LAPORAN PRAKTIKUM HPI (SB091523) Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas Hydrophila Hydrophila pada Ikan yang Terserang Penyakit serta Cara Pewarnaan Bakteri Aeromonas Hydrophila Hydrophila
Nama Kelompok Musallamah
1507 100 023
Evi Kurnia Sari
1507 100 039
Hutami Tri R
1508 100 008
Novita Mardhia A
1508 100 024
Kelompok IV Asisten Dosen Nanin Dwi Rinawati Dyah Eka W
JURUSAN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2011 BAB I PENDAHULUAN 1.1
Latar Belakang
Penyakit yang menyerang ikan tropis tawar pada umumnya adalah bakteri. Infeksi bakteri biasanya timbul apabila ikan menderita stres. Kematian banyak terjadi pada ikan yang menderita stres karena serangan bakteri yang menyebabkan infeksi. Bakteri Aeromonas hydrophila salah satu bakteri yang mengakibatkan penyakit dan mampu menyebabkan kegagalan budidaya ikan air tawar. Bakteri ini menyerang berbagai jenis ikan air tawar seperti Lele Dumbo, ( Clariusglariepinus), Ikan mas ( Cyprinus carpio), Gurami (Osphronemus gouramy) dan Udang Galah ( Macrobracium rusenbergil). Bakteri A.hydrophila dapat menimbulkan wabah penyakit dengan tingkat kematian tinggi (80-100%) dalam waktu 1-2 minggu (Purwaningsih, 2007) Bakteri dapat dilihat dengan mudah dan dipelajari. Tingkat sel kontras itu dapat ditingkatkan dengan cara pewarnaan. Yang dimaksud dengan pewarnaan disini adalah perlakuan dengan zat warna yang mengikat secara selektif baik seluruh sel maupun komponen sel tertentu, sehingga dapat menghasilkan penyerapan cahaya yang jauh lebih besar. 1.2
Tujuan
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk mengetahui bagaimana cara isolasi dan kultur bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta cara pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila.
1.3
Permasalahan
Permasalahan yang dibahas dalam praktikum ini adalah bagaimana cara isolasi dan kultur bakteri Aeromonas hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta bagaimana cara pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1
Bakteri Aeromonas hydrophila
Bakteri Aeromonas hydrophila umumnya hidup di air tawar yang mengandung bahan organik tinggi. Ciri utama bakteri A. hydrophila adalah berbentuk batang, berdiameter 0,3 - 1,0 mikrometer dan panjang 1,0 -3,5 mikrometer, bersifat Gram negatif, hidup pada temperatur optimal 22 - 28°C, gelatinase positif (Holt et al., 1994). Selain itu bakteri ini juga bersifat fakultatif aerobik (dapat hidup dengan atau tanpa oksigen) yang mengubah karbohidrat menjadi asam dan gas, tidak berspora, bersifat motil (bergerak aktif) karena memiliki flagel (Monotrichous flagella) yang keluar dari salah satu kutubnya, koloni bakteri ini pada media agar benvarna putih kekuningan, bentuk bulat cembung, oksidase sitokrom dan reaksi katalase positif. Bakteri ini senang hidup di lingkungan perairan bersuhu 15 - 30°C dan pH antara 53-9 (Ghufran dan Kordi, 2004). A. hydrophila merupakan bakteri agen penyebab penyakit BHS (Bacterial Hemorrhagic Septicemia) atau MAS (Motil Aeromonad Septicemia) (Irianto, 2006). Berikut adalah klasifikasi Aeromonas hydrophila (Holt et. al. 1998): Filum
: Protophyta
Kelas
: Schizomycetes
Ordo
: Pseudanonadeles
Family
: Vibrionaceae
Genus
: Aeromonas
Spesies
: Aeromonas hydrophila
2.2
Penyakit MAS ( Motile Aeromonas Septicaemia)
Salah satu jenis ikan air tawar, lele yang terkena bakteri ini mengalami gejala warna tubuh menjadi gelap, kulit kesat dan timbul pendarahan. Lele bernafas megap-megap di 1
permukaan air (Anonim , 2009). Menurut Sugianti (2005) gejala yang menyertai serangan bakteri ini antara lain ulser yang berbentuk bulat/tidak teratur dan berwarna merah keabu-abuan, inflamasi dan erosi di dalam rongga dan di sekitar mulut seperti penyakit mulut merah ( red mouth disease). Tanda lain adalah haemorhagi pada sirip dan eksopthalmia (pop eye) yaitu mata membengkak dan menonjol (Nitimulyo et al., 1993). Selain itu ciri-ciri lainnya adalah pendarahan pada tubuh, sisik terkuak, borok, nekrosis, busung, dan juga ikan lemas sering di permukaan atau dasar kolam (Dana dan Angka, 1990).
