Ivo Ovia Airin 260110110150
Antibodi Poliklonal
Antibodi poliklonal adalah antibodi yang diperoleh dari beberapa sel B atau baris sel. Dalam mempersiapkan antibodi ini, memiliki beberapa kemiripan dengan berbagai antibodi yang ditemukan dalam serum normal, yaitu merupakan komponen cairan yang dipisahkan dari darah beku. Kemiripan ini disebabkan oleh fakta bahwa antibodi yang poliklonal mengenali epitop yang berbeda dan memiliki derajat spesifisitas yang berbeda. Sebaliknya, antibodi monoklonal dalam sediaan berasal dari satu jenis klon dan mengenali epitop yang sama dengan derajat spesifisitas yang sama. Untuk menghasilkan antibodi poliklonal, binatang seperti ayam, tikus atau kelinci diimunisasi dengan antigen dan adjuvan yang telah dipersiapkan. Sistem kekebalan hewan dirangsang untuk memproduksi sel B yang mensekresikan antibodi yang spesifik untuk antigen. Setelah jangka waktu tertentu, biasanya beberapa minggu atau bahkan berbulan-bulan, serum hewan dipanen. Persiapan antibodi poliklonal biasanya campuran kekhususan antibodi yang semuanya mengenali antigen yang sama. Perbedaan spesifisitas menandakan antibodi berikatan dengan kekuatan yang berbeda untuk epitop yang berbeda pada antigen. Serum dapat digunakan sekali ketika telah dipisahkan dipisahkan dari seluruh darah, dan juga dapat dimurnikan lebih lebih lanjut jika diinginkan. Serum darah yang mengandung antibodi poliklonal dikenal sebagai antiserum. Antibodi poliklonal digunakan secara eksperimental dalam kedokteran klinis untuk berbagai alasan. Persiapan poliklonal umumnya lebih mudah dan lebih murah untuk dihasilkan daripada antibodi monoklonal, dan mereka juga mampu bertahan pada berbagai rentang variasi sushu dan PH yang lebih besar. Dalam pengobatan yang paling umum digunakan antibodi poliklonal adalah untuk memberikan kekebalan pasif terhadap penyakit tertentu. Satu-satunya pengobatan yang efektif untuk Ebola, misalnya, adalah transfusi antibodi serum dari korban virus manusia. Dalam penyakit seperti Ebola ini dapat efektif karena k arena virus berkembang biak dan bergerak begitu cepat dalam tubuh yang yang menyebabkan sistem kekebalan tubuh tidak punya waktu untuk me-mount me-mount
pertahanan sendiri. Ketika seseorang menjadi terinfeksi dengan virus Ebola, ia meninggal jauh sebelum sistem kekebalan tubuh dapat memerangi virus. Oleh karena itu satu-satunya pengobatan yang efektif adalah perlindungan yang diberikan oleh antiserum dari seseorang yang telah mengalami infeksi sebelumnya.Penggunaan medis lain untuk antiserum adalah sebagai antitoksin atau antivenin. Persiapan ini mengandung antibodi spesifik untuk racun dari reptil beracun, arakhnida, dan serangga. Mereka digunakan untuk mengobati orang-orang yang telah digigit atau disengat hewan ini, ditambah lagi karena racun bertindak terlalu cepat dalam tubuh sehingga sistem kekebalan tubuh tidak mampu untuk menyusun pertahanan. Antibody Production
Produksi dari antibody poliklonal sebagian besar merupakan proses empirik. Hanya beberapa variasi dari prosedur imunisasi dasar yang dapat meningkat seb agai kesempatan dalam memperoleh bahan bahan yang berguna. Intinya, variasi meliputi jalur penghantaran imunogen, dosis imunogen, waktu dan jumlah yang tepat dalam imunisasi.
