr e as i n gd ema ndf o rb i o ma ma s si sal s op r o bl ema t i cbe c au sesu c h l andus ec hangesi nc r eas egr eenhous egasemi s si ons( Far r el l e tal . ,2006;Sear c hi ngeretal . ,2008) . He nc e,o t h eral t er nat i v e ss uc hast hepr oduc t i ononf a l l o wfi el dsofc r o psandgr as s est opr od uc e bi of uel shav er ec ent l yat t r ac t edat t ent i on.I npar t i c ul ar ,t hel i gnoc el l ul os i cmat er i al ss uc has agr i c ul t ur al was t esar econs i der edt obet hema mai npo t ent i al s our c esofbi omas sf or" s ec ond gener at i on"bi oe t hano lpr o duc t i on( Gal be&Zac c hi ,200 7;Mer i no&Ch er r y , 200 7;Sak ai e tal . ,200 7; Hu ,He i t ma nn ,&Ro j a s ,2 00 8;Go h,T a n,L ee ,&Bh at i a20 10 ) .
Pi neappl ewas t es( PW)c ompr i s ef r ui tt r i mmi ngsp r odu cedi nl ar geamount sb yca nni ngi ndus t r i es t h r o ug hou tt h ewo r l d( F AO,2 00 9) .Co st aRi c ai samon gt h ema i np r o du ce r san de x po r t er s ,wi t h appr o xi ma t el y110, 00 0ac r esofpi n eappl e s.Appr o x i mat el y25% oft h ef r e shpi n eappl ehar v es t edi n Co st asRi c ai sp r o ces s edt omak eaddedv al uepr oduc t ss uc hasc onc ent r at e dj ui c e,j el l yand c annedpi neappl e.Near l y75% oft hef r ui tpr oc es s edi nc anner i esr es ul t si npeel edsk i n,c or e,c r o wn end,e t c . ,whi c hi sno tut i l i z edandgener al l ydi s char gedasawas t e.Thedr ymat t erc ont enti n p i n ea pp l ewa s t ei sa r o u nd10 %,a ndc omp os e do fa bo ut9 6% o r g an i ca nd4 %i n or g an i cma t t e r ( Ab du l l a h,2 00 7) .Th es emat e r i a l se x hi b i tb ot hhi g hbi o c hemi c a lo x y ge nd ema nd( BOD)a nd c h emi c a lo x y g end ema nd( COD)v a l u es( Ba nKo ffi &Ha n,1 99 0) ,a ndg i v er i s et os e r i o uspo l l u t i o n pr obl emsi fnotpr oper l ydi s pos edof . I nt hepas t ,PW wer eut i l i z edass our c esf orbr omel i ne xt r ac t i on,wi neandv i negarpr oduc t i on,y eas t c ul t i v at i onf orf ood/ f eedpr ot ei ns ,oral s of oror gani cac i dspr oduc t i on( Lar r aur i ,Ruper ez ,&Cal i x t o, 1 99 7;Ni g am,1 99 9a ,b ;Bu s ai r i ,2 00 8;He bb ar ,Su ma na ,&Ra gh av a r a o,2 00 8;Da c er a ,Ba be l ,& Pa r k pi a n,2 00 9;J ama l ,Fa hr u r r a z i ,&Za ha ng i r ,20 09 ;Ba ni k ,Na g,&De bn at h ,2 01 1;Dh an as e ka r an , L awa ny a ,Sa ha ,Th aj u dd i n ,&Pa nne er s el v a m,2 01 1;Raj i ,J i b r i l ,Mi s au ,&Da nj u ma ,20 12 ) .Th eh i g h s ugarandl i gnoc el l ul os i c samount sf oundi nPW pr o vi deapot ent i al l yi nt er es t i ngs our c eofv al uabl e f er me nt at i onandn on f er ment a t i onp r odu ct s .Li gnoc el l ul os ec omp r i s est womai nc l a ss eso fs t r uc t ur al pol y s ac char i des ,c el l ul os eandhemi c el l ul os e.I fh ydr ol y s ed,t he yc anpr o vi des our c esoff er ment abl e s ugar s( gl uc os eandx y l os e,r es pec t i v el y ) .Thepol y s ac char i des ,howe ver ,ar et i ght l ypac k edi npl ant c el l wal l sandar eof t ens ur r oundedbyl i gni n,f or mi nghi ghl yr ec al c i t r ants t r uc t ur esr e si s t antt odi r ec t enz y mat i cat t a ck( Sun&Cheng,2002;Hi mmel e tal . ,2 00 7) .Cel l u l os eandh emi c el l ul os ef r ac t i ons f r om agr oi ndus t r i al r es i duescanbedepol y mer i z edt of er ment abl es ugar sgi v i ngr i s er es pec t i v el yt o h ex o s es( gl u c os ean dma nno s e)a ndpe nt o se s( x y l o sean da r a bi n os e) ,e i t h erb yen z yma t i co r c hemi c al h ydr ol y s es( Sun&Ch eng,2 002;Mo si ere tal . ,2 00 5;Hi mmel e tal . ,2007 ) . Enz y mat i chy dr ol y s i si sr eg ar dedt o da yast hemos tpr omi s i ngappr oa cht ol i ber a t i ngf e r ment abl e s ugar si nanener gy effic i entwa yf r om t hecar boh ydr at esf oundi nl i gnoc el l ul os i c si nor dert opr oduc e e t h an ol ( Wo ol e y , Ru t h ,Gl a s s ne r ,&Sh ee ha n,1 99 9;Ga l b e&Za c c hi ,2 00 2;Yu&Zh an g,2 00 4) . Sug ar sr e l e as edbye nz y me st h enc anbef e r me nt edt oet h an ol b yy ea s t s .The r ear es ev e r a l f er me nt at i onappr oa chest h atc anbec ons i d er ed.Sequen t i al en zy mat i chy dr o l y s i sandf er ment a t i on ar ede sc r i bedass epar at ehy dr ol y s i sandf e r men t a t i on( SHF) ,whi l ewh ent het wost epsar e s i mul t aneous l ycar r i edout ,t hepr oc es si scal l eds i mul t aneoussac char i fi cat i onandf er ment at i on ( SSF) .SSFha st headv ant ageofpr e v ent i ngt hebui l dupofh ydr ol y s i spr odu ct ss uc ha sc el l obi o se andgl uc os e,whi c hc anr educ et her at eoff ur t hers ubs t r at eh ydr ol y s i s .Howev er ,i thast obec ar r i ed outatt emper at ur est hats ui tt hef er ment i ngor gani s m.I nt hec as eofy eas t ,t het emper at ur ei s gener al l ybe l o w 40° C,whi c hi sbel o wt h eop t i mum t emp er at ur ef o renz y mat i ch ydr ol y s i s( 50° C) ( T ak agi ,Abe,Su zuk i ,Emer t ,&Yat a,1 97 7;T en gbo r g,Gal be,&Zac c hi ,2001 ) .Fe r ment at i onal s o s eemst ode cr eas et hei nhi bi t i onoft heenz y mespr obabl ybyc on v er t i ngs omeoft het o xi c c ompo und sp r e sen ti nt h eh y dr o l y s at e( T en gbo r geta l . ,2 00 1) .Th es eme ch an i s msi n cr e as et h e
o ver al l pr oduc t i v i t y , t heconc ent r at i onandal s ot hefi nal et hanol y i el d( Wr i ght ,Wy man,&Gr ohmann, 1 98 8;Phi l i p pi d i s ,Smi t h ,&Wy ma n,1 99 3;Sod er s t r o m,Ga l be ,&Za c ch i ,2 005 ) . I nt hi ss t udyt hr eedi ff er entpr oc es s eswer eus edt oobt ai nbi oet hanol f r om PW:di r ec tf er ment at i on ( DF)f ol l owedb yenz y meaddi t i ont ov er i f yt her eal y eas tc apac i t yoff er ment i ngt heunt r eat ed s ub st r at e;s epar at eh ydr ol y s i sandf er ment at i on( SHF)i nt hes amer eac t or ;s i mul t a ne ous s ac c har i fi c at i onan df er men t a t i on( SSF) . 2 .Mat e r i a l sa ndMe t h od s 2. 1Subs t r at e Pi neappl eswer eob t ai nedf r om al oc al mar k e ti nNor wi c h,UK.Forana l y t i c al pur po se,t hep i neappl e wasdi v i dedi nt of ourpar t s :c r o wn( t het oppar t ) ,s ki n,pul pandc or e( t hei nnerpar t ) .I nt hi sst udy onl ysk i nandc or ewe r eus edf orf er me nt at i ont es t s . 2. 2Ye as t s Sa cc ha r omy c e sce r e v i s i a eNCYC2 82 6wa spr o v i d edbyNa t i o na lCo l l e ct i o no fYea s tCu l t u r e s,a BBSRCs uppo r t edNat i ona lCapabi l i t yb as edatt heI ns t i t ut eofFoodRes ear c h,Nor wi c hTh es t r ai n wa sma i n t a i n edo nYM a ga rme di u m( y e as te x t r a c t3g / L ,ma l te x t r a ct3g / L ,pe pt o ne5g / L ,g l u co se 10g/ L)at4° C.T oc ar r y o utt het es t sS.c er e vi s i aewasgr o wno v er ni gh ta t30° Conar o t ar ys hak er ( I NNOVA4 4,I n cu ba t o rSh ak e rSe r i e s,Ne w Br u ns wi c kSc i e nt i fi c )a t2 00r p m,i nt u be sc o nt ai n i n g2 0 ml YM med i um. 2. 3Ex per i men t al Se t up Fer me nt at i ont es t swer ec ar r i edouti na2 . 