2.2.1
Pencegahan Penyakit MAS 1
Lingkungan harus tetap bersih, termasuk kualitas air harus baik (Anonim , 2009).Berikut adalah standarisasi budidaya Lele dalam mencegah perkembangan Bakteri A. hydrophila.Tanah yang baik untuk pembuatan kolam pemeliharaan adalah jenis tanah liat/lempung, tidak berporos, berlumpur dan subur. Mutu air yang digunakan untuk perkolaman harus memenuhi syarat sebagai berikut: Idealnya untuk tumbuh dan berkembangbiak ikan dalam kolam ialah : Oksigen sebanyak 0,3 ppm, Karbondioksida kurang dari 12,8 mg/liter, Amoniak terikat 147,29 – 157,56 0
0
mg/liter. Keasaman air ideal antara pH 6,5-9., suhu 20 C, dengan suhu optimal antara 25-28 C. 0
Sedangkan untuk pembentukan larva diperlukan kisaran suhu antara 26- 30 C dan untuk 0
2
pemijahan 24- 28 C (Anonim , 2009). 2.2.2
Pengobatan Penyakit MAS
Penanggulangan bakteri Aeromonas dapat dilakukan dengan menggunakan antibiotik melalui perendaman, penyuntikan atau dicampur dengan pakan.Perendaman dilakukan dalam
larutan Kalium Permanganat (PK) 10-20 ppm selama 30-60 menit atau 3-5ppm selama 12-24 jam. larutan 5-10 ppm selama selama 12-24 jam, Oxytetracycline 5 ppm selama 24 jam, Imequil 5 ppm selama 24 jam, 5-8 m3 air untuk waktu yang tidak terbatas (Kordi, 2004). Pengobatan dapat dilakukan melalui makanan antara lain pakan dicampur Terramycine dengan dosis 50 mg/kg ikan/hari, diberikan selama 7-10 hari berturut-turut atau dengan 2
Sulphonamid sebanyak 100 mg/kg ikan/hari selama 3-4 hari. (Anonim , 2009). Sedangkan penanngulangan dengan cara penyuntikan dilakukan dengan Oxytetracycline 20-40 mg/kg ikan, Kanamycin 20-40 mg/kg ikan atau Streptomycine 20-60 mg/kg ikan (Kordi, 2004). 2.3
Pewarnaan Bakteri
Pewarnaan bakteri terdapat 2 metode yaitu pewarnaan sederhana dan pewarnaan bertingkat. a. Pewarnaan Sederhana Pewarnaan sederhana bertujuan untuk mempelajari kegunaan pewarnaan untuk mempertinggi
kontras
antara
sel
dan
sekelilingnya
dan
mengamati
ciri
ciri
bakteri.Pewarnaan sederhana dibagi menjadi 2 yaitu pewarnaan langsung dan tidak langsung. Pada pewarnaan langsung memiliki prinsip bakteri diwarnai oleh reagen tunggal.pewarna dasar dengan kromogen muatan positif disarankan,selama asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogen. Pewarnaan tak langsung (basa atau positif) memiliki prinsip memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri.oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna (Irianto, 2006). b. Pewarnaan Bertingkat Pengecatan bertingkat menggunakan lebih dari satu macam bahan cat.Bahan yang digunakan dalam pewarnaan adakalanya terpisah, atau adalanya dicampur dan digunakan dalam satu larutan.Pengecatan bertingkat digunakan untuk penggolongan bakteri dan penampakan struktur tubuh sel bakteri (Irianto, 2006).
2.3.1
Pewarnaan Langsung
Pewarnaan langsung bertujuan untuk mewarnai apusan bakteri dengan satu jenis zat pewarna sederhana yang bersifat basa. Prinsip pewarnaan langsung, bakteri diwarnai oleh reagen tunggal. Pewarna dasar dengan kromogen muatan positif disarankan, selama asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogen. Lamanya waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarna yang digunakan. Karbol fuchsin membutuhkan 15-30 detik,Kristal violet 2-60 detik,dan Methilen Blue 1-2 menit (Irianto, 2006) Pewarnaan ini dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan.Bahan dan alat sudah disiapkan dalam keadaan steril, agar bakteri yang akan diamati tidak terkontaminasi dengan
peralata-peralatan
yang
digunakan.
Kaca
obyek
yang
bersih
dan
tidak
berlemak.Penggunaan aquades adalah untuk menghindari tercampurnya mikroorganisme yang akan diamati dengan mikroorganisme lain yang terbawa dari bahan dan peralatan praktikum. Penggunaan kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak adalah agak lemak tidak mempengaruhi proses fiksasi bakteri dengan zat kimia tertentu. Kemudian jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser-geserkan pada air dikaca obyek dan dibiarkan kering di atas api spirtus sampai kering. Pemijaran jarum ose digunakan untuk sterilisasi jarum ose agar tidak terkena kontam dari mikroorganisme lain. Selanjutnya metilen blue diteteskan sebanyak 5 tetes pada kaca obyek dan dibiarkan zat pewarna tersebut menutupi seluruh permukaan apusan dan dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati. Pencucian dilakukan diatas staining jar dengan menggunakan tetesan air dari pipet dan tidak langsung dibuang di saluran pembuangan karena dikhawatirkan mikrorganisme yang digunakan terbawa oleh air dan mencemari perairan. Kaca obyek dikeringkan dengan cara meletakkan di atas kertas saring atau tissue. Cara ini dilakukan agar sisa-sisa air setelah pencucian tidak mengganggu pengamatan dengan mikroskop. Apusan ditetesi dengan minyak emersi dan preparat siap untuk diamati dibawah mikroskop. Minyak imersi berguna untuk menjernihkan kaca obyek dan kaca penutup agar memfokuskan gambar yang diamati dimikroskop. Hasil yang diperoleh adalah pada bakteri E.coli dengan pengamatan dimikroskop perbesaran 1000 terlihat bahwa bakteri ini berbentuk basil atau batang, selnya berwarna biru dengan background berwarna ungu. Pada bakteri Bacillus sp. dengan pengamatan dimikroskop perbesaran 1000
terlihat bahwa bakteri ini berbentuk basil atau batang, selnya berwarna biru dengan background berwarna ungu (Irianto, 2006). 2.3.2
Pewarnaan Tidak Langsung
