Universidad Autónoma de Querétaro Facultad de Química Laboratorio de Bacteriología Reporte 3. Bacterias Gram negativos (Enterobacterias) Grecia Alejandra Ortiz Cano/ Arturo Torres Zamora/ José Manuel Alvarez Baltazar.
Fecha de realización: 02/09/2017 Fecha de entrega: 06/09/2017
ÍNDICE
l. RESUMEN………………………………………………………………………..2 II. INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………2 III. OBJETIVOS……………………………………………………………...…….3 IV. METODOLOGÍA……………………………………………………………….3 V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………………………………6 Vl. CONCLUSIÓN…………………………………………………………………..13 Vll. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………………..13
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I. RESUMEN En esta práctica se estudiaron las características microscópicas y macroscópicas de los organismos que conforman la familia enterobacteriaceae. Además, el equipo de trabajo mediante la utilización de una batería de pruebas bioquímicas consiguió identificar exitosamente las cepas 9 y 10 que le fueron suministradas, siendo Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli respectivamente. II. INTRODUCCIÓN Este grupo de organismos incluye a varios que causan infecciones primarias del tracto gastrointestinal humano. Por tanto, se les refiere como entéricos (sin importar si causan o no enfermedades intestinales). Las bacterias que afectan el tracto gastrointestinal, incluyen a ciertas cepas de E. coli y Salmonella, a las 4 especies de Shigella y a Yersinia entercolitica. La enfermedad reumática, el síndrome de Reiter (asociada con HLA-B27), puede ser resultado de una previa exposición a Salmonella, Shigella, o Yersinia. Otros organismos que no son miembros de los Enterobacteriacae, incluyendo a Campylobacter y Chlamydia, son también agentes causales del síndrome de Reiter. Yersina pestis (la causa de la "plaga") se considerará por separado con otros organismos zoonóticos. Los miembros de esta familia son las causas principales de infecciones oportunistas (incluyendo septicemia, neumonía, meningitis e infecciones del tracto urinario). Los ejemplos de los géneros que causan infecciones oportunistas son: Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, Hafnia, Morganella, Providencia y Serratia. La selección de la terapia de antibióticos es complicada debido a la diversidad de los organismos involucrados. Hay una serie de pruebas que son utilizadas para la identificación de especies del género Enterobacteriacae: ● Urea. Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa produciendo un cambio de color rojo en el medio. La hidrólisis de la urea es catalizada por la ureasa, para dar dos moléculas de amoniaco. La ureasa es una importante enzima microbiana vinculada con la descomposición de los compuestos orgánicos. ● OF. Determina el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono. El medio OF contiene una elevada concentración de carbohidratos con una baja concentración de peptona, produciendo así una condición alcalina que neutraliza la más ligera acidez producida por un organismo oxidativo. El fosfato de potasio agregado al medio favorece la fermentación y actúa como buffer para controlar el pH. La concentración de agar empleado permite también la determinación de la movilidad y ayuda a la distribución por todo el tubo del ácido producido en la superficie del medio. ● Reducciòn de nitratos. Determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrógeno libre. La reducción de nitrato en nitrito y en gas nitrógeno tiene lugar generalmente en condiciones anaerobias, en las cuales un organismo obtiene su oxígeno del nitrato. El oxígeno sirve como un aceptor de hidrógeno. ● SIM. Determinar si un organismo es móvil o inmóvil, si es capaz de liberar ácido sulfhídrico por acción enzimática de los aminoácidos que contienen azufre produciendo una reacción visible de color negro y por último la capacidad de desdoblar el indol de la molécula triptófano, además que la consistencia del medio 2
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permite la observación de la movilidad de algunas bacterias. 1. Producción de ácido sulfhídrico 2. Producción de indol 3. Movilidad TSI. Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico. El agar KIA es un medio diferencial que determina tanto la fermentación de los hidratos de carbono y la producción de ácido sulfhídrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, características que son utilizadas para la diferenciación de éstas, principalmente para las Enterobacterias. MIO. Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (ornitina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. La descarboxilación es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico. La descomposición de los aminoácidos se produce anaeróbicamente. El proceso de descarboxilación es irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima común, el fosfato de piridoxal.
III.
OBJETIVOS A. Conocer las características que diferencian al grupo de las enterobacterias B. Conocer las características microscópicas y macroscópicas de las enterobacterias en diversos medios de aislamiento y diferenciación C. Conocer los géneros que integran la familia enterobacteriaceae D. Conocer las pruebas bioquímicas elementales que definen a géneros y especies.
IV.