5Lbat c hf er men t er( L H Fer ment at i o n2000Ser i es ) .The f e r me nt e rwa se qu i pp edwi t hon ef o ur b l a de dr u s ht o nt u r b i ne ,a ndt h ec ommo nc on t r o ls y s t e ms : t e mp er a t u r e ,p H,CO2de t e c t o ra n dg a sma s sfl o wme t e r . Pi neappl ewas t es ,c ompr i s i ngf r ui ts k i nandc or e,wer ehomogeni z edi naf r ui tbl ender .Ther es ul t i ng homo gen at e ,wi t had r ymat t erc on t entof14 %( w/ w) ,wasdi l ut edwi t hwat ert oa9% dr ymat t er ,i na wo r k i n gv o l u meo f1 . 5Lan di mme di a t el yt r e at e da t10 0° Cf or1 0mi nu nd erc on t i n uou smi x i n gt o i nac t i v at eendogenousenz ymesandr educ emi c r obi al s poi l age.Nof ur t hers t er i l i z at i onpr oc edur e wasadopt ed. Thr eedi ff er entpr o ces s eswe r eus edt oo bt ai nb i oe t hanol :di r ec tf er me nt at i on( DF)oft heb l ended bi oma ssf ol l o wedbyenz y mead di t i on;s epar at ehy dr o l y s i sandf er ment a t i on( SHF) ;s i mul t aneous s ac c har i fi c at i onan df er men t a t i on( SSF) .
ForDFo ft hebl endedbi omas s ,wi t hadr ymat t e rc ont entof9. 2%,20ml ofS.c er e vi s i aei no cul u m ( 1 07c el l spe rml )wer ea dd edt ot h eme di u m.Thet e s t swe r ec ar r i e do uta t3 0° Cu nd erc on t i n uo us mi x i n ga t2 00r p m.p H wa spr e v i o us l ya dj u s t e df r o m3 . 8upt o4. 5us i n g2M Na OH. Af t e r1 2h ou r st h eme di u m wa ss u pp l e me nt e dwi t h20μl / gdr yma t t e ro fDe po l TM 7 40La nd25 0 μl / gd r yma t t e ro fAc c el l e r a se ® 15 00e nz y me s,ma i n t a i n i n gt h es amef e r me nt a t i onp ar a me t e r s . Fo rSHFf e r men t a t i o ns ,s ac c ha r i fi c at i o no f8 . 5 % dr ymat t e rb i o ma s s,wa sc ar r i e dou tu si n gt hes ame c el l wa l l de gr a di n gen z yme s,a sab ov e ,f o r2ha t5 0° Ca ndpH5,a dj u s t edus i ngNa OH2M,wi t h c ons t ants t i r r i ngat500r pm.Af t er6hour sdi ges t eds ubs t r at ewascool edt o30° Cands t i r r i ng dec r eas edt o200r p m.pHat4. 5wasno tf ur t herc or r ec t edb yal k al i addi t i on.Thef er ment at i on s t ar t edwi t haddi t i onof20ml ofS.c er ev i s i aei noc ul um,asbef or e. SSFf er me nt at i o nwa sc ar r i e doutaddi ngt oge t herenz y mesan dy ea stc ul t ur et ot hes ubs t r at e. Fer me nt at i onpar a me t er swe r e30° C,pH4. 5,adj us t edasabo v e,andco ns t ants t i r r i ngat20 0r pm. I ni t i a lbi omas sdr yma t t erwas9%. CO2ev o l u t i o nwa sme as u r e dd ur i n ga l l f e r me nt a t i o nt e s t su s i n gaADCI n f r aRe dCO2An al y z e ra nd dupl i c at ebr o t hsampl e swer ewi t h dr a wnf r om t her eac t i onv es s el us i nga20ml s y r i n ge :t hesamp l e f oret hanol anal y s i swasi mmedi at el yf r oz enat18° Cunt i l anal y s i s ;wher eass ampl esf ormoi s t ur e det er mi nat i on,s ol ubl eandi ns ol ubl es ugar swer eheat edat100° Cf or6mi nt oi nac t i v at et he enz y mesandt henf r oz enat18° Cunt i l anal y zed.Al l f er ment at i onswer ec ar r i edoutunt i l nof ur t her CO2fl uc t u at i onswer eobs er v ed.p H wasno tc ont r ol l edb yt head di t i o nofal k al i d ur i ngf er me nt at i on . 2 . 4Ch emi c a l s Ch emi c al swer epr o vi de db ySi gmaAl dr i c h,e x c ep t i ngf o rg al a ct ur on i cac i dandgl u cos epr o vi dedb y Fl u kaBi o chemi c al andgl y c er ol pr o v i d edb yFi s herSc i ent i fi c . Commer c i al l yav ai l abl ee nz y mes ol u t i onsDep ol TM 74 0L( f e r u l i cac i des t e r as e) ,pr o vi dedb y Bi o ca t a l y s t sLt d . ,Ce f nCo ed ,Wa l e s,U. Ka ndAc c el l e r a se ®1 50 0( e ndo gl u c ana s e) ,p r o v i de db y Ge ne nc o r ewe r eu s ed .Bo t ho ft h e m we r ea dd e dt ot h eme d i aa tr e c o mme nd edd os e s .De c l a r e d ac t i v i t i e swer e3 6U/ gand22002800CMCU/ gr es pec t i v el y( 1 CMCU=uni tofa ct i v i t yl i be r at e s1 μmo lo fr e du c i n gs ug ar s ,e x pr e ss edasg l u co seequ i v a l e nt sp ermi nu t eat50° Ca ndpH4 . 