Pewarnaan tidak lansung dapat juga disebut pewarnaan negatif atau pewarnaan asam. Pewarnaan negatif memerlukan pewarna asam seperti eosin atau negrosin. Pewarna asam memiliki negatif charge kromogen, tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. Oleh karena itu,sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat diperoleh dengan lebih tepat (Hadiotomo, 1990). Pewarnaan ini dimulai dengan mempersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Bahan dan alat sudah disiapkan dalam keadaan bersih, agar bakteri yang akan diamati tidak terkontaminasi dengan peralatan - peralatan yang digunakan meneteskan tinta cina pada kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak. Penggunaan kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak adalah agak lemak tidak mempengaruhi proses fiksasi bakteri dengan zat kimia tertentu. Kemudian jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser-geserkan pada air dikaca obyek. Pemijaran jarum ose merupakan teknik sterilisasi insenerasi yaitu dengan pemanasan kering. Perlakuan ini bertujuan untuk mengurangi kontaminasi oleh bakteri-bakteri lainnya yang tidak diinginkan. Jarum ose dipijarkan pada api bunsen. Inokulasi tinta cina pada kaca obyek dengan bakteri. Selanjutnya kaca obyek yang lain diambil, lalu diletakkan ujungnya dengan kedudukan miring di pinggir tetesan zat pewarna yang telah diinokulasikan bakteri. Kaca obyek lain didorong pada kaca objek yang terdapat tinta cina dan bakteri, sehingga tetesan tinta cina tersebar merata membentuk apusan tipis dipermukaan kaca obyek pertama, hal ini dilakukan supaya didapatkan film zat warna yang tipis sama rata.Lalu keringkan kaca obyek dengan cara meletakkan di atas kertas saring atau tissue. Cara ini dilakukan agar sisa-sisa air setelah pencucian tidak mengganggu pengamatan dengan mikroskop. Apusan ditetesi dengan minyak emersi dan diamati dibawah mikroskop. Minyak imersi berguna untuk menjernihkan kaca obyek dan kaca penutup agar memfokuskan gambar yang diamati dimikroskop Hasil yang diperoleh adalah pada bakteri Escherichia coli dengan perbesaran 1000 pada mikroskop terlihat bahawa bentuknya basil atau batang dengan warna sel yang transparan
dan warna background hitam. Pada bakteri Bacillus sp. dengan perbesaran 1000 pada mikroskop terlihat bahwa bentuknya basil atau batang dengan warna sel yang transparan dan warna background hitam (Irianto, 2006). 2.3.3
Pewarnaan Gram
Pewarnaan gram merupakan salah satu teknik pewarnaan diferensial yang penting dan yang paling luas digunakan. Pewarnaan ini digunakan untuk mengidentifikasi bakteri gram positif dan gram negative berdasarkan warna akhir yang terbentuk yaitu gram positif berwarna ungu dan gram negatif berwarna merah. Proses pewarnaan diferensial ini memerlukan 4 jenis reagen. Reagen pertama disebut warna dasar, berupa pewarna basa, jadi pewarna ini akan mewarnai dengan jelas. Reagen kedua disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent). Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna, maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak kuat menelan warna dasar, maka warna akan tercuci. Reagen terakhir adalah warna pembanding, bila warna tidak tercuci maka warna pembanding akan terlihat, yang terlihat pada hasil akhir tetap warna dasar. Bakteri hidup sulit untuk dilihat dengan mikroskop cahaya terang biasa karena bakteri itu tampak tidak berwarna jika diamati secara sendiri, walaupun biakannya secara keseluruhan mungkin berwarna. Bakteri sering diamati dalam keadaan olesan terwarnai daripada dalam keadaan hidup. Yang dimaksud dengan bakteri terwarnai adalah oganisme yang telah diwarnai dengan zat pewarna kimia agar mudah dilihat dan dipelajari (Volk dan Whleer, 1998). Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu: a. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer. b. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat. c. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin. d. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet. e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana. f. Tidak resisten terhadap gangguan fisik. Pewarnaan ini dimulai dengan meneteskan tinta cina pada kaca. (Hadiotomo, 1990)
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu: a. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer. b. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat. c. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin. d. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal. e. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit. f. Lebih resisten terhadap gangguan fisik. (Hadiotomo, 1990) Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya.Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alkohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negatif lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm). (Hadiotomo, 1990) 2.4
Patogenesis Penyakit
Menurut Botterelli dan Ossiprandi 1999 yang diacu dalam Hidayat 2006, sebagaimana halnya bakteri enteropatogenik, terdapat dua mekanisme patogenesa infeksi bakteri Aeromonas hydrophila, yaitu: a. Tissue adherence. Mekanisme ini diperantarai oleh S-Layer. S-Layer membantu penempelan dan kolonisasi bakteri pada mukosa usus. Proses ini juga dibantu oleh struktur filamentous (fimbriae) atau membranous (adhesins) yang memiliki aktivitas hemagglutinasi, terutama ditemukan pada strain mesofilik. b. Toxin production. Toksin Aeromonas dapat diklasifikasikan menjadi endotoksin dan eksotoksin. Cytotoxins dan enterotoxins (termasuk aktivitas haemolytic) merupakan yang paling penting dalam patogenitas (Hidayat 2006).
