Analisis Kuantitatif Glukosamin Produk glukosamin yag biasanya digunakan sebagai suplemen makanan untuk mengurangi gejala dari osteoarthritis. Glukosamin diketahui dapat menurunkan rasa sakit, meningkatkan kekuatan dan meningkatkan fungsi untuk pembentukan kembali jaringan penghubung utama (sendi). Beberapa metode liquid kromatografi di ketahui dapat digunakan untuk menganalisis glukosamin dari suplemen makanan. Digunakan sebuah metode untuk menganalisis glukosamin dengan menggunakan deteksi fluoresensi tidak langsung (indirect fluorescent) untuk menganalisis kandungan glukosamin yang beredar di pasaran sebagai suplemen makanan dengan menggunakan proses pemisa han kromatografi. Kebanyakan glukosamin diderivatisasi menjadi penggabungan kromofor atau fluuoropor sebelum pemisahan LC, untuk meningkatkan deteksi dari analit. Pereaksi yang memungkinkan untuk digunakan adalah yang mengandung o phthalatdehyde
(OPA)-3-asam
phenylisothiosianat
(PITC)(7,8)
dan
mercaptopropionik N-
(MPA)(5,6),
(9-fluorenyl-methoxycarbonyloxy)) (9-fluorenyl-methoxycarbonyloxy
succinimide (FMOC-Su). Metode deteksi fluoresensi tidak langsung (indirect fluorescent) dilakukan dengan cara mengelusi analit yaitu glukosamin yang dapat dideteksi dengan monitoring peningkatan signal fluoresensi untuk L-tryptopan atau DL-5-methoxytryptophan (5-MTP) yang dihasilkan setelah terjadinya kompleks glukosamin dengan ion copper (II) kemudian melepas L-trp atau 5MTP dari kompleks copper (II) atau lebih dikenal dengan postcolumn, Glukosamin dapat di deteksi setelah pengelusian dengan pengukuran index reaktif atau absorbansi dengan UV pada 195 nm. Kemudian hasil dari metode deteksi fluoresensi dibandingkan (dikomper) dengan hasil dari derivatisasi precolum dengan menggunakan phenylisothiosianat. Analisis statistik ditunjukan untuk membandingkan hasil dari 2 interaksi komponen postcolumn, Cu(L-Trp) 2 and Cu(5-MTP)2 dengan hasil dari penggunaan deteksi fluoresensi dan derivatisasi percolumn. Deteksi fluoresensi tidak langsung merupakan suatu alternatif dari derivatisasi precolumn adalah metode untuk menentukan konsentrasi konsentrasi glukosamin pada suplemen makanan di pasaran. Stabilitas dari turunan asam glukosamin – oo-
phthalaldehyde – 3-mercaptopropionic
juga
dievaluasi
untuk
mengetahui
pengaplikasian dari reagent derivatisasi precolumn yaitu asam o-phthalaldehyde – 3-mercaptopropionic yang digunakan untuk analisis. Metode Deteksi fluoresensi tidak langsung digunakan untuk monitoring elusi dari gula amino, glukosamin, galactosamine dan mannosamine dengan pemisahan kromatografi. Dengan menggunakan basic dari pengukuran sinyal fluoresensi dari L-tryptopan atau DL-5-methoxytryptophan (5-MTP). L-tryptopan atau DL-5-methoxytryptophan (5-MTP) dimasukan ke postcolumn untuk membentuk kompleks copper. Fluoresensi dari senyawa tersebut dihasilkan ketika mereka berikatan degan larutan copper (II). Reaksinya sebagai berikut: Cu(L)2 +nGlcN→Cu(GlcN)n+ 2L dimana L adalah ligan yang berfluoresensi dan n adalah nomer dari molekul glukosamin yang berikatan dengan copper(II). Hasil yang menggunakan metode deteksi fluoresensi dibandingkan dengan hasil dari derivatisasi precolum yang menggunakan phenylisothiosianat. Prosedur yang dilakukan: 1. Preparsi dari glukosamin standar Glukosamin hidroklorida digunakan sebagai standar, ditimbang secara akurat untuk membuat larutan stok dalam air pada konsentarsi 0,3065 dan 1,063 mg/ml. Konsentrasi yang tepat dari larutan standar digunakan untuk mengkomper kandungan glukosamin dari suplemen makanan dengan menggunakan L-Trp dan 5-MTP berkisar antara 30-155 mikrogram/ml. 2.Preparasi glukosamin yang terkandung dalam suplemen makanan. Untuk sediaan berbentuk solid berupa tablet atau kapsul dilarutkan di dalam beakerglass menggunakan 300ml air deionisasi dengan pengadukan, lalu larutan tersebut didiamkan selama 30 menit. Larutan dimasukan ke labu ukur 500ml dan ditambahkan air deionisasi samapai batas (tanda) pada labu ukur, menghasilkan larutan stok yang mengandung paling tidak 3 mg/ml glukosamin. Aliquot dari larutan stok ini disaring menggunakan syringe filter dan dilusi untuk