8 ) . 2. 5Al c ohol I ns ol ubl eRes i dues( AI R)Pr epar at i on AI Rswer epr e par e df r om pu l pan dr es i d uespr i ort oanal y s i sf orc el l wal l s ug ar s .We tf e r ment e d p i n ea pp l ewa st es amp l e s,a f t e rd ef r o s t i ng ,wer ehomo gen i z edf o r1mi natma xs pe edi naJ an k e& Ku nn el ,I k aWe r kUl t r a T ur r a xho mog en i z e ra tr o om t e mp er at u r e .3 0ml o fe ac hs a mp l ewe r et he n pour edi nt oboi l i nget hanol ,t oobt ai nafi nal mi x t ur ewi t hEt OHc onc ent r at i onof85% ( v / v ) , c o ns i d er i n gt h ewa t e rc o nt e nto ft h es a mp l e .5 0ml o f7 0% Et OHt owa s hd owna ndc o l l e c ta n y
s ampl epar t i c l esf r om t h ehomog eni z erwer eus ed.Thei ns ol ub l er es i duer emai nedaf t ert hi s t r e at me ntwa sr e c ov e r e db yv ac u um fi l t r a t i o nt h r o ug ha5 μm n y l o nfi l t e rNYBOL Tus i n gaBu c hn er f unnel .Af t erf ur t her2s equent i al e xt r ac t i onsi nboi l i ng85% et hanol ( v / v )t her es i duewasex t r ac t edi n boi l i ngab sol ut ee t hanol ( 300mLf or5mi n ) , t henwa she dwi t hcol dab sol u t ee t hanol ( 150mL) .The fi nal fi l t r at ewasdr i edbyBüc hi Rot ar yEv apor at orat40° C,r ec ov er edi nwat erandt es t edf orr es i dual s ol ub l esug ar s .Th ei n so l u bl er e si d uewa swa sh edwi t h2v ol u me sa ce t o nea nda f t e rr e mo v al b y s uc t i on,d r i edt oc ons t antwei ghtat40° C( Wa l dr on&Sel v endr a n,199 0;Mandal ar i e tal . ,2 005) . 2. 6Moi s t ur eDet er mi nat i on Thedr ywe i gh t sbo t hoft hef r es hpi n ea ppl ewa st eandf er ment at i onss amp l es ,wer eca l c ul a t edas s t e ad ywe i g ht sa f t e r2ha t1 10° Cu s i n gaMe t t l e rPM 2 00eq ui p pe dwi t haMe t t l e rL P1 6I Rb al a nc e. 2 . 7Sug arDe t e r mi n at i o n Su ga r swe r er e l e as e df r o m AI Rs a mp l e sb ySa ema nh y d r o l y s i sb ys amp l edi s p e r s i o ni n72 % H2 SO4 f o r3ha tr o om t emp er a t u r ef o l l o wedbyh y dr o l y s i si n1M H2 SO4f o r1ha t1 00° C. Hy dr ol y s at eswer eder i v at i z edast hei ral d i t ol ac et at esanda nal y z edb yGCu si ngaPer k i nEl mer Au t o sy s t em XL( Pe r k i nEl mer ,Se erGr e en ,UK) ,e qu i p pe dwi t hafl amei o ni z at i o nd et e ct i o nan da RTX22 5( Re s t e k,Be l l e f o nt e ,USA)c ol umn( Bl a k en ey , Ha r r i s ,He nr y , &St o ne ,1 98 3) . Anal y s i sofs uper nat antf r ac t i onsf ol l owedt hes amepr ot oc ol ,buts t ar t i ngf r om ah ydr ol y s i si n1M H2SO4. Thet ot al ur oni cac i dc ont enti nt hes ugarh ydr ol y s at eswass pec t r ophot omet r i c al l yde t er mi nedus i ng g l u cu r o ni cac i da sast a nd ar df o l l o wi n gt h eme t h odo fBl u me nk r a nt zandAs boe -Ha ns en( 1 973 ) , mo di fi edbyRaeeta l .( 1 98 5) . Al l s ampl eswer eanal y zedi nt r i pl i c at e. 2. 8Et h an ol De t e r mi nat i on Et hanol wasquant i fiedbyHPLC. 5 00μl s a mp l e so fs up er n at a ntf r o mf e r men t e dp i n eap pl ewa s t ewe r ec en t r i f u ge df o r1 0mi nu t e sa t 5 00r p ma nd20° Ci na9 6d eepwe l l p l a t eus i n ga nEp pe nd or fCe nt r i f u ge58 10R,t h enfi l t e r e d t h r o ug hAc r o Pr e pTM 0 . 2μm GHPMe mb r a ne96We l l Fi l t e rPl a t e si n t oa9 6d ee pwe l l c o l l e c t i o n pl at ef orf ur t he r1 0mi nut esatt hes ames peed. Af t erc ent r i f ugat i onpl at eswer ec ov er edbyar ubberl i dandl oadeddi r ec t l yont oaSer i es200L C i ns t r ument( Per k i nEl mer ,See rGr een,UK)equi ppedwi t har ef r ac t i v ei nde xde t e ct or .Anal y s eswer e c a r r i e do utu s i n ganAmi n e xHPX8 7Pc o l u mn( Bi o Ra dLa bo r a t o r i e sL t d ,He me lHe mp s t e ad ,UK)