2.4.1
Patogenitas Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila yang patogen, diduga memproduksi faktor-faktor eksotoksin dan
endotoksin, yang sangat berpengaruh pada patogenitas bakteri ini. Eksotoksin merupakan komponen protein terlarut, yang disekresikan oleh bakteri hidup pada fase pertumbuhan eksponensial. Produksi toksin ini biasanya spesifik pada beberapa spesies bakteri tertentu baik Gram positif maupun Gram negatif, yang menyebabkan terjadinya penyakit terkait dengan toksin tersebut. Endotoksin adalah toksin yang merupakan bagian integral dari dinding sel bakteri Gram negatif. Aktivitas biologis dari endotoksin dihubungkan dengan keberadaan lipopolisakarida (LPS). LPS merupakan komponen penyusun permukaan dari membran terluar (outer membrane) bakteri Gram negatif (Syamsir 2008) Eksotoksin yang diproduksi oleh Aeromonas hydrophila meliputi hemolisin, protease, elastase, lipase, sitotoksin, enterotoksin, gelatinase, kaseinase, lecithinase dan leucocidin. Hemolisin merupakan enzim yang mampu melisiskan sel-sel darah merah dan membebaskan hemoglobinnya. Protease adalah enzim proteolitik yang berfungsi untuk melawan pertahanan tubuh inang untuk berkembangnya penyakit dan mengambil persediaan nutrient inang untuk berkembangbiak (Angka 2001). Aeromonas hydrophila dapat memanfaatkan albumin, kasein, fibrinogen, dan gelatin sebagai substrat protein. Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa bakteri ini bersifat proteolotik (Shotts et al. 1985), sehingga berpotensi besar sebagai patogen ikan. Adanya enzim proteolitik akan merusak dinding intenstin, sehingga terjadi penebalan dinding, udem dan semi transparan (Munro 1982). Ketika Aeromonas hydrophila masuk ke dalam tubuh inang, maka toksin yang dihasilkan akan menyebar melalui
aliran darah menuju organ. Enterotoksin merupakan suatu toksin ekstraseluler bakteri yang khususnya menyerang saluran gastrointestinal. Lechitinase adalah enzim yang menghancurkan berbagai sel jaringan dan terutama aktif melisiskan sel-sel darah merah, sedangkan leucocidin adalah enzim yang dapat membunuh sel-sel darah putih (Pleczar & Chan 1988). Hirono dan Aoki (1991) menambahkan bahwa Aeromonas hydrophila dapat memproduksi toksin ekstrasellular acetylcholinesterase, phospholipids, acyltransferase dan protease. Bakteri Aeromonas hydrophila memiliki struktur dinding sel berupa Lipopolisakarida (LPS) yang dikenal sebagai endotoksin. Menurut Syamsir (2008), LPS dapat menyebabkan peradangan, demam, penurunan kadar besi, dan pembekuan darah. Angka (2001) menambahkan bahwa LPS dapat menyebabkan shock pada inang. Endotoksin akan dilepaskan ke lingkungan hanya apabila bakteri tersebut mati dan mengalami lisis. Disamping mampu memproduksi
eksotoksin dan endotoksin sebagai faktor virulensi, Aeromonas hydrophila patogen juga memiliki kemampuan untuk menempel pada sel tubuh ikan melalui aktifitas adhesins (Trust et al. diacu dalam Austin & Austin 1993). Adhesins ini bersifat sangat selektif, hanya mampu mengenali rantai polimer D-mannosa dan L-sucosa yang terletak pada permukaan sel eukariot. Dengan menempelnya Aeromonas hydrophila pada permukaan sel inang, kemungkinan besar sel inang tersebut akan terinfeksi (Austin & Austin 1993). 2.4.2 Ciri-Ciri ikan yang Terserang Aeromonas hydrophilla Aeromonas hydrophila telah dihubungkan dengan beberapa penyakit pada ikan, termasuk
busuk ekor, busuk sirip, dan haemorrahagic septicaemia. Haemorrahagic septicaemia ditandai oleh adanya luka kecil pada permukaan, sering mengarah pada pengelupasan sisik, pendarahan pada insang dan dubur, borok, bisul, exophthalmia (mata membengkak), dan pembengkakan perut. Pada bagian dalam, dimungkinkan adanya cairan ascitic di dalam rongga peritoneal, kekurangan darah merah, dan pembengkakan ginjal dan hati (Miyazaki dan Kage, 1985). Agen etiologik dipindahkan secara horisontal (antar binatang selain dari induk dan keturunan) tetapi tidak secara vertikal (dari induk ke keturunan). Bakteri memperbanyak diri di dalam usus, menyebabkan
suatu
radang
haemorrhagic
mucuous-desquamative
(pengeluaran
lendir
berlebihan). Metabolit beracun Aeromonas hydrophila diserap dari usus dan menginduksi keracunan. Pendarahan pada kapiler terjadi di permukaan sirip dan di submukosa perut. Sel hepatik dan epitel dari tubulus ginjal menunjukkan adanya degenerasi. Glomeruli dihancurkan dan jaringan menjadi berdarah, dengan eksudat dari serum dan fibrin (Miyazaki dan Jo, 1985). Aeromonas menghasilkan banyak produk yang bersifat toksik bagi sel-sel lain. Beberapa dilepaskan dari sel aktif dalam bentuk terlarut, sedang yang lain tetap berasosiasi dengan permukaan sel, dan yang lainnya dilepaskan saat kematian sel. Tiga protein ekstraselular Aeromonas yang diketahui berkaitan dengan patogenitas telah dikloning, disekuen, dan dikarakterisasi secara biokimia. Protein tersebut yaitu aerolysin, GCAT (Glycerophospholipid Cholesterol Acyltransferase), dan serin protease (Rodriguez et al., 1992). Penjangkitan penyakit biasanya berhubungan dengan perubahan kondisi lingkungan. Stres, overcrowding (populasinya padat), suhu tinggi, perubahan suhu secara mendadak, penanganan yang kasar, transfer ikan, rendahnya oksigen terlarut, rendahnya persediaan makanan, dan infeksi fungi atau parasit, berpengaruh pada perubahan fisiologis dan menambah kerentanan terhadap infeksi.