Mode of Immunization Tujuan utama dalam memaparkan antigen ke system imun sehingga menghasilan keadaan hiperimun adalah untuk hadir sebagai persiapan rilis berkelanjutan dalam hubungannya dengan agen diketahui menyebabkan stimulasi umum dari system imun. Adjuvant yang sering dipakai untuk imunisasi dikenal sebagai Freund’s complete adjuvant (FCA). Adjuvant ini mengandung dasar mineral oil didalam suspensi dari mikrobakteri yang telah mati. Ketika laruatan yang mengandung air ditambahkan, system bifase akan terbentuk. Endapan kuat campuran mengarah pada informasi emulsi tebal. produksi emulsi stabil sering dianggap sebagai sesuatu seni dan sebagian peneliti memiliki metode pilihan mereka sendiri. Produksi dari emulsi stabil terkadang di anggap sebagai sesuatu darisarana lain yang telah dilaporkan tetapi muncul menjadi keuntuungan yang tidak universal dalam penggunaan dimana metode diatas telah gagal unttuk menghasilkan respon imun yang sesuai. Sebagai contoh adalah adanya endapan alum dari liposom. Imunisasi yang efektif membutuhkan beberapa administrasi dari imunogen. Prosedur diatas dengan FCA adalah secara normal dipandang sebagai imunisasi primer. Hal ini menimbulkan so-called primary immune response yang menghasilkan bentuk dari
antibody dengan konsentrasi IgM rendah. Tantangan lebih lanjut dari hasil sistem imun dalam kelas merubah menjadi antibody IgG yang lebih berguna., yang juga diproduksi dalam konsentrasi yang lebih besar. Tantangan ini disebut imunisasi sekunder dan dalam prakteknya memiliki aksi yang sama dengan imunisasi primer. Imunisasi lebih lanjut (imunisasi penguat) yang dilakukan seperlunya dalam u paya untuk memaksimalkan produksi antibody dan digunakan sebelum memanen darah dari hewan. Imunisasi ini membutuhkan imunisasi sekunder lebih jauh.
Dosis Of Immunogen Telah diketahui bahwa antibody yang memiliki afinitas antibody tertinggi adalah yang diproduksi oleh imunisasi dengan jumlah immunogen yang sedikit. Pada hewan, dosisnya adalah 10-100µg dari imunogen yang biasanya digunakan. Pada tikus, hal ini dapat mempengaruhi pemberian menjadi 100µl emulsi atau dalam kasus domba mencapai 1ml.
Timing of Imunization Waktu untuk berbagai imunisasi bergantung dari hewan yang digunakan. Pada tikus, imunisasi sekunder diberikan kira kiar 2 minggu setelah pemberian imunisasi primer. Pada hewan hewan yang lebih besar imunisasi penguat diberikan terkadang 2 minggu sebelum dipanen. Pada tikus, imunisasi penguat diberikan secara optimal hanya dalam beberapa hari sebelum splenektomi untuk proses
1. Contoh Prosedur Antibody Poliklonal Pada Kelinci
Housing and Immunization Kelinci disimpan di kandang stainless steel dan akses gratis diperbolehkan untuk menyelesaikan diet kelinci pellet dan air, dan dengan 12 jam lama penyinaran. Setelah tidak kurang dari 7 hari aklimatisasi terhadap lingkungan dan pengamatan untuk tanda-tanda penyakit, kelinci diberi imunisasi primer dengan (Xug antigen atau agen) dalam suatu 1 ml volume emulsi of steril PBS dan Lengkap Adjuvant Freund, diberikan secara subkutan di lima lokasi. dua penguat imunisasi diberikan pada interval 21 hari dengan emulsi disusun dengan
menggunakan Adjuvant tidak lengkap Freund diberikan secara subkutan di dua lokasi. Kelinci diperiksa setiap hari untuk tanda-tanda ketidaknyamanan atau reaksi vaksin lokal. Sampai dua booster imunisasi dapat diberikan pada interval 3 minggu jika antibodi yang terdeteksi tetapi titer ditemukan rendah (<200, tentukan pilihan peneliti). Jika kelinci tidak menanggapi imunisasi setelah waktu ini akan manusiawi eutanasia (tentukan endpoint).