wi t hma t c hi n gg ua r dc ol u mn so pe r a t i n ga t6 5° Cwi t hu l t r a pu r ewa t e ra tafl o wr a t eo f0 . 6mL / mi na s mo b i l eph as e . 2. 9Cal c ul at i ons Theor et i c al y i el d( TY)i nt hi sst udywascal c ul at edast hemaxet hanol y i el di nr el at i ont odr ymat t er : 0. 5 11ga l c ohol pe r1 . 0gdr ymat t e r . 3.Res ul t s 3 . 1Di r e c tFe r me nt a t i o no ft h eBl e nd edBi o ma s sFo l l o we db yEn z y me sAd di t i o n( DF) I ni t i al l y ,et hanol pr oduc t i onbyS.c er ev i s i aeNCYC2826us i ngunt r eat edbl endedbi omas s,wi t hadr y ma t t erc ont en to f9. 2%,wasi n v es t i g at edb yb at c hc ul t ur ei nDFmodeasde sc r i be di ns ec t i on2. 3. T abl e1s ho wst heco mpo si t i onofwa st efi beratt hebegi nni ngoft hef e r ment at i on,bef o r eenz y me addi t i onandatt h eendoft hepr oc es s .Ass ho wni nT abl e1,att heb egi nni ngo ft hef e r men t at i onGl c a ndXy l we r et h emo s ta bu nd an tn eu t r a lmo no s ac c h ar i d esi nAI RPW r e s i d ue s ,f o l l o we db yGa lA, Ar a,Gal a ndMa n,wi t hsmal l erp r opor t i on sofRhaandFuc .Themai ns ugar si nt hes ol ubl ef r ac t i on ( Fi g ur e1)we r eGl ca ndMa n;o nl ys ma l l a mo un t so fGa lAa ndGa lwa sde t e c t e d. Re su l t sar es ho wna sme anv a l ue( M)a nds t an da r dd ev i a t i o n( SD) ;r e si d ue( %)=p r op or t i o no f bi oma ssr ec ov er edasal c ohol i ns ol ubl er es i due( AI R) . Fi g ur e2as ho wst het i mec our s eofe t hanol pr oduc t i onandc or r es pond i ngdec l i nei nt hel e v el sof s ol ubl eandfi ber bounds ugar s .Sugar sut i l i z at i onbyt hey eas ti nt heear l yphas eoft hec ul t ur ewas r el at i v el ysl owandet hanol pr oduc t i onv er yl ow.Sampl ec ol l ec t edbef or eenz ymesaddi t i on,af t er12 hf er ment at i on,s ho weda0. 07% et hanol c onc ent r at i on,wi t hani ns ol ubl es ugarc onc ent r at i ons l i ght l y a ffe c t e db yy e as tg r o wt h ,wh er e asa mo ngt h es o l u bl es ug ar sa9% d ec r e as ei nGl cwa sob s er v e d. Theaddi t i onofc el l wal l de gr a di ngen zy mest ot h es ubs t r at eaf t er1 2hc aus edar api ds ug ar s c on cent r at i ondec r eas e,f ol l o wedb yac or r es pondi ngi n cr eas ei ne t hanol pr o du ct i o n.AI Rr es i due% d ec r ea s edf r om 3 . 9t o1 . 7a ndt h et o t a la mo un to fc e l l wa l l s ug ar sde cr e as edf r o m6 57 . 1μg / mgt o 5 28 . 6μg / mg .Th eGl ca ndMa ni nt h es o l u bl es ug ar sf r a c t i o nd ec r e as e db y6 3. 7 %a nd5. 3 % r es pec t i v el y ,whi l s tXy landAr a,Gal andGal Ai nc r eas edr efl ec t i ngt hei rr el eas ef r om t hec el l wal l s , andt hei nabi l i t yoft hey eas tt of er mentt hem.Et hanol pr oduc t i onr eac hed3. 4% wi t hi n24hof enz y meaddi t i on,r e ac hi ngt he86% oft heTY( T ab l e2) .Thi se t hanol c onc ent r a t i onr emai ne ds t ea dy unt i l f er ment a t i onwasc ompl e t ed.ThepHoft hef er me nt at i o ndr o ppe ddo wnf r om 4. 5t o3. 4att he e ndo ft h ep r o ce s s. 3 . 2Se pa r a t eHy d r o l y s i san dFe r me nt a t i o no ft h eBl e nd edWa s t e s( SHF) Re su l t sc on ce r n i ngd r yma t t e r%,fi br e sa nds ol u bl es ug ar sf orSHFp r o c es sar er ep or t e di nT ab l e2 .