menghasilkan larutan 0,15 mg/ml glukosamin yang siap untuk dianalisis. Sedangakan untuk sediaan liquid dimasukan ke labu ukur 25ml dan dilusi menghasilkan larutan glukosamin dengan konsentrasi 0,15mg/ml kemudian di saring. 3. Prosedur untuk mereaksikan glukosamin dengan OPA-MPA Campurkan larutan OPA dalam metanol (10.798 mg/mL), 100 µL MPA, 800 µL larutan glukosamin hidroklorida (1.023 mg/mL),dan 9580 µL buffer borat (80mM, pH=9,5). Untuk memonitor stabilitas dari glukosamin-OPA-MPA, 600 mikroliter dari campuran larutan tersebut dicampurkan dengan 2400 mikroliter buufer borat (80mM, pH=9,5) dan dimasukan ke spektofotometer uv-vis. 4. Prosedur reaksi derivatisasi precolumn dalam glukosamin dengan PITC (pre column) 1ml darilarutan glukosamin 0,15mg/ml dan 1ml buffer phosfat 0,3M pada pH 8,3 serta 1 ml phenylisothiosyanat 5% dalam metanol dimasukan ke vial 20 ml dan dicampurkan. Vial ditutup rapat dan ditempatkan ke water bath pada suhu 60 0 C. Lalu vial dipindahkan dari water bath dan di vortex selama 1 menit tiap 20 menit. Setelah 120 menit vial dimasukan ke ice bath selama 10 menit dan kemudian disimpan di suhu ruangan. Larutan disaring menggunakan syringe filter 0,45 µm. Sampel blank untuk reaksi derivat precolumn disiapkan mengikuti prosedur yang dijelaskan sebelumnya, tetapi tidak measukan 1ml air ke 1 ml glukosamin. 5. Kondisi kromatografi -Metode fluoresensi tidak langsung Fase geraknya adalah sodium borat pH 9, kecepatan alir 1 ml/min; interaksi poscolumn 2 × 10 – 5 M Cu(L-Trp)2 pada 40mM sodium borate di pH 9.0 atau 2×10 – 5M Cu(5-MTP)2 dalam 40mM sodium borate pada
pH 8.4;
menggunakan kolom strong anion exchange; spektroflow 980 fluoresence panjang gelombang eksitasi 280 nm dan panajang gelombang emisi 320 nm atau 340 nm.
-Metode precolumn derivatisasi Fase gerak metanol-air-asam asetat (10:89,96:0,04 v/v/v); kecepatan alir 1ml/min; column, fase terbalik; detector, waters 484 tunable absorbance dengan panjang gelombang 254 m. Perhitungan konsentrasi: Kandungan glukosamin dalam suplemen makanan yang berasal dari glukosamin hidroklorida dapat dihitung: Perhitungan ke-1: GLcN. HCl (mg) =(h-b/a) X D Keterangan: h=tinggi puncak; b=y-intercept dari kurva kalibrasi; D=faktor dilusi Perhitungan ke-2: GlcN=GlcN· Hcl × 179.17/215.6 Keterangan: GlcN=glukosamin yang berasal dari sediaan basa glukosamin; 179,17 adalah massa dari basa glukosamin dan 215,63 adalam massa dari glukosamin hidroklorida. Perhitungan ke-3: (GlcN)2 · H2SO4 = GlcN· HCl × 456.42/431.26 Keterangan: (GlcN)2·H2SO4 merupakan glukosamin dari sediaan glukosamin sulfat; 456,42 adalah massa dari glukosamin sulfat dan 431,26 massa glukosamin hidroklorida dikalikan 2. Perhitungan ke- 4: (GlcN)2·H2SO4·2KCl = GlcN· HCl × 605.52/431.26 Keterangan: (GlcN)2 · H2SO4 · 2KCl adalah glukosamin yang berasal dari sediaan gukosamin sulfat potasium klorida; 605.52 adalah massa dari gukosamin sulfat potasium klorida; 431,26 massa glukosamin hidroklorida dikalikan 2 (Xiaoxuan dkk, 2007).
Xiaoxuan Shen,. Min yang., Sterling A,. 2007. Liquid Chromatographic Analysis of Glucosamine in Commercial Dietary Supplements Using Indirect Fluorescence Detection.Available at:http://chromsci.oxfordjournals.org/content/45/2/70.full.pdf (diakses pada tanggal 15 maret 2014).
.