Blood sampling
Kelinci akan memiliki sampel darah pra-imun (1-3 ml) ditarik sebelum untuk imunisasi pertama dari auricular arteri pusat menggunakan 3 ml jarum suntik dan 20 mengukur jarum. Kelinci akan ditempatkan dalam kotak penahanan kelinci dan telinga diusap dengan alkohol. Salep anestesi (yaitu Lanocaine) kemudian digosok pada kulit di atas arteri. Setelah 5 menit atau lebih telinga adalah kembali diusap dengan alkohol untuk mendisinfeksi dan menghapus bius yang tersisa. Dengan menggunakan metode ini kelinci biasanya mentolerir pengambilan darah dengan sedikit reaksi. Sebuah posting-imunisas sampel (berdarah test) juga sama diambil 7 hari setelah 3 imunisasi dan diperiksa oleh western blotting atau ELISA untuk menentukan titer antibodi. Jika imunisasi tambahan diberikan, pendarahan uji diambil 7 hari kemudian untuk memeriksa titer antibodi. Setelah cukup respon antibodi telah mengembangkan sampel darah akhir ditarik oleh intra jantung (IC) Metode bawah anestesi pada tingkat yang cocok untuk operasi. Setelah pengambilan darah IC kelinci ini eutanasia tanpa pemulihan dari anestesi.
Antibodi Monoklonal Antibodi monoklonal adalah antibodi sejenis yang diproduksi oleh sel plasma klon sel-sel b sejenis. Antibodi ini dibuat oleh sel-sel hibridoma (hasil fusi 2 sel berbeda; penghasil sel b Limpa dan sel mieloma) yang dikultur.Bertindak sebagai antigen yang akan menghasilkan anti bodi adalah limpa. Fungsi antara lain diagnosis penyakit dan kehamilanAntibodi monoklonal dibuat dengan darisel hibrid yang mempunyai sifat lebih baik dari antibodipoliklonal karena hanya mengikat 1 epitop serta dapat dibuat dalam jumlah tak terbatas. Terobosan
teknik
hibridoma yang menghasilkan antibodi monoklonal terhadap antigen, membuka era baru cara identifikasi dan memurnikan suatu molekul pada berbagai disiplin ilmu, juga membuka cakrawala dalamprosedur diagnostik dan pengobatan dan pencegahan alternatif pada keganasan dan berbagai penyakit lain. Antibodi monoklonal dibuat dengan cara penggabungan atau fusi kedua jenis sel yaitu sel limfosit B yang memproduksi antibodi dengan sel kanker (sel mieloma) yang dapat hidup dan membelah terus menerus. Hasil fusi antara sel limfosit B dengan sel kanker secara in vitro ini disebut dengan hibridoma.Apabila sel hibridoma dibiakkan dalam kultur sel, sel yang secara genetik mempunyai sifat yang identik akan memproduksi antibodi sesuai dengan antibodi yang diproduksi oleh sel aslinya yaitu sel limfosit B. Hal yang penting diperhatikan adalah proses pemilihan sel klon yang identik yang dapat mensekresi antibodi yang spesifik .Sel hibridoma mempunyai kemampuan untuk tumbuh secara tidak terbatas dalam kultur sel,sehingga mampu memproduksi antibodi homogen (monoklonal) yang spesifik dalam jumlahyang hampir tidak terbatas. Hal ini tentu saja sangat menguntungkan jika digunakan sebagai alatdiagnostik. Beberapa jenis kit antibodi monoklonal telah tersedia di pasaran untuk mendeteksibakteri patogen dan virus, serta untuk tes kehamilan. Semua antibodi monoclonal dari klon tunggal akan berikatan dengan tipe epitope tunggal atau antigen determinan dari antigen, dibandingkan dengan antiserum poliklonal yang memiliki rentang dalam mengenali berbagai epitope. Sifat ini menyebabkan reagen memiliki spesifisitas yang tinggi, mampu untuk membedakan perbedaan yang sangat kecil dari molekul, sel atau mikroorganisme. Selain itu, antibody monoclonal dapat dibuat dengan tidak terbatas karena sel