I ni t i al dr ymat t eroft hemat er i al was8. 5%.Fi gur e2bs howset hanol pr oduc t i onands ugarut i l i z at i on b yS.c er e v i s i aed ur i n gSHFmo de ,d es c r i b edi ns ec t i on2 . 3 .Th er e su l t ss ho wt h att h ee nz y me ac t i v i t yatt hebegi nni ngoft hepr oc es sr es ul t edi nadec r eas ei nt hei ns ol ubl ef r ac t i onanda c onc omi t anti nc r eas ei nt hes ol ubl es ugar s .I ni t i al monos ac char i dec ompos i t i onsf ort hei ns ol ubl e ands ol ubl ef r a ct i onswer ec ompar a bl ewi t ht hos ef ou ndf orDFmode( 3. 1s ec t i on) ,r epr e sent i ng r es pec t i v el y25% and48. 6% ofi ni t i al dr ymat t er .I nk eepi ngwi t ht hes eobs er v at i ons ,enz ymat i c s ac c har i fi c at i onbe f or ey eas ti no cul at i oncaus edt h eAI Rr e si duet odec r eas ef r om 3. 2% t o1 . 4 %, r e s ul t i n gi n1 5% fi b erl o s sa nd1 1% s o l u bl es u ga r si n c r e as e .Th efi b er% d ec r e as e dt o1 0. 1 7%, f ol l o wedb yas ol ubl es ug ar si nc r ea si ngu pt o59. 26 %,bef or ey eas taddi t i on.Assho wni nT abl e1,b y 1 2ht h eAI Ry i e l dh add ec r e as e db yov e r5 0%,a ndt h ei n s ol u bl es u ga r sr e ma i n i n gh add ec r e as e d f r o m6 60 . 1μg / mgt o5 81 . 1μg / mg ,d uet os o l u bi l i s a t i o no fAr a ,Xy l ,Ma nGa lGl ua ndGa lA;o nt h e o t h erh an ds o l u bl es u g ar ss h owe dad e c r e as ei nGl ca ndMa n3 1% a nd8 %r e s p ec t i v e l y ,p r e s u ma bl y duet of er ment at i on,andani nc r eas ei nXy l ,Ar a,Gal AandGal f r om t hefi br ehy dr ol y s i s( Fi gur e1) . Atc ompl e t i ono ff e r men t a t i on,t heAI Rr es i duewa s0. 7% a ndt o t a li ns ol ubl es ug ar sconc ent r at i on wa s56 5. 6μg / mg .Th efi n a ld r yma t t e rc o n t e n twa s2. 6 %a ndfi be r sa nds o l u bl es ug a r s% d r o pp ed d ownt o5. 3 6a nd6. 2r e sp ec t i v e l y . Th eh i g he s tEYwa supt o3. 7 %,r e ac hi n g8 9% o ft h eTY( T ab l e 2 ) .Th ep Hr e co r d edatt h ee ndoft hepr o ce sswa s3. 3 . 3 . 3Si mu l t a ne ou sSa c ch ar i fi c at i o na ndFe r men t a t i on( SSF) Th ei n i t i a lfi b er san ds ol u bl es ug ar swe r e2 3. 9 %a nd42 . 2 %r e sp ec t i v e l y . Su ga rc o mp os i t i o nwa s c ompa r a bl ewi t ht h ata bo v er e po r t e df o rDFmo dei ns e ct i o n3 . 1( T ab l e1 ) .Ass ho wni nFi g ur e2 c, s ac char i fi cat i ons t ar t edatt=0:s ol ubl es ugar si nc r eas edr eac hi ngt hei rhi ghes tc onc ent r at i onaf t er6 hour s ,at51. 54%.Byt hi st i me,t hey eas twasf er ment i ngwel l andaf t ert hi spoi ntt hes ol ubl es ugar s dr oppedr api dl ywhi l s tt hea l c ohol be gant oi nc r e as eupt oapl at e auo f4%.By21hour set hanol pr oduc t i on,aswel l ass ubs t r at eut i l i z at i onb yt hey eas t ,s t oppedascanbeobs er v edf r om t hes t eady s u ga ra ndal c o ho l%.T a bl e1s h owst h emo no s ac c h ar i d ec o mp os i t i o ni nSSFs a mp l eatt h e begi nni ng,af t er12hour sf er ment at i onandatt heendoft hepr oc es s .I nFi gur e1t hes ol ubl es ugar c ompo si t i oni sr e po r t ed.Byt hee ndo ft hef e r men t at i on,Gl candManc onc ent r at i on swer ev er yl o w i nc omp ar i s onwi t ht h el e v el sofXy l ,Ar aa ndGa lA,a sp r e v i o us l yob se r v e da l s of o rDFa ndSHF p r o c es s e s .Fi b era nds ol u bl es u ga r sd ec r e as e dd ur i n gt h ep r o c es sf r o m2 3. 