METODOLOGÍA A. Material 1. Asas bacteriológicas 2. Asas bacteriológicas rectas. 3. Portaobjetos 4. Mechero 5. Cajas petri 6. Tubos de ensayo B. Reactivos 1. Equipo de tinción Gram 2. Reactivo para prueba de catalasa 3. Tiras reactivas para prueba de oxidasa 4. Reactivo de indol 5. Tubos de ensayo para pruebas de: a) Citrato de Simmons b) MIO c) SIM d) Degradación de nitratos e) TSI f) Urea 3
g) OF h) Lisina 6. Cajas petri con agar, dos de cada uno: a) Salmonella b) McConkey c) Sal y manitol C. Procedimiento 1. Tinción de Gram a) Realizar el procedimiento estándar para tinción de Gram en todas las cepas proporcionadas. b) Observar al microscopio e identificar si la prueba resulta negativa o positiva. 2. Catalasa a) Realizar el frotis de las dos cepas en un portaobjetos b) Agregar una gota de H2 O2 a cada frotis c) Notar si hay efervescencia o no 3. Oxidasa a) Con aplicadores de madera tomar una colonia de cada cepa b) Colocar las muestras en una tira reactiva y notar si hay cambio de coloración o no. 4. Cajas petri con agar. a) Por cada uno de los agares preparar dos cajas petri b) Sembrar cada cepa los distintos agares (McConkey, Salmonella y sal y manitol) c) Incubar a 37°C por 24 h d) Notar crecimiento y cambios de coloración 5. SIM a) Tomar una colonia con un asa recta estéril b) Sembrar por picadura hasta la sección intermedia del medio c) Repetir para cada cepa d) Incubar a 37°C por 24 h e) Adicionar gotas del reactivo de indol f) Notar cambios en crecimiento, coloración y motilidad de bacterias 6. MIO a) Tomar una colonia con un asa recta estéril b) Sembrar por picadura hasta la sección intermedia del medio c) Repetir para cada cepa d) Incubar a 37°C por 24 h e) Notar cambios en crecimiento, coloración y motilidad de bacterias 7. Citrato de Simmons a) Tomar una colonia con un asa estéril b) Sembrar por arrastre en la superficie del pico de flauta y por picadura en la sección inferior c) Repetir para cada cepa 4
8. OF
9. TSI
d) Incubar a 37°C por 24 h e) Notar cambios en crecimiento y coloración a) Tomar una colonia con un asa recta estéril b) Sembrar por picadura hasta la sección intermedia del medio en dos tubos c) Hacer lo mismo con otros dos tubos pero en este caso adicionar aceite de bebé en la superficie para generar un medio de anaerobiosis d) Repetir para cada cepa e) Incubar a 37°C por 24 h f) Notar cambios en crecimiento y coloración
a) Tomar una colonia con un asa estéril b) Sembrar por arrastre en la superficie del pico de flauta y por picadura en la sección inferior c) Repetir para cada cepa d) Incubar a 37°C por 24 h e) Notar cambios en crecimiento y coloración 10. Urea a) Tomar una colonia con un asa recta estéril b) Sembrar por picadura hasta la sección intermedia del medio c) Repetir para cada cepa d) Incubar a 37°C por 24 h e) Notar cambios en coloración y formación de gas 11. Degradación de nitratos a) Tomar una colonia con un asa recta estéril b) Sembrar por picadura hasta la sección intermedia del medio c) Repetir para cada cepa d) Incubar a 37°C por 48 h e) Adicionar dos gotas de ácido sulfanílico al 0,8% y dos gotas de alfa-naftilamina al 0,5% f) Notar cambios en coloración 12. Lisina a) Tomar una colonia con un asa estéril b) Sembrar por arrastre en la superficie del pico de flauta y por picadura en la sección inferior c) Repetir para cada cepa d) Incubar a 37°C por 24 h e) Notar cambios en crecimiento y coloración
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V. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Al equipo de trabajo le fueron suministradas dos cepas, identificadas únicamente como cepa 9 y cepa 10.
Fig 1. Cepa 9
Fig 2. Cepa 10
Una vez registradas las características macroscópicas de las cepas se realizó una tinción Gram. Ambas cepas resultaron ser Gram negativas (-).
Fig 3. Tinción negativa de cepa 9
Fig 4. Tinción negativa de cepa 10
Se realizaron las pruebas estándar de oxidasa y catalasa.
Fig 5. Prueba de catalasa para ambas cepas. Fig 6. Prueba de oxidasa para ambas cepas Ambas son positivas Ambas son negativas. 6
VI. CONCLUSIÓN A partir de las pruebas bioquímicas se lograron identificar las cepas numero 9 y 10, siendo Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli respectivamente. Las características macroscópicas y microscópicas, así como las pruebas bioquímicas fueron contundentes para mostrar estos resultados. VII.
BIBLIOGRAFÍA 1. Elmer W. K. (2008) Diagnóstico Microbiológico. 6a. Edición. Editorial Panamericana. 2. Jean F. Mc fadin. (2003). Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. 3ª. Edición. Editorial Panamericana. 3. AMPMPM, 1981, Microbiología médica, UNAM, México, pp 190- 548. 4. Bailey and Scot´s, 1985, Diagnostic microbiology, Mosby, four edition, España, pp 118-446. 5. Balows A, Hausler W. J. Hermann K. L. Isenberg H. D, Shadomy H. J, 1991, Manual of clinical microbiology, quinta edición, American society for microbiology, USA, pp 67-73.
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