hibridoma dapat tumbuh di kultur jaringan yang tanpa batas dalam skala industry. Keuntungan lainnya dari antibody monoclonal adalah sel dapat dibekukan untuk penyimpanan dan dapat digunakan lagi tanpa perlu proses rekarakterisasi seperti pada antiserum poliklonal yang masih baru.Sebagian besar dari antibodi monoclonal didapatkan dari sel mencit, terkadang tikus, dan sangat jarang adalah dari sel antibosi manusia. Dapat terjadi pula untuk mendapatkan antibody yang diambil dari heterohibridoma yang merupakan produk dari sel induk dari spesies ini. Antibodi monoclonal pertama kali dijelaskan pada tahun 1975 oleh Georges Kohler dan Cesar Milstein di sebuah artikel dengan judul “Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity”. Mereka dapat mendemonstrasikan untuk pertama kalinya bahwa sel yang memproduksi antibody dapat di hibridisasi kedalam sel lain yang immortal tanpa mengganggu kemampuan untuk menghasilkan dan memproduksi antibody. Dengan demikian keberlanjutan sumber antibody secara in vitro dapat diperoleh. Prosedur untuk Membuat Antibodi Monoklonal Immunization
Tujuan utama dalam memaparkan antigen ke system imun sehingga menghasilan keadaan hiperimun adalah untuk hadir sebagai persiapan rilis berkelanjutan dalam hubungannya dengan agen diketahui menyebabkan stimulasi umum dari system imun. Adjuvant yang sering dipakai untuk imunisasi dikenal sebagai Freund’s complete adjuvant (FCA). Adjuvant ini mengandung dasar mineral oil didalam suspensi dari mikrobakteri yang telah mati.Cara pembuatan antibody monoclonal untuk mendapatkan antibodi yang homogen : 1. Imunisasi mencit Antigen berupa protein atau polisakarida yang berasal dari bakteri atau virus, disuntikkan secara subkutan pada beberapa tempat atau secara intra peritoneal. Setelah 23 minggu disusul suntikan antigen sekali atau beberapa kali suntikan. Mencit dengan kekebalan terbaik dipilih, 12 hari setelah suntikan terakhir, antibodi yang terbentuk pada mencit diperiksa secara aseptis, kemudian dibuat suspensi sel atau limpa untuk memisahkan sel B yang mengandung antibodi. Cara ini dianggap cukup baik dan banyak dipakai, walaupun kadangkala dipengaruhi oleh sifat antigen atau respon imun binatang yang berbeda-beda. Cara Imunisasilain yang juga sering dilakukan adalah imunisai sekali
suntik (single-shot intrasplenic immunization). Pada cara imunisasi konvensional antigen dipengaruhi bermacam macam factor. Bila disuntikkan kedalam darah sebagian besar akan dieliminasi secara alami, sedangkan melalui kulit akan tersaring kelenjar limfe, makrofag, dan sel retikuler. Hanya sebagian kecil antigen yang terlibat dalam proses imun. Oleh sebab itu, untuk mencegah eliminasi antigen oleh tubuh dilakukan suntikkan imunisasi langsung pada limpa dan ternyata hasilnya lebih baik secara konvensional. Menyuntik hewan laboratorium (mencit) dengan antigen dan kemudian, setelah antibody telah terbentuk, mengumpulkan antibody dari serum darah hewan tersebut (antibody yang mengandung serum darh disebut antiserum ) 2. Fusi Sel Limpa dan sel myeloma Pada kondisi biakan jaringan basa, sel limpa yang membuat antibody akan cepat mati sedangkan sel myeloma yang dapat dibiakkan terus menerus. Fusi sell dapat menciptakan sel hybrid yang terdiri dari gabungan sel limpa yang dapat membuat antibodi dan sel myeloma yang dapat dibiakkan terus menerus, sehingga sel hybrid dapat memproduksi antibody secara terus menerus dalam jumlah yang tidak terbatas secra in vitro. Fusi sel diawali dengan membrane plasma sehingga menghasilkan sel besar dengan dua atau lebih inti sel, yang berasal dari kedua induk sel yang berbeda jenis yang dibuat heterokarion. Pda waktu tumbuh dan membelah diri terbetuk satu inti yang mengandung kromosom kedua induk yang disebut sel hybrid. Frekuensi fusi dipengaruhi beberapa factor antara lain jenis medium ; dan bahan yang mendorong timbulnya fusi (fusogen). Penambahan polietilen glikol (PEG) dan dimetilsulfoksida (DMSO) dapat menaikkan efisiensi fusi sel. Mentransfer campuran fusi fusi sel (se limfosit B dan sel myeloma ke medium kultur yang disebut HAT ( karena mengandung Hipoxantin Amino Timidin)
Sel Mieolma (Sel tumor sum-sum tulang yang kan tumbuh tanpa batas di laboratorium dan menghasilkan immunoglobulin) yang tidak mengalami fusi tidak dapat tumbuh karena HGPRT
Sel Limfosit B (Limpa mencit yang telah terkena antigen sehingga memproduksi antibodi X) yang tidak mengalami fusi tidak dapat tumbuh terus karena punya batas waktu hidup.