Gambar : Morfologi infeksi Aeromonas hydrophila pada ikan (Sumber: Hayes, 2000)
BAB III METODOLOGI 3.1
Alat dan Bahan
3.1.1
Alat
Peralatan yang diperlukan dalam praktikum ini adalah cawan petri, tabung reaksi, jarum ose, bunsen, alas lilin, kapas, kaca obyek, kaca penutup. 3.1.2
Bahan
Bahan-bahan yang dibutuhkan dalam praktikum ini adalah alkohol, medium TSA, biakan bakteri Aeromonas hidrophila, ikan mas, Kristal violet, lugol, safranin, methanol, akuades. 3.2
Cara Kerja
3.2.1
Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari Ikan mas
Diambil ikan yang diduga terserang parasit bakteri Aeromonas hydrophila.Di scrapping bagian luar tubuh ikan yang diduga terserang Aeromonas hydrophila.Di lakukan metode streak pada medium agar yang telah steril. Di inkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang terbentuk. 3.2.2
Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari biakan
Di siapkan biakan bakteri Aeromonas hydrophila.Di lakukan metode streak pada medium agar yang telah steril. Di inkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang terbentuk. 3.2.3
Pewarnaan Gram Bakteri Aeromonas hydrophila
Dipersiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Air diteteskan pada kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak. Jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser-geserkan pada air dikaca obyek dan dibiarkan kering di atas api spirtus sampai kering. Crystal violet diteteskan pada kaca obyek, dibiarkan selama 3-4 menit. Cuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Lugol atau iodine diteteskan, dibiarkan selama 3-4 menit. Cuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Direndam apusan dalam metanol selama 30 detik. Dicuci apusan pada air mengalir.Warnai dengan safranin selama 1 menit sebagai warna pembanding, Cuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati. Digambar hasil pengamatannya.
BAB IV ANALISA DATA DAN PEMBAHASAN 4.1
Analisa Data
4.1.1
Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari Ikan mas
No
1.
Perlakuan
Pengamatan
Diambil ikan yang diduga terserang parasit
bakteri
Ikan yang di gunakan adalah ikan mas
Aeromonas
hydrophila
2.
Di scrapping bagian luar tubuh ikan
Yang diambil adalah pada bagian yang terkena luka
yang diduga terserang Aeromonas hydrophila
3.
Di lakukan metode streak pada medium agar yang telah steril
4.
Di inkubasi salama 48 jam
5.
Di amati koloni yang terbentuk
Koloni yang terbentuk
4.1.2
Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari biakan
No
1.
Perlakuan
Disiapkan
biakan
Pengamatan
bakteri
Aeromonas hydrophila
2.
Di lakukan metode streak pada medium agar yang telah steril
3.
Di inkubasi salama 48 jam
4.
Di amati koloni yang terbentuk
4.1.3
Pewarnaan Gram Bakteri Aeromonas hydrophila
No.
1.
medium rusak,dan koloni tidak tumbuh
Perlakuan
Pengamatan
Dipersiapkan alat dan bahan yang
Alat : Jarum ose, bunsen, kaca obyek
diperlukan Bahan : Kultur murni (Aeromonas hydrophila), Zat warna asam (Kristal violet, iodin atau lugol, safranin), Metanol 2.
Air diteteskan pada kaca obyek Terdapat gumpalan air pada kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak
3.
Jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit
biakan
bakteri,
dicampurkan sedikit dan digesergeserkan pada air dikaca obyek dan dibiarkan kering di atas api spirtus sampai kering
Sedikit biakan bakteri terangkat pada jarum ose
4.
Crystal violet diteteskan pada kaca
Crystal violet memberikan warna ungu
obyek, dibiarkan selama 3-4 menit
5.
Cuci kelebihan zat pewarna dengan
Kelebihan warna memudar
air secara hati-hati
6.
Lugol
atau
iodine
diteteskan,
dibiarkan selama 3-4 menit
7.
Cuci kelebihan zat pewarna dengan
Kelebihan warna memudar
air secara hati-hati
8.