9 %t o3. 4 %a nd4 2. 2 % t o7 . 5% r e s pe ct i v e l y . Thehi g he s tEYwa su pt o3 . 9 %,r e ac hi n g9 6% o ft h eTY( T a bl e2) .Att h ee nd o ft h ef e r me nt a t i o np Hd r op pe dd ownf r o m4 . 5t o3 . 3 . 4.Di s c us si on Thes i gni fi c antamou ntofc ar boh ydr at er i c hmat er i al sdi s pos edofi nt hepi nea ppl ec anner i esmak e s t hi swa st eani nt er es t i ngs our c ef ore t ha no lpr oduc t i on.Ac c or di ngwi t hAbdul l ahandMat( 2 008 )a nd Huangetal .( 2011) ,t hemai ns ugar s ,c al c ul at edoni ni t i al dr ybi omas s,wer egl uc os eandx y l os e, f o l l o we db yur o ni cac i d ,a r ab i n os e,g al a ct o sea ndma nn os e,wi t hs ma l l e ra mo un t sofr h amn os ea nd f uc os e,r e veal i ngt hatpi neappl ewas t esar epr i mar i l yc ompos edofc el l ul os es ,pec t i cs ubs t anc esand
hemi c el l ul os es .Thepr es enc eofdi ff er entpol y mer i csubs t anc esi nc el l wal l sj us t i f yt heneedofapr et r eat mentont hi swas t e.DFga ver i s et oanEYof0. 07%,duet os ol ubl egl uc os eut i l i z at i onbyy eas t . Af t eren zy mea dd i t i ont ot hemedi um,t hefi bers t ar t e dt obedi g es t edan dt hee t h anol y i el dr os et o 3 . 4 %,c o r r e s po nd i n gt oa8 6% o fTY . T e s t sc a r r i e do uti nSHFa ndSSFg a v er i s et o3. 7 %a nd3. 9 %o fEY ,c o r r e s po nd i n gt o89 %a nd96 % ofTYr es pec t i v el y ,c al c ul at edonadr ymat t erbas i s . Thoug ht heEYobt ai nedappear sr at herl o w,d ueofc ou r s et ot hel o ws uga rc ont ent ,t hi sc oul dbe a t t r a ct i v eb ec a us eTY ,c a l c ul a t edo nd r yma t t e rl o s s,wa si nar a ng ea r o und9 09 6%,ma k i ngt h es e wa st e sa ne x c el l e ntr a w ma t e r i a lf o re t ha no lp r o du ct i o nb yS.c er e v i s i a eNCYC2 82 6,a sc omp ar ed wi t hp r e v i o uss t u di e so nj u i c eo rr o t t enp i ne ap pl e( Ban Ko ffi &Han19 90 ;Ni g am,1 99 9a ;Ni g am, 2 00 0;Ho s sa i n&Fa zl i n y ,2 01 0) . Thepr el i mi nar yt es t sr epor t edi nt hi spapers ho wt hei mpor t anc eoft heenz y mat i cpr et r eat mentof pi neappl ewas t est oi nc r eas et hes ugarl ev el oft hemas hf oral c ohol i cf er ment at i on.I ts houl dbe p oi n t e do utt h atSHFa ndSSFs h owt h es a met r e nd ,b ot honfi be rs a c c ha r i fi c a t i o na ndons ug ar s ut i l i z at i onbyS.c er ev i s i ae.Thi smeanst hatt heenz ymeac t i v i t yi snotaffec t edbyt hef er ment at i on p ar a me t e r su se d.I nf a ct ,p r e v i ou ssa c ch ar i fi c at i o nu se di nSHFmo de ,a t5 0° C,p H 5an d50 0r p m, wa sn otf o l l o we db yhi g he rc e l l wa l l d eg r a da t i o ni nc o mp ar i s o nwi t hSSFmo de ,wh er ee nz y me sa nd y e as twer ea dd edt o ge t he rt ot hes ubs t r a t ea t30° C,pH4. 