Sel Hibridoma (dihasilkan oleh fusi yang berhasil) dapat tumbuh tanpa batas karean sel limpa dapat memproduksi HGPRT dan sel myeloma dapat membantu sel limpa
Fusi ini menggabungkan kemampuan untuk tumbuh terus menerus dari sel myeloma dan kemampuan untuk menghasilak sejumlah besar antibody dari sel limfosit B murni.
3. Eliminasi Sel Induk Frekuensi terjadinya hybrid sel limpa sel myeloma biasanya rendah, karena itu penting untuk mematikan sel yang tidak fusi yang jumlahnya lebih banyak agar sel hybrid mempunyai kesempatan untuk tumbuh dengan cara membiakkan sel hybrid dalam media selektif yang mengtandung hypoxanthine, aminopterin, thymidine (HAT). Aminopterin menghambat jalur biosintesis purin dan pirimidin sehingga memaksa sel menggunakn salvage pathways. Seperti kita ketahui bahwa sel myeloma mempunyai kelainan untuk mensintesis nukleotida yaitu sel myeloma yang tidak mempunyai enzim timidin kinase atau hypoxanthine phosphoribosyl transferase, sehingga sel myeloma yang tidak berfusi, karena tidak mempunyai enzim timidine kinase atau hypoxanthine phosphoribosyl transferase akan mati, sedankgan sel hybrid karena mendapatkan enzim tersebut dan sel mamalia yang didifusikan dapat menggunakan salvage pathway, sehingga dapat hidup dan berkembang. 4. Isolasi dan Pemilihan klon hibridoma Sel Hibrid dikembangbiakkan sedemikian rupa, sehingga tiap sel Hibrid akan membentuk koloni homogeny yang disebut sel hibridoma. Tiap koloni kemudian dipelihara terpisah satu sama lain.Hibridoma yang tumbuh diharapkan mensekresi antibody ke dalam medium, sehingga antibodi yang terbentuk bisa dii solasi. Umumnya penentuan antibody yang diinginkan dilakukan dengan cara enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) atau Radioimmoassay(RIA). Pemilihan klon hibridoma dilakukan dua kali, pertama adalah dilakukan untuk memperoleh hibridoma yang apat menghasilkan antibody dan yang kedua adalah memilih sel penghasil antibody monoclonal yang potensial menghasilkan antibody monoclonal yang tinggi dan stabil.
AntibodiMonoklonal Generasi Baru
Beberapa antibodi monoklonal yang digunakan untuk pengobatan berasal dari sel mencit/tikus sehingga ser ing menimbulkan reaksi alergi pada pasien yang menerima terapi
antibody
monoclonal tersebut.Untuk mengatas imasalah tersebut, maka para peneliti melakukan
pengembanganan tibody monoclonal yang memiliki sedikit efek penol akan dari system imun pasien.Pengembangan tersebut mencit akan antibodi monoklonal generasi baru, antara lain: Chimeriic Monoclonal Antibodies Antibodi
chimeric mengambil nama mereka dari Chimera, sebuah binatang mistisdengan kepala singa, tubuh seekor kambing dan ekor naga. Rituxan atau Rituximab adalah jenis ter tentu obat yang dikenal sebagai antibodi monoclonal chimeric.Rituxan merupakan hibrida dari antibodi dari dua sumber, yaitu manusia dan tikus. Anti gen C 20 disuntikkan ke tikus , mendoronng produksi antibody. Antibodi sel kemudian diisolasi dari limpa hewan kemudian digabungkan dengan sel myeloma. Hal ini menghasilkan baris sel yang akan terus memproduksi antibody tanpa batas. Rekayasa genetika lebih lanjut menghilangkan unsure-unsur sel tikus yang biasanya akan menghasilkan reaksi (alergi) kekebalan jika disuntikkan ke manusia.Terapi antibody monoclonal basis awal untuk kanker terganggu dengan sejumlah masalah. Pada eksperimen awal, terdapat reaksi alergi dari bagian asing antibody eksperimnetal dari tikus, yang disebut HAMA (human anti-mouse antibody) yang membatasi kegunaan dan mencegah digunakan lebih dari sekali. Para pengembang Rituxan mengatasi masalah ini dengan menghapus bagian antigen dari bagian tikus