Direndam apusan dalam metanol
Preparat terendam dalam alkohol
selama 30 detik 9.
Cuci apusan pada air mengalir
Kelebihan alkohol hilang
10.
Warnai dengan safranin selama 1
Safranin memberikan warna merah
menit sebagai warna pembanding,
Kelebihan warna memudar
Cuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati
11.
Digambar hasil pengamatannya
Aeromonas hydrophila
4.2
Pembahasan
Praktikum yang berjudul isolasi dan kultur bakteri A. hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta cara pewarnaan bakteri A. hydrophila ini bertujuan untuk mengetahui bagaimana cara isolasi dan kultur bakteri A. hydrophila pada ikan yang terserang penyakit serta cara pewarnaan bakteri A. hydrophila. 4.2.1
Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari Ikan mas
Langkah awal yang dilakukan dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan.Kemudian diambil ikan yang diduga terserang parasit bakteri A. hydrophila, setelah itu discrapping bagian luar tubuh ikan yang diduga terserang A. hydrophila.Bagian yang discrapping adalah bagian tubuh ikan yang terkena luka. Hal ini dimaksudkan agar pada bagian ikan yang luka terdapat bakteri yang menginfeksi ikan. Kemudian dilakukan metode streak pada medium agar yang telah steril. Dilakukan metode streak dengan tujuan agar dapat diamati koloni bakteri yang terbentuk serta morfologi dari koloni tersebut.
Gambar 4.1 Cara membuka cawan Petri saat penggoresan
Gambar 4.2 cara streak dengan teknik gores kuadran Teknik goresan yang kita pergunakan adalah teknik goresan kuadran. Prinsipnya adalah sama dengan yang lainnya yaitu pengenceran dimana goresan pertama paling padat kemudian menjadi semakin tersebar sampai pada goresan ke empat yang terletak ditengah-tengah media. Bila metode ini dilakukan dengan baik akan menghasilkan isolasi mikroorganisme, koloninya yang terpisah berasal dari satu sel. Setelah itu diinkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang terbentuk. Tujuan diinkubasi adalah agar bakteri dapat tumbuh dan membentuk koloni.
Aeromonas hydrophila bersifat gram negatif, oksidasi positif dan katalase positif (Krieg dan Holt 1984). Bakteri ini juga mampu memfermentasikan beberapa gula seperti glukosa, fruktosa, maltosa, dan trehalosa. Hasil fermentasi dapat berupa senyawa asam atau senyawa asam dengan gas. Pada nutrient agar setelah 24 jam dapat diamati koloni bakteri dengan diameter 1-3 mm yang berbentuk cembung, halus dan terang (Isohood dan Drake 2002). Dari hasil pengamatan menunjukkan bahwa koloni yang terbentuk adalah bulat, berwarna putih dan tepinya tidak beraturan seperti terlihat pada gambar dibawah ini. Ciri-ciri koloni Aeromonas adalah pada media agar benwarna putih kekuningan, berbentuk bulat cembung, oksidase sitokrom dan reaksi katalase positif.
Gambar 4.3 Koloni yang terbentuk dari isolasi bakteri pada ikan Bakteri merupakan mikroorganisme yang sangat sederhana, tidak mempunyai nucleus tetapi memiliki nukleoid yang terbentuk seperti nukleus dan sifatnya berbeda dengan organisme yang mempunyai inti sel. Bakteri termasuk organisme yang mempu menguraikan bahan organik menjadi unsur anorganik sederhana yang bisa dimanfaatkan organisme produsen dalam proses fotosentesis. Seperti telah kita ketahui bahwa satuan ukuran bakteri adalah micron, namun ketika ditumbuhkan dalam media umumnya akan membentuk koloni. Koloni inilah yang memudahkan kita melakukan pengamatan secara langsung dan visual. Setelah waktu inkubasi bakteri yang tergores pada media di harapkan tumbuh dan menyebar dan bisa terpisah membentuk kolonikoloni terpisah. Menururt Tarigan (1988) kebutuhan mikroorganisme untuk pertumbuhan dapat dibedakan menjadi dua kategori, yaitu: kebutuhan fisik dan kebutuhan kimiawi atau kemis. Aspek-aspek fisik dapat mencakup suhu, pH dan tekanan osmotik. Sedangkan kebutuhan kemis meliputi air, sumber karbon, nitrogen oksigen, mineral-mineral dan faktor penumbuh. Dalam pertumbuhannya setiap makhluk hidup membutuhkan nutrisi yang mencukupi serta kondisi lingkungan yang mendukung demi proses pertumbuhan tersebut, termasuk juga bakteri. Menurut Darkuni (2001) pertumbuhan bakteri pada umumnya akan dipengaruhi oleh faktor lingkungan. Pengaruh faktor ini akan memberikan gambaran yang memperlihatkan peningkatan jumlah sel
yang berbeda dan pada akhirnya memberikan gambaran pula terhadap kurva pertumbuhannya. Kebutuhan-kebutuhan tersebut dipenuhi dari media pertumbuhan yang kita gunakan dan pengkondisian pada saat inkubasi. Pertumbuhan merupakan proses bertambahnya ukuran atau subtansi atau masa zat suatu organisme, misalnya kita makhluk makro ini dikatakan tumbuh ketika bertambah tinggi, bertambah besar atau bertambah berat. Pada organisme bersel satu pertumbuhan lebih diartikan sebagai pertumbuhan koloni, yaitu pertambahan jumlah koloni, ukuran koloni yang semakin besar atau subtansi atau masssa mikroba dalam koloni tersebut semakin banyak, pertumbuhan pada mikroba diartikan sebagai pertambahan jumlah sel mikroba itu sendiri seperti pada gambar di bawah ini.
Gambar 4.4 pertumbuhan bakteri pada media agar 4.2.2
Isolasi dan Kultur Bakteri Aeromonas hydrophila dari biakan
Langkah awal yang dilakukan dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan bahan yang dibutuhkan. Kemudian menyiapkan biakan bakteri A. hydrophila. Di lakukan metode streak pada medium agar yang telah steril. Dilakukan metode streak dengan tujuan agar dapat diamati koloni bakteri yang terbentuk serta morfologi dari koloni tersebut. Di inkubasi salama 48 jam dan di amati koloni yang terbentuk. Pada saat pengamatan ternyata medium tidak tumbuh koloni. Hal ini kemungkinan disebabkan karena pada saat melakukan streak bakteri jarum ose yang digunakan terlalu panas sehingga biakan bakteri yang diambil mati sehingga tidak tumbuh. Selain itu dimungkinkan disebabkan oleh umur kultur bakteri terlalu lama atau tua sehingga dimungkinkan mati. 4.2.3
Pewarnaan Gram Bakteri Aeromonas hydrophila
Langkah awal yang dilakukan dalam praktikum ini adalah menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Air diteteskan pada kaca obyek yang bersih dan tidak berlemak. Jarum ose dipijarkan dan diambil sedikit biakan bakteri, dicampurkan sedikit dan digeser-geserkan pada air
dikaca obyek dan dibiarkan kering di atas api spirtus sampai kering. Crystal violet diteteskan pada kaca obyek, dibiarkan selama 3-4 menit. Penambahan kristal violet berfungsi sebagai pewarna bakteri.Kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati. Lugol atau iodine diteteskan, dibiarkan selama 3-4 menit. Penambahan Lugol berfungsi untuk mematikan bakteri. Kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Direndam apusan dalam metanol selama 30 detik. Metanol berfungsi untuk fiksasi. Kemudian dicuci apusan pada air mengalir. Kemudian diwarnai dengan safranin selama 1 menit sebagai warna pembanding, kemudian dicuci kelebihan zat pewarna dengan air secara hati-hati.Penambahan safranin berfungsi untuk memperjelas pewarnaan bakteri. Setelah itu digambar hasil pengamatan. Hasil pewarnaan menunjukkan bahwa bakteri hasil pewarnaan adalah bakteri Aeromonas hydrophila. Aeromonas adalah jenis bakteri yang bersifat metropolitan, oksidasif, anaerobik fakultatif, dapat
memfermentasi gula, gram negatif, tidak membentuk spora, bentuk akar, dan merupakan penghuni asli lingkungan perairan. Aeromonas hydrophila adalah bakteri gram negatif. Hal ini sesuai dengan pernyataan Holt et all tahun 1994 yang menyatakan bahwa bakteri Aeromonas hydrophila umumnya hidup di air tawar yang mengandung bahan organik tinggi. Ciri utama
bakteri A. hydrophila adalah berbentuk batang, berdiameter 0,3 - 1,O mikrometer dan panjang 1,O -3,5 mikrometer, bersifat Gram negatif, hidup pada temperatur optimal 22 2g°C, gelatinase positif (Holt et all.,
1994). Selain itu bakteri ini juga bersifat fakultatif
aerobik (dapat hidup dengan atau tanpa oksigen) yang mengubah karbohidrat menjadi asam dan gas, tidak berspora, bersifat motil (bergerak aktif) karena memiliki flagel (Monotrichous flagella) yang keluar dari salah satu kutubnya, bakteri ini senang hidup di lingkungan perairan bersuhu 15 - 30°C dan pH antara 53-9 (Ghufran dan Kordi, 2004). A. hydrophila merupakan bakteri agen penyebab penyakit BHS ( Bacterial Hemorrhagic Septicemia) atau MAS
( Motil Aeromonad
Septicemia) (Irianto, 2005). Ketika diwarnai bakteri Aeromonas
berwarna merah. Hal ini disebabkan karena Aeromonas adalah jenis bakteri gram negatif. Ketika penambahan kristal violet baik bakteri gram positif ataupun gram negatif dapat terwarnai duaduanya dimana warna yang terbentuk adalah warna biru. Ketika penambahan metanol maka bakteri gram negatif pada bagian lipidnya akan terdegradasi sehingga bakteri gram negatif yang tadinya terwarnai menjadi tak berwarna. Kemudian penambahan lugol berfungsi untuk membunuh bakteri. Selanjutnya ditambahkan safranin, penambahan safranin akan mewarnai
bakteri gram negatif yang tadinya tidak berwarna. Sedangkan bakteri gram positif sudah tidak bisa menyerap warna lagi karena sudah terwarnai pada penambahan kristal violet.