5and2 00r pm.Thi sf ac i l i t a t est hes etu p off e r men t at i onpr oc es s esba sedo nt h es i mul t aneo usaddi t i onofy eas tc ul t ur ean denz y me s,t o r educ ebot hpr oc es st i meandt o t al c os t s .I nf ac tet hanol pr oduc t i oni nSSFs t ar t ed3hour sbef or ei t d i di nSHF .He nc e,SSFi spr ob ab l yt h emo stc o nv e ni en ta nds ui t a bl ef e r me nt a t i o nmo deu s edi nt h i s s t u d y . Al l s ampl esofdi ges t edmat er i al wer ec har ac t er i z edbyi nc r eas esi ns ol ubl ex y l os e,ar abi nos e, ga l ac t os e,g al ac t ur oni cac i dan dgl uc os e.Thi swa sdueo fc our s et ot h eenz y ma t i csa cc ha r i fi c at i o n o fp i n ea pp l ec el l wa l l s .Ac c el l e r a se®1 50 0a ct i v i t ywa sp r o ba bl yen ha nc edb yDe po l TM 7 40 Ls i n ce , i nac cor danc ewi t ht hel i t er at ur e,pi neappl ec el l wal l sar ec har ac t er i z edbyf er ul i cac i d,es t er i fi edt o gl uc ur onoar a bi n ox y l an s( Smi t h&Har r i s ,1 995 ;Smi t h&Har r i s ,20 01) .Enz y mat i cr e l ea seof s i gni fi c antquant i t i esofx y l os eandar abi nos epoi nt st ot heus eofmi x edcul t ur esandr ec ombi nant y eas t ,ori nt hede vel opmentofr obus ts t r ai nt hatwi l l s i mul t aneous l yf er menthe x os eandpent os e s ug ar sf ore t h an ol pr odu ct i on.Thi swo ul db ee xp ec t e dt oi mpr o v et hefi nal e t h an ol c on cent r a t i onan d pr oduc t i v i t y ,s i nc eas i gni fi cantquant i t yofpent os es ugar swer el ef tunut i l i z edi nh ydr ol y sat es f e r me nt e dme d i a . Al l t hef er ment at i onscar r i edouti nt hi ss t udywer ec har ac t er i z edb yadr ymat t erl os sofar ound70%. Th i sme an st h at3 0% o fs ub s t r a t er e mai n edu nu t i l i z ed .Th i sc ou l dbed uet ot h ep Hd ec r e as i n g dur i ngt hef er ment at i onper i od.I nf ac tpHv al uesappeart obes t eadyi nt her ange3. 33. 5.The s i g ni fi c an tpHd r opi spr obabl ycau sedb yp r oduc t i onofy ea stc at abol i t esan dt her el ea seofDga l ac t ur oni cac i df r o mp ec t i n,ha vi ngapKav a l u e3. 51( Fi l i ppo v ,Shk ol enk o&Kohn,1978) .The
o bs er v e dp Hd ec r e as ec ou l dl e adt oad i mi n ut i ono nen z yma t i cac t i v i t yan dac on se qu en ts t o po f fi bers ac char i fi cat i on.Fur t hert es t s ,c ar r i edoutwi t has t r i c tpHc ont r ol dur i ngt hepr oc es s,c oul d i mpr o vedr ymat t erut i l i z at i onandc ons equent l yet hanol pr oduc t i on. Mo r e ov e r ,a nEYi mp r o v e me ntmi g hta l s obeac h i e v e db ot hbyd ev e l o pi n gamo r eeffic i e ntp r e t r ea t mentme t h od( mec ha ni c al and / oren zy ma t i c )andbys uppl ement i ngt h es ubs t r at ewi t hdi ff er en t n i t r o ge ns ou r c est or e du cet hel a gp ha sea ndi n c r e as ey e as tb i oma s s. Ack nowl edgment s TheAut hor sac kno wl edget he" Di par t i ment odi Sc i enz edel l ' Ambi ent e,del l aSi c ur ez za,del T er r i t or i o, degl i Al i ment i edel l aSal ut e" ,Uni v er s i t yofMes s i na( I )andt heI ns t i t ut eofFoodRes ear c hNor wi c h ( UK)( I n s t i t u t eSt r a t e gi cPr og r ammeGr a ntBB/ J 00 45 45 / 1f r o m BBSRC)f o rt h es up po r t . Re f e r e n c e s
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