tersebut dengan antibody chimeric. Humanized Monoclonal Antibodies Humanized antibodies adalah antibody dari spesies non-manusia yang sekuens proteinnya telah dimodifikasi untuk meningkatakan kesamaan mereka pada varian antibody yang dihasilkan secara alami pada manusia. Proses “humanisasi” biasanya diterapkan untuk antibody monoclonal yang dikembangkan untuk manusia (misalnya, antibody yang dikembangkana sebagai obat antikanker). Humanisasi ini diperlukan pada saat proses pengembangan antbodi s[esifik yang melibatkan mehluk hidup lain dalam system kekeblan tubuh manusia, sepert tikus. Urutan protein antibody yang diproduksi dengan cara ini adalah sedikit berbeda dari homolog antibody yang terjadi secara alami pada manusia, oleh karenanya berpotensi imunogenik jika diberikan kepada pasien manusia. Tidak semua antibody monoclonal dirancang untuk
administrasi manusia perlu dilakukan humanized karean banyak yang merupakan terapi jangka pendek. Menurut The International Nonproprietary nama akhir antibody yang telah dimanusiawikan berakhiran – mab seperti omalizumab. Proses ini mempunyai keuntungan yang dapat dibuktikan dari fakta bahwa produksi antibody monoclonal dapat dicapai dengan menggunakan DNA rekombinan untuk membuat konstruksi yang mampu berekspresi pada kultur sel mamalia. Artinya, segmen gen yang mampu memproduksi antibody diisolasi dan dikloning ke dalam sel yang dapat tumbuh dalam sebuah tangki sehingga protein yang dihasilkan dari DNA dari gen cloning dipanen secara masal.Tidak semua metode untuk menurunkan antibody dimasudkan untuk terapi manusia memerlukan langkah humanisasi (misalnya tampilan fag) tetapi pada dasarnya semua tergantung pda teknik yang sama memungkinkan “sisipan” bagian dari molekul antibody. Fully Human Monoclonal Antibodies
Antibodi ini merupakan antibody yang paling ideal untuk menghindari terjadinya respon imun karena protein antibody yang disuntikkan ke dalam tubuh seluruhnya merupakan protein yang berasal dari manusia. Salah satu pendekatan yang dilakukan untuk merancang pembentukan antibody monoklonla yang seluruhnya mengandung proteinmanusia tersebut adalah teknik rekayasa genetika untuk menciptakan mencit transgenic yang membaawa gen yang berasal dari manusia, sehingga mampu memproduksi antibody antibody yang diinginkan. Pendekatan lainnya adalah merekayasa suatu bintatang transgenic yang dapat mensekresikan antibody manusia dalam air susu yang dikeluarkan oleh binatang tersebut. Salah satu contoh fully human monoclonal antibodies adalah Panitumumab. Panitumumab ini sebelumnya memiliki nama ABX-EGF, merupakan fully human monoclonal antibodies pertama yang spesifik untuk reseptor factor pertumbuhan epidermal (juga dikenal sebagai reseptor EGF, EGFR, ErbB-1, dan HER1 pada manusia). Panitumumab ini disetujui oleh lembaga obat dan makanan di Amerika pada September 2006 untuk terapi metatesis kanker usus besar yang diekspresikan oleh EGFR. EGFR ini merupakan protein transmembran. Panitumumab bekerja
dengan cara mengikat pda bagian ekstraselular membrane EFGR untuk mencegah aktivitasnya. Sehingga sinyal intraseluler yang terkait dengan re sptor ini kana terutus atau terhambat. Panitumumab ini dikembangkan dengan cara imunisasi mencit transgenic yang disebut dengan XenoMouse yangmampu menghasilkan immunoglobulin manusia rantai berat dan ringan. Setelah dilakukan imunisai, klon spesifik sel B yang memproduksi antibodi untuk melawan EGFR dipilih dan diawetkan pada sel CHO (Chinese hamster ovary). Sel ini kemudian diguankan pada produksi skala besar. Panitumumab ini diproduksi oleh Amgen dan diperjualbelikan dengan nama dangan Vectibix.