Gambar 4.5 hasil pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila Aeromonas hydrophila merupakan salah satu bakteri penyebab penyakit pada budidaya
ikan air tawar. Bakteri tersebut menyerang ikan mas yang merupakan salah satu komoditas unggulan air tawar dan dapat menginfeksi ikan pada semua ukuran yang dapat menyebabkan kematian sampai 80%. Penanggulangan bakteri Aeromonas terutama A. hydrophila yang menginfeksi ikan mas dengan menggunakan antibiotik sudah banyak dilakukan, tetapi usaha tersebutdapat mengakibatkan terjadinya resistensi terhadap bahan-bahan kimia (antibiotik) dan penggunaan vaksin masih memungkinkan ikan dengan mudah diserang oleh bakteri atau penyakit lain. A. hydrophila telah dihubungkan dengan beberapa penyakit pada ikan, termasuk busuk ekor, busuk sirip, dan haemorrahagic septicaemia. Haemorrahagic septicaemia ditandai oleh adanya luka kecil pada permukaan, sering mengarah pada pengelupasan sisik, pendarahan pada insang dan dubur, borok, bisul, exophthalmia (mata membengkak), dan pembengkakan perut.Pada bagian dalam, dimungkinkan adanya cairan ascitic di dalam rongga peritoneal, kekurangan darah merah, dan pembengkakan ginjal dan hati (Miyazaki dan Kage, 1985).
Gambar 4.6 hasil pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila (Literatur) Pencegahan dalam budidaya perairan dapat dilakukan dengan beberapa langkah yaitu: 1. Hindari perpindahan ikan dari satu kolam ke kolam lain. Ikan secara bertahap membangun resistansi terhadap bakteri local tapi dapat membawa organisme virulen bila dipindahkan.
2. Sediakan kondisi lingkungan optimal, berikan perhatian khusus pada mempertahankan tingkat oksigen dan penanganan ikan yang hati-hati. Perawatan dengan menggunakan alat sangat menolong saat mensortir, penanganan atau pemindahan bibit ikan. 3. Sebisa mungkin hindari penggunaan antibiotik, meskipun antibiotik dan disinfektan seringkali terbukti ampuh digunakan dengan ditambahkan pada air sebanyak 2-4 ppm seperti acriflavin dan prophylactic (Warren, 1991). Penggunaan antibiotik dapat menyebabkan resistensi pada patogen. 4. Sebagai pengganti antibiotik, gunakan vaksin yang bersifat spesifik Aeromonas, probiotik, atau bioaktif yang terbukti ampuh untuk meningkatkan kekebalan tubuh ikan. 3
(Anonim , 2011).
BAB V KESIMPULAN
Kesimpulan yang diperoleh dari parktikum ini adalah isolasi dan kultur bakteri pada ikan dapat dilakukan dengan metode streak dengan teknik gores kuadran. Teknik pewarnaan bakteri Aeromonas hydrophila dapat dilakukan dengan 4 tahapan yaitu penambahan Kristal violet,
penambahan lugol, fiksasi dengan methanol dan penambahan safranin. Bakteri Aeromonas merupakan jenis bakteri yang bersifat metropolitan, oksidasif, anaerobik fakultatif, dapat memfermentasi gula, gram negatif, tidak membentuk spora, bentuk akar, dan merupakan penghuni asli lingkungan perairan. Aeromonas hydrophila juga merupakan salah satu bakteri penyebab penyakit pada budidaya ikan air tawar.
DAFTAR PUSTAKA 1
Hama
Anonim .2009.
dan
Penyakit
Ikan
Lele.
Diakses
dari
http://1001peluangusaha.wordpress.com pada tanggal 14 Januari 2011 Pukul 15.00 WIB 2
Anonim .
2009.
Standar
Operasi
dan
proses
Budidaya
Ikan
Lele.
Diakses
darihttp://r1organik.com pada tanggal 14 Januari 2011 Pukul 17.00 WIB 3
Anonim . 2011. Mengantisipasi Serangan Bakteri Aeromonas pada Ikan. Diakses dari http://benihikan.net/penyakit/mengantisipasi-serangan-bakteri-aeromonas-pada-ikanpatin-dan-manusia/ pada tanggal 15 Januari pukul 17.00 WIB Angka, Sri Lestari. 2005. Kajian Penyakit Motil Aromonad Septicema (MAS) pada ikan lele dumbo
(Clarias
sp.);
Patologi,
Pencegahan
dan
Pengobatannya
dengan
Fitofarmaka. Disertasi Sekolah Pasca Sarjana Intitut Pertanian Bogor.
Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Jakarta : Pt Gramedia. Hayes,
J.,
2000.
Aeromonas
hydrophila.Oregon
State
University.
http://hmsc.oregonstate.edu/classes/MB492/hydrophilahayes Tanggal akses: 13 December 2006 Irianto. 2006. Patogen Ikan Teleostei. Gadjah Mada University Press.Yogyakarta. Kordi, K dan H. Ghufran.2004. Penanggulangan Hama dan PenyakitIkan.PT Rineka Cipta dan PT Bina Adiaksara. Jakarta Miyazaki, T. and Kaige, N. 1985.A histopathological study on motile aeromonad disease in Crucian carp.Fish Pathology. Edisi 21: halaman 181 – 185. Miyazaki, T. and Jo, Y. 1985.A histopathological study on motile aeromonad disease in ayu.Fish Pathology. Edisi 20: halaman 55 – 59. Volk, Wesley A dan Margareth F. Wheeler., 1998. Mikrobiologi Dasar Jilid I. Jakarta